DE112021001605T5 - BIOMARKER PANEL SPECIFIC FOR MYELOID-DERIVED SUPPRESSIVE CELLS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Transkriptvarianten von Genen, die für Oberflächenproteine kodieren, von denen bekannt ist, dass sie auf der Oberfläche von granulozytären myeloischen Suppressorzellen (gMDSC) zu finden sind, bei der Charakterisierung von MDSC-Populationen (eMDSC, gMDSC und mMDSC-Populationen). Die Verwendung von Isoform-Proteinen, die von Transkriptvarianten kodiert werden, die sich als spezifisch für MDSC erweisen, als Oberflächenmarker wird es auch ermöglichen, neue Behandlungsansätze bei chronischen Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs zu entwickeln.The invention relates to the use of transcript variants of genes encoding surface proteins known to be found on the surface of granulocytic myeloid suppressor cells (gMDSC) in the characterization of MDSC populations (eMDSC, gMDSC and mMDSC- populations). The use of isoform proteins encoded by transcript variants found to be specific for MDSC as surface markers will also allow the development of new treatment approaches in chronic inflammation, autoimmune diseases and cancer.
Description
Technisches Gebiettechnical field
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Transkriptvarianten von Genen, die Oberflächenproteine kodieren, von denen bekannt ist, dass sie auf der Oberfläche von granulozytären Myeloid-abgeleiteten Suppressorzellen (gMDSC) zu finden sind, zur Charakterisierung von MDSC-Populationen (eMDSC-, gMDSC- und mMDSC-Populationen). Die Verwendung von Isoform-Proteinen, die von Transkriptvarianten kodiert werden, die sich als spezifisch für MDSC erweisen, als Oberflächenmarker wird auch die Entwicklung neuer Behandlungsansätze bei chronischen Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs ermöglichen.The invention relates to the use of transcript variants of genes encoding surface proteins known to be found on the surface of granulocytic myeloid-derived suppressor cells (gMDSC) for the characterization of MDSC populations (eMDSC-, gMDSC - and mMDSC populations). The use of isoform proteins encoded by transcript variants shown to be specific for MDSC as surface markers will also enable the development of new treatment approaches in chronic inflammation, autoimmune diseases and cancer.
Stand der TechnikState of the art
Obwohl seit der Entdeckung von Myeloid-abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) bei Krebspatienten fast 20 Jahre vergangen sind, ist die funktionelle Bedeutung dieser Zellen im Immunsystem noch nicht geklärt. Die Ergebnisse der durchgeführten Studien belegen, dass die MDSC-Population eine Rolle bei der negativen Regulierung des Immunsystems bei Krebs und anderen Krankheiten spielt.Although almost 20 years have passed since the discovery of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in cancer patients, the functional importance of these cells in the immune system is still not understood. The results of the conducted studies demonstrate that the MDSC population plays a role in the negative regulation of the immune system in cancer and other diseases.
Gemeinsame Merkmale der MDSC-Populationen sind, dass sie von Myeloiden abstammen, dass sie pathologisch aktiviert werden, obwohl sie noch nicht ausgereift sind, und dass sie eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Unterdrückung von T-Zellen haben. Obwohl die Forscher bei verschiedenen Krankheiten verschiedene MDSC-Untergruppen definiert haben, sind die durchgeführten Studien aufgrund der methodischen und technischen Unterschiede bei der Charakterisierung der identifizierten MDSC-Populationen oft nicht allgemein anerkannt. Die Tatsache, dass noch keine spezifischen Biomarker für die MDSC-Population entdeckt wurden, unterstreicht das Problem des Vertrauens in die MDSC-Biologieforschung.Common features of the MDSC populations are that they are myeloid-derived, that they are pathologically activated although immature, and that they have a remarkable ability to suppress T cells. Although researchers have defined different MDSC subgroups in different diseases, the studies conducted are often not universally accepted due to the methodological and technical differences in characterizing the identified MDSC populations. The fact that specific biomarkers for the MDSC population have not yet been discovered underscores the issue of trust in MDSC biology research.
Für humane MDSCs werden häufig verschiedene Kombinationen der Oberflächenmarker CD33, CD11b, IL-4Ra, CD14, CD15, CD16, CD66b, VEGFR1 und HLA-DR verwendet. Während CD11b, CD33 und IL-4Ra zum Nachweis der allgemeinen MDSC-Population verwendet werden, gelten neben diesen drei Markern CD14-CD16 low VGFR1 +HLA-DR- G-MDSC und CD15+/- CD16-CD66b+/-VGFRI-HLA-DR low M-MDSC als Subtypen.Different combinations of the surface markers CD33, CD11b, IL-4Ra, CD14, CD15, CD16, CD66b, VEGFR1 and HLA-DR are often used for human MDSCs. While CD11b, CD33 and IL-4Ra are used to detect the general MDSC population, in addition to these three markers CD14-CD16 low VGFR1 +HLA-DR- G-MDSC and CD15+/- CD16-CD66b+/-VGFRI-HLA-DR apply low M-MDSC as subtypes.
Aktuelle Studien zur Multicolor-Immunphänotypisierung haben gezeigt, dass es sechs verschiedene MDSC-Subtypen [MDSC1, CD14+IL-4Roc+; MDSC2, CD15+IL-4Ra+; MDSC3, Lin-(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56)-HLA-DR-CD33+; MDSC4, CD14+HLA-DR-/Iow; MDSC5, CD11b+CD14-CD15+ und MDSC6, CD15+FSC low SSC high] beim Menschen gibt. Zusätzlich zu diesen Markern gibt es Veröffentlichungen, die besagen, dass etwa 32 verschiedene Oberflächenmoleküle mit dem MDSC-Phänotyp in Verbindung gebracht werden können.Recent studies on multicolor immunophenotyping have shown that there are six different MDSC subtypes [MDSC1, CD14+IL-4Roc+; MDSC2, CD15+IL-4Ra+; MDSC3, Lin-(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56)-HLA-DR-CD33+; MDSC4, CD14+HLA-DR-/low; MDSC5, CD11b+CD14-CD15+ and MDSC6, CD15+FSC low SSC high] in humans. In addition to these markers, there are publications stating that about 32 different surface molecules can be associated with the MDSC phenotype.
Obwohl in den bisherigen Studien mehrere Subtypen von myeloischen Regulatorzellen identifiziert wurden, lassen sich die myeloischen Regulatorzellen in drei Hauptsubtypen unterteilen: granulozytäre MDSC (oder polymorphkernige (PMN) -MDSC), monozytäre MDSC und MDSC-Populationen im Frühstadium. Die immunphänotypische Klassifizierung, die von Forschern für diese drei Hauptpopulationen mit einem gemeinsamen Konsortium verwendet wird, lautet wie folgt:
- • CD11b+ CD 14- CD66b+ oder CD1 Ib+ CD 14- CD15+ granulozytäre MDSC-Population (gMDSC),
- • CD11b+ CD14+ HLA-DR-/low CD66b- monozytäre MDSC-Population (mMDSC),
- • Lin- (CD3, CD14, CD15, CD19, CD56) HLA-DR- CD33+ MDSC-Population im Frühstadium (eMDSC).
- • CD11b + CD 14 - CD66b + or CD1 Ib + CD 14 - CD15 + granulocytic MDSC population (gMDSC),
- • CD11b + CD14 + HLA-DR -/low CD66b - monocytic MDSC population (mMDSC),
- • Lin - (CD3, CD14, CD15, CD19, CD56) HLA-DR - CD33 + early stage MDSC population (eMDSC).
In dem Patentdokument mit der Nummer
In der Patentschrift mit der Nummer
In einem anderen Dokument, in dem die zur Markierung der MDSC-Populationen verwendeten Marker und die angewandten Strategien erwähnt werden, werden in ähnlicher Weise die Marker genannt, die bei der Trennung der MDSC-Populationen durch Durchflusszytometrie zu verwenden sind. Dieses Dokument gibt einen Überblick über die Strategie, die bei Studien zur MDSC-Biologie angewandt werden sollte, da spezifische Marker für MDSC-Populationen noch nicht entdeckt wurden. Wie in dem Dokument erwähnt, wird der Schluss gezogen, dass funktionelle, biochemische und molekulare Tests notwendig sind, um MDSC-Populationen zu validieren, ebenso wie die Verwendung der vorgeschlagenen Markerkombinationen in der Durchflusszytometrie.Another document, which mentions the markers used to label the MDSC populations and the strategies used, similarly mentions the markers to be used when separating the MDSC populations by flow cytometry. This paper provides an overview of the strategy that should be used in studies of MDSC biology, as specific markers for MDSC populations have not yet been discovered. As mentioned in the paper, it is concluded that functional, biochemical and molecular assays are necessary to validate MDSC populations, as is the use of the proposed marker combinations in flow cytometry.
Es ist bekannt, dass die im Stand der Technik erwähnten Zelloberflächenmarker auch während normaler Differenzierungs-, Reifungs- oder Aktivierungsprozesse myeloischer Zellen in unterschiedlichen Mengen und/oder vorübergehend transportiert werden. Daher muss zusätzlich zu den Oberflächenmarkern, die bei der Identifizierung von MDSCs verwendet werden, fast immer auch ihre immunsuppressive Funktion nachgewiesen werden. In Anbetracht der von Mensch zu Mensch unterschiedlichen Auswirkungen von Entzündungskrankheiten wie Krebs auf das Immunsystem wurde die Bedeutung von Standardisierungsstudien zur genauen und zuverlässigen Identifizierung dieser myeloischen regulatorischen Zellen hervorgehoben.It is known that the cell surface markers mentioned in the prior art are also transported in different amounts and/or transiently during normal differentiation, maturation or activation processes of myeloid cells. Therefore, in addition to the surface markers used in the identification of MDSCs, their immunosuppressive function almost always needs to be demonstrated as well. Considering the different human-to-human effects of inflammatory diseases such as cancer on the immune system, the importance of standardization studies to accurately and reliably identify these myeloid regulatory cells has been highlighted.
Infolge der Differenzierungs-, Reifungs- und Aktivierungsprozesse von Immunzellen ändern sich ihre biologischen Verhaltensweisen und Genexpressionsprofile. Die durch Genexpression synthetisierte Vorläufer-mRNA wird durch verschiedene Mechanismen verarbeitet, um eine Reife zu erreichen, die ein Protein kodieren kann. In diesem Stadium kommen posttranskriptionelle Mechanismen des „alternativen Spleißens“ ins Spiel, und es werden Isoformen unterschiedlicher Länge synthetisiert, die einige Einheiten des betreffenden Proteins nicht tragen. Ein weiterer Mechanismus, der zur Bildung verschiedener Varianten führt, ist die Verwendung von „alternativen Transkriptionsstartstellen“, wenn diese innerhalb der Genregion liegen.As a result of the differentiation, maturation and activation processes of immune cells, their biological behavior and gene expression profiles change. The precursor mRNA synthesized through gene expression is processed by various mechanisms to reach maturity that can encode a protein. At this stage, post-transcriptional mechanisms of “alternative splicing” come into play, and isoforms of different lengths are synthesized that do not carry some units of the protein in question. Another mechanism leading to the formation of different variants is the use of "alternative transcription start sites" when they are within the gene region.
Obwohl bekannt ist, dass es funktionelle Unterschiede zwischen den Isoformen einiger Proteine gibt, sind die Informationen über die Funktion und die Expressionsdynamik der Isoformen der meisten Proteine begrenzt. Es gibt nur wenige Studien über die Bedeutung alternativer Transkriptionsmechanismen in myeloischen Zellen. Darüber hinaus wurden in der Literatur keine Informationen darüber gefunden, welche Transkriptvarianten die Oberflächenmarker menschlicher MDSCs in den Differenzierungs-, Reifungs- und Aktivierungsschritten kodieren.Although it is known that there are functional differences between the isoforms of some proteins, information on the function and expression dynamics of the isoforms of most proteins is limited. There are few studies on the importance of alternative transcription mechanisms in myeloid cells. Furthermore, no information has been found in the literature on which transcript variants encode the surface markers of human MDSCs in the differentiation, maturation, and activation steps.
Zusammenfassung der ErfindungSummary of the Invention
Im Rahmen der Erfindung werden zunächst Transkriptvarianten von Oberflächenmolekülen, von denen bekannt ist, dass sie auf der Oberfläche von gMDSC vorhanden sind, mittels Echtzeit-PCR-Methode gescreent, um Biomarker-Kandidaten mit einer Spezifität zu finden, die Oberflächenmoleküle mit Konsistenz- oder Zuverlässigkeitsproblemen ersetzen können, die häufig zur Bestimmung von MDSCs verwendet werden.In the context of the invention, transcript variants of surface molecules known to be present on the surface of gMDSC are first screened using a real-time PCR method in order to find biomarker candidates with a specificity that surface molecules with consistency or reliability problems can replace, which are often used to determine MDSCs.
Es wurde gezeigt, dass Protein-Isoformen, die von Transkriptvarianten kodiert werden, die sich von den untersuchten Varianten unterscheiden, als neue und einzigartige Moleküle für die Überwachung und/oder das Targeting von MDSCs verwendet werden können. Mit der Erfindung wurde gezeigt, dass CDId tv2-, CD44 tv1- und CD44 tv2-Varianten Biomarker sein können, die spezifisch für eMDSC- und/oder mMDSC-Populationen sind, die innerhalb der Monozytenpopulation verteilt sind, während CD33 tv2-, CDId tv1-, CD16 tv1-, CD16 tv2- und CDI6 tv3-Transkriptvarianten Biomarker sein können, die spezifisch für gMDSC-Populationen sind.It has been shown that protein isoforms encoded by transcript variants distinct from the variants examined can be used as new and unique molecules for monitoring and/or targeting of MDSCs. With the invention it was shown that CDID tv2, CD44 tv1 and CD44 tv2 variants can be biomarkers specific for eMDSC and/or mMDSC populations distributed within the monocyte population, while CD33 tv2, CDID tv1 -, CD16 tv1, CD16 tv2 and CDI6 tv3 transcript variants may be biomarkers specific for gMDSC populations.
Die Verwendung von Isoform-Proteinen, die von Transkriptvarianten kodiert werden, die sich als spezifisch für MDSCs erweisen, als Oberflächenmarker wird es auch ermöglichen, neue Behandlungsansätze bei chronischen Entzündungen, Autoimmunkrankheiten und Krebs zu entwickeln.The use of isoform proteins encoded by transcript variants found to be specific for MDSCs as surface markers will also allow the development of new treatment approaches in chronic inflammation, autoimmune diseases and cancer.
Der größte Unterschied der Erfindung zu anderen Studien und Patenten ist, dass sichergestellt werden kann, dass die MDSC-Populationen durch einen variantenspezifischen Marker erkannt werden können. Die Erfindung basiert auf Variantenunterschieden von Markern, die spezifisch für MDSC-Zellen sind. Zur kurzen Erläuterung: Es gibt zum Beispiel 3 Transkriptvarianten des Gens A: A1, A2 und A3; diese 3 Varianten kodieren 3 Protein-Isoformen des A-Gens: AP1, AP2 und AP3; MDSC-Zellen enthalten die kodierten Proteine desselben Gens (AP1, AP2 und AP3 in unserem Beispiel) auf ihrer Oberfläche.The greatest difference between the invention and other studies and patents is that it can be ensured that the MDSC populations can be recognized by a variant-specific marker. The invention is based on variant differences of markers specific for MDSC cells. As a brief explanation: there are, for example, 3 transcript variants of gene A: A1, A2 and A3; these 3 variants encode 3 protein isoforms of the A gene: AP1, AP2 and AP3; MDSC cells contain the encoded proteins of the same gene (AP1, AP2 and AP3 in our example) on their surface.
Handelsübliche Antikörper erkennen alle Protein-Isoformen des A-Gens gleichzeitig, so dass die Proteine AP1, AP2 und APS in unserem Beispiel nicht getrennt gesehen werden können. Wenn AP1 in der MDSC-Population zu stark erhöht ist und AP3 in anderen Zellgruppen zu stark erhöht ist, können handelsübliche Antikörper dies nicht erkennen. Im Stand der Technik verfügbare Studien, die diese Unterscheidung nicht treffen, sind in der Lage, Zellen, bei denen es sich um MDSC-Populationen handeln könnte, nur durch strategische Ansätze zu trennen, indem sie alle Isoformen eines Proteins gleichermaßen berücksichtigen. Das erfindungsgemäße „Biomarker-Panel, das spezifisch für Myeloid-abgeleitete suppressive Zellen“ ist, kann jedoch MDSC-Populationen allein anhand von Oberflächenproteinen charakterisieren, die von spezifischen Transkriptvarianten kodiert werden.Commercially available antibodies recognize all protein isoforms of the A gene simultaneously, so the proteins AP1, AP2 and APS cannot be seen separately in our example. When AP1 is too elevated in the MDSC population and AP3 is too elevated in other cell groups, commercially available antibodies cannot detect it. Studies available in the prior art that do not make this distinction are able to separate cells that could be MDSC populations only by strategic approaches, by considering all isoforms of a protein equally. However, the "biomarker panel specific for myeloid-derived suppressive cells" according to the invention can characterize MDSC populations solely on the basis of surface proteins encoded by specific transcript variants.
Figurenlistecharacter list
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1 : Prozentualer Unterschied in der Expression von Transkriptvarianten bei kolorektalem Krebs (CRC) im Vergleich zu gesunden Probanden.1 : Percent difference in the expression of transcript variants in colorectal cancer (CRC) compared to healthy subjects. -
2 : Prozentualer Unterschied in der Expression von Transkriptvarianten bei Brustkrebs (BC) im Vergleich zu gesunden Probanden.2 : Percent difference in expression of transcript variants in breast cancer (BC) compared to healthy subjects. -
3 : Prozentualer Unterschied der Expression von Transkriptvarianten in der gMDSC-Population im Vergleich zu gesunden und kranken PMN-Populationen.3 : Percent difference in expression of transcript variants in the gMDSC population compared to healthy and diseased PMN populations. -
4 : Antigenitäts-Score-Tabellen von Protein-Kandidatenvarianten, die zur Bestimmung der gMDSC-Population verwendet werden können, ermittelt durch die Kolaskar- und Tongaonkar-Methoden.4 : Antigenicity score tables of candidate protein variants that can be used to determine the gMDSC population determined by the Kolaskar and Tongaonkar methods.
Elemente/Teile, die die Erfindung definierenElements/parts that define the invention
V1-7: VariantennummerierungV1-7: Variant numbering
Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed Description of the Invention
Mit der Erfindung werden die Exon-mRNA-Sequenzen und reifen mRNA-Sequenzen der Gensequenzen und Transkriptvarianten (tv) von insgesamt 45 Oberflächenmolekülen (CD33, CD14, CD16, CD1a, CD1d, CD44, EMR1(ADGRE1), PD-L1(CD274), CD40, LGALS3, IL-IR1, IL-4R, IL6ST, ITGA6, lTGAL(CD11a) TFRC(CD71), FLT1(VEGFR1), CEACAM21, CD66a(CEACAMI), CD43, CD32, IL-6R, ITGA4, ITGAM(CD11b), ITGAX(CD11c), ITGAD(CD11d), CSFR1, CLEC10A(CD301), SELPLG(CD162), CD66d(CEACAM3), CD1b, CD1c, CD15, CD32, CD62L, CD13, CD66b5 C5AR1, VEGFR2, CD2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA5, und CD31), die nachweislich von MDSCs in verschiedenen Studien transportiert werden, anhand von Referenz-Nukleotidsequenzen bestimmt, die im National Center for Biotechnology Information (NCBI) der Vereinigten Staaten von Amerika - GenBank und Nucleotide; und ENSEMBL (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Sanger Institute) registriert sind.With the invention, the exon mRNA sequences and mature mRNA sequences of the gene sequences and transcript variants (tv) of a total of 45 surface molecules (CD33, CD14, CD16, CD1a, CD1d, CD44, EMR1(ADGRE1), PD-L1(CD274) , CD40, LGALS3, IL-IR1, IL-4R, IL6ST, ITGA6, lTGAL(CD11a) TFRC(CD71), FLT1(VEGFR1), CEACAM21, CD66a(CEACAMI), CD43, CD32, IL-6R, ITGA4, ITGAM( CD11b), ITGAX(CD11c), ITGAD(CD11d), CSFR1, CLEC10A(CD301), SELPLG(CD162), CD66d(CEACAM3), CD1b, CD1c, CD15, CD32, CD62L, CD13, CD66b5 C5AR1, VEGFR2, CD2, ITGA1 , ITGA2, ITGA3, ITGA5, and CD31) shown to be transported by MDSCs in various studies, determined from reference nucleotide sequences maintained in the United States National Center for Biotechnology Information (NCBI) - GenBank and Nucleotide; and ENSEMBL (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Sanger Institute) are registered.
Da der Hauptzweck der Erfindung darin besteht, neue Zelloberflächenantigene zu identifizieren, die von Transkriptvarianten zur Identifizierung von MDSCs kodiert werden können, wird es als vorrangiges Kriterium angesehen, dass sich die relevanten Transkriptvarianten in der extrazellulären Region des Proteins unterscheiden.Since the main purpose of the invention is to identify new cell surface antigens that can be encoded by transcript variants for identification of MDSCs, it is considered the overriding criterion that the relevant transcript variants differ in the extracellular region of the protein.
Für das Primerdesign werden die Online-Tools Primer-BLAST (NCBI), OligoAnalyzer (Integrated DNA Technologies, USA) und Offline FastPCR (Primer Digital, Finnland) verwendet. Das Online-Tool Clustal Omega (The European Bioinformatics Institute, UK) wird für die Analyse von Sequenzvarianten verwendet. Der Design-Algorithmus für das Design von Primern, die spezifisch für Varianten sind, kann wie folgt verwendet werden:
- i. Wenigstens einer der Primer befindet sich an der Exon-Exon-Kreuzung,
- ii. Wenigstens 7 bp des 5'-Endes und wenigstens 4 bp des 3'-Endes des Primers, der an die Exon-Exon-Kreuzung angehängt werden soll, befinden sich auf den beiden Exons an der Kreuzung,
- iii. Die Primerlänge liegt zwischen 18 bis 22 bp,
- iv. Die Schmelztemperatur (Tm) des Primers liegt im Bereich von 57 bis 63 °C und die Schmelztemperaturdifferenz des Primerpaares beträgt höchstens 3 °C,
- v. Der GC-Anteil im Primer liegt
im Bereich von 40bis 60 %, - vi. Es werden keine Sekundärstrukturen wie Haarnadel, Selbst-Dimer und Kreuz-Dimer gebildet,
- vii. Dinukleotid-Wiederholungen und gleiche Nukleotid-Wiederholungen kommen höchstens viermal vor,
- iix. Das 3'-Ende des Primers ist stabil und verursacht keine unspezifische Bindung,
- ix. Die Amplikonlänge liegt im Bereich von 70 bis 1000 (optimal 500 bp),
- x. Die Primer-Oligonukleotidsequenz bindet an den kodierenden Teil des Exons.
- xi. Primer binden nicht an genomische DNA,
- i. At least one of the primers is at the exon-exon junction,
- ii. At least 7 bp of the 5' end and at least 4 bp of the 3' end of the primer to be appended to the exon-exon junction is on the two exons at the junction,
- iii. The primer length is between 18 to 22 bp,
- IV. The melting temperature (Tm) of the primer is in the range of 57 to 63 °C and the melting temperature difference of the primer pair is at most 3 °C,
- v. The GC content in the primer is in the range of 40 to 60%,
- vi. Secondary structures such as hairpin, self-dimer and cross-dimer are not formed,
- vii. Dinucleotide repeats and same nucleotide repeats occur at most four times,
- iix. The 3' end of the primer is stable and does not cause non-specific binding,
- ix. The amplicon length is in the range of 70 to 1000 (optimal 500 bp),
- x. The primer oligonucleotide sequence binds to the coding part of the exon.
- xi. Primers do not bind to genomic DNA,
Als Ergebnis der Analysen wurde festgestellt, dass 17 der 48 Gene keine Transkriptdiversität aufweisen (mit einer einzigen kodierenden mRNA), und diese Gene wurden von den Zielen ausgeschlossen. Das CDIe-Gen wurde aus der Analyse ausgeschlossen, da es nur selten auf der Zelloberfläche zu finden ist und sich normalerweise in intrazellulären Organellen befindet. Primer-Oligonukleotidpaare wurden entwickelt, um 108 verschiedene Varianten der verbleibenden 31 MDSC-verwandten Gene zu unterscheiden. Ihre Sequenzen, Produktlängen (Größe) und GenBank-Referenznummern sind in Tabelle 1 aufgeführt.As a result of the analyses, 17 of the 48 genes were found to lack transcript diversity (having a single coding mRNA), and these genes were excluded from the targets. The CDIE gene was excluded from the analysis because it is rarely found on the cell surface and is usually located in intracellular organelles. Primer-oligonucleotide pairs were designed to distinguish 108 different variants of the remaining 31 MDSC-related genes. Their sequences, product lengths (size), and GenBank reference numbers are listed in Table 1.
Die optimalen Reaktionsbedingungen für die Oligonukleotidpaare werden durch konventionelle PCR bestimmt. 5 der mit konventioneller PCR optimierten Varianten konnten nicht vollständig untersucht werden, da keine positiven Kontrollproben (Hoden, Gehirn, Bauchspeicheldrüse und embryonales Gewebe usw.) vorhanden waren. Es handelt sich um ITGAL tv2, LGALS3 tv3, ITGA6tv2, ILIRI tv3 und CD16 tv5.The optimal reaction conditions for the oligonucleotide pairs are determined by conventional PCR. 5 of the variants optimized with conventional PCR could not be fully investigated due to the lack of positive control samples (testis, brain, pancreas and embryonic tissue, etc.). They are ITGAL tv2, LGALS3 tv3, ITGA6tv2, ILIRI tv3 and CD16 tv5.
Im Rahmen der Erfindung werden 70 Transkripte von 19 Genen ausgewertet, die sich vor allem in ihren Sequenzen unterscheiden, die für extrazelluläre Proteinbereiche kodieren. Diese 70 Transkripte, die sich in der extrazellulären Proteinregion unterscheiden, werden mit konventioneller PCR-Analyse unter Verwendung von cDNA-Mustern getestet, die aus der gesamten myeloischen Zellpopulation stammen, die von Dickdarmkrebspatienten und gesunden Personen isoliert wurde. Die erhaltenen PCR-Produkte werden durch Gelelektrophorese dargestellt.In the context of the invention, 70 transcripts of 19 genes are evaluated, which differ primarily in their sequences that code for extracellular protein regions. These 70 transcripts that differing in the extracellular protein region are tested by conventional PCR analysis using cDNA samples derived from the total myeloid cell population isolated from colon cancer patients and healthy subjects. The resulting PCR products are visualized by gel electrophoresis.
Varianten, die in beiden Gruppen nicht oder nur in sehr geringem Maße exprimiert werden, wurden aus dem erfindungsgemäßen Panel ausgeschlossen, indem Varianten analysiert wurden, die aus den Transkriptpools der gesamten myeloischen Zellpopulation von Darmkrebspatienten und gesunden Probanden gewonnen wurden.Variants that are not expressed or only expressed to a very low extent in both groups were excluded from the panel according to the invention by analyzing variants obtained from the transcript pools of the entire myeloid cell population of colorectal cancer patients and healthy subjects.
Für 47 Transkriptvarianten (D40 tv1, tv2, tv3; CD44 tv1, tv2, tv3, tv4, tv5, tv6, tv7 ve tv8; CD274 tv1, tv2, tv4; ADGRE1 tv2 ve tv5; CD1D tv1 ve tv2; ILIRI tv1, tv2, tv6, tv7, tv8 ve v9; IL4R tv1, tv4 ve tv5; TFRC tv2; CEACAMI(CD66a) tv1, tv2, tv4 ve tv6; CEACAM21 tv1, tv2 ve tv4; FLT1 tv2 ve tv4; IL6ST tv1, tv2 ve tv3; ITGAL tv1, CD16 tv1, tv2, tv3, tv4; CD33 tv2 und tv3), die sich sowohl in ihren Sequenzen, die für extrazelluläre Proteinregionen kodieren, als auch in ihren Expressionsniveaus von gesunden Probanden auf der Grundlage konventioneller PCR-Daten unterscheiden, werden Vergleiche mit der Echtzeit-PCR durchgeführt (
25 (CD16 tv1, tv2, tv3, tv4; CDId tv1, tv2; CD33 tv2; CD40 tv2, tv3; CD44 tv1, tv2, tv6, tv7, tv8; CE AC AM 1 (CD66a) tv4, tv6; CEACAM21 tv1, tv2, tv4; FLT1 tv2, tv4; IL1R1 tv6; IL6ST tv2, ADGREI tv5; und IL4R tv4) der 47 Transkriptvarianten, die sich in den Darmkrebs- und Gesundentrankriptpool unterscheiden, werden durch Echtzeit-PCR mit cDNA aus den gesamten Monozyten- und PMN-Zellpopulationen von Brustkrebs ausgewertet (
In der ersten Phase wurden angesichts der Daten, die von Brustkrebspatientinnen nach kolorektalem Krebs gewonnen wurden, die Transkriptvarianten CD 16 tv1, tv2, tv3, tv4, CDId tv1, tv2 und CD33 tv2 in gMDSC-Populationen untersucht. In diesem Stadium wurde die gMDSC-Population, die aus Brust- und Darmkrebspatienten gereinigt wurde und deren suppressive Zelleigenschaften durch funktionelle Experimente bestätigt wurden, auf die genannten 7 Varianten getestet (
Die Analyse und die grafischen Ergebnisse in den Figuren zeigen, dass die Varianten CD33 tv2, CDId tv1, CD16 tv1, CD16 tv2 und CD16 tv3 in der gMDSC-Population im Vergleich zu den PMN-Zellen des Patienten auf Transkriptionsebene niedriger sind. Von diesen Varianten waren CD33 tv2 und CDId tv1 in der gMDSC-Population auf Transkriptniveau höher, während die Varianten CD16 tv1, CD16 tv2 und CD16 tv3 im Vergleich zu gesunden Probanden auf einem niedrigeren Niveau lagen.The analysis and the graphical results in the figures show that the variants CD33 tv2, CDID tv1, CD16 tv1, CD16 tv2 and CD16 tv3 are lower in the gMDSC population compared to the patient's PMN cells at the transcription level. Of these variants, CD33 tv2 and CDID tv1 were higher at transcript level in the gMDSC population, while variants CD16 tv1, CD16 tv2, and CD16 tv3 were at lower levels compared to healthy subjects.
Wenn das Äquivalent der auf der Transkriptebene ermittelten Unterschiede auf der Proteinebene mit Hilfe von Bioinformatik-Tools analysiert wird, unterscheiden sich CD33 tv2-Protein 12-19, CD16 tv1- und tv2-Protein 117, CD16 tv3-Protein 20-21, CDId tv1-Protein 203-295 in den Aminosäurepositionen. CD 33 tv2-Protein 12-19, CD16 tv1 und tv2 1-17, CD16 tv3-Protein 20-21, CD1d tv1-Protein unterscheiden sich in den Aminosäuresequenzen an den Positionen 203-295.When the equivalent of the differences found at the transcript level is analyzed at the protein level using bioinformatics tools, CD33 tv2 protein 12-19, CD16 tv1 and tv2 protein 117, CD16 tv3 protein 20-21, CDID tv1 differ -protein 203-295 in amino acid positions. CD33 tv2 protein 12-19, CD16 tv1 and tv2 1-17, CD16 tv3 protein 20-21, CD1d tv1 protein differ in amino acid sequences at positions 203-295.
Wenn die Antigenanalysen der genannten Proteinvarianten durchgeführt werden, werden Peptidsequenzen bestimmt, die eine Antigenität an verschiedenen Positionen der CD33 tv2-, CDId tv1-, CD 16 tv1- und CD 16 tv2-Protein zeigen (
Es wird festgestellt, dass durch die Translation der CD16 tv1- und tv2-Varianten das gleiche Protein erhalten wird, der Unterschied zwischen den Varianten ist auf die 5'UTR zurückzuführen und die Peptidregion, die Antigenität zeigt, befindet sich in der Signalsequenz. Das CDId tv1-Protein hat eine Peptidregion von 93 Aminosäuren und Aminosäuresequenzen, die eine hohe Antigenität in dieser Region zeigen, was das CDId tv1-Protein zum stärksten Kandidaten für die Charakterisierung von gMDSC macht.It is noted that the same protein is obtained by translation of the CD16 tv1 and tv2 variants, the difference between the variants is due to the 5'UTR and the peptide region showing antigenicity is in the signal sequence. The CDId tv1 protein has a peptide region of 93 amino acids and amino acid sequences that show high antigenicity in this region, making the CDId tv1 protein the strongest candidate for characterizing gMDSC.
Andererseits hat das CD33 tv2-Protein eine Region von 4 Aminosäuren, von denen ein Teil in der Signalsequenzregion verbleibt, die sich aber in der N-Terminus-Region nach dem Abschneiden der Signalsequenz befindet und Antigenität aufweist und für die Entwicklung von Antikörpern sehr schwierig zu verwenden ist.On the other hand, the CD33 tv2 protein has a region of 4 amino acids, part of which remains in the signal sequence region, but which is located in the N-terminal region after the signal sequence is cut off and has antigenicity and is very difficult for the development of antibodies use is.
Es scheint, dass die extrazelluläre Region der CD33 tv1- und CD33 tv3-Proteine zum Nachweis des CD33 tv2-Proteins auf der Zelloberfläche verwendet werden kann. Da die extrazelluläre Region der CD33 tv1- und CD33 tv3-Proteine viel länger ist, haben diese Proteine extrazelluläre Peptidregionen, die im CD33 tv2-Protein nicht vorhanden sind. Durch die Entwicklung von Antikörpern, die alle CD33-Proteinvarianten (tv1, tv2, tv3) und die CD33 tv1- und CD33 tv3-Proteine erkennen, wird es daher möglich sein, Zellen zu erkennen, die die CD33 tv2-Proteinvariante tragen.It appears that the extracellular region of the CD33 tv1 and CD33 tv3 proteins can be used to detect the CD33 tv2 protein on the cell surface. Because the extracellular region of the CD33 tv1 and CD33 tv3 proteins is much longer, these proteins have extracellular peptide regions that are not present in the CD33 tv2 protein. Therefore, by developing antibodies that recognize all CD33 protein variants (tv1, tv2, tv3) and the CD33 tv1 and CD33 tv3 proteins, it will be possible to recognize cells carrying the CD33 tv2 protein variant.
Die COST BM1404-Aktion kann keine ausreichenden Informationen und technische Unterstützung für mMDSC- und eMDSC-Populationen liefern, daher können gMDSC-Populationen innerhalb der gesamten Monozyten bewertet werden. Im Rahmen der Erfindung wurde durch den Vergleich der gesamten Monozyten-Transkripte von gesunden Probanden mit den gesamten Monozyten-Transkripten von Brustkrebs- und Darmkrebspatienten gezeigt, dass die Varianten CDId tv2, CD44 tv1 und CD44 tv2 spezifische Biomarker für eMDSC- und/oder mMDSC-Populationen sein können, die in der Monozytenpopulation verteilt sind.The COST BM1404 Action cannot provide sufficient information and technical support for mMDSC and eMDSC populations, therefore gMDSC populations can be assessed within whole monocytes. Within the scope of the invention, it was shown by comparing the total monocyte transcripts from healthy volunteers with the total monocyte transcripts from breast cancer and colon cancer patients that the variants CDID tv2, CD44 tv1 and CD44 tv2 are specific biomarkers for eMDSC and/or mMDSC Populations distributed in the monocyte population.
Ein weiterer Beleg für dieses Ergebnis ist die Spiegelung der eMDSC- und mMDSC-Populationen in der gesamten Monozytenpopulation in funktionellen Experimenten. Es wird beobachtet, dass die Kapazität zur Produktion von Stickstoffmonoxid zunimmt und die Expression von Arginase, Cyclooxygenase und Inhibitormolekülen in der gesamten Monozytenpopulation von Patienten im Vergleich zu gesunden Personen höher ist. Infolgedessen können mit der Erfindung Protein-Isoformen, die von den folgenden kodiert werden, zum Nachweis von MDSC-Populationen verwendet werden
- • als spezifische Biomarker für eMDSC- und/oder mMDSC-Populationen CDId tv2, CD44 tv1 und CD44 tv2 Varianten,
- • als Biomarker spezifisch für gMDSC-Populationen CD33 tv2, CDId tv1, CD16 tv1, CD16 tv2 und CD16 tv3 Transkriptvarianten.
- • as specific biomarkers for eMDSC and/or mMDSC populations CDID tv2, CD44 tv1 and CD44 tv2 variants,
- • as a biomarker specific for gMDSC populations CD33 tv2, CDID tv1, CD16 tv1, CD16 tv2 and CD16 tv3 transcript variants.
SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG
- <110> Hacettepe Universitesi<110> Hacettepe Universitesi
- <120> FÜR MYEOLID-ABGELEITTETE SUPPRESIVE ZELLEN SPEZIFISCHES BIOMARKER-PANEL<120> BIOMARKER PANEL SPECIFIC TO MYEOLID-DERIVED SUPPRESIVE CELLS
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