DE112004002170T5 - Verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen für RNA Interferenz - Google Patents

Verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen für RNA Interferenz Download PDF

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Abstract

Verfahren zum Schwächen der Expression einer Zielnukleotidsequenz in einer eukaryotischen Zelle, wobei dieses Verfahren umfasst:
Einführen doppelsträngiger RNA (dsRNA) in die eukaryotischen Zelle, um die Expression der Zielnukleotidsequenz zu schwächen;
worin die dsRNA eine Nukleotidsequenz umfasst, die unter stringenten Bedingungen an die Zielnukleotidsequenz hybridisiert; und
worin diese dsRNA von einem Vektor exprimiert wird, der einen oder mehrere Transkriptionsterminatoren enthält.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Technisches Gebiet: Die Erfindung bezieht sich auf Wege zum Verbessern der Effizienz von doppelsträngiger RNA- („dsRNA"-) Inhibition als ein Verfahren, Genexpressionen in Eukaryoten zu inhibieren. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf das Hinzufügen von Terminatorsequenzen zu den Vektoren, die verwendet werden, um dsRNA zu exprimieren, um die Inhibition von Genexpression durch dsRNA zu steigern.
  • HINTERGRUND
  • Die mittleren 1980er präsentierten einen möglichen neuen Weg für den therapeutischen Eingriff mit der Entdeckung von Antisense-Technologien (Gegensinntechnologien), wo Ziel-mRNA-Transkripte in einer sequenzspezifischen Weise an homologe RNA, DNA oder chemisch geänderte Nukleinsäuren hybridisieren, wodurch ihre Expression posttranskriptionell inhibiert wird (Dean, N.M., Functional genomics and target validation approaches using antisense oligonucleotide technology, 12 Curr. Opin. Biotechno. 622 (2001)). In der Theorie könnte diese Art Ansatz selektiv jedes Genprodukt, bevor es translatiert wurde, dämpfen („silence") und wurde deshalb mit großem Enthusiasmus betrachtet. Anders als klassische kleine Moleküle haben jedoch Antisense-Nukleinsäuren Molekulargewichte von mehr als 1000 Dalton (Da), was in signifikanten Zufuhrproblemen resultiert.
  • In den frühen 1990ern wurden Nukleinsäuremoleküle verwendet, um direkt die Transkriptionsregulation der Genexpression zum Ziel zu nehmen. „Triplex" erzeugende Reagenzien öffneten das Fenster für Forscher, den Transkriptionsprozess selber durch Einführen eines Nukleinsäuremoleküls zu hemmen, welches an eine spezifische DNA-Sequenz innerhalb einer Zelle hybridisiert, um die zelluläre Maschinerie davon abzuhalten,dabei zu wirken, die Gentranskription zu starten oder zu verlängern (Casey, BP. und P.M. Glazer, Gene targeting via triple-helix formation, 67 Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 192 (2001)). Ähnlich wie Antisense haben jedoch Zufuhrangelegenheiten und vorübergehende inhibitorische Wirkungen den Erfolg dieser Strategie begrenzt.
  • Doppelsträngige RNA-Verfahren des Inhibierens der Genexpression, genannt z.B. RNA-Indifferenz („RNAi"), RNA-Silencing, posttranskriptionales Gen-Silencing und Quelling (-Unterdrückung) (US-Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 2003/0084471 A1), werden als wesentlich effektiver erachtet als das einzelne Bereitstellen eines RNA-Strangs, wie vorgeschlagen bei der Antisense-Technologie. RNAi ist ein angeborener zellulärer Vorgang, der aktiviert wird, wenn ein dsRNA-Molekül mit mehr als 19 Duplexnukleotiden in die Zelle eindringt, wodurch Abbau nicht nur des eindringenden dsRNA-Moleküls bewirkt wird, sondern auch von einzelsträngiger RNA mit identischen Sequenzen, einschließlich endogener mRNA.
  • RNAi-Verfahren sind auf Nukleinsäure-Technologie basiert; anders als Antisense- und Triplexansätze, aktiviert die dsRNA jedoch einen normalen zellulären Vorgang, der zu einem hochspezifischen RNA-Abbau und zu einer Verbreitung dieses Gen-Silencing-Effektes von Zelle zu Zelle führt. Die Injektion von zum Beispiel dsRNA wirkt systemisch, um posttranskriptionelle Abreicherung der homologen endogenen RNA in Caenorhabditis elegans zu bewirken (Fire et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, 391 Nature 806 (1998); Montgomery et al., RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans, 95 Proc. Natl. Acad. Sci. 15502 (1998)). Diese Abreicherung endogener RNA bewirkt Wirkungen, ähnlich wie ein konditioneller Gen-„Knock-out", was den durch das Fehlen einer bestimmten Genfunktion verursachten Phänotypen enthüllt.
  • Planarien sind bilateral symmetrische Metazoen, bekannt für ihre regenerativen Fähigkeiten, ausgedehnten Gewebeumsatz (Gewebeerneuerung) und -regulation als Teil ihrer normalen Homöostase und die Anwesenheit einer pluriptenten adulten Stammzellpopulation, bekannt als die Neoblasten. Diese herausragenden Eigenschaften der normalen Planarienbiologie beziehen sich auf klassische Probleme der Entwicklungsbiologie und In-vivo-Stammzellregulation, die in anderen untersuchten Organismen nicht leicht untersucht werden können1,2.
  • Unter der Annahme, dass diese Probleme schlecht verstanden sind und von Wichtigkeit für das Leben der meisten Metazoen sind, wurde eine Strategie erdacht, um ihre genetische Regulation bei der Planarie Schmidtea mediterranea zu enthüllen. Wie kann die Funktion von Genen, die die Planarienbiologie regulieren, erkundet werden? Ein Ansatz, der zentral war beim Verstehen der Biologie von mehreren Metazoen, einschließlich Drosophila melanogaster3, Caenorhabditis elegans4 und Danio rerio5,6, schließt funktionelle genetische Prüfungen in großem Maßstab ein. Solch ein Ansatz wurde durch die Lebenszyklen von Planarien ausgeschlossen. Die Entwicklung von dsRNA-vermittelter genetischer Interferenz (RNAi)7 und die Anwendung von RNAi auf systematische Studien der Genfunktion8–10 öffneten die Tür für eine neue Generation genetischer Manipulationen. Es wurden 1065 Gene ausgewählt mit einer Absicht, dass diese eine Musterkollektion des Genoms der Planarie S. mediterranea darstellen, und es wurde eine RNAi-basierte Screeningstrategie in großem Maßstab entwickelt, um systematisch ihre Expression zu unterbrechen und ihre Funktion in der Planarienbiologie zu bewerten. Dieses Screening ist das erste seiner Art und definiert die Hauptphänotypkategorien, die in Planarien nach Genstörung existieren.
  • RNAi unter Verwendung von durch Vektoren erzeugte dsRNA, die gegenwärtig in der Technik bekannt sind, kann jedoch nur schwach eine Phänotypenexpression auslösen oder kann darin resultieren, dass nur einige der gegenständlichen Organismen den erwarteten Phänotypen exprimieren.
  • Die Erfindung kann zum Beispiel verwendet werden, um effiziente dsRNA-Produktion bereitzustellen, die Stärke der Phänotypenexpression zu und die Anzahl von Individuen, die einen Zielphänotypen exprimieren, verbessern, und die Produktion von dsRNA-produzierenden Plasmiden für eine große Anzahl von Genen zu rationalisieren. Die Erfindung ist unter anderem nützlich als ein Forschungswerkzeug und für Therapien von Erkrankung, einschließlich Reduktion oder Inhibition von fehlerhaften Transkripten und Translationsprodukten, die aus chromosomalen Translokationen, Deletionen und anderen Mutationen resultieren, und Inhibition von viralen Produkten wie das HIV-Genom oder spezifischen Produkten wie RCV. Die Erfindung ist in allen Organismen nützlichen, in welchen RNAi wirksam ist. Die Erfindung ist auch nützlich in allen Anwendungen, die RNAi nutzen. Zusätzlich ist die Erfindung nützlich in allen Geschäftspraktiken, die RNAi ausnutzen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zum Abschwächen der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle. Dieses Verfahren involviert das Einführen von dsRNA in die Zelle in einer Menge, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen, wobei die dsRNA eine Nukleotidsequenz einschließt, welche unter stringenten Bedingungen an eine Nukleotidsequenz des Zielgens hybridisiert, und wobei die dsRNA von einem Vektor exprimiert wird, der einen oder mehrere Transkriptionsregulatoren enthält, was einen oder mehrere Transkriptionsterminatoren einschließt.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Abschwächen der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle. Dieses Verfahren involviert das Einführen eines Expressionsvektors mit wenigstens einer Nukleotidsequenz in die Zelle, welche mit dem Zielgen ähnlich ist, welcher, wenn er transkribiert wird, dsRNA in einer Menge produziert, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren des Abschwächens der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle. Das Verfahren schließt das Einführen eines Expressionsvektors mit zwei Promotoren in die Zelle ein, welche an entgegengesetzten Strängen der Nukleinsäureduplex positioniert sind, so dass die Promotoren nach der Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren in der Lage sind, die Transkription einer Zielnukleotidsequenz zu starten, die zwischen die Promotoren kloniert ist, um dsRNA in einer Menge zu erzeugen, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren des Abschwächens der Expression eines Zielgens in einer Zelle. Dieses Verfahren involviert das Einführen einer Haarnadelnukleinsäure (Hairpin-Nukleinsäure) in die Zelle in einer Menge, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen, worin die Haarnadelnukleinsäure eine invertierte Wiederholung einer Nukleotidsequenz einschließt, welche unter stringenten Bedingungen an eine Nukleotidsequenz des Zielgens hybridisiert. Bei diesen und allen Aspekten der vorliegenden Erfindung, die eine Haarnadelnukleinsäure einschließen, kann die Haarnadelnukleinsäure ohne Beschränkung RNA sein.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Haarnadelnukleinsäure zum Inhibieren der Expression eines Zielgens. Diese Haarnadelnukleinsäure hat eine erste Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleotidsequenz des Zielgens hybridisiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die eine komplementäre invertierte Wiederholung der ersten Nukleotidsequenz ist und die an die erste Nukleotidsequenz hybridisiert, um eine Haarnadelstruktur zu bilden.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen, die verantwortlich sind für das Verleihen eines bestimmten Phänotyps in einer Zelle. Dieses Verfahren involviert das Konstruieren einer Bibliothek aus Nukleinsäuresequenzen aus einer Zelle in einer Orientierung im Verhältnis zu wenigstens einem Promotor, um dsRNA zu erzeugen; das Einführen der dsRNA-Bibliothek in die Zielzelle; das Identifizieren von Mitgliedern der Bibliothek, die der Zelle einen bestimmten Phänotypen verleihen; und das Identifizieren der Nukleotidsequenz der Zelle, welche dem Bibliotheksmitglied entspricht, die den bestimmten Phänotyp verleiht.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen eines Arzneimittelentdeckungsgeschäftes. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren eines Zielgens durch den gegenständlichen Test, welches eine phänotypisch wünschenswerte Reaktion bereitstellt, wenn es durch RNAi inhibiert wird; das Identifizieren von Mitteln durch ihre Fähigkeit, die Expression des Zielgens oder die Aktivität eines Expressionsproduktes des Zielgens zu inhibieren; das Durchführen von therapeutischer Profilierung von Mitteln, die in dem unmittelbar vorangegangenen Schritt identifiziert worden sind, oder von weiteren Analogon davon für die Wirksamkeit und Toxizität in Zellen; und das Formulieren einer pharmazeutischen Zubereitung, die ein oder mehrere Mittel einschließt, welche in dem unmittelbar vorangegangenen Schritt als ein annehmbares therapeutisches Profil aufweisend identifiziert worden sind.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen eines Zielgenentdeckungsgeschäftes. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren eines Zielgens durch den gegenständlichen Test, das eine phänotypisch wünschenswerte Reaktion bereitstellt, wenn es durch RNAi inhibiert wird; wahlweise Durchführen von therapeutischer Profilierung des Zielgens für Wirksamkeit und Toxizität in Zellen; wahlweise Lizenzieren der Rechte für die weitere Arzneimittelentwicklung von Inhibitoren des Zielgens an eine dritte Partei; und Entwicklung eines Arzneimittels, um die Expression des Zielgens zu inhibieren.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf transgene Eukaryoten, die ein Transgen einschließen, welches ein dsRNA-Konstrukt kodiert.
  • Ein anderer Aspekt bezieht sich auf eine dsRNA zum Inhibieren der Expression eines eukaryotischen Gens. Diese dsRNA schließt eine erste Nukleotidsequenz ein, die unter stringenten Bedingungen an eine zweite Nukleotidsequenz hybridisiert, welche zu der ersten Nukleotidsequenz komplementär ist.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verminderung des Schädlingsbefalls von Pflanzen. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren einer DNA-Sequenz des Schädlings, die für das Überleben, Wachstum, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings kritisch ist; das Klonieren der Sequenz oder eines Fragmentes davon in einen Vektor, der in der Lage ist, die Sequenz und ihr Komplement zu transkribieren, um dsRNA zu erzeugen; und Einführen des Vektors in die Pflanze unter Bedingungen, die wirksam sind, den Schädlingsbefall zu vermindern.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein therapeutisches Verfahren zur Verminderung von Parasitenbefall (z.B. Helminthe) von Tieren oder Menschen. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren einer DNA-Sequenz des parasitischen Schädlings, die kritisch ist für das Überleben, Wachstum, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings; Klonieren der Sequenz oder eines Fragmentes davon in einen Vektor, der in der Lage ist, die Sequenz und ihr Komplement zu transkribieren, um dsRNA zu erzeugen; und Einführen des Vektors in das Tier oder den Menschen unter Bedingungen, die wirksam sind, den Schädlingsbefall zu vermindern. Zum Beispiel wird ein Verfahren zur Verminderung von parasitischen Helminthe-Infektionen in Menschen und Tieren bereitgestellt. Bei diesem Beispiel kann eine DNA-Sequenz, die kritisch ist für das Überleben, Wachstum, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings, die vorzugsweise nicht in dem Genom von zu behandelnden Menschen oder Tieren gefunden wird, in einen Vektor kloniert werden, der in der Lage ist, die Sequenz und ihr Komplement zu transkribieren, um dsRNA zu erzeugen, und kann in die infizierten Wirte unter Bedingungen eingeführt werden, die wirksam sind, den Schädlingsbefall zu vermindern.
  • Die Erfindung bezieht sich noch weiter auf ein Verfahren zur Behandlung eines Subjektes, entweder Pflanze oder Tier, das durch parasitische Schädlinge (z.B. Helminthe) infiziert ist. Worin die Infektion eines Subjektes durch Helminthe gemäß der Erfindung reduziert wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf das Plasmid, das identifiziert ist als pDONRdT7. In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Bibliothek aus RNAi-Eingangsklonen (RNAi-Entry-Klonen), die aus einer eukaryotischen Zelle wie einer Planarie stammen, und weiter auf Verfahren zum Screenen mit der Bibliothek.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Expressionsvektor. Dieser Vektor schließt einen oder mehrere Promotoren ein, die im Verhältnis zu einer Polynukleotidsequenz, zum Beispiel ein DNA-Molekül, orientiert sind, so dass die Promotoren in der Lage sind, die Transkription der Polynukleotidsequenz von Interesse zu starten, worin wenigstens eine Transkriptionsterminatorsequenz 3' der Polynukleotidsequenz von Interesse lokalisiert ist, um dsRNA zu erzeugen. Wenn das Komplement einer Terminationssequenz auch als eine Terminatorsequenz funktioniert, ist es notwendig, die Terminationssequenz 5' des Promotors zu platzieren, wie definiert auf dem komplementären Strang.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Ändern der Genexpression in einer undifferenzierten Stammzelle oder den differenzierten Nachfahren davon. Dieses Verfahren involviert das Einführen von einer oder mehreren dsRNA in die Zelle gemäß der Erfindung unter Bedingungen, die wirksam sind, die Genexpression in der Zelle zu ändern.
  • In noch einer zusätzlichen Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Identifizieren einer Funktion in einem Gen in einer Planarie. Das Verfahren involviert das Produzieren einer Genbibliothek in einer bakteriellen Zellpopulation, das Füttern der bakteriellen Zellpopulation an die Planarie und das Beobachten einer Änderung in einem Phänotypen oder Verhalten (z.B. Änderungen auf zellulärem Niveau). Die Identität des Gens, das die Änderung in dem Phänotypen oder die Änderung auf dem zellulären Niveau erzeugt, kann bestimmt oder sequenziert werden.
  • Folglich ist die gegenwärtige Erfindung in noch einer anderen Ausführung auf Nukleinsäuren oder Sequenzen gerichtet, die mit dem Verfahren zum Identifizieren der Funktion des Gens der gegenwärtigen Erfindung identifiziert worden sind.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Screening für Verbindungen, die in die Pathogenese einer Zelle verwickelt sind. Das Verfahren schließt das Aussetzen der Zelle an Stress, wie eine Infektion, und Ändern der Genexpression in der Zelle unter Verwendung von RNAi ein. Die Zelle wird im Hinblick auf Veränderungen im Phänotypen oder eine Änderung auf dem Zellniveau in Antwort auf den Stress beobachtet.
  • Die Erfindung kann unter anderem in sämtlichen Anwendungen verwendet werden, die RNAi nutzen, einschließlich,jedoch nicht beschränkt auf Genomanalyse und Gen-Silencing-Therapien.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein schematisches Diagramm, das einen Überblick über den RNAi-Weg abbildet.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm, das die RNAi-Vektoren L4440 und pDONRdT7 zeigt.
  • 3A bis 3D: RNAi-Screeningstrategie in S. mediterranea. 3A: S.mediterranea-cDNA wurde in pDONRdT7 transferiert, enthaltend zwei T7-Promotoren und -Terminatoren, unter Verwendung einer einschrittigen Gateway- (Invitrogen) Reaktion (siehe Verfahren). 3B: RNAi-Screeningvorgehen involvierte das Exprimieren von dsRNA in Bakterien, das Vermischen von Bakterien mit einer künstlichen Futtermischung, das insgesamt dreimalige Füttern der Planarien, das zweimalige Amputieren der Planarien, zwei Regenerationsrunden und drei Auswertungen (siehe Beispiel 5). 3C: Tiere mit einem Phänotyp wurden mit αH3P (mitotische Neoblasten) und VC-1 (Photorezeptorneuronen) markiert. Tiere ohne Phänotyp wurden mit VC-1 markiert und für Phänotypen gescreent. 3D: 143 Gene, die Phänotypen nach RNAi und Amputation verliehen, wurden durch RNAi inhibiert. Gewebehomöostase wurde in einem Vorgang beobachtet, der fünf Fütterungen und Auswertungen für sechs Wochen einschloss. Anwesenheit und Fähigkeit, aus Neoblasten zu teilen, wurde beurteilt durch Amputation, Fixierung und Markierung mit αH3P (siehe Beispiele 5 und 6).
  • 4A bis 4J. Repräsentative Phänotypen aus dem RNAi-Screen. Phänotypnomenklatur und Homologien für repräsentative Gene können in Tabelle 4 gefunden werden. Weiße Pfeilspitzen zeigen die Defekte an. Anterior, links; v, ventrale Oberfläche. Strich, 0,2 mm. 4A: Kontrolle, unc-22-RNAi-Tier. Bestrahlen bei 6000 rad blockierte Regeneration (BLST(0), 8d) und bewirkte Kräuselung (CRL, 15d). Schwarze Pfeilspitze, Photorezeptor. P, pharynx. Klammern, Blastem (unpigmentiert). 4B: Reduzierte Regeneration, Kräuselung und kaudale Regenerationsdefekte. 4C: Zugespitzte, breite und eingekerbte Blasteme. 4D: Diffuse, blasse und asymmetrische Photorezeptoren. 4E: Regression der vorderen Spitze und zwischen den Photorezeptoren. 4F: Läsionen und Lyse. 4G: Aufgebläht und mit Blasen. 4H: Kleben und Strecken und Sanduhrgestalten. 4I: Flecken und Pigmentfleckchen. 4J: Wachstum und Beule.
  • 5A bis 5N: Zelluläre Analysen von Regenerationsanormalitäten. Anterior, links. 5B bis 5L: Repräsentative Defekte, beobachtet mit VC-1-Färbung. Pfeilspitzen, Anormalitäten. Strich, 0,1 mm. oc, optische Chiasmen. cb, Zellkörper. Die Schädelganglien von H.68.4a-RNAi-Tieren wurden auch mit α-Synaptotagmin markiert. Das Nomenklatursystem ist ähnlich wie jenes, das in Tabelle 3 und 5 verwendet wird. Phänotypische Begriffe: EXTNT, Photorezeptorregenerationsausmaß anormal. EXTNT-Deskriptoren: nopr, keine Markierung; ltd, begrenzt; sqish, leicht unterentwickelt. PRCELLS, Photorezeptorzellkörper anormal. Deskriptoren: wd, Photorezeptoren breit; difus, diffuses Clustering; asym, Asymmetrie; trs, Tränen, ektopische Neuronen posterior zu dem Cluster; ecto, ektopischer Photorezeptor. DISORG, Axondisorganisation. Kein Deskriptor passte, falls allgemein und/oder variabel.
  • Deskriptoren: straightoc, oc gerade; splitoc, Axons vermochten es nicht, die Mittellinie zu überqueren; fwdproj, Zellkörperprojektionen in Richtung der anterioren Spitze; ectoax, Extraprojektionen. 5M: Zusammenfassung der αH3P-Markierung von Tieren aus RNAi aus 140 Genen. 14d, 14 Tage. Strich, 1 mm. Bestrahlte Tiere erhielten 6000 rad. Kontroll-unc-22-RNAi-Tiere hatten einen Durchschnitt aus 212 ± 37 Zellen/mm Länge (von Photorezeptoren bis zum Schwanz). Defekte wurden kategorisiert als LOW(v), LOW, LOW(s), normal, HIGH(s), HIGH und HIGH(v) („v", sehr; „s", leicht). Die LOW(s)-Schwelle wird bei dem Kontrollmittelwert minus 2X Standardabweichung (sd) gesetzt. Dieser Absolutwert wurde in drei gleiche Bereiche aufgeteilt, um LOW und LOW(v) zu setzen. Dieselben Bereiche, hinzugefügt zu dem Mittelwert plus 2X sd, setzten die hohen Bereiche. Für jene innerhalb von 2X sd, aber sichtbar anormal, wurden Daten als signifikant erachtet, falls P < 0,01 (t-Test) war. 5N: Zusammenfassung der αH3P-Markierung von RNAi-Tieren, fixiert 16 oder 24 h nach der Amputation (siehe Text für Gendetails). Tiere wurden nach der ersten oder zweiten Amputation wie geeignet fixiert (3). Kontrolltiere wurden gefüttert oder gefastet, wie geeignet, und nach 16 h oder 24 h fixiert. Strich, 1 mm. Daten wurden, wie in 5M beschrieben, kategorisiert. Eine vollständige Tabelle der Ergebnisse kann in Tabelle 8 gefunden werden.
  • 6A bis G: Repräsentative Defekte in intakten Tieren nach RNAi. 6A bis G: Anterior, links. Pfeilspitzen, Defekte. v, ventral. Strich, 0,4 mm. Nomenklatur ähnlich wie Tabelle 4. Zusätzliche Phänotypenbegriffe: CONSTR, Konstriktion. Zusätzliche Deskriptoren und Modifikatoren: (i) Körperregionen: all, gesamtes Tier; hd, Kopf; hdside (hdsd), laterale Kante des Kopfes; ant, anteriore Hälfte oder das anteriore Ende einer Region; brn, Gehirn, posterior zu den Photorezeptoren; tl, Schwanz; int, Gastrovascularsystem. (ii) Läsionen: big, groß; many, mehrere; bli, mit Blasen; strp, Streifen. 6A: unc-22-RNAi-Tiere, Negativkontrolle. Bestrahlung bei 6000 rad bewirkte Geweberegression (8d) und Kräuselung (15d). 6B: Regression. 6C: Kräuselung. 6D: Läsionen mit Tumoren und mit Blasen. 6E: Läsionen und Lyse. 6F: Läsionen in dem Muster von Photorezeptorneuronen und Gastrovascularsystem. 6G: Läsionen an spezifischen Körperörtlichkeiten.
  • 7A bis E. Verteilung von RNAi-Phänotypen. 7A bis D: Jedes Quadrat stellt Beobachtungen aus der RNAi eines einzelnen Gens dar. Die Quadratörtlichkeit für ein gegebenes Gen ist in jeder Abbildung dieselbe. Y-Achse, Blastemgröße mit 3 = normal und 0 = keine Regeneration. X-Achse, Anzahl von mit αH3P markierten Zellen (beschrieben in 3). 7A: Farben stellen die Verteilung von Kräuselung nach Amputation dar. 7B: Farben stellen Defekte dar, die in intakten RNAi-Tieren gesehen werden. 7C: Farben stellen Regression und Kräuselungsdefekte dar, die in intakten RNAi-Tieren gesehen werden. 7D: Farben stellen Läsionsbildung in intakten RNAi-Tieren dar. 7E: Gruppen von Genen, die Profile von Defekten teilen, sind zusammengefasst. Gewisse Gene werden in mehreren Kategorien gefunden. LYS, Lyse. Reg, Regeneration (Blastembildung); „abort" zeigt an, dass zu kleines oder gar kein Blastem gebildet worden ist. CRL, Kräuselung. BLST, Blastem. VC-1, anormale Photorezeptorneuronen (siehe Text, Tabelle 7). PHX, Pharynxregeneration in Schwanzfragmenten. RGRS, Geweberegression. BHV, anormales Verhalten. H3P-Kategorisierung ist beschrieben in 3 und Tabelle S3. Für das Profil, in welchem Tiere CRL und/oder RGRS zeigen und normale Zahlen an αH3P-markierten Zellen haben, wurden jene Gene in Zusammenhang mit niedrigen Mitosezahlen 14 d nach der Regeneration ausgeschlossen. LES; Läsionen. Gene sind als neu kategorisiert, falls sie keine vorhergesagte Funktion haben. Gene werden als spezifisch charakterisiert, falls von ihnen vorhergesagt wird, dass sie Proteine kodieren, die in die Signaltransduktion Transkription, Zelladhäsion, neuronale Funktionen, Erkrankung, RNA-Bindung, Kanäle-/Transporterfunktion, Cytoskelettregulation involviert sind. Gene werden als basal charakterisiert, falls von ihnen vorhergesagt wird, dass sie Proteine kodieren, die verwickelt sind in Translation, Metabolismus, RNA-Splicing, Proteolyse, Proteinfaltung, Vesikeltrafficking, Zellzyklus oder Cytoskelettmaschinerie.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abschwächen der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle. Doppelsträngige RNA (dsRNA) kann Gen-Silencing in zahlreichen In-vivo-Zusammenhängen, einschließlich Drosophila, Caenorhabditis elegans, Planarie, Hydra, Trypanosomen, Pilzen, Pflanzen und anderen eukaryotischen Zellen, hervorrufen. Das Verfahren schließt das Einführen von doppelsträngiger RNA in die Zelle in einer Menge ein, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen, wobei die dsRNA eine Nukleotidsequenz einschließt, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleotidsequenz des Zielgens hybridisiert und wobei die dsRNA aus einem Vektor exprimiert wird, der einen oder mehrere Transkriptionsterminatoren enthält.
  • Wie hierin verwendet, schließt „Zielgen" jede Nukleotidsequenz ein, die identifizierte(s) Gen(e) enthalten kann oder nicht enthalten kann, einschließlich, ohne Beschränkung, Zwischenregion(en), nicht-kodierende(n) Region(en), untranskribierte(n) Region(en), Intron(s), Exon(s) und Transgen(e).
  • dsRNA aktiviert einen normalen zellulären Vorgang, der zu einem hoch spezifischen RNA-Abbau und zu einem Verbreiten dieses Gendämpfungseffektes von Zelle zu Zelle in etlichen RNAi-Modellen führt. (Shuey et al., RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention, 7(20) Drug Discovery Today 1040 (2002).) Injektion von dsRNA wirkt zum Beispiel systemisch, um posttranskriptionelle Abreicherung der homologen endogenen RNA in C. elegans zu bewirken (US-Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 2003/0084471 A1). Diese Abreicherung von endogener RNA bewirkt Effekte, die ähnlich sind wie ein konditioneller Gen-„Knock-out", wodurch der durch das Fehlen einer bestimmten Genfunktion bewirkte Phänotyp enthüllt wird. C.elegans-Nematoden können zum Beispiel mit Bakterien gefüttert werden, die verändert worden sind, um dsRNA zu exprimieren, entsprechend einem C.elegans-Zielgen. Mit veränderten Bakterien gefütterte Nematoden zeigen einen Phänotypen, der ähnlich ist wie jener von Mutanten, die eine Mutation in dem Zielgen enthalten (1998, Nature 395:854).
  • 1 ist ein schematisches Diagramm, das einen Überblick über den RNAi-Weg abbildet. Intrazellulär synthetisierte oder von Außen verabreichte dsRNA wird durch ein Enzym gespalten, zum Beispiel Dicer, in siRNA, annähernd 19 bis ungefähr 25 Nukleotide lang. siRNA wird mit dem RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC (RNA-induced silencing complex)) assoziiert, welcher den Gegensinnstrang der siRNA verwendet, um an die Ziel-mRNA zu binden, unter Spaltung der mRNA. Die siRNA kann auch als Primer für die Erzeugung von neuer dsRNA durch RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp (RNA-dependent RNA polymerase)) verwendet werden. Diese neu gebildete dsRNA kann dann auch als ein Ziel für das Dicer-Enzym dienen.
  • Sowohl in Pflanzen- als auch in Tierzellen kann das intrazelluläre Aussetzen einer dsRNA-Sequenz in dem spezifischen posttranskriptionellen Gen-Silencing („PTGS") der homologen zellulären RNA resultieren (Fire, A. et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, 391 Nature 806 (1998); Shuey et al., RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention, 7(20) Drug Discovery Today 1040 (2002)). Der wie in 1 gezeigte RNAi-Pfad besteht aus der Präsentation einer „Auslösungs"-dsRNA, die nachfolgend zu siRNA verarbeitet wird, durch ein RNaseIII-ähnliches Enzym, zum Beispiel Dicer (Zamore, P. D. et al., RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 25 nucleotide intervals, 101 Cell 25(2000); Hutvagner, G. und Zamore, P. D., RNAi: nature abhors a double-strand, 12 Curr. Opin. Genet. Dev. 225 (2002)). Diese siRNA-Arten, die ungefähr 19 bis ungefähr 25 bp lang sein können, werden dann in einen mehrere Untereinheiten umfassenden RNA-induzierten Silencing-Komplex eingebaut, der das einzige zelluläre RNA-Transkript für enzymatischen Abbau zum Ziel nimmt. RNA-Hydrolyse geschieht innerhalb der Homologieregion, gelenkt durch die Ausgangs-siRNA (Fibashir, S. M. et al., RNA interference is mediated by 21 and 22 nucleotide RNAs, 15 Genes Dev. 188 (2001)), wodurch selektiv Zielgenexpression inhibiert wird.
  • dsRNA aktiviert auch durch RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) vermittelte Erzeugung und Amplifikation von einzelsträngiger RNA zu dsRNA-Vorläufern (Ahlquist, P., RNA-depended RNA polymerases, viruses, and RNA silencing, 296 Science 1270 (2002)), wie in 1 gezeigt, wodurch die inhibitorische Wirkung von dsRNA verlängert wird.
  • Nach lokalem Aussetzen an dsRNA, die aus einem viralen oder Plasmidvektor, der dsRNA produziert, produziert sein kann, folgt oftmals eine weit verbreitete Gen-Silencing-Wirkung durch die meisten, wenn nicht alle Gewebe des daran ausgesetzten Organismus. Dieses systemische RNAi-vermittelte Gen-Silencing wurde beobachtet zum Beispiel in Pflanzen (Napoli, C. et al., Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans, 2 Plant Cell 279 (1990)), Nematoden (Fire et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, 391 Nature 806 (1998); Tabara, H. et al. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence, 282 Science 430 (1998); Timmons, L. et al, Ingestion of bacterially expressed CISRNAS can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans, 263 Gene 103 (2001); Winston, W. M. et al., Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1, 295 Science 2456 (2002)), Planarien (Sanchez, Alvarado et al., dsRNA Specifically Disrupts Gene Expression During Planarian Regeneration, 96 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5049 (1999); Cebrià, F. et al., FGFR-related gene nuo-darake restricts brain tissues in the head region of planarians, 419 Nature 620 (2002)) und Mäusen (Pachuk, C. J. et al., dsRNA mediated post-transcriptional gene silencing and the interferon response in human cells and an adult mouse model, Keystone Symposia; RNA Interference, Cosuppression and Related Phenomena, 21. bis 26. Februar, Taos, New Mexico. Abstract Nr. 217 (2002)), und es wird gedacht, dass wenigstens zwei Bestandteile dabei involviert sind: eine kürzlich beschriebene lokale und zelluläre PTGS-Wirkung und ein gesonderter, aber verwandter globaler Gen-Silencing-Mechanismus, auf den oftmals Bezug genommen wird als transkriptionales Gen-Silencing („TGS"). (Shuey, et al., RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention, 7 (20) Drug Discovery Today 1040 (2002)).
  • Es wurde gezeigt, dass lange transfizierte dsRNA in kürzere siRNA verarbeitet wird, wenn sie in die Zelle eingeführt wird (Zamore, P. D. et al., RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals, 101 Cell 25 (2000)). Chemisch synthetisierte siRNA wurde für RNAi verwendet (Elbashir, S. M. et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, 411 Nature 494 (2001)). Verschiedene siRNA und siRNA-exprimierende Plasmide zeigten variierende Fähigkeiten, RNAi für identische Ziel-mRNA zu induzieren (Holen, T. et al., Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor, 30 Nucleic Acids Respondents. 1757 (2002); Lee, N. S. et al., Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells, 19 Nat. Biotechnol. 500 (2002)). Geeignete kurze dsRNA kann gestaltet werden von einem Durchschnittsfachmann, basierend auf dem Wissen der suppressiven Aktivitäten einzelner siRNA. Längere (> 50 bp) dsRNA-Moleküle können auch verwendet werden, um mehrere Dicer-gewonnene siRNA der Zelle bereitzustellen, wodurch folglich der Zelle erlaubt wird, den endogenen dsRNA-Silencing-Weg auszunutzen, um die wirksamste Silencing-siRNA auszuwählen. Dies sorgt für die gleichzeitige Expression einer großen Anzahl von siRNA, die aus einer einzelnen Vorläufer-dsRNA abgeleitet sind, von denen etliche eine starke und sequenzspezifische RNAi-Antwort auslösen sollten, ohne eine generalisierte suppressive oder Apoptoseantwort zu induzieren. Eine längere dsRNA würde auch das Targeting von mehr als einem Boten mit einem einzelnen Konstrukt erlauben und könnte möglicherweise die Entwicklung von Resistenz gegen mögliche RNAi-Therapien erleichtern, die zum Beispiel aus Punktmutationen in dem Ziel resultieren können.
  • Ein Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass in Tieren, die eine PKR-Antwort zeigen (Stark G. E. et al., How cells respond to interferons, 67 Annu. Rev. Biochem. 227 (1998); Gil, J. und Esteban, M., Induction of apoptosis by the dsRNA dependent protein kinase (PKR): mechanism of action, 5 Apoptosis 107 (200)), die Antwort, wo erwünscht und passend, vermieden werden kann oder überwunden werden kann. Zum Beispiel kann der PKR-Weg umgangen werden mit der Verwendung von kleineren dsRNA. (Shuey et al., RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention, 7 (20) Drug Discovery Today 1040 (2002).) Vektorvermittelte Zufuhr von größerer dsRNA kann ebenfalls die PKR-Antwort umgehen (Shuey et al., RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention, 7 (20) Drug Discovery Today 1040 (2002); Pachuk, C. J. et al., dsRNA mediated post-transcriptional gene silencing and the interferon response in human cells and an adult mouse model, Keystone Symposia; RNA Interference, Cosuppression and Related Phenomena, 21. bis 26. Februar, Taos, New Mexico. Abstract Nr. 217 (2002).) Zusätzlich kann längere dsRNA vor dem Einführen in die Zelle gespalten werden und/oder Dicer kann jederzeit aktiviert werden, wodurch die PKR-Antwort reduziert oder eliminiert wird.
  • Geeignete Vektoren schließen ohne Beschränkung jene ein, die beschrieben sind in den US-Patenten mit den Nummern 6,025,192; 5,888,732; 6,143,557; 6,171,861; 6,270,969; 5,766,891; 5,487,993; 5,827,657; 5,910,438; 6,180,407; 5,851,808 und PCT-Veröffentlichungen WO98/12339 und WO 00/01846, die nach der Erfindung weiter modifiziert sein können. Klonieren der Sequenz von Interesse kann erreicht werden durch enzymatischen Abbau von, zum Beispiel, multiplen Klonierstellen in dem Vektor und Ligation der Sequenz von Interesse in den Vektor, welche zu 100 % mit einer Region des Zielgens identisch sein kann, oder durch andere Verfahren, die für einen Fachmann ersichtlich sein werden. Ein Gen oder eine Sequenz von Interesse kann in Vektoren gemäß der Erfindung durch traditionelle Klonierverfahren wie Rekombinationstechnologien (Lox/Cre oder Att) und andere Verfahren inseriert werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Vorzugsweise wird die Sequenz von Interesse in den Vektor im Wege der Gateway-Klonierstrategie kloniert, wie beschrieben im US-Patent Nr. 6,143,557 und PCT WO 88/09372 (Karnaoukhova et al. (2003) Construction of cDNA libraries by recombination using the CloneMinerTM cDNA library construction kit. Focus 25.2: 20–25.2). Vorzugsweise schließt der Vektor eine Nukleotidsequenz ein, die einen selektierbaren Marker kodiert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Marker, die Resistenz gegen Ampicillin, Bleomycin, Chloramphenicol, Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin, Lincomycin, Methotrexat, Phosphinothricin, Puromycin, Carbenicillin und Tetracyclin verleihen. In wenigstens einer Ausführung der Erfindung ist die Nukleotidsequenz, die die Sequenz von Interesse kodiert, zwischen zwei Promotoren lokalisiert. Der Vektor enthält vorzugsweise einen Replikationsstartpunkt, um andauernde Replikation des Vektors innerhalb des Organismus zu erlauben. Der Vektor enthält am bevorzugtesten eine Transkriptionsterminationssequenz, die in der Lage ist, die Transkription an einer spezifizierten Stelle auf der Matrizen-DNA zu stoppen.
  • Kanamycin-Selektion kann für die leichtere Produktion von rekombinanten Plasmiden gemäß der Erfindung genutzt werden. Zum Beispiel existieren die meisten in die pTERMdT7- und pDONRdT7-Vektoren für dsRNA-Produktion zu transferierenden Gene in ampicillinresistenten Plasmiden; deshalb sorgt die Kanamycin-Selektion für die Wiedergewinnung von nur pTERMdT7 und pDONRdT7 mit dem Gen von Interesse, ohne Selektion des anfänglichen ampicillinresistenten Plasmides.
  • In gewissen Ausführungen sind die Vektoren episomal. In anderen Ausführungen sind die Vektoren chromosomal integriert. In jedem Fall kann die Sequenz von Interesse transient, konditional oder konstitutiv exprimiert werden. Weiter können chromosomal integrierte Vektoren eine stabil transformierte oder transfizierte Zelllinie erzeugen. Vektoren für die Bildung solcher stabiler Zelllinien schließen ohne Beschränkung jene ein, die beschrieben sind im US-Patent Nr. 6,025,192 und in der PCT-Veröffentlichung WO 98/12339.
  • Induzierbare Promotoren (tet, Hormonrezeptoren usw.) können auch verwendet werden, um, zum Beispiel, Gen-Silencing-Analysen durch Zulassen der temporären Unterdrückung von normalerweise letalen Knock-outs (z.B. „essentielle Gene") zu erleichtern und um beim Zergliedern der sequenziellen oder zeitlichen Beschränkungen gewisser zellulärer Phänomene zu helfen. Weiterhin können zum Beispiel induzierbare Vektoren verwendet werden, um die Expression der Sequenz von Interesse zu einer wünschenswerten Zeit zu induzieren. Zum Beispiel kann sich die Sequenz von Interesse unter der Kontrolle eines Promotors befinden, der aus einem Gen abgeleitet ist, das in Antwort auf Infektion (z.B. Transkriptionsfaktor vom Myb-Typ, ein spätes, bei der Embryogenese häufiges Protein, ein wurzelspezifisches Gen (d. h. TobRB7), D-Ribulose-5-phosphat-3-epimerase oder eine 20S Proteasom-α-Untereinheit) durch einen Schädling, wie ein Mitglied der Plathelminthen, heraufreguliert ist, wodurch die Expression der dsRNA in Antwort auf Infektion induziert wird.
  • Promotoren werden in den Vektor eingebaut, um die Transkription zu starten. Geeignete Promotoren schließen jede Nukleotidsequenz ein, die in der Lage ist, Transkription unter geeigneten Bedingungen zu starten. Geeignete Promotoren schließen ohne Beschränkung ein pol-III-Promotoren; pol-II-Promotoren (siehe Paddison, P. J. et al., Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells, 99 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1443 (2002)), wie zum Beispiel der Gal4-Promotor, let858, SERCA, UL6, myo-2 oder myo-3, Gal4p-Bindungsstellen und/oder Pho5; pol-I-Promotoren; virale Promotoren wie T7, T3 und SP6, adenovirale Promotoren, der Immediate-Early-Promotor von Cytomegalovirus und die Hauptoperator- und/oder Promotorregionen des Phagen λ; Hefepaarungs- (Yeast-Mating-) faktorpromotoren (a oder α); jene, die offenbart sind in US-Patent Nr. 6,537,786, der Polyhedron oder p10-Promotor des Baculovirussystems und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen kontrollieren, und jede Kombination davon. Ein Durchschnittsfachmann kann jeden bekannten oder entdeckten Promotor in Kombination mit der Erfindung verwenden. Promotoren können zum Beispiel minimal, induzierbar, konstitutiv, gewebespezifisch, rheostatisch, stressansprechend oder Kombinationen davon sein.
  • Vorzugsweise ist ein E.coli-Stamm, der verwendet wird, um die dsRNA zu erzeugen, ein RNaseIII- und sogar noch bevorzugter ein RNase-Negativstamm. Ähnlich haben Organismen und Stämme, die verwendet werden, um die dsRNA zu produzieren, vorzugsweise eine dezimierte RNase-Aktivität.
  • Der Vektor kann einen oder mehrere Transkriptionstermiantoren enthalten, die die Transkription der Matrizen-DNA an einer gewünschten Örtlichkeit stoppen. Dies kann zum Beispiel verwendet werden, um die Transkription auf die klonierte Sequenz von Interesse zu beschränken und/oder die Transkription von Vektor-DNA zu verhindern. Terminatoren können auch verwendet werden, um die Größe der Produkt-dsRNA auf eine Größe zu reduzieren, die ausreichend ist, die PKR-Antwort zu reduzieren oder zu eliminieren.
  • Der Begriff „Transkriptionsterminator" oder „Terminator", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Sequenz, die die Termination der Transkription signalisiert, die erkannt wird durch die Polymerase oder ein selbst-spaltendes Ribozym (z.B. siehe Chowrira et al. 1994, J. Biol. Chem. 269: 25864), worin eine funktionelle Terminatorsequenz bestimmt werden kann durch Einbau in eine Primerverlängerungsmatrize, worin der Terminator die weitere Verlängerung solch eines Primerverlängerungsproduktes verhindert. Der Terminator kann ein Polyadenylierungssignal einschließen.
  • Die exakte Länge eines Transkriptes ist nicht allgemein kritisch und deshalb kann ein Transkriptionsterminator in einem weiten Bereich von Positionen im Verhältnis zu der exprimierten Nukleinsäure positioniert sein und immer noch die gewünschte Wirkung des Bewirkens von Termination der Transkription haben. Demgemäß ist ein Transkriptionsterminator an eine transkribierte Nukleinsäure operabel gekoppelt, vorausgesetzt, dass er Expression der Nukleinsäure auf einem gewünschten Niveau vermittelt oder damit kompatibel ist. Zum Beispiel sollte ein Terminator, der an die Sequenz von Interesse operabel gekoppelt ist, keine frühreife Termination (d. h. 3'-Trunkierung) des gewünschten Transkriptes bewirken und sollte in der beabsichtigten Transkriptionsquelle funktionieren.
  • Geeignete Terminatoren schließen ein, ohne Beschränkung, T7, NusA, GTTE1 und GTTE2 (Carlomagno, M. S., Nappo, A., NusA modulates intragenic termination by different pathways, 308 Genes 115 (2003)), lamba NUT, lamba tR2, Rho-Stellen, tml, CaMV 355, PI-II, TpsbA, Trps16, Octopin- (ocs) und Nopalinsynthase (nos) (Thornburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 744, (1987); An et al., Plant Cell 1: 115 (1989)), trp A, trp A (invertiert), rrnBT1, rrnBT1 (invertiert), rrnC, thr-Attenuator, phi 8-oop, OTH, lambda 65, lambda 65 (invertiert) (Macdonald et al., (1993) Termination and slippage of bacteriophage T7 RNA polymerase J. Mol. Biol. 232 (4): 1030–47), der Erbsen-rbcS-E9-Terminator und funktionelle Kombinationen davon, siehe auch US-Patente mit den Nummern 6,297,429; 6,518,066; 6,512,162; 6,537,786; Kashlev, M., Komissarova N. (2002) Transcription termination: primary intermediates and secondary adducts, J. Biol. Chem. 277 (17): 14501-8; Kakarin et al., (1998) Characterization of unusual sequence- specific termination signal for T7 RNA polymerase J. Biol. Chem. 273 (30): 18802-11; Lyakhov et al. (1997) Mutant bacteriophage T7 RNA polymerases with altered termination properties, J. Biol. Chem. 280 (2): 201-13; Macdonald et al., (1994) Characterization of two types of termination signal for bacteriophage T7 RNA polymerase, J. Mol. Biol. 232 (4): 145-58; und Evgeny Nudler und Max E. Gottesman (2002) Transcription termination and anti-termination in E. coli. Zusätzlich kann der native Transkriptionsterminator eines Gens verwendet werden, Genes to Cells 7: 755–768.
  • Die Erfindung sorgt für die Erzeugung von dsRNA zu spezifischen Zeiten der Entwicklung und Örtlichkeiten in einem Organismus ohne das Einführen von permanenten Mutationen in das Zielgenom. dsRNA und/oder ein Vektor, der in der Lage ist, dsRNA zu produzieren, können direkt in die Zelle eingeführt werden (d. h. intrazellulär) oder können extrazellulär in eine Höhle, einen interstitiellen Raum, in den Krauslauf eines Organismus eingeführt werden, können oral eingeführt werden oder können durch Baden eines Organismus in einer dsRNA-enthaltenden Lösung eingeführt werden. Verfahren für die orale Einführung schließen direkten Verzehr und Hinzufügen von dsRNA zu oder Mischen von dsRNA mit Futter, was die Aufnahme von Flüssigkeiten einschließt, des Organismus, ebenso wie veränderte Ansätze, in welchen ein organisches Material oder Arten, das entweder als Futter konsumiert wird oder in der Lage ist, den Organismus zu infizieren, verändert wird, um eine dsRNA zu exprimieren, und dann dem zu beeinflussenden Organismus verabreicht wird. Zum Beispiel kann dsRNA transfiziert oder transformiert werden in einen Mikroorganismus wie eine Bakterien- oder Hefezelle, der dann dem Organismus gefüttert werden kann. Physikalische Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuren sind in der Technik bekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Injektion einer dsRNA-Lösung direkt in die Zelle oder extrazelluläre Injektion in den Organismus.
  • Die Erfindung sorgt weiter für die Synthese von siRNA in großem Maßstab unter Verwendung einer Biofabrik, wie sie zum Beispiel in Bakterien oder C. elegans produziert werden kann. Der Biofabrikorganismus kann verändert sein, um dsRNA zu erzeugen, und kann dem Zielorganismus, in welchem dsRNA-Inhibition gewünscht wird, gefüttert werden. Der Zielorganismus kann endogen oder durch Transgenese das Gen exprimieren, von dem einer wünscht, es zum Ziel zu nehmen. Da der Zielorganismus die dsRNA in große siRNA-Mengen umwandelt, kann dieses Verfahren verwendet werden, um große siRNA-Mengen zu erzeugen, die auf ein spezifisches Zielgen gerichtet sind. Nach einer geeigneten Zeitdauer, wobei für die optimale Produktion von siRNA gesorgt wird, kann der veränderte Biofabrikorganismus einem Zielorganismus zugeführt werden. Alternativ kann die siRNA vor der Zufuhr an den Zielorganismus unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie und Chemie gereinigt werden.
  • Die dsRNA kann eine siRNA oder eine Haarnadel einschließen und kann in einen Wirt transient oder stabil transfiziert oder transformiert sein.
  • Die Erfindung ist nützlich beim Erlauben der Inhibition von essentiellen Genen. Solche Gene können erforderlich sein für die Lebensfähigkeit der Zelle oder des Organismus, nur in bestimmten Entwicklungsstadien oder nur in spezifischen zellulären Kompartmenten oder Geweben. Das funktionelle Äquivalent einer konditionalen Mutation kann erzeugt werden durch Inhibieren der Aktivität des Zielgens unter spezifizierten Bedingungen oder in einer spezifischen zeitlichen, speziellen oder Entwicklungsweise. In gewissen Ausführungen kann das Zielgen ohne Beschränkung ein endogenes Gen der Zielzelle oder des Zielorganismus oder ein heterologes Gen im Verhältnis zu dem Genom der Zielzelle oder des -organismus sein, wie zum Beispiel ein Pathogengen oder ein in eine Zelle durch Rekombinationstechniken eingeführtes Gen.
  • Die das Zielgen aufweisende Zelle kann aus der Keimbahn sein oder kann somatisch, totipotent oder pluripotent, teilend oder nicht teilend, Parenchym oder Epithel, immortalisiert/transformiert oder primär oder Ähnliches sein. Die Zelle kann eine Stammzelle oder eine differenzierte Zelle sein. Geeignete Zelltypen, die differenziert sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Adipozyten, Fibroblasten, Myozyten, Cardiomyozyten, Endothel, Neuronen, Glia, Blutzellen, Megakaryozyten, Lymphozyten, Macrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Mastzellen, Leukozyten, Granulozyten, Keratinozyten, Chondrozyten, Osteoblasten, Osteoclasten, Hepatozyten und Zellen der endokrinen oder exokrinen Drüsen.
  • Eine eukaryotische Zielzelle kann enthalten sein oder gewonnen sein aus, ohne Beschränkung, Tieren; Trypanosomen; Pflanzen, einschließlich Monokotyledonen, Dikotyledonen und Gymnospermen; Pilzen, einschließlich sowohl Schimmel- als auch Hefemorphologien; oder Mikroben, einschließlich jenen, die in der Landwirtschaft oder durch die Industrie verwendet werden, und jenen, die für Pflanzen oder Tiere pathogen sind.
  • Geeignete Pflanzen schließen ohne Beschränkung ein Arabidopsis; Feldfrüchte (z.B. Alfalfa, Gerste, Bohne, Mais, Baumwolle, Flachs, Erbse, Raps, Reis, Roggen, Distel, Hirse, Sojabohne, Sonnenblume, Tabak und Weizen); pflanzliche Feldfrüchte (z.B. Spargel, Rübe, Broccoli, Kohl, Karotte, Blumenkohl, Sellerie, Gurke, Aubergine, Salat, Zwiebel, Paprika, Kartoffel, Kürbis („pumpkin"), Rettich, Spinat, Kürbis („squash"), Taro (Wasserbrotwurzel), Tomate und Zucchini); Frucht- und Nussfrüchte (z.B. Mandel, Apfel, Aprikose, Banane, Brombeere, Heidelbeere, Kakao, Kirsche, Kokosnuss, Preiselbeere, Dattel, Feijoa (Brasilianische Guave), Haselnuss, Traube, Grapefruit, Guave, Kiwi, Zitrone, Limone, Mango, Melone, Nektarine, Orange, Papaya, Passionsfrucht, Pfirsich, Erdnuss, Birne, Ananas, Pistazie, Pflaume, Himbeere, Erdbeere, Mandarine, Walnuss und Wassermelone); und Ziergewächse (z.B. Erle, Esche, Espe, Azalee, Birke, Buchsbaum, Kamelie, Nelke, Chrysantheme, Ulme, Tanne, Efeu, Jasmin, Wacholder, Eiche, Palme, Pappel, Kiefer, Redwood, Rhododendron, Rose und Gummibaum).
  • Beispiele von geeigneten vertebraten Tieren schließen ein, z.B. Fisch und Säuger (z.B. Rind, Ziege, Schwein, Schaf, Nager, Hamster, Maus, Ratte, Primat, Mensch und Kugelfisch). Geeignete invertebraten Tiere schließen ein, ohne Beschränkung, Nematoden, Planarien, Plathelminthen und andere Würmer; Drosophila und andere Insekten; und Hydra. Beispielhafte Gattungen an Nematoden schließen jene ein, die Tiere infizieren (z.B. Ancylostorna, Ascaridia, Ascaris, Bunostomum, Caenorhabditis, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Haernonchus, Heterakis, Nematodirus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Toxascaris, Trichuris, Trichostrongylus, Tflichonema, Toxocara, Uncinaria), und jene, die Pflanzen infizieren (z.B. Bursaphalenchus, Criconerriella, Diiylenchus, Ditylenchus, Globodera, Heicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Melodoigyne, Nacobbus, Paratylenchus, Pratylenchus, Radopholus, Rotelynchus, Tylenchus und Xiphinerna). Beispielhafte Arten an Plathelminthes, die Tiere infizieren oder angreifen, schließen ohne Beschränkung ein Arthurdendyus, Ascaris, Austroplana, Artioposthia, Bipallium, Dolichoplana, Geoplana, Schistosoma, Taenia und Trichuris. Beispielhafte Insektenordnungen schließen Coleoptera, Diptera, Lepidoptera und Homoptera ein.
  • Die Expression des Zielgens wird vorzugsweise so abgeschwächt, um reproduzierbar einen Funktionsverlust (loss-of-function) in dem Gen, das aktiv zum Ziel genommen wird, im Verhältnis zu einer Zelle zu erzeugen, die nicht an dsRNA ausgesetzt ist.
  • Diese und alle Aspekte der Erfindung können unter anderem verwendet werden, um effizient dsRNA zu produzieren; die Stärke der Phänotypenexpression zu verbessern; die Anzahl von Individuen, die den Zielphänotypen exprimieren, zu steigern; die Produktion von dsRNA-produzierenden Plasmiden für eine große Anzahl von Genen zu organisieren; die Produktion von dsRNA, die spezifisch für das Zielgen ist, durch Reduzieren oder Verhindern von Transkription des genetischen Gerüstes des Vektors zu erhöhen; und/oder Optimieren der Länge der in die Zelle eingeführten dsRNA. Diese und alle Aspekte der Erfindung können in allen Organismen verwendet werden, in welchen RNAi effektiv ist, und in allen Anwendungen, die RNAi nutzen, einschließlich,jedoch nicht beschränkt auf Genomanalyse (Clemens, J. C. et al. (2000) Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6499–6503; Dobrosotskaya, I. Y. et al. (2002) Regulation of SREBP processing and membrane lipid production by phospholipids in Drosophila, Science 296: 879–883), Gen-Silencing-Therapien und Arzneimittelentwicklung.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Abschwächen der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle, worin dsRNA in die Zelle eingeführt wird durch einen Vektor mit wenigstens einer Nukleotidsequenz, die ähnlich ist mit dem Zielgen, welche, wenn sie transkribiert wird, dsRNA in einer Menge produziert, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen.
  • In gewissen Ausführungen wird die Transkription der Sequenz von Interesse in sowohl Sinn- als auch Gegensinnrichtungen gestartet, worin die Transkription jedes Strangs funktionell gekoppelt ist an eine Transkriptionsregulationssequenz, wie zum Beispiel ein Promotor oder Enhancer und ein Transkriptionsterminator; wo die Transkriptionsregulationssequenzen Transkription in beide Richtungen starten und terminieren, wodurch komplementäre Transkripte gebildet werden; und wo die komplementären Transkripte miteinander Doppelstränge bilden, um die dsRNA zu bilden. Wo die Bildung von dsRNA innerhalb einer Wirtszelle erzeugt wird, bilden die komplementären Transkripte unter physiologischen Bedingungen Doppelstränge. In anderen Ausführungen kann der Vektor zwei Nukleotidsequenzen einschließen, die jeweils nach der Transkription zwei komplementäre Sequenzen erzeugen, die Doppelstrang bilden, um die dsRNA zu bilden. In noch anderen Ausführungen kann der Vektor eine Nukleotidsequenz einschließen, die eine Haarnadel nach Transkription bildet, wo die Haarnadel eine intramolekulare dsRNA bildet. In gewissen bevorzugten Ausführungen transkribiert der Vektor die Sequenz von Interesse von beiden Strängen der Doppelhelix und kann wenigstens eine, aber vorzugsweise zwei Transkriptionsterminatorsequenzen einschließen, die die Transkription dazu bringen, zu stoppen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abschwächen der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle durch Einführen eines Vektors in eine Zelle mit zwei Promotoren, die so orientiert sind, dass die Promotoren nach der Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren in der Lage sind, die Transkription einer Sequenz von Interesse, die zwischen den Promotoren liegt, zu starten, um dsRNA in einer Menge zu erzeugen, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abschwächen der Expression eines Zielgens in einer Zelle durch Einführen in die Zelle einer Sequenz von Interesse mit einer Haarnadelstruktur in einer Menge, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens abzuschwächen, wobei die Haarnadel eine invertierte Wiederholung einer Nukleotidsequenz einschließt, die unter stringenten Bedingungen an das Zielgen hybridisiert. Die Haarnadelnukleinsäure kann ohne Beschränkung RNA sein. Die Haarnadelstruktur stellt die dsRNA bereit, folglich kann die Sequenz von Interesse eine Sequenz darstellen, die abgeleitet ist aus der mRNA des Zielgens, einer Schleifensequenz (Loop-Sequenz) und dem Komplement der mRNA-Sequenz, so dass ein einzelnes Transkriptionsereignis eine dsRNA produzieren wird. Alternativ kann die Schleifensequenz eine Sequenz sein, die von einem Enzym, wie zum Beispiel einem Ribozym, erkannt wird.
  • Immer noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen, die verantwortlich sind für das Verleihen eines bestimmten Phänotypens in einer Zelle. Dieses Verfahren involviert das Konstruieren einer Bibliothek aus Nukleinsäuresequenzen aus einer Zelle in einer Orientierung im Verhältnis zu einem Promotor, um dsRNA zu erzeugen; das Einführen der dsRNA-Bibliothek in eine Zielzelle; das Identifizieren von Mitgliedern der Bibliothek, welche der Zelle einen bestimmten Phänotypen verleihen; und das Identifizieren der Nukleotidsequenz, die dem Bibliotheksmitglied entspricht, welches den bestimmten Phänotypen verleiht. Bei diesen und allen Aspekten der Erfindung schließt „entsprechend" ohne Beschränkung identisch oder homolog seiend ein.
  • Deshalb wird ein Verfahren zum Identifizieren von DNA bereitgestellt, die verantwortlich ist für das Verleihen eines Phänotypen in einer Zelle, welches umfasst a) das Konstruieren einer cDNA-Bibliothek oder anderen Bibliothek (z.B. einer genomischen Bibliothek) der DNA aus einer Zelle in einen Vektor, der wenigstens zwei Promotoren hat, die in der Lage sind, die Transkription der cDNA oder DNA zu fördern, welche Sequenzen einschließen kann, die die cDNA oder DNA flankieren, wodurch dsRNA nach der Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren produziert wird, b) das Aufweisen von Transkriptionsterminatorsequenzen, die operabel an die cDNA- oder DNA-Sequenz gekoppelt sind, c) das Einführen der Bibliothek in eine oder mehrere Zellen mit dem Transkriptionsfaktor, und d) das Identifizieren eines gewünschten Phänotyps der Zelle mit dem gewünschten Bibliotheksmitglied und das Identifizieren, was Isolieren einschließen kann, des DNA- oder cDNA-Fragmentes aus dem Bibliotheksmitglied, das verantwortlich ist für Verleihen des Phänotyps. Wahlweise kann die Bibliothek vor Schritt c) in hierarchische Pools organisiert sein, wie zum Beispiel Pools, die auf Genfamilien basiert sind. Ähnlich können bekannte Sequenzen unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens untersucht werden, worin die Sequenz von Interesse in den Vektor von Schritt a) inseriert ist, und können durch das Verfahren mit geeigneten Modifikationen geführt werden.
  • In noch einer zusätzlichen Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Identifizieren einer Funktion eines Gens in einer Planarie. Das Verfahren involviert das Produzieren einer Bibliothek aus Genen in einer bakteriellen Zellpopulation, das Füttern der bakteriellen Zellpopulation an die Planarie und das Beobachten einer Änderung in einem Phänotypen oder einer Änderung auf einem zellulären Niveau. In einer Ausführung ist die Planarie S. mediterranea.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Screening nach Verbindungen, die in die Pathogenese einer Zelle verwickelt sind. Das Verfahren schließt das Aussetzen der Zelle an Stress ein, wie zum Beispiel eine Infektion, und das Ändern der Genexpression in der Zelle unter Verwendung von RNAi. Die Zelle wird beobachtet hinsichtlich Änderungen im Phänotypen oder einer Änderung auf dem zellulären Niveau in Antwort auf den Stress. Zum Beispiel wird in einer Ausführung eine eukaryotische Zelle mit einem Virus infiziert, wie zum Beispiel menschliches Immunschwächevirus. RNAi wird verwendet, um Genexpression der infizierten eukaryotischen Zelle zu ändern, und ein Phänotyp wird untersucht, um zum Beispiel zu bestimmen, ob irgendwelche eukaryotischen Zellen länger leben. Das geänderte Gen, das einen unterschiedlichen Phänotyp, falls vorhanden, in der eukaryotischen Zelle bewirkt, wird bestimmt.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen eines Arzneimittelentdeckungsgeschäftes. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren eines Zielgens durch den gegenständlichen Test, welches eine phänotypisch wünschenswerte Antwort bereitstellt, wenn es durch RNAi inhibiert wird; das Identifizieren von Mitteln durch ihre Fähigkeit, die Expression des Zielgens oder die Aktivität eines Expressionsproduktes des Zielgens zu inhibieren; das Durchführen von therapeutischem Profilieren von Mitteln, die in dem unmittelbar vorangegangenen Schritt identifiziert worden sind, oder von weiteren Analogon davon, für Wirksamkeit und Toxizität in Zellen; und das Formulieren einer pharmazeutischen Zubereitung, die ein oder mehrere Mittel einschließt, die in dem unmittelbar vorangegangenen Schritt als ein annehmbares therapeutisches Profil aufweisend identifiziert worden sind.
  • Dieser Aspekt der Erfindung kann einen zusätzlichen Schritt des Etablierens eines Vertriebssystems für den Vertrieb der pharmazeutischen Zubereitung zum Verkauf einschließen und kann wahlweise das Etablieren einer Verkaufsabteilung zum Vermarkten der pharmazeutischen Zubereitung einschließen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen eines Zielgenentdeckungsgeschäftes. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren eines Zielgens durch den gegenständlichen Test, welches eine phänotypisch wünschenswerte Antwort bereitstellt, wenn es durch RNAi inhibiert wird; wahlweise das Durchführen von therapeutischem Profilieren des Zielgens für Wirksamkeit und Toxizität in Zellen; wahlweise das Lizenzieren der Rechte für die weitere Arzneimittelentwicklung von Inhibitoren des Zielgens an eine Drittpartei; und das Entwickeln eines Arzneimittels, um die Expression des Zielgens zu inhibieren.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf transgene Eukaryoten, die ein Transgen einschließen, das ein dsRNA-Konstrukt kodiert.
  • Eine Eukaryote, die für das Transgen chimär ist, ist bei diesem Aspekt der Erfindung geeignet. Bei diesem und allen Aspekt(en) der Erfindung, die Transgene involvieren, kann das Transgen in einer oder mehreren Keimbahn- und/oder somatischen Zellen lokalisiert sein. Das Transgen kann ohne Beschränkung chromosomal eingebaut sein.
  • Geeignete dsRNA-Konstrukte schließen ohne Beschränkung Konstrukte ein, wo die dsRNA identisch ist oder ähnlich ist mit einem oder mehreren Zielgen(en), vorzugsweise einem Zielgen, das stabil in das Genom der Zelle integriert ist, in welcher es vorkommt. Auch geeignet sind Konstrukte, die eine Nukleotidsequenz einschließen, welche unter stringenten Bedingungen an eine Nukleotidsequenz eines Zielgens hybridisiert; die Sequenz von Interesse kann ohne Beschränkung an eine kodierende oder nicht-kodierende Sequenz des Zielgens hybridisieren. „Ähnliche Nukleotidsequenz", wie in dieser Anmeldung verwendet, bedeutet eine erste Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Zielgensequenz hybridisiert, die zu der ersten Nukleotidsequenz komplementär ist.
  • Selektivität der Hybridisierung existiert, wenn Hybridisierung, die wesentlich selektiver ist als ein vollständiges Fehlen von Spezifität, geschieht. Typischerweise wird selektive Hybridisierung geschehen, wenn es wenigstens ungefähr 70 % Homologie über eine Strecke von wenigstens ungefähr neun Nukleotiden gibt, vorzugsweise wenigstens ungefähr 85 %, bevorzugter wenigstens ungefähr 90 % und am bevorzugtesten wenigstens ungefähr 95 %. Die Länge des Homologievergleichs kann über längere Strecken sein, und wird in gewissen Ausführungen oftmals über eine Strecke von wenigstens ungefähr 14 Nukleotiden, gewöhnlich wenigstens ungefähr 20 Nukleotiden, gewöhnlicher wenigstens ungefähr 24 Nukleotiden, typischerweise wenigstens ungefähr 28 Nukleotiden, noch typischer wenigstens ungefähr 32 Nukleotiden und bevorzugt wenigstens ungefähr 36 oder mehr Nukleotiden sein.
  • Nukleinsäurehybridisierung wird durch solche Bedingungen beeinflusst, wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel, zusätzlich zu der Basenzusammensetzung, der Länge der komplementären Stränge und der Anzahl von Nukleotidbasenfehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Nukleinsäuren, wie leicht von Fachleuten erkannt werden wird. Stringente Temperaturbedingungen werden allgemein Temperaturen von höher als 30 °C einschließen, typischerweise höher als 37 °C und bevorzugt höher als 45 °C. Stringente Salzbedingungen werden gewöhnlich niedriger sein als 1000 mM, typischerweise niedriger als 500 mM und vorzugsweise weniger als 200 mM. Die Kombination von Parametern ist jedoch viel wichtiger als das Maß jedes einzelnen Parameters. Die Stringenzbedingungen sind auch abhängig von der Länge der Nukleinsäure und der Basenzusammensetzung der Nukleinsäure und können bestimmt werden durch in der Technik wohlbekannte Techniken. Zum Beispiel Asubel, 1992; Wetmur und Davidson, 1968.
  • Folglich bedeutet, wie hierin verwendet, der Begriff „stringente Bedingungen", dass Hybridisierung nur geschehen wird, falls es wenigstens 85 %, vorzugsweise wenigstens 90 %, bevorzugter 95 % und am bevorzugtesten wenigstens 97 % Identität zwischen den Sequenzen gibt. Solche Hybridisierungstechniken sind Fachleuten wohlbekannt. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind wie oben definiert oder sind, alternativ, Bedingungen unter Über-Nacht-Inkubation bei 42 °C in einer Lösung, umfassend: 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in ungefähr 0,1 × bis ungefähr 0,2 × SSC bei ungefähr 65 °C. Hybridisierungstechniken und -vorgehensweisen sind Fachleuten wohlbekannt und sind zum Beispiel beschrieben in Ausubel et al., Protocols in Molecular Biology, und Guide to Molecular Cloning Techniques.
  • dsRNA-Konstrukte können einen oder mehrere Stränge aus poylmerisiertem Ribonukleotid umfassen. Die doppelsträngige Struktur kann durch einen einzelnen selbstkomplementären RNA-Strang oder zwei komplementäre RNA-Stränge gebildet werden. RNA-Duplexbildung kann entweder innerhalb oder außerhalb der Zelle gestartet werden. Das dsRNA-Konstrukt kann in einer Menge eingeführt werden, welche die Zufuhr von wenigstens einer Kopie pro Zelle erlaubt. Höhere Dosen an doppelsträngigem Material können eine effektivere Inhibition ergeben. Inhibition ist sequenzspezifisch, dahingehend, dass Nukleotidsequenzen, die der Duplexregion der RNA entsprechen, für genetische Inhibition zum Ziel genommen werden. In gewissen Ausführungen werden dsRNA-Konstrukte für die Inhibition bevorzugt, die Nukleotidsequenzen enthalten, welche mit einem Teil des Zielgens identisch sind. RNA-Sequenzen mit Insertionen, Deletionen und Punktmutationen im Verhältnis zu der Zielsequenz wurden ebenfalls als für die Inhibition effektiv befunden. Folglich kann Sequenzidentität durch in der Technik bekannte Anordnungsalgorithmen und Berechnen des prozentualen Unterschiedes zwischen den Nukleotidsequenzen optimiert werden. Alternativ kann die Duplexregion der RNA funktionell definiert werden als eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, mit einem Teil der Zielgensequenz zu hybridisieren. In einer anderen Ausführung enthält das dsRNA-Konstrukt Nukleotidsequenzen, die mit einem nicht-kodierenden Teil des Zielgens identisch sind. Beispielhafte nicht-kodierende Regionen schließen ein, ohne Beschränkung, Introns, 5'-untranslatierte Regionen und 3'-untranslatierte Regionen. Sequenzen mit Insertionen, Deletionen und Punktmutationen im Verhältnis zu der nicht-kodierenden Zielsequenz sind ebenfalls geeignet.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine dsRNA zum Inhibieren der Expression eines Säugergens. Diese dsRNA schließt eine erste Nukleotidsequenz ein, die unter stringenten Bedingungen an die Zielsequenz oder ihr Komplement hybridisiert.
  • Die Sequenz von Interesse kann ohne Beschränkung wenigstens 20 Nukleotide, wenigstens 25 Nukleotide, wenigstens 100 Nukleotide oder wenigstens 400 Nukleotide umfassen. Die Sequenz von Interesse kann im Wesentlichen identisch sein mit, ohne Beschränkung, wenigstens einem eukaryotischen Zielgen, wenigstens einer kodierenden Sequenz aus wenigstens einem eukaryotischen Gen und/oder wenigstens einer nicht-kodierenden Sequenz. Die nicht-kodierende Sequenz gemäß diesem Aspekt kann zum Beispiel untranskribiert sein, wenn RNA-Virusinfektiosität zum Ziel genommen wird.
  • Die Sequenz von Interesse kann in der Lage sein, eine Haarnadelstruktur mit einer ersten Nukleotidsequenz zu bilden, die unter stringenten Bedingungen an wenigstens ein Säugergen hybridisiert; und mit einer zweiten Nukleotidsequenz, die eine komplementäre invertierte Wiederholung der ersten Nukleotidsequenz ist und an die erste Nukleotidsequenz hybridisiert, um eine Haarnadelstruktur zu bilden.
  • Die dsRNA kann gestaltet sein, um eine Sequenz zu haben, welche zum Beispiel hoch konservierte Domänenregionen wie katalytische Domänen oder Ligandenbindungsregionen vermeidet, um das Inhibieren der Translation von mRNA von hoch homologen Multigenfamilien zu umgehen; welche die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen zum Ziel nimmt; welche zu allen mRNA-Arten beiträgt, die möglicherweise mit der Ziel-mRNA kreuzreaktiv sind; oder welche eine vollständige Klasse aus Zielen dämpfen wird. (Shuey et al., (2002) RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention, Drug Discovery Today 7 (20):1040–1046).
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verminderung des Schädlingsbefalls von Pflanzen. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren einer DNA-Sequenz des Schädlings, die für das Überleben, das Wachstum, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings kritisch ist; das Klonieren der Sequenz oder eines Fragmentes davon in einen Vektor, der in der Lage ist, die Schädlingssequenz und ihr Komplement zu transkribieren, wodurch dsRNA gebildet wird; und das Einführen des Vektors in die Pflanze unter Bedingungen, die wirksam sind, den Schädlingsbefall zu vermindern.
  • Dieser Aspekt der Erfindung stellt einen selektiven Mechanismus zur Verminderung des Schädlingsbefalls bereit. Wenn der Schädling an der Pflanze frisst, wird die dsRNA von Zellen in dem Schädling aufgenommen, welche die dsRNA verdauen. Die verdaute dsRNA inhibiert die Expression der identifizierten Schädlingssequenz innerhalb des Schädlings, welche für dessen Wachstum, Überleben, Vermehrung oder Fortpflanzung kritisch ist, wodurch folglich das Wachstum, Überleben, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings beeinträchtigt wird. Dieser Aspekt der Erfindung ist geeignet zur Verhinderung, Verminderung oder Behandlung von Schädlingsbefall, einschließlich, ohne Beschränkung, Nematodenwürmer, Insekten, Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemellas ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichondorus ssp., Paratrichondorus ssp., Aphelenches ssp. und andere Pflanzenschädlinge. Die dsRNA kann in einem spezifischen Pflanzengewebe in Abhängigkeit von der Futterquelle des Schädlings durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren exprimiert sein. Geeignete Pflanzen schließen ohne Beschränkung jene ein, die oben aufgelistet sind, und jede Pflanze, in welche die dsRNA eingeführt werden kann. Vorzugsweise wird die dsRNA von einem Vektor produziert, der die Sequenz von Interesse und ihr Komplement transkribiert und der Transkriptionsterminatoren hat, die 3' der Sequenz von Interesse lokalisiert sind.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein therapeutisches Verfahren zur Verminderung von parasitischem Helminthebefall von Tieren oder Menschen: Dieses Verfahren involviert das Identifizieren einer DNA-Sequenz des Schädlings, die für das Überleben, Wachstum, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings kritisch ist, die jedoch bevorzugt in dem Genom des infizierten Wirtes fehlt; das Klonieren der Sequenz oder eines Fragmentes davon in einen Vektor, der in der Lage ist, die Sequenz und ihr Komplement zu transkribieren, um dsRNA zu produzieren; und das Einführen des Vektors in das Tier oder den Mensch unter Bedingungen, die wirksam sind, den Schädlingsbefall zu vermindern.
  • Die Erfindung bezieht sich noch weiter auf ein Verfahren zur Verminderung der Zerstörung von Regenwurmpopulation durch Helminthen. Dieses Verfahren involviert das Identifizieren einer DNA-Sequenz des Schädlings, die für das Überleben, Wachstum, die Vermehrung oder Reproduktion des Schädlings kritisch ist; das Klonieren der Sequenz oder eines Fragmentes davon in einen Vektor, der in der Lage ist, die Sequenz und ihr Komplement zu transkribieren, um dsRNA zu produzieren; das Einführen des Vektors in Regenwürmer unter Bedingungen, die effektiv sind, den Schädlingsbefall zu vermindern und das Verbringen dieser Regenwürmer in Bereiche, wo die Regenwurmpopulation durch Helminthen zerstört worden ist oder von ihnen angegriffen ist.
  • Die Erfindung stellt einen selektiven Mechanismus zur Verhinderung, Verminderung oder Behandlung von Schädlingsbefall bereit. Wenn der Schädling den Menschen oder das Tier befällt oder an dem Regenwurm frisst, wird die dsRNA von Zellen in dem Schädling aufgenommen, welcher die dsRNA verdaut. Die verdaute dsRNA inhibiert die Expression der identifizierten Schädlingssequenz in dem Schädling, welche für sein Wachstum, Überleben, seine Vermehrung oder Fortpflanzung kritisch ist, wodurch folglich das Wachstum, Überleben, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings beeinträchtigt wird. Dieser Aspekt der Erfindung ist geeignet zum Verhindern, Vermindern oder zur Behandlung von Schädlingsbefall, einschließend, ohne Beschränkung, Nematoden, Plathelminthen, Drosophila und andere Insekten; und Hydra. Repräsentative Gattungen von Nematoden schließen jene ein, die Tiere infizieren (z.B. Ancylostorna, Ascaridia, Ascaris, Bunostomum, Caenorhabditis, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Haernonchus, Heterakis, Nematodirus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Toxascaris, Trichuris, Trichostrongylus, Tflichonema, Toxocara, Uncinaria). Repräsentative Gattungen von Plathelminthen, die Tiere infizieren oder angreifen, schließen, ohne Beschränkung, ein Arthurdendyus, Ascaris, Austroplana, Artioposthia, Bipallium, Dolichoplana, Geoplana, Schistosoma, Taenia und Trichuris. Repräsentative Ordnungen von Insekten schließen Coleoptera, Diptera, Lepidoptera und Homoptera ein. Die dsRNA kann in einem spezifischen Gewebe exprimiert sein, in Abhängigkeit von der Futterquelle des Schädlings, durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren. Geeignete Tiere schließen ohne Beschränkung jene ein, die oben aufgelistet sind, und jedes Tier, in welches die dsRNA eingeführt werden kann. Vorzugsweise wird die dsRNA von einem Vektor erzeugt, der die Sequenz von Interesse und ihr Komplement transkribiert und der Transkriptionstermiantoren hat, die 3' der Sequenz von Interesse lokalisiert sind.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf das Plasmid, das als pDONRdT7 identifiziert ist. In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Bibliothek aus RNAi-Eingangsklonen, die aus einer eukaryotischen Zelle, wie einer Planarie, stammen, und weiter auf Verfahren zum Screenen mit der Bibliothek. Die Bibliothek kann in einer bakteriellen Zelle erzeugt werden und kann in die Planarie durch Füttern eingeführt werden.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Vektor. Dieser Vektor schließt einen oder mehrere Promotoren ein, die im Verhältnis zu einer DNA-Sequenz so orientiert sind, dass der Promotor in der Lage ist, die Transkription der DNA-Sequenz zu starten, um dsRNA zu erzeugen. Zum Beispiel wird die Sequenz von Interesse zwischen attP1 und attP2 von pDONRdT7 oder einem ähnlich konstruierten Vektor kloniert.
  • Bei diesem und allen Aspekt(en) der Erfindung, die Promotoren involvieren, können zwei Promotoren die DNA-Sequenz von Interesse flankieren. Die DNA-Sequenz kann sich, wenn sie nicht von wenigstens zwei Promotoren flankiert wird, in einer passenden Sinnorientierung und in einer Gegensinnorientierung im Verhältnis zu dem Promotor befinden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Änderung der Genexpression in einer undifferenzierten Stammzelle oder ihren differenzierten Nachfahren. Die Erfindung schließt auch das Einführen von einer oder mehreren dsRNA gemäß der Erfindung in die Zelle ein, unter Bedingungen, die effektiv sind, die Genexpression in der Stammzelle oder ihren Nachfahren zu ändern.
  • Geeignete Stammzellen schließen ohne Beschränkung embryonale Stammzellen und adulte Stammzellen ein. Differenzierte Nachfahren schließen ohne Beschränkung Zellen ein, die aus embryonalen Stammzellen differenziert sind, und Zellen, die aus adulten Stammzellen differenziert sind.
  • Geeignete embryonale Stammzellen werden vorzugsweise aus Eukaryoten gewonnen, bevorzugter von einem Tier. Embryonale Stammzellen können durch Fachleute bekannte Verfahren isoliert sein, zum Beispiel aus der inneren Zellmasse (ICM) von Embryonen im Blastocystenstadium. Embryonale Stammzellen können zum Beispiel aus zuvor etablierten Zelllinien erhalten werden oder können de novo durch Standardverfahren gewonnen werden.
  • Die embryonalen Stammzellen können das Ergebnis eines Kerntransfers sein. Die Donorkerne können zum Beispiel aus jedem adulten, fötalen oder embryonalen Gewebe durch in der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. In einer Ausführung werden die Donorkerne auf eine zuvor modifizierte Empfänger-Oocyte übertragen. Alternativ werden die Donorkerne vor dem Transfer modifiziert.
  • Zusätzlich kann die Empfänger-Oocyte vor der Zerstörung des Kernmaterials der Oocyte und Übertragung der Donorkerne modifiziert sein. Solch eine Modifikation kann beim Verhindern der Implantation einer Zygote, die das Kernkomplement der Oocyte hat, nützlich sein. Mutationen schließen ohne Beschränkung jede Änderung im Genprodukt oder der Proteinexpression eines Embryos ein, der aus der modifizierten Oocyte abgeleitet wird, welche die erfolgreiche Implantation in der Uteruswand verhindert. Da Implantation in der Uteruswand für befruchtete Säugerembryonen essentiell ist, um über das Blastocystenstadium hinaus fortzuschreiten, könnten aus solchen modifizierten Oocyten gemachte Embryonen einen lebensfähigen Organismus nicht entstehen lassen, wodurch für Zygoten selektiert wird, die das Donorkernkomplement haben. Nicht beschränkende Beispiele solcher Modifikationen schließen jene ein, welche die Expression eines Zelloberflächenrezeptors, der für die Erkennung zwischen der Blastocyste und der Uteruswand erforderlich ist, reduzieren oder eliminieren; Modifikationen, die die Expression von Proteasen, die erforderlich sind, um die Matrix in der Uterusauskleidung zu verdauen und folglich die geeignete Implantation zu erlauben, reduzieren oder eliminieren; und Modifikationen, die die Expression einer Protease reduzieren oder eliminieren, die notwendig ist für die Blastocyste, um sich aus der Zona pellucida zu lösen, wo die Lösung für die Implantation erforderlich ist.
  • Die Erfindung kann verwendet werden, um den Phänotyp eines „Knock-out" in solchen Zielzellen wie Zelloberflächenrezeptoren, Proteasen, Entwicklungsgenen (z.B. Hox-Genen) und jedem anderen Zielgen zu überzeugen. Zum Beispiel kann ein Hox-Gen in einen Vektor inseriert werden, der ähnlich ist zu pDONRdT7, und in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Die Wirtszelle kann in dem Organismus sein, um den „Knock-out" zu erhalten, kann dem Organismus, in welchem der „Knock-out" gewünscht wird, gefüttert werden, wie geeignet. In einem anderen Aspekt kann das Zielgen aus einer Genbank stammen, die von einer eukaryotischen Zelle gewonnen wird, zum Beispiel eine Genbank aus der Planarie S. mediterranea.
  • Eine Promotorsequenz kann ein induzierbarer Promotor oder ein funktionelles Fragment davon sein, oder eine andere Promotorsequenz, die in dem dsRNA-Produktionssystem erkannt wird. Ein Duplikat des Promotors kann in die komplementäre Sequenz inseriert werden, entsprechend einer Position 3' des ersten Transkriptes, das heißt, um die dsRNA zu bilden, wodurch Promotoren erzeugt werden, die die Sequenz von Interesse flankieren. Transkriptionsterminationssequenzen können außerhalb der flankierenden Promotoren inseriert werden. Das Konstrukt kann dann in eine Zelle transfiziert werden, zufällig integriert werden oder zusätzliche Sequenzen können zu dem Vektor hinzugefügt werden, um die homologe Rekombination zu erleichtern. Wo der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, wie zum Beispiel ein Hitzeschockpromotor, wird der Organismus einem induzierenden Ereignis ausgesetzt, wie zum Beispiel Hitzeschock, welches die dsRNA erzeugt, wodurch die Expression des Hox-Gens in den Organismus inhibiert wird.
  • Embryonale Stammzellen oder embryonale Stammzellen, die aus der Befruchtung von modifizierten Oocyten erhalten worden sind, oder die differenzierten Nachfahren der Oocyten können weiter durch Einführen von einer oder mehreren zusätzlichen dsRNA in die Zelle modifiziert werden.
  • Beispielhafte adulte Stammzellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf hämatopoetische Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, Herzstammzellen, Pankreasstammzellen und neuronale Stammzellen. Beispielhafte adulte Stammzellen schließen jede Stammzelle ein, die in der Lage ist, differenzierte ektodermale, mesodermale oder endodermale Abkömmlinge zu bilden. Nicht beschränkende Beispiele differenzierter Zelltypen, die aus adulten Stammzellen entstehen, schließen Blut, Skelettmuskel, Myokard, Endokard, Perikard, Knochen, Knorpel, Sehne, Ligament, Bindegewebe, Fettgewebe, Leber, Pankreas, Haut, Nervengewebe, Lunge, Dünndarm, Dickdarm, Gallenblase, Rektum, Anus, Blase, weiblichen oder männlichen Genitaltrakt, Genitalien und die Auskleidungen der Körperhöhle ein.
  • Das Ändern der Zielgenexpression schließt ohne Beschränkung Änderungen ein, die die Expression von Haupthistokompabilitätskomplex (MHC) reduzieren oder eliminieren. Auf diesem Wege modifizierte Zellen werden von dem Empfänger toleriert werden, wodurch folglich Komplikationen, die aus Implantatsabstoßung herrühren, vermieden werden. Solche modifizierten Zellen sind für die Transplantation in einen verwandten oder nicht verwandten Patienten geeignet, um einen Zustand zu behandeln, der durch Zellschädigung oder Zellverlust gekennzeichnet ist; und Änderungen, die die Expressionen von Genen reduzieren oder eliminieren, die für die virale oder bakterielle Infektion erforderlich sind.
  • In einem anderen Aspekt werden die RNAi-Verfahren der vorliegenden Erfindung für einen Screen der RNA-vermittelten genetischen Interferenz (RNAi) bei Planarien verwendet, der Geninhibitionsstudien im großen Maßstab bei diesem klassischen System einführt. Planarien waren ein klassisches Modellsystem für das Studium von Regeneration, Gewebehomöostase und Stammzellbiologie für über ein Jahrhundert, waren jedoch historisch nicht für ausgedehnte genetische Manipulation zugänglich. In einer Ausführung wurden 1065 Gene einer Planarie gescreent. Mit der RNAi von 240 Genen verbundene Phänotypen identifizieren viele Paradigmen für die Studie von Genfunktion und definieren die Hauptkategorien an Defekten von Planarien, die Genstörungen zeigen.
  • In einer zusätzlichen Ausführung können die Planarien gescreent werden für einen Phänotypen mit einem heterologen Gen aus einem anderen Organismus. Zum Beispiel kann eine Bibliothek aus menschlichen Genen in einer bakteriellen Zellpopulation erzeugt werden, wobei die bakterielle Zellpopulation, einschließlich der menschlichen Bibliothek, in die Planarie eingeführt wird, um für Phänotypen oder andere zelluläre Änderungen zu screenen. Auf diese Weisen kann die Funktion oder die Wirkung von zu der Planarie heterologen Genen untersucht werden.
  • In einer Ausführung wurden die Wirkungen des Inhibierens von Genen mit RNAi auf Gewebehomöostase in intakten Tieren und Neoblastenproliferation in amputierten Tieren bewertet, wodurch folglich Kandidatenstammzellen, Regeneration und Homöostaseregulatoren identifiziert wurden. Die gegenwärtige Erfindung zeigt das große Potential von RNAi für die systematische Erkundung der Genfunktion in wenig untersuchten Organismen und etabliert Planarien als ein neues und mächtiges Modell für die molekulargenetische Studie von Stammzellen, Regeneration und Gewebehomöostase.
  • Planarien sind bilateral symmetrische Metazoen, die für ihre regenerativen Fähigkeiten, ausgedehnten Gewebeumsatz und Regulation als Teil ihrer normalen Homöostase und für das Vorhandensein von pluripotenten adulten Stammzellpopulation, die als Neoblasten bekannt ist, Berühmtheit erlangten. Diese hervorstechenden Attribute der normalen Planarienbiologie beziehen sich auf klassische Probleme der Entwicklungsbiologie und In-vivo-Stammzellregulation, die in anderen allgemein untersuchten Organismen1,2 nicht leicht untersucht werden können.
  • Unter der Annahme, dass diese Probleme schlecht verstanden werden und von Wichtigkeit für das Leben der meisten Metazoenen sind, wurde in einer anderen Ausführung die genetische Regulation von Metazoen in der Planarie Schmidtea mediterranea erkundet. Funktionelle genetische Reihenuntersuchungen in großem Maßstab wurden unternommen und waren zentral beim Verstehen der Biologie von mehreren Metazoen, einschließlich Drosophila melanogaster3, Caenorhabditis elegans4 und Danio rerio5,6. Solch ein Ansatz wurde jedoch durch die Lebenszyklen von Planarien ausgeschlossen. Die Entwicklung von dsRNA-vermittelter genetischer Indifferenz (RNAi)7 und die Anwendung von RNAi auf systematische Studien der Genfunktion8–10 öffneten die Tür für eine neue Generation von genetischen Manipulationen. Bei der gegenwärtigen Erfindung wurden 1065 Gene ausgewählt als eine repräsentative Musterkollektion des Genoms der Planarie S. mediterranea, es wird eine RNAi-basierte Screeningstrategie in großem Maßstab offenbart, um systematisch ihre Expression zu unterbrechen und ihre Funktion bei der Planarienbiologie zu bewerten. Dieser Screen definiert die Hauptphänotypkategorien, welche in Planarien nach Genstörung existieren.
  • In einer Ausführung schließt das Verfahren zum Screening der Planarien erstens das Vergleichen von Regenerationsphänotypen mit Defekten ein, beobachtet in Tieren, denen Neoblasten fehlen. Zweitens schließt das Verfahren das Bewerten der Differenzierung und der Musterbildung in anormalen Blastemen durch Antikörperfärbung ein, um das Ausmaß der neuen Gewebebildung und Musterbildung zu verstehen, welche geschahen. Drittens wurde bestimmt, ob proliferierende Neoblasten in geeigneten Zahlen in Tieren vorhanden waren, welche es nicht vermochten, zu regenerieren, und in neu amputierten Tieren. Schließlich wurden Gene, die für die Regeneration wichtig sind und in intakten Tieren beobachtet worden sind, inhibiert, um Gene zu identifizieren, welche die homöostatischen Aktivitäten von Neoblasten regulieren, und jene, die spezifisch in die Regeneration involviert sind. Die RNAi-Screeningstrategie nutzt die Tatsache, dass die Sequenzen der gestörten Gene bekannt sind, was für die Verknüpfung von Phänotypen mit vorhergesagter/n kodierter/n biochemischer/n Funktion(en) sorgt. Die verschiedenen enthüllten Phänotypen erhellen die Funktion von neuen Genen, identifizieren zuvor unbekannte Wechselwirkungen zwischen Genen und definieren neue Rollen für Gene, die in anderen Organismen charakterisiert sind. Die gegenwärtige Erfindung etabliert neue Paradigmen für die Erkundung, wie Gene die Metazoen-Biologie kontrollieren, einschließlich Regeneration und die In-vivo-Regulation von Stammzellen.
  • Planarien werden gegenwärtig als Mitglieder der Lophotrochozoa angesehen, die eine der drei hauptphylogenetischen Gruppierungen von bilateral symmetrischen Tieren sind27. Die anderen beiden Gruppen sind bekannt als die Ecdysozoa, welche C. elegans und Drosophila einschließen, und die Deuterostoma, welche die Vertebraten einschließen. Die Lophotrochozoa schließen einen mannigfaltigen Satz aus Tieren wie Mollusken, Schnurwürmer (Nemertea) und Anneliden ein, die eine Anzahl von biologischen Merkmalen zeigen, die durch gegenwärtige Ecdysozoa-Modellsysteme nicht herausragen manifestiert sind. Der hierin beschriebene Screen der Planarie S. mediterranea, der 1.065 Gene und 53.400 Amputationen einschloss, ist die erste systematische Studie des Verlustes von Genfunktion von irgendeiner Lophotrochozoe und entdeckt Defekte, die mit der RNAi von 240 Genen verbunden sind, welche die Hauptphänotypkategorien der Planarienregeneration und -homöostase definieren. Viele dieser Phänotypen involvieren Aspekte der Metazoen-Biologie, die in Planarien hervorstechend sind, die jedoch in Drosophila und C. elegans nicht leicht untersucht werden können, einschließlich Regeneration, adulte pluripotente Stammzellen und ausgedehnter Gewebeumsatz als Teil der normalen Homöostase. Als solcher veranschaulicht der Screen der gegenwärtigen Erfindung die Nützlichkeit solcher Analysen in den Lophotrochozoen, um über die Evolution von Genwegen zu informieren, und für die Untersuchung von Prozessen, die für die menschliche Entwicklung und Gesundheit relevant sind, welche in gegenwärtigen genetischen Invertebratensystemen nicht einfach studiert werden können.
  • In einem weiteren Aspekt der gegenwärtigen Erfindung identifizieren die hierin enthüllten Planarienphänotypen Funktionen für neue Gene und neue funktionelle Genassoziationen, ebenso wie sie Rollen für in anderen Organismen charakterisierte Gene bei neuen biologischen Vorgängen identifizieren (5E). Zum Beispiel wird hierin die Funktion von 35 neuen Genen und 38 menschlichen Erkrankungsgenen zurückgeführt, ebenso wie das Definieren von experimentellen Verfahren für funktionelle Studien von mehr. 85 % der mit RNAi-Phänotypen assoziierten Gene sind evolutionsmäßig konserviert. Folglich werden hierin die Rollen für viele konservierte Gene in wenig untersuchten Aspekten der Metazoen-Biologie zurückgeführt. Die gegenwärtige Erfindung entdeckte, dass es mehrere Kategorien von Planarienregenerationsmangelphänotypen gibt, und offenbart Verfahren, um zwischen diesen zu unterscheiden. Eine Kategorie scheint für das Funktionieren von Neoblasten bei der Regeneration gebraucht zu werden, da sie bestrahlten Tieren ähneln, denen Neoblasten fehlen; d. h. die Unfähigkeit, zu regenerieren, Kümmung und Lyse. Von vielen mit diesen RNAi-induzierten Phänotypenattributen assoziierten Genen wird, nicht überraschend, vorhergesagt, dass sie Zellgrundfunktionen kontrollieren (5E). Andere scheinen jedoch spezifischer zu sein und kodieren zum Beispiel ein Argonaut-ähnliches Protein, andere RNA-Bindungsproteine, Signaltransduktionsproteine wie zum Beispiel ein Phosphatidylinositoltransferprotein, Chromatinregulatoren und Gegenspieler von zwei menschlichen Erkrankungsgenen, wie hierin identifiziert. Diese Gene können für das Funktionieren von Stammzellen in allen Tieren wichtig sein. Einige dieser Gene bewirkten niedrige Zahlen von Neoblastenmitosen nach RNAi, was anzeigt, dass sie möglicherweise für das basale Neoblastenfunktionieren erforderlich sind, wohingegen RNAi von anderen Neoblastenmitosen nicht großartig beeinträchtigte, was anzeigt, dass sie für das Funktionieren von Neoblastennachfahren erforderlich sein könnten (5E). Andere Gene werden für die Regeneration gebraucht, verursachten jedoch nicht Kräuselung oder hemmten Neoblastenmitosen nach RNAi (5E). Diese Gene könnten bei der Blastembildung tätig sein.
  • In noch einem anderen Aspekt entdeckt die gegenwärtige Erfindung Gene, die für die Regeneration gebraucht werden, die jedoch nicht für die Homöostase gebraucht werden oder die nicht Geweberegression oder Kräuselung in intakten Tieren nach RNAi bewirken. Diese Gene können die Regenerationsinitiation, Blastembildung und die Differenzierung von Neoblastennachfahren kontrollieren (5E). Zum Beispiel kann, da ein Gen, welches ein SMAD4-ähnliches Protein kodiert, für die Neoblastenfunktion bei der Homöostase entbehrlich ist, aber für die Regeneration gebraucht wird, TGF-β-Signalgebung das Starten der Planarienregeneration kontrollieren.
  • Die gegenwärtige Erfindung offenbart auch, dass nicht alle für Homöostase kritischen Gene für die Regeneration der Neoblastenproliferation gebraucht werden, was nahe legt, dass Homöostase sowohl die Neoblastenkontrolle des Zellumsatzes als auch die regulierte Musterbildung und das Funktionieren von differenzierten Geweben involviert (5E). Diese Beobachtung wird unterstützt durch die Tatsache, dass adulte Planarien konstant die Größe und den Maßstab ihrer verschiedenen Organsysteme regulieren28, und durch die Beobachtung, dass gewisee Homöostasedefekte die Bildung von Läsionen in der Form von zugrunde liegenden Organen involvierten (4F). Zahlreiche andere bemerkenswerte Phänotypen wurden entdeckt, einschließend, zum Beispiel, anormales Verhalten, Läsionen, Wachsen, Asymmetrie, anormale Musterbildung, anormale Gestalt, defekte kaudale Blastembildung und anormale Pigmentierung. Diese Phänotypen identifizierten Gene, die die Musterbildung von Blastemen und das Funktionieren von regenerierten Tieren kontrollieren, die vielen Genen Funktionen zuschreiben und viele Paradigmen für die Erforschung der Planarienbiologie definieren.
  • In einer anderen Ausführung zeigt der RNAi-Screen der gegenwärtigen Erfindung die Verwendung von RNAi, um funktionelle Analysen von Genen in großem Maßstab in genetischen Organismen, die nicht Standard sind, durchzuführen, welche hauptsächlich eine charakterisierte cDNA-Sammlung und geeignete Tierkultur- und dsRNA-Zufuhrverfahren erfordern. Solche Analysen sind von hauptsächlicher Wichtigkeit für die Studie der Evolution von Genen und ihren Funktionen und für die Erforschung von wenig untersuchten, konservierten biologischen Vorgängen in Tieren. Eine Entdeckung der gegenwärtigen Erfindung etabliert S. mediterranea als einen effektiven Organismus für die Studie von in Erkrankung, Stammzellen, Homöostase und Regeneration involvierten Genen ist.
  • Die hierin offenbarte Erfindung kann durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden werden, welche lediglich für Zwecke der Erläuterung gewisser Aspekte und Ausführungen der Erfindung inkludiert sind und von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie die Erfindung beschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Konstruktion des Plasmidvektors pDONRdT7
  • Der in 2 gezeigte RNAi-Vektor pDONRdT7 wurde für die Erzeugung einer S.mediterranea-RNAi-Bibliothek konstruiert. L4440, ebenfalls in 2 gezeigt, ist der Standardvektor, der für das Füttern von Bakterien, die dsRNA exprimieren, an C. elegans verwendet wird und der erfolgreich für einen C.elegans-RNAi-Screen verwendet worden ist. Zwei gegenüberliegende T7- Promotoren wurden eingebaut, welche für die Produktion von dsRNA sorgen. Um die dsRNA-Produktion zu verbessern, wurden T7-Terminatoren genutzt, um sicherzustellen, dass Transkription aus den T7-Promotoren nur dsRNA aus dem cDNA-Insert und nicht aus dem Vektor erzeugt. Die gegenwärtige S.mediterranea-cDNA ist in einem Bluescript-Vektor. Diese cDNA kann durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, welche die Vektorsequenz erkennen und att-Rekombinationssequenzen enthalten und welche mit att-Rekombinationsstellen in pDONRdT7 in einer Reaktion in einer einzelnen Stunde auf der Oberseite des Labortischs rekombinieren. Diese Strategie nutzt das Ersetzen eines toxischen ccdB-Gens mit der cDNA für die Selektion in Bakterien und ist eine modifizierte Version der Gateway®-Genklonierungsstrategie (InvitrogenTM). pDONRdT7 wurde erfolgreich konstruiert und verwendet für den Transfer von cDNA.
  • Beispiel 2: RNAi von C.elegans-unc-22-Gen
  • RNAi des C.elegans-Gens unc-22 resultiert in einem zuckenden Phänotyp in adultem C. elegans. Die unc-22-cDNA wurde in den Vektor pDONRdT7 unter Verwendung einer Gateway-Rekombinationsreaktion (InvitrogenTM) transferiert und pDONRdT7 wurde als für RNAi effektiver befunden als der ursprüngliche L4440-Vektor, wie in Tabelle 1 unten gezeigt. pDONRdT7 sorgt für das effiziente Klonieren einer großen Anzahl an cDNA, allgemein effektiver als die bestehende Technik, und arbeitet mit 100 % Effizienz, um RNAi-Phänotypen in Planarien bei diesem Beispiel zu erzeugen.
  • Figure 00430001
  • Beispiel 3: RNAi des Planarien-PC2-Gens
  • PC2 ist das Gen des Prohormons Convertase 2 von Planarien und ist erforderlich für die einwandfreie Fortbewegung. PC2 wurde in pDONRdT7 unter Verwendung einer Gateway®-Rekombinatonsreaktion (InvitrogenTM) transferiert, verwendet, um dsRNA von PC2 in Bakterien zu erzeugen, welche dann mit für Planarien geeignetem Futter (Leberhomogenat) vermischt wurde und an die Planarien einmal pro Tag für entweder einen, zwei oder drei aufeinander folgende Tage gefüttert wurde. In allen Fällen zeigten 100 % der betroffenen Tiere einen Fortbewegungsphänotyp nach einer einzelnen Fütterungsrunde, wie in Tabelle 2 unten gezeigt.
  • Figure 00440001
  • Folglich resultiert der Einschluss von Transkriptionsterminatorsequenzen für beide Transkripte der dsRNA in einer Zunahme in der Effizienz der Inhibition. Als eine mögliche Ursache dieses neuen und unerwarteten Ergebnisses wird angenommen, dass dies an Beschränkung der Transkription auf die klonierte cDNA liegen muss. Ohne die Anwesenheit von flankierenden Transkriptionsterminatoren schreitet die Transkription in den Vektor hinein fort, was in der Produktion eines großen RNA-Transkriptes resultiert, das die klonierte cDNA ebenso wie die Vektor-DNA-Sequenz kodiert. Die Terminatoren helfen dabei, sicherzustellen, dass nur die klonierte cDNA transkribiert wird, wodurch folglich die Ausbeute an doppelsträngigen RNA-Molekülen gesteigert wird, wodurch genspezifische RNA-vermittelte genetische Interferenz bewirkt wird.
  • Beispiel 4: Konstruktion einer RNAi-Bibliothek
  • pDONRdT7 wurde durch Schaffen eines PCR-Fragmentes aus L444013 erzeugt, welches zwei T7-Promotorsequenzen, die die multiple Klonierstellenregion von L4440 flankieren, zwei Klasse-I- T7-Terminatoren und StuI- und AfIII-Restriktionsstellen enthielt. Dieses Fragment wurde in pDONR221 (Invitrogen) an den AfIII/EcoRV-Restriktionsstellen kloniert. Ein ApaI/EcoRV-Fragment aus pDONR221, enthaltend die attP-Rekombinationssequenzen, ein Chloramphenicolresistenzgen und das toxische mutierte ccdB-Gen, wurde in die ApaI/SmaI-Stellen auf dem resultierenden Plasmid kloniert. Um RNAi-Bibliotheksklone zu erzeugen, wurde cDNA in einem pBluescript-Vektor aus Neoblasten-angereicherten und Kopfbibliotheken29 durch PCR amplifiziert, unter der individuellen Verwendung von Primern, die pBluescript erkennen und attB-Rekombinationssequenzen enthalten. PCR-Produkte wurden einzeln in pDONRdT7 unter Verwendung einer BP-Reaktion (Invitrogen) kloniert, um RNAi-Eingangsklone zu erzeugen (3A). RNAi-Eingangsklone wurden einzeln in den E.coli-Stamm HT11513 für RNAi transformiert.
  • Beispiel 5: RNAi
  • RNAi-Klone enthaltende Bakterien wurden über Nacht in 2 × YT-Medien, enthaltend Kanamycin und Tetracyclin, wachsen gelassen. Übernachtkulturen wurden 1:10 in frischen Medien verdünnt, auf einen OD-Wert von 0,4 bei 37 °C wachsen gelassen und mit 100 mM IPTG für zwei Stunden (h) induziert. Um 10 Tiere zu füttern, wurden 2,5 ml Bakterien durch Zentrifugation gesammelt und in 25 μl einer 1:1-Mischung aus homogenisierter Leber (zuvor gemixt und durch ein Edelstahlsieb passiert) und Wasser resuspendiert. Diese Suspension wurde mit 9,4 μl 2 % bei sehr niedriger Temperatur gelierender Agarose (ultra-low gelling temperature agarose) und 0,7 μl roter Lebensmittelfarbe vermischt und es wurde ihr erlaubt, sich auf Eis in Tropfen mit ~ 10 μl zu verfestigen. Raumtemperatur- (RT-) RNAi-Futter wurde an Planarien verfüttert. Nach vier Tagen wurde den Tieren das RNAi-Futter für ein bestimmtes Gen wiederum verfüttert und 3,5 Stunden nach dieser Fütterung wurden die Köpfe und die Schwänze mit einem Skalpell entfernt. Nach neun Tagen der Regeneration wurden die Tiere wiederum gefüttert und amputiert (3B). Um die Gewebehomöostase in RNAi-Tieren zu bewerten, wurden vier Fütterungen durchgeführt. Etliche der Gene aus dem Pilotscreen wurden inhibiert durch Injizieren von dsRNA, 3 × 32 nl an drei aufeinander folgenden Tagen, Amputieren, Injizieren von 3 × 32 nl nach der Regeneration und wiederum Amputieren. Die ungeschlechtliche klonale CIW4-Linie von S.mediterranea-Tieren wurde für diese Studien verwendet und, wie kürzlich beschrieben19, aufrechterhalten.
  • Beispiel 6: Antikörpermarkierung
  • Tiere wurden in 2N HCl mit 4 °C für fünf Minuten abgetötet, in Carnoy-Fixativ (60 % Ethanol, 30 % Chloroform, 10 % Eisessig) für 2 Stunden auf Eis fixiert, in Methanol bei –20 °C für eine Stunde gegeben und über Nacht in Licht bei RT in 6 % Wasserstoffperoxid in Methanol gebleicht. Tiere wurden zweimal in Methanol gespült und bei –20 °C gelagert. Nach Rehydrierung in einer Folge mit 75 %, 50 %, 25 % MeOH:PBTx (PBS + 0,3 %Triton X-100) und zwei Spülungen in PBTx wurden die Tiere für 6 Stunden bei RT in PBTxB (PBTx + 0,25 % BSA) oder PBTxBH (PBTxB + 10 % Pferdeserum) geblockt. Durch das Vorgehen hindurch wurden Tiere bei Raumtemperatur (RT) unter Schwingen gehalten. Tiere wurden über Nacht mit 1:5000 α-phosphoryliertes Histon H3 (freundliches Geschenk von Dr. C. A. Mizzen) 1:5000 α-Arrestin (freundliches Geschenk von Dr. K. Agata) und/oder 1:133 α-Synaptotagmin (freundliches Geschenk von Dr. K. Agata) inkubiert. Markierte Tiere wurden für 5 Minuten in PBTxB gespült, dann 1 × pro Stunde, 6 Mal. Tiere wurden über Nacht in 1:400 Ziegen-α-Maus-Alexa488 (Molecular Probes) oder in 1:100 Ziegen-α-Kaninchen-HRP (Molecular Probes)markiert. Tiere wurden für 5 Minuten gewaschen, dann 1 × pro Stunde, 6 Mal. Für jene, die mit α-Maus-488 markiert worden sind, wurden die Tiere in Vectashield (Vektor) eingebettet. Für jene, die mit α-Kaninchen-HRP markiert worden sind, wurden die Tiere mit 1:100 Tyramid-Alexa568 in Amplifikationspuffer (Molecular Probes) für eine Stunde inkubiert. Tiere wurden 5 × für 5 Minuten, jeweils in PBTxB, dann 4 × für 30 Minuten, jeweils in PBTxB, gespült. Tiere wurden über Nacht im Dunkeln bei 4 °C gelagert. Die Tiere wurden 6 × für eine Stunde jeweils bei RT gespült und in Vectashield (Vektor) eingebettet.
  • Beispiel 7: RNAi-Screen in S. mediterranea
  • Von RNAi wurde gezeigt, das sie die Expression von S.mediterranea-Genen mit einem hohen Effizienzgrad und Spezifitätsgrad unterbricht11,12. Die Methodik der RNAi durch Füttern, die für den Screen der gegenwärtigen Erfindung verwendet wurde, involviert das Exprimieren von dsRNA aus einem Planariengen in Bakterien und das Suspendieren jener Bakterien mit dem gewöhnlich verwendeten Planarienfutter aus gemixter Leber, gemischt mit Agarose12. Die Wirksamkeit des Fütterungsverfahrens und -protokolls, das in diesem Manuskript verwendet wird (3, Methoden), wurde durch ausgedehnte Optimierungsexperimente (Daten nicht gezeigt) maximiert. Ein RNAi-Vektor (pDONRdT7) wurde erzeugt, der zwei T7-RNA-Polymerasepromotoren enthält, die von zwei Klasse-I-T7-Transkriptionsterminatoren flankiert werden, und der eine modifizierte Gateway-Klonierstrategie (Invitrogen) nutzt, um den cDNA-Transfer (3A) zu erleichtern. Die Daten der gegenwärtigen Erfindung zeigen, dass die Anwesenheit von T7-Terminatoren in diesem Vektor in effektiverer RNAi resultiert, als jene, die mit konventionellen Vektoren13 in C. elegans und Planarien beobachtet wird (Daten nicht gezeigt).
  • Aus zwei cDNA-Bibliotheken zufällig selektierte S.mediterranea-cDNA wurde in pDONRdT7 inseriert und eingeführt in den RNaseIII-defizienten Bakterienstamm HT11513. 1065 dieser Gene wurden inhibiert unter Verwendung von RNAi durch Füttern (3B). Für jedes zu inhibierende Gen wurde das dsRNA-Futter zweimal innerhalb der Spanne von 5 Tagen an Planarien verfüttert. Die Köpfe und Schwänze von 8 Planarien pro Gen wurden chirurgisch entfernt und nach 8 Regenerationstagen wurden Tiere für Defekte ausgewertet („A"-Wertung) (3B). Am folgenden Tag wurden die Tiere wiederum mit dem dsRNA-Futter gefüttert und die regenerierten Köpfe und Schwänze wurden chirurgisch entfernt. Nach weiteren 8 Tagen wurden die Tiere ausgewertet („B"-Wertung) für die Größe der Kopfblasteme auf Rümpfen und Schwänzen, die Größe des Schwanzblastems auf Köpfen, die Fähigkeit von Schwänzen, einen Pharynx in dem bereits existierenden Gewebe zu regenerieren, die Form der Blasteme, die Anwesenheit und das Muster von Photorezeptoren, Lichtempfindlichkeit, Vibrationsempfindlichkeit, Berührungsempfindlichkeit, Umdrehen, Fortbewegung, Wenden und Kopfheben. Nach weiteren 6 Tagen wurden Tiere für Änderungen in jedem vorexistierenden Phänotyp oder für die Entwicklung eines neuen Defektes ausgewertet („C"-Wertung). Viele Tiere, sowohl mit als auch ohne einen detektierbaren Defekt, wurden fixiert und durch Antikörpermarkierung analysiert, um zusätzliche Phänotypen oder Defekte auf Zellniveau zu detektieren (3C). Mehrfache RNAi-Fütterungen und zwei Regenerationsrunden halfen, Proteinüberdauern zu minimieren. Die A-, B- und C-Wertungszeitpunkte dienten dazu, unterschiedliche Grade an Phänotypenexpressivität zu bestimmen, da Aspekte eines bestimmten Genphänotyps in der A-Wertung beobachtet werden könnten und durch einen schärferen Aspekt der B-Wertung ausgeschlossen werden könnten.
  • Beispiel 8: Identifikation von mehreren neuen Paradigmen für die Untersuchung der Genfunktion
  • Die Typen an Phänotypen, welche durch Beeinflussen der Genfunktion in Planarien entdeckt werden würden, waren unbekannt. Von den 1065 Genen, die durch RNAi gestört wurden, verliehen 240 (22,5 %) spezifische Phänotypen, wenn sie gestört wurden (Tabellen 3, 4, 5). Eine Musterauswahl des Spektrums an beobachteten Phänotypen kann in Tabelle 3 und 4A bis J gefunden werden. Die entdeckten Hauptphänotypkategorien schlossen die Unfähigkeit zu regenerieren (4B), Kräuselung von Tieren um ihre ventrale Oberfläche herum (4B), Blastemform- und -morphologieanormalitäten (4C), eine Reihe von Photorezeptoranormalitäten (4D), Verhaltensdefekte (Tabellen 3, 4), Geweberegression (4E), Läsionen (4F) und Lyse (4F) ein. Regenerationsanormale Phänotypen wurden kategorisiert unter Verwendung eines in Tabelle 4 beschriebenen Nomenklatursystems. Eine große Anzahl unerwarteter und überraschender Phänotypkategorien wurde ebenfalls entdeckt (Tabelle 4). Beispiele schließen Defekte ein, die einzigartig sind bei kaudalen Blastemen (TLBLST), wenn sie gestört werden (Tabelle 4, 4B), Tiere, die seitlich gleiten (Tabelle 4), Tiere mit Anzeichen von Asymmetrie (Tabellen 4, 5, 4D, 5F), Tiere mit anormaler Gestalt (4H), Tiere mit Pigment-„Fleckchen" in den normalerweise unpigmentierten Blastemen oder mit Körperflecken (4I) und Tiere mit ektopischen Geschwulsten und Photorezeptoren (4J, 5H). Diese neuen Phänotypen etablieren einzigartige Paradigmen, um die genetische Kontrolle von diversen Aspekten der schlecht verstandenen Biologie von Planarien zu studieren.
  • Beispiel 9: S.mediterranea-Gene in Zusammenhang mit RNAi-Phänotypen sind konserviert
  • Von den mit RNAi-Phänotypen in Zusammenhang stehenden 240 Genen wurde von 205 (85 %) vorhergesagt, dass sie Proteine mit signifikanter Homologie zu jenen kodieren, die in den Genomen anderer Organismen kodiert werden (Tabellen 4, 5). Diese hohe Häufigkeit, gekoppelt mit dem diversen Satz vorhergesagter Funktionen für diese Gene (Tabelle 3), zeigt den Nutzen von Studien von S. mediterranea, um über die allgemeine Metazoenbiologie breit zu informieren. Zum Beispiel sind 38 der mit RNAi-Phänotypen assoziierten identifizierten Gene verwandt mit menschlichen Erkrankungsgenen (Tabelle 6). Diese Gene bewirken eine Reihe von Phänotypen; zum Beispiel sich erstreckend von fehlerhafter Regeneration nach RNAi eines Gens für spastische Paraplegie14 bis zu fehlerhafter Photorezeptorregeneration und -funktion nach RNAi eines RGS9-ähnlichen kodierenden Gens, welches mit Bradyopsie im Menschen15 in Zusammenhang steht.
  • Unter der Annahme, dass nur acht dieser 38 Gene ein entsprechendes Maus-Knock-out-Modell haben, stellen die in S. mediterranea beobachteten Phänotypen neue Information über die Funktionen von Erkrankungsgenen bereit und zeigen die Nützlichkeit von S. mediterranea für die Untersuchung von Orthologa von menschlichen Genen, die in genetische Funktionsstörungen verwickelt sind. Weiterhin können die verbleibenden 35 Gene, die mit RNAi-Phänotypen verbunden sind, für welche keine offensichtlichen Homologe in anderen Phyli gefunden worden sind, ebenfalls von medizinischer Relevanz sein. Diese Gene können für die Plathelminthes spezifisch sein und können folglich für das Überleben ihrer verwandten pathogenen Brüdern, die Cestoden und Trematoden (Tabellen 4, 5), erforderlich sein. Unter Berücksichtigung, dass von solchen Pathogenen geschätzt wird, dass sie Erkrankung in annähernd 300 Millionen Menschen weltweit verursachen (www.who.int), können diese Gene attraktive Arzneimittelziele ausmachen. Zusammen stellt die gegenwärtige Erfindung Einsichten in das Funktionieren einer großen Anzahl von Genen bereit, welche die Metazoen-Biologie kontrollieren, ebenso wie sie neue Information über die Funktionen von Erkrankungsgenen präsentiert.
  • Beispiel 10: Ähnliche Phänotypen identifizieren Gene mit geteilten funktionellen Aktivitäten
  • In mehreren Fällen verleihen Gene, von denen vorhergesagt wird, dass sie zusammenwirken, wenn sie unabhängig durch RNAi gestört werden, ähnliche Phänotypen. Zum Beispiel bewirkte RNAi von zwei Genen, die unterschiedliche Untereinheiten des ARP2/3-Komplexes mit sehr unterschiedlichen Nukleotidsequenzen (HE.2.11E, HE.2.12A) kodieren, frühe Lyse; RNAi von zwei Genen, die Bestandteile der TGF-β-Signalgebung kodieren (HE.2.07D, HE.3.03B), bewirkte eingekerbte Blasteme; und RNAi von α- und β-Tubulin-kodierenden Genen (HE.1.03G, HE.1.01H) bewirkte unkoordiniertes Verhalten, Blasen und Anschwellen (Tabellen 4, 5). Diese Daten zeigen die Fähigkeit von S.mediterranea-RNAi-Untersuchungen, mehrere Wegkomponenten zu identifizieren, die in diverse biologische Ereignisse verwickelt sind. Diese Beobachtungen zeigen auch, dass der Screen der gegenwärtigen Erfindung vorhersagende Kraft bereitstellt, d. h., Gene mit unbekannter Funktion oder unbekannter Assoziation mit anderen Genen können zusammen mit jenen Genen wirken, die einen ähnlichen RNAi- Phänotyp teilen.
  • Zum Beispiel bewirkte RNAi von NBE.3.07F oder NBE.5.04A Flecken, Blasen und Anschwellen (4I). Das erste ist ähnlich mit Hunchback und das andere kodiert ein POU-Domänenprotein (Tabelle 4). Folglich mögen diese beiden Transkriptionsfaktoren zusammenwirken. Ebenso bewirkte RNAi von HE.1.08G oder NBE.8.03C Fleckchen (4I). Das erste kodiert ein α-Spektrin-ähnliches Protein und das andere kodiert ein Protein mit keiner bekannten vorhergesagten Funktion, das folglich mit α-Spektrin wirken mag (Tabelle 4). Für die vielen andern Phänotypkategorien, einschließend Regenerations- und Neoblastenanormalitäten, identifizieren die Daten in Tabellen 4, 5, 7, 8 und 7A bis E geteilte Eigenschaften, die auf viele Kandidaten funktioneller Assoziationen hinweisen (siehe unten).
  • Beispiel 11: Proliferations- und Musterbildungsphänotypen auf dem zellulären Niveau
  • Um die Häufigkeit zu bestimmen, mit welcher zelluläre Defekte geschahen, aber keinen mit Lichtmikroskopie detektierbaren Phänotypen bewirkten, wurden die Photorezeptorneuronen von Tieren ohne sichtbaren Phänotyp mit einem anti-Arrestinantikörper (VC-1)16 markiert. Tiere aus der RNAi aus 564 Genen wurden getestet. Die Photorezeptorneuronen wurden für die Studie ausgewählt, da sie leicht für Defekte auszuwerten sind12, in zwei gut definierten Clustern aus jeweils ~ 24 Zellen vorkommen und sich in leicht sichtbar zu machenden, posterioren und ventralen Fortsätzen zu den Kopfganglien erstrecken17,18 (5A). Zehn mit zellulären Phänotypen nach RNAi verbundene neue Gene wurden auf diese Weise identifiziert (Tabellen 5, 7). Zusätzliche Tiere mit unbestimmten morphologischen Defekten, resultierend aus der RNAi von anderen 113 Genen, wurden auch mit VC-1 markiert. Diese Tiere wurden genutzt, um die Machbarkeit des Detektierens von Proliferationsdefekten durch Markieren mit einem Antikörper, der mitotische Neoblasten erkennt19 (αH3P, anti-phosphoryliertes Histon H320), zu bestätigen. Analyse der αH3P-Daten erforderte als erstes das Quantifizieren der Anzahl von mitotischen Zellen in Kontrolltieren (Tabelle 7, 5M) und das Kategorisieren von Unterschieden der in RNAi-Tieren gefundenen mitotischen Anzahlen von der Kontrolle. 10 zusätzliche Gene wurden als mit Proliferationsdefekten nach RNAi in Zusammenhang stehend bestimmt und drei von diesen hatten auch Photorezeptorneuronenanormalitäten (Tabelle 7).
  • Als nächstes wurden Tiere, die anormal regenerierten, aus der RNAi von 140 Genen verwendet und Defekte in der Musterbildung, Differenzierung und Neoblastenproliferation wurden bewertet durch Fixieren von Mustern nach 14 Regenerationstagen und ihrem Markieren mit VC-1 und αH3P. Analyse der VC-1-Daten enthüllte eine große Varietät an Photorezeptoranormalitäten (Tabelle 7, 5B bis L). Phänotypen schließen ein begrenzte Regeneration des Photorezeptorsystems (5B bis F), Photorezeptorzellkörper, die posterior aus dem Hauptneuronencluster ausgestreut waren („Tränen"-Phänotyp), und/oder ektopische Photorezeptoren (5G, H), diffuse Cluster aus Photorezeptorneuronen (5E), asymmetrische Photorezeptorzellkörpercluster (5F), Defekte der Chiasma optice ( 5D, I), Axonanormalitäten (5J, K) und allgemeine Gewebeauflösung (5L) ein. Diese Defekte enthüllen zelluläre Anormalien und Anomalien der Musterbildung, die mit spezifischen Genstörungen in Zusammenhang stehen, die durch Lichtmikroskopie nicht beobachtet hätten werden können (Tabelle 7).
  • Homologien von Genen im Zusammenhang mit diesen RNAi-induzierten Musterbildungsdefekten können in Tabelle 7 gefunden werden. Analyse der αH3P-Daten enthüllte Proliferationsdefekte (Tabelle 7, 5M). Von den 140 Genen in diesem Datensatz führte RNAi von 48 der Gene zu niedrigen mitotischen Zellzahlen, was nahe legt, dass ihre Störung Anomalien aufgrund von Abwesenheit von Neoblasten oder ihrer Unfähigkeit zu proliferieren bewirken könnte. Eine große Mehrheit von Tieren mit einer geringeren als der normalen Anzahl von mitotischen Zellen, hatte auch Defekte bei der Produktion von Blastemen normaler Größe (Tabelle 7, 5M). RNAi von 8 Genen führte zu anormal hohen Zahlen von mitotischen Neoblasten im Vergleich mit der Kontrolle, was anzeigt, dass diese Tiere Regenerationsanormalitäten aufgrund von Mitosedefekten oder Fehlregulation der Neoblastenpopulation entwickelt haben könnten (Tabelle 7, 5M). RNAi von 84 Genen führte zu vergleichsweise normalen Anzahlen von mitotischen Zellen, was anzeigt, dass diese Tiere Defekte entwickelt haben könnten aufgrund von Disfunktion von anderen Zellen als Neoblasten (Tabelle 7, 5M). Diese Ergebnisse identifizieren unterschiedliche funktionelle Kategorien für sämtliche der getesteten Gene und zeigen die Machbarkeit des Durchführens von Screens für bestimmte zelluläre Defekte in S. mediterranea (Tabelle 7).
  • Beispiel 12: Gene für die Regeneration
  • Viele für die Regeneration wichtige Gene wurden identifiziert. Anormalien in der Blastemgröße wurden auf einer Skala von 0 bis 3 kategorisiert, wobei sich „BLST(0)" auf keine Regeneration bezieht und „BLST(3)" auf normale Regeneration bezieht (4B). Eine große Anzahl von Defekten jedoch, die für Regeneration nicht spezifisch sind, jedoch andere allgemeinere zelluläre Vorgänge beeinflussen, mag der Unfähigkeit von Tieren zugrunde liegen, nach RNAi zu regenerieren. Da Neoblasten essentiell sind, damit Regeneration in Planarien geschehen kann, wurden zwei Kategorien an Experimenten gestaltet, um zu bestimmen, ob für Regeneration wichtige Gene auch wichtig waren für das Überleben und die Proliferation von Neoblasten. Erstens, RNAi-Phänotypen wurden mit jenen verglichen, die in Tieren beobachtet wurden, denen Neoblasten fehlen. Zweitens, Gene, die für die Produktion von Blastemen normaler Größe gebraucht werden, wurden inhibiert und fixiert in Tieren nach Amputation, um die Zahlen von mitotischen Neoblasten während der Initiation der Regeneration zu bestimmen.
  • Gene, die gebraucht werden für das Funktionieren von Neoblasten. Bestrahlung von Planarien ist dafür bekannt, dass spezifisch die Neoblasten abgetötet werden, dass die Regeneration gehemmt wird und dass sie in Lethalität resultiert21–23. Bei bestrahlten (z.B. 6000 rad) und amputierten Wildtyp-S.mediterranea-Tieren wurde beobachtet, dass sie unfähig sind, zu regenerieren (4A), ihre Körper um ihre ventrale Oberfläche herum innerhalb von 15 Tagen kräuselten (4A) und anschließend durch Lyse starben. Deshalb könnten Gene, die ähnliche Defekte nach RNAi bewirken, für die Neoblastenfunktion bei der Regeneration gebraucht werden. 140 Genstörungen hemmten, beschränkten oder reduzierten die Regeneration (Tabellen 3, 4, 5). Die RNAi aus 47 Genen bewirkte eine Wellenbildung des Körpers um die ventrale Oberfläche herum (CRL), ähnlich zu jener, die in bestrahlten Tieren gesehen wird (Tabelle 4, 4B). Lyse war das typische Schicksal dieser gekräuselten Tiere (Tabelle 4). Diese Kandidatenstammzellregulationsgene für die Regeneration schließen unter erwarteten basalen Zellmaschineriefaktoren RNA-Bindungsproteine (HB.14.6D, NBE.4.06D, NBE.7.07D, NBE.8.12D), Signaltransduktionsfaktoren (NBE.4.08C, Phosphatidylinositol-Transferprotein), Chromatinregulatoren (HE.2.01H, Histondesacetylase) und Erkrankungsgene (NBE.3.11F, Chondrosarcom-assoziiertes Protein 2 und NBE.3.08C, menschliches spastisches Paraplegieprotein) (Tabellen 4, 5) ein.
  • Keine Markierung bestrahlter Tiere wurde mit αH3P beobachtet, was anzeigt, dass αH3P spezifisch mitotische Neoblasten markiert (5M). 139 Gene, die mit RNAi-Phänotypen in Zusammenhang stehen, wurden inhibiert und die resultierenden Tiere wurden 16 oder 24 Stunden nach Amputation mit αH3P markiert. 50 der 139 untersuchten Gene bewirkten niedrigere als normale Zahlen mitotischer Zellen nach RNAi und Amputation (Tabelle 8, 5N, 7A bis D). Die Mehrheit dieser Gene störte auch die Fähigkeit, nach RNAi zu regenerieren (7A bis D). Diese Gene könnten wichtig sein für die Neoblastenaufrechterhaltung oder -entwicklung. Vier Gene, die sehr hohe Zahlen mitotischer Zellen nach RNAi und Amputation bewirken, schließen zwei Bestandteile aus Proteasom, Gamma-Tubulin und CDC23 (Untereinheit eines die Anaphase fördernden Komplexes) ein, was mögliche Defekte in der Chromosomenaufteilung bei der Mitose anzeigt (Tabelle 8). Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass durch NBE.5.01A-RNAi (eine andere Untereinheit eines die Anaphase fördernden Komplexes) gescreente Tiere ebenfalls hohe Zahlen von αH3P-markierten Zellen 14 Tage nach Amputation hatten (Tabelle 7). Bei Genen, die den ventralen Kräuselungsphänotypen nach RNAi und Amputation bewirken, ist es sehr wahrscheinlich, dass sie erforderlich sind für die Regeneration (P < 0,0001) und dass sie oftmals, aber nicht immer in Zusammenhang stehen mit reduzierten mitotischen Zellzahlen nach Amputation (7A). Dass RNAi von Genen Regeneration hemmen kann, Kräuselung bewirken kann und Mitosezahlen nicht reduzieren kann, legt nahe, dass postmitotische Unterbrechungen der Neoblastenfunktion ebenfalls identifiziert worden sind (n = 13 Gene, Tabelle 8, 7E).
  • Gene, die für die Regeneration notwendig sind, aber nicht für das Funktionieren von Neoblasten. Bei 85 von 139 durch RNAi inhibierten Genen hatten Tiere, die mit αH3P nach Amputation markiert worden sind, normale Zahlen mitotischer Neoblasten (Tabelle 8, 5N). Diese Beobachtung schließt nicht die Möglichkeit von feinen mitotischen Defekten oder anderen Defekten in dem Zellzyklus aus. RNAi von 38 dieser Gene bewirkte Regeneration von sehr kleinen Blastemen (BLST ≤ 1,5, 7A bis E). Diese 38 Gene repräsentieren einen auffallend verschiedenen Satz an Genfunktionen aus jenen Genen, die für die Regeneration gebraucht werden und die Kräuselung nach RNAi bewirken, oder jene, die die Zahl mitotischer Zellen reduzieren. Zum Beispiel kodieren von 30 Genen, die Kräuselung und anormale Zahlen mitotischer Neoblasten nach RNAi und Amputation bewirkten, 18 ribosomale Proteine und nur eines kodiert ein metabolisches Protein (Tabelle 8). Im Gegensatz dazu kodiert von den 38 Genen, die für die Regeneration, aber nicht für Neoblastenmitosen wichtig waren, nur eines einen cytosolischen Ribosomenbestandteil, und von acht wird vorhergesagt, dass sie in den Metabolismus verwickelt sind (Tabelle 8). Von den 38 für Regeneration wichtigen Genen, die aber nicht gebraucht werden für die Anwesenheit und/oder Teilung von Neoblasten, wird von fünf vorhergesagt, dass sie RNA-bindende Proteine kodieren (HE.1.07A, HE.2.01A, HE.2.09A, HE.2.09G, HE.4.02E), und von fünf, dass sie die Signaltransduktionsproteine kodieren (HE.3.03B, HE.4.05E, NBE.3.03G, NBE.4.12G, NBE.6.07H, Tabellen 4, 8). Diese Gene können die Regenerationsinitiation kontrollieren, die Fähigkeit von Neoblastennachfahren, differenzierte Zellen zu bilden oder zu organisieren, um ein Blastem zu bilden.
  • Beispiel 13: Gewebehomöostasedefekte kategorisieren Regenerationsgenfunktionen
  • Um die zellulären Funktionen von für Regeneration erforderlichen Genen weiter zu verstehen, wurde ihre Funktion bei der Gewebehomöostase untersucht. Da Neoblasten den ausgedehnten Zellumsatz kontrollieren, der während dem normalen adulten Planarienleben geschieht19, erlaubt die Beobachtung von nicht-amputierten RNAi-behandelten Tieren eine Bewertung, ob Gene für sämtliche Neoblastenfunktionen erforderlich sind, primäre Funktionen bei der Regeneration haben oder für das Funktionieren von differenzierten Zellen erforderlich sind. Unter Verwendung des Wissens um Phänotypen aus dem Regenerationsscreen hierin, wurden 123 Gene ausgewählt, um eine Verteilung von Blastemgrößenphänotypen nach RNAi darzustellen, sich erstreckend von 0,5 bis 2,5 (Tabelle 8). Weitere 20 Gene wurden ausgewählt, die eine Auswahl an anderen Defekten nach RNAi bewirken, einschließlich Geweberegression nach Regeneration, Lyse, kaudale Blastemanomalien, Photorezeptordefekte und Paralyse (Tabelle 7). Diese 143 Gene wurden durch RNAi in jeweils 20 Tieren inhibiert. Acht Tiere wurden intakt belassen, 5 Mal über 4 Wochen gefüttert und 3 bis 4 Mal pro Woche für 10 Wochen beobachtet, um die Rolle dieser Gene bei der Gewebehomöostase zu beurteilen (3D). 12 Tiere aus der RNAi von jedem der 143 Gene wurden nach dem für den Screen beschriebenen Protokoll amputiert (3B). Von diesen wurden sechs 16 oder 24 Stunden nach Amputation fixiert und mit αH3P markiert (siehe oben) und der Rest wurde als eine Kontrolle für die Wirksamkeit der RNAi-Behandlung beobachtet (3D). Die Anzahl teilender Zellen wurde verglichen mit jener von Kontroll-RNAi (C. elegans unc-22), amputierte Tiere. RNAi von 111 dieser 143 Gene verlieh stabile Defekte, welche die Hauptplanarienhomöostasephänotypen definieren (Tabelle 8, 6B bis G). Überraschenderweise gab es eine große Vielfalt in den Mustern an Läsionenbildung und Geweberegression bei intakten RNAi-Tieren, was die komplexe Weise zeigt, in welcher Störung von unterschiedlichen Genen die Homöostase in Planarien beeinträchtigt (6B bis G). Für Tiere der RNAi von jedem untersuchten Gen vergleichen die 7A bis D die Gewebehomöostase- und Neoblastenproliferationsergebnisse mit der Größe der erhaltenen Blasteme nach RNAi und Amputation (siehe unten).
  • Gene, die die Kontrolle des Zellumsatzes durch Neoblasten regulieren. Gene, die RNAi-Phänotypen in intakten adulten Tieren verleihen, welche ähnlich sind wie von bestrahlten intakten Tieren, und die für die Regeneration gebraucht werden, werden wahrscheinlich gebraucht für sämtliche Aspekte des Neoblastenfunktionierens. Bestrahlte, intakt gelassene Tiere zeigten reproduzierbare Homöostasedefekte: Geweberegression innerhalb von acht Tagen (6A), Kräuselung innerhalb von 15 Tagen (6A) und Lyse. Das Gewebe anterior zu den Photorezeptoren, wo Regression typischerweise beobachtet wird, ist normalerweise zur Regeneration unfähig24 und wird konstant durch Neoblastennachfahren ersetzt19. RNAi von vielen Genen bewirkte Defekte, die ähnlich sind zu jenen, die in bestrahlten, intakten Tieren beobachtet werden; und diese Gene könnten für die Neoblastenfunktion gebraucht werden (Tabelle 8, 6B, C). Geweberegression und Kräuselung neigen dazu, in RNAi-Experimenten gemeinsam zu erscheinen (32 von 45 Fällen, in welchen Regression oder Kräuselung beobachtet wurde, P < 0,0001), ebenso wie mit Lyse (29/32), was einen gemeinsamen zugrunde liegenden Defekt nahe legt (Tabelle 8, 7C). Abnahme von αH3P-markierten Zellen nach Amputation korreliert mit Kräuselung und Regressionsdefekten in intakten Tieren (7C). Gene, die Regression und Kräuselung nach RNAi in intakten Tieren bewirken, neigen dazu, für die Regeneration gebraucht zu werden (26 von 32 Genen, P < 0,0005), was anzeigt, dass diese Gene für sämtliche Neoblastenfunktionen erforderlich sein könnten (7C). Von den 66 Genen in dieser Studie, die für die Regeneration gebraucht wrden (BLST (0/0,5)), brachte RNAi von 31 der Gene intakte Tiere dazu, Geweberegression zu zeigen, und RNAi von 28 der Gene brachte intakte Tiere dazu, sich zu kräuseln, was anzeigt, dass nur ungefähr die Hälfte der Gene, die für Regeneration gebraucht werden, für die Neoblastenfunktion bei der Homöostase gebraucht werden mögen. Unter den 47 Genen, die Kräuselung und/oder Regression in intakten Tieren nach RNAi bewirkten, wird von 21 Genen vorhergesagt, dass sie Proteine kodieren, die in die Translation oder den Metabolismus involviert sind, 2 Gene in Vesikeltrafficking, 3 Gene in den Zellzyklus, 3 Gene in Chromatinfaktoren, 1 Gen in Cytoskelettprotein, 4 Gene in RNA-Bindungsfaktoren, 1 Gen, ähnlich einem Erkrankungsprotein, 1 Gen in Proteintransport, 2 Gene in RNA-Splicing, 3 Gene in Signaltransduktionsproteine und 6 Gene mit unbekannten Funktionen (Tabelle 8). Dieser Gensatz stellt ein Profil von Genfunktionen bereit, die wahrscheinlich erforderlich sind für das Funktionieren von Neoblasten.
  • Gene, die spezifisch für Rogation gebraucht werden. Gene, die für die Regeneration gebraucht werden, neigen auch dazu, für die Homöostase gebraucht zu werden (P < 0,005) (7B). RNAi von 33 von 143 Genen verlieh jedoch keine oder nur kleinere Defekte in intakten Tieren (Tabelle 8, 7B). 25 dieser 33 Gene waren in zwei gesonderten RNAi-Experimenten verbunden mit kleineren Blastemen als normal (Tabelle 8). Ein Gen, HE.3.04D, ist ein Kandidat für einen neuen Wundheilungsfaktor, da es Lyse nach Amputation bewirkt, wenn es gestört wird. Von zwei Genen, die wichtig sind für die Bildung von kaudalen Blastemen (HE.4.06F, NBE.7.07H), wird vorhergesagt, dass sie ein neues Protein kodieren und eine Nucleostemin-ähnliche GTPase (Tabellen 4, 8). Wenigstens 4 Gene bewirkten Geweberegression nach Amputation und Regeneration und kodieren einen Transporter (NBE.2.08E), einen Kaliumkanalregulator (NBE.3.01A), eine leichte Kette von Myosin (HE.2.11C) und ein FKBP-ähnliches Immunophilin (NBE.3.05F) (Tabellen 4, 8). Gene, die für die vollständige Regeneration gebraucht werden, die aber anscheinend nicht notwendig sind für die Homöostase, schließen jene ein, von denen vorhergesagt wird, dass sie Proteine kodieren, die ähnlich sind zu Chondrosarcom-assoziiertem Protein 2 (NBE.3.11F), einem DEAD-Box-RNA-Bindungsprotein (HE.1.06D), SMAD4 (HE.3.03B), Baf53a (HE.3.10F), einer Topoisomerase (HE.3.05A) und einem WW-Domänenprotein (HE.3.02A) (Tabellen 4, 8). Etliche dieser Gene könnten Signalisierungsmechanismen aufzeigen, die spezifisch Neoblasten nach Verwunden aktivieren oder die andere Prozesse kontrollieren, die für die Blastembildung und -aufrechterhaltung gebraucht werden. Eines dieser Gene, SMAD4, steht abseits als ein Gen, das notwendig ist für jegliche Blastembildung, aber erlässlich ist für das Neoblastenfunktionieren bei der Homöostase. Diese Beobachtung zeigt, dass TGF-β-Signalgebung Regenerationsinitiation in Planarien kontrollieren könnte.
  • Gene, die für die Homöostase gebraucht werden, aber nicht für das basale Neoblastenfunktionieren. RNAi von etlichen Genen bewirkte stabile, nicht existenzfähige Homöostasedefekte, hemmte aber nicht Blastembildung nach Amputation (7B). Zusätzlich wurden nicht alle für Homöostase erforderlichen Gene für Neoblastenmitosen nach Amputation gebraucht (7B). Deshalb brauchen für Homöostase erforderliche zelluläre Ereignisse nicht für die Regeneration erforderlich sein oder immer Neoblastenproliferation involvieren. Eine Hauptkategorie von Homöostasephänotypen involviert die Bildung einer Varietät an Läsionstypen (6D bis G). Gene, die Läsionen in intakten Tieren nach RNAi bewirken, haben keine starken Tendenzen, Regeneration oder Neoblastenproliferation nach RNAi und Amputation zu hemmen (7D). Dies zeigt, dass die zellulären Defekte, die Läsionenbildung während Homöostase zugrunde liegen, Regeneration oder Proliferation nicht zu hemmen brauchen, und dass Defekte, die Proliferation und Regeneration hemmen, nicht Läsionen bewirken brauchen (7D). Da Bestrahlung von Planarien nicht in Läsionen resultiert (6A), entstehen Läsionen wahrscheinlich aufgrund von Defekten in differenzierten Zellen. Von den 33 Genen, für welche RNAi Regeneration hemmte, aber Regression oder Kräuselung in intakten Tieren nicht bewirkte, brachte RNAi von 31 Läsionen dazu (29/31 stabil), sich in den intakten Tieren zu entwickeln. Diese verblüffende Korrelation (P < 0,0005) legt nahe, dass es zwei Hauptkategorien von Genen geben könnte, die für die Regeneration und Lebensfähigkeit in adulten Tieren gebraucht werden: Eine Kategorie, die das Funktionieren der Stammzellen reguliert, und eine andere, die notwendig ist für das Funktionieren von differenzierten Zellen. Diese Kategorien mögen nicht gegenseitig ausschließend sein; z.B. entwickelten etliche Tiere, die Regression und/oder Kräuselung hatten, auch Läsionen (12/33). RNAi von 18 Genen erlaubte Regeneration von BLST ≤ 2, bewirkte jedoch stabile Defekte in intakten Tieren. 15 von diesen stehen im Zusammenhang mit Läsionenbildung. 8 von diesen 15 Genen kodieren vorhergesagte Signaltransduktions- oder Transkriptionsfaktoren (im Vergleich mit 18 von 143 in dem gesamten Experiment), was anzeigt, dass diese Gene bei der Musterbildung und beim Funktionieren von differenzierten Zellen funktionieren könnten (Tabelle 8).
  • Beispiel 14: Blastemmorphologie und Musterbildungsgene
  • Eine Reihe von Phänotypen der Blastemmorphologie und von Musterbildungsdefekten wurde beobachtet, einschließlich eingekerbten, zugespitzten und flachen Blastemen, ebenso wie ausgedehnte, blasse oder gar keine Photorezeptoren (Tabelle 4, 4C, 4D). Die molekularen Identitäten von Genen, von denen folglich geschlossen wurde, dass sie in diese Merkmale der Planarienblastemmusterbildung verwickelt sind, können in den Tabellen 4, 5 gefunden werden. Wildtypplanarien sind bilateral symmetrisch mit keiner bekannten Asymmetrie25. RNAi von fünf Genen verursachte asymmetrische Regeneration von Photorezeptoren, was aktive Mechanismen anzeigt, welche für die Aufrechterhaltung der Symmetrie in Tierarten existieren könnten, denen Asymmetrie fehlt (Tabellen 4, 5, 4D, 5F). 18 der Gene, die Regression (RGRS) nach RNAi bewirkten, bewirkten Regression von Blastemen, möglicherweise das Ergebnis von Defekten bei der Blastemaufrechterhaltung (Tabelle 4, 4E). Überraschende und neue Phänotypen identifizieren Kandidateneigenschaften der Planarienbiologie für die weitere Erforschung. Zum Beispiel kann ektopisches neuronales Material an der Mittellinie in H.68.4a-Slit(RNAi)-Tieren dazu dienen, ektopische Achsenbildung rechtwinklig zu der ursprünglichen Tierachse zu induzieren (Tabellen 4, 7, 5H). In einem anderen Beispiel zeigen eingekerbte Blasteme in HE.2.07D-BMP1(RNAi)-Tieren, dass BMP-Signalgebung die Regeneration von Geweben der Mittellinie kontrollieren könnte (Tabelle 4, 4C, 5I). Überraschende Defekte wie diese erhellen nicht nur die genetische Kontrolle von spezifischen Aspekten der Planarienbiologie, sondern zeigen auch, dass in Planarien unentdeckte Rollen von bekannten Genen in wenig untersuchten biologischen Vorgängen identifiziert werden können.
  • Beispiel 15: Verhaltensgene
  • Planarien bewegen sich über das Schlagen von ventralen Cilien fort, können ihren Körper dazu bringen, zu wenden, und auf Objekte durch die Verwendung ihres Muskelsystems anzusprechen, und kontrollieren ihr Verhalten mit dizephalen Ganglien, zwei ventralen Nerventrakten, einer Reihe von Sinnessystemen und einem submuskulären Nervenplexus25. RNAi von 44 Genen verlieh unkoordinierte Fortbewegung (36 kräftig), wobei RNAi von zwei zusätzlichen Genen unkoordiniertes Umdrehen (flp) ergab (Tabellen 4, 5). Nach der RNAi von gewissen Genen, wie zum Beispiel einem Proproteinkonvertase-kodierenden Gen (HE.2.02B), wurden Tiere vollständig paralysiert (Tabelle 4). Fünf Gene verliehen Blasenbildung (BLI) und Anschwellen (BLT) ebenso wie Fehlen von Koordination nach RNAi, was Gene einschloss, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Cytoskelettproteine wie Tubuline (HE.1.01H, HE.1.03G), α-Spektrin (HE.1.08G) und Rootletin (HE.1.02E) (Tabelle 4, 4G) kodieren. Da Cilienstrukturen sowohl für die Fortbewegung als auch das Exkretionssystem gebraucht werden, könnten diese Gene die Cilienfunktion kontrollieren25,26. RNAi von vier Genen brachte Tiere dazu, unkoordiniert zu werden und eine anormale Körpergestalt anzunehmen, wie zum Beispiel, dass sie flach werden (flattened) nach RNAi eines Gens, das Sekretionsgranula-Neuroendocrinprotein kodiert (HE.4.05F), oder dass sie in der Mitte schmäler werden als an den Enden (Sanduhr) nach RNAi eines Tropomyosin-kodierenden Gens (NBE.1.12G) (Tabelle 4, 4H). RNAi eines Gens, von dem vorhergesagt wird, dass es ein Protein kodiert, ähnlich einem hepatozellulär-assoziierten Antigen (NBE.8.11C), brachte Tiere dazu, an einer Oberfläche zu kleben und ihre Körper zu einer sehr dünnen Morphologie auszustrecken (stick&stretch) (Tabelle 4, 4H). RNAi eines Gens, von dem vorhergesagt wird, dass es eine äußere dichte Faser aus spermienschwanzähnlichem Protein kodiert (NBE.8.03E), brachte Tiere dazu, sich seitwärts zur Rechten zu bewegen (sidewinder) (Tabelle 2). Von anderen Genen, die in Zusammenhang stehen mit anormalem Verhalten, wird vorhergesagt, dass sie Proteine kodieren, einschließlich G-Proteinfaktoren, Transkriptionsfaktoren und 12 neuen Proteinen (Tabelle 4). Diese Ergebnisse schreiben Verhaltensfunktionen einem Sortiment von Genen zu und identifizieren Funktionen für zuvor uncharakterisierte Gene.
  • Sämtliche Bezugnahmen, einschließlich Publikationen, Patenten, Patentanmeldungen und Sequenzzugangsnummern, die hierin zitiert worden sind, sind hiermit durch Bezugnahme auf das gesamte Ausmaß eingeschlossen, als ob von jeder Bezugnahme einzeln und besonders angezeigt wäre, dass sie durch Bezugnahme eingeschlossen sei, und werden in ihrer Gesamtheit hierin dargelegt.
  • Während diese Erfindung in gewissen Ausführungen beschrieben worden ist, kann die Erfindung weiter innerhalb des Geistes und des Umfangs dieser Offenbarung modifiziert werden. Von dieser Anmeldung ist deshalb beabsichtigt, dass sie alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung unter Verwendung ihrer allgemeinen Prinzipien abdeckt. Weiter wird von dieser Anmeldung beabsichtigt, dass sie solche Abweichungen von der Offenbarung abdeckt, wie sie in der bekannten oder gewohnten Praxis in der Technik liegt, auf welche sich diese Erfindung bezieht, und welche innerhalb die Grenzen der angehängten Ansprüche fallen.
  • TABELLEN
  • Tabelle 3: Zusammenfassung der Screeningergebnisse von S.mediterranea-RNAi.
  • Phänotypdeskriptoren und -details können in Tabelle 4 gefunden werden. Da der Phänotyp vieler Gene mehrere Defekte einschloss, kann ein bestimmtes Gen in mehrere Phänotypkategorien fallen. Jedes Gen fällt in nur eine Funktionskategorie. Homologiedetails können in Tabelle 4 gefunden werden.
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  • Tabelle 4: 240 Gene verleihen in S. mediterranea Phänotypen
  • Es wurde eine systematische Nomenklatur entwickelt, um S.mediterranea-Phänotypen zu beschreiben, einschließend großbuchstabige „Phänotypbegriffe", beschrieben mit kleinbuchstabigen „Deskriptoren" in runden Klammern, die modifiziert sein können mit kleinbuchstabigen „Modifikatoren" in eckigen Klammern. Phänotypbegriffe (in der Reihenfolge des Gebrauchs): BLST, Blastem anormal; TLBLST, Schwanzblastem spezifisch anormal; REG, Regenerationsgeschwindigkeit; PHX, anormale Pharynxregeneration; PR, anormale Photorezeptoren; CRL, Kräuselung um ventrale Oberfläche herum; RGRS, Geweberegression; BHV, Verhalten anormal; LES, Läsionen; SPOTS, große dunkel gefärbte Flecken; FRECKLES, kleine Pigmentflecken; FLATTENED, flache Gestalt; HOURGLASS, sanduhrförmige Gestalt; RDGE, Wulst; BLI, Blasen; BLT, Anschwellung; VAB, variabel anormal; CNTRCT, Kontraktion; GRWTH, anormale Gewebeentwicklung; BUMP, Beule; PIG, Pigmentierung anormal; LYS, Lyse. Deskriptoren und Modifikatoren (in der Reihenfolge des Gebrauchs): (i) allgemein: ok, normal; no, keine Entwicklung; slw, langsam; early, Defekt, bevor Tiere regenerieren können; "a" beobachtet bei der "A"-Wertung (siehe 3), "c", beobachtet bei der C-Wertung (alle anderen beobachtet bei "B"). (ii) Blastemgröße: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 (0 = kein Blastem und 3 = normal; hier, Rumpf-Kopf-Blastem); smll, klein (wenn die Zahl nicht zugänglich ist). Bindestrich, für einen großen Bereich. Normale Größen nicht notiert. (iii) Körperfragmente: hdfrg, Kopf; tlfrg, Schwanz. (iv) Körperregionen: bist, Blastem; hdblst, Kopfblastem; pr, Photorezeptoren; prephx, prä-pharyngeal; mid, Mittellinie; phngl, pharyngeal; phx, Pharynx; tip, Kopfspitze; bndry, Blastemgrenze; drsl, dorsal. (v) Blastemattribute: ndnt, eingekerbt; split, geteilt; flt, flach; pnty, spitz; morph, morphologisch anormal; cntrct, kontrahiert; overpig, zu stark pigmentiert; underpig, zu wenig pigmentiert. (vi) Photorezeptorattribute anhand von Pigmentbechermustern: fnt, schwach; undv, unterentwickelt; wd; breit; close, zu eng aneinander; back, zu weit hinten; diffuse, diffus; brown, braun; dark, dunkel; fuse, verschmolzen; cyc, zyklopartig; asym, asymmetrisch; slant, geschlitzt; ectopic, gesondert. (vii) Verhaltensattribute: movt, träge; glide, gleitend; prlzd, paralysiert; inch, langsam manövrierend; jerky, ruckartige Bewegung; extend, anormale Kopfverlängerung; sidewinder, Seitwärtsbewegung; flp, anormales Umdrehen; vib, anormales Vibrationsansprechen; tch, anormales Berührungsansprechen; attach, mangelhafte Anheftungsfähigkeit; sticky, Tiere sind klebrig; stick&stretch, Ausstreckverhalten; hdlift, anormales Kopfheben; eat, Fressen anormal; light, Lichtansprechen anormal. Falls BLST(> 1), ist PR(no) vermerkt, falls fehlend; falls BLST(≤ 1), ist PR(ok) vermerkt, falls vorhanden, nichts ist vermerkt, falls fehlend. Falls BLST(≤ 2), "PHX" vermerkt, falls anormal und "PHX(ok)" falls nicht. Falls Pharynxdaten unschlüssig sind, ist nicht vermerkt. Für BLST(≥ 2.5) ok ist Pharynxregeneration nicht vermerkt. Fressen wird nur notiert, wenn es möglich gewesen sein sollte. Tage (d) nach Amputation vermerkt, falls planatypisch.
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  • Tabelle 5: Zusätzliche Phänotypgene, die in Tabelle 4 nicht vorhanden sind.
  • Die hier aufgelisteten Gene werden nur zusammengefasst in den Gesamtzahlen, die in Tabelle 4 präsentiert werden. Siehe Legende der Tabelle 4 für Details des Phänotypenbeschreibungssystems. Deskriptoren, die hier, aber nicht in Tabelle 4, gefunden werden: vntrl, ventral; all, überall; twitch, zuckend.
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  • Figure 00730001
  • Tabelle 7: VC-1- und αH3P-Markierung von Tieren aus der RNAi von Phänotypgenen.
  • 149 Phänotypgene wurden mit VC-1 und/oder αH3P markiert. Unter diesen sind 10, hierin identifiziert, Phänotypen, die nur mit VC-1 markiert werden können, sog. VC-1-only-Phänotypen, 7 Phänotypen, die nur mit αH3P markiert werden können, sog. αH3P-only-Phänotypen, und 3 Phänotypen, die sowohl mit VC-1 als auch mit αH3P markiert werden können, sog. VC-1-und-αH3P-only-Phänotypen. Zusätzliche 129 verliehen Phänotypen, die mit Lichtmikroskopie sichtbar waren. Tiere aus der RNAi von 103 Genen, markiert mit VC-1 und αH3P, zeigten keinen Defekt und sind nicht gezeigt. C H3P, αH3P-Markierungsergebnisse von Tieren, die 14 Tage nach der zweiten Screeningamputation und der "C"-Wertung fixiert worden sind (siehe 4). Die αH3P-Phänotypdeskriptoren tl und phngl geben Defekte an, die in den Schwanz- bzw. pharyngealen Regionen lokalisiert sind. Auswertungskriterien sind in der Legende zu 5 spezifiziert. Das VC-1-Phänotyp-Nomenklatursystem ist in 6 beschrieben. Unten sind jene Begriffe aufgelistet, die in Tabelle 5 vorhanden sind, die nicht in 6 vorhanden waren. Phänotypbegriff DISORG, Deskriptoren: defas, Defaszikulierung; ocproj, anteriore Fortsätze von den oc; shortax, kurze Fortsätze posterior zu den oc; fewax, enge Axonbündel; invertoc, oc bildet anterior zum Photorezeptor Zellkörper. PRCELLS-Deskriptoren: cyc, Zyklopen, nur ein Photorezeptor ist vorhanden; fuse, verschmolzen, Photorezeptoren sind an der Mittellinie verschmolzen; rhabdo, helle Rhabdomere, die Region in der unmittelbaren Nähe des Pigmentbechers markiert intensiv mit VC-1. Sämtliche EXTNT-Deskriptoren werden durch den auf einem gegebenen Objektträger vorhandenen mehrheitlichen Zustand bestimmt. Wenn Zahlen für zwei Zustände gleich sind, wird der extremere Zustand notiert (z.B. falls 2/4 trace und 2/4 nopr, dann wird nopr notiert). Bei Tieren mit EXTNT(trace) und EXTNT(ltd) wird allgemeine Disorganisation von allen vorhandenen Zellkörpern oder Axons angenommen. Deshalb werden nur einzigartige und definierende Defekte unter dem Phänotypbegriff DISORG angehängt. Für EXTNT(sqish)-Tiere gilt, falls nichts angehängt ist, wurde keine Disorganisation gesehen. Falls DISORG alleine aufgelistet ist, wurde allgemeine Disorganisation mit keinen einzigartigen und definierenden Qualitäten beobachtet. Falls der EXTNT-Begriff nicht verwendet wird, dann waren die Photorezeptoren und Axons innerhalb der normalen Skala vorhanden. Falls EXTNT(nopr) notiert wird, aber eine gewisse einzigartige Eigenschaft in den Tieren vorhanden ist, die VC-1-Färbung haben, kann es angehängt werden. Für jene Defekte, die bei der Kontrolle in Tieren mit EXTNT(ok oder sqish) nicht beobachtet werden, gitl: (i) Falls zwei oder mehr Fälle von ectoax, fewax, invertoc, straightoc, splitoc, difus, asym, rhabdo oder wd oder ein oder mehrere Fälle von trs oder ecto beobachtet worden sind, wurde der Defekt als signifikant erachtet. (ii) Falls ein lichtmikroskopischer Phänotyp Zyklopen oder Fusion einschloss, wurde der Defekt notiert, falls eines oder mehrere cyc- oder fuse-Tiere bei der VC-1-Markierung beobachtet worden sind. (iii) Bei jenen Defekten, die in Kontrolltieren (defas, ocproj, fwdproj, shortax) beobachtet worden sind, wurden Defekte für signifikant erachtet, falls P < 0,005 in einem Fisher-Exakttest war. Für jene Defekte, die nicht bei der Kontrolle in Tieren mit EXTNT(ltd oder trace) beobachtet wurden: Es wird erwartet, dass Disorganisation in diesen Tieren geschieht und deshalb werden nur atypische oder definierende Defekte aufgelistet. Das Minimalerfordernis für jeden einzigartigen, definierenden Defekt ist, dass wenigstens zwei Tiere mit dem Defekt beobachtet worden sind. Da eine gewisse Photorezeptorneuronentwicklung in sehr kleinen Blastemen geschehen kann, die nicht leicht sichtbar auf dem Lichtmikroskopniveau zu sehen ist, können Fusion von Photorezeptoren oder Zyklopendefekte bei diesen Blastemen während dem Screening für sichtbare Defekte nicht beobachtet worden sein. Falls cyc- oder fuse-Tiere in solchen Blastemen hier anwesend waren, muss wenigstens ein Drittel der Tiere (Minimum zwei mit Defekt) fehlerhaft sein, um für echt erachtet zu werden. Falls nichts aufgelistet ist, war Disorganisation aber nichts Einzigartiges vorhanden.
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  • Tabelle 8: Homöostasephänotypen und Anzahl mitotischer Neoblasten nach Amputation.
  • Phänotypbegriffe sind in Tabelle 4, 4, 6, definiert. Zusätzliche intakte Phänotypdeskriptoren: post, posteriore Hälfte oder posteriores Ende einer Region; smll, kleine Läsionen. Control BLST, Größe von Blastemen in Tieren, die eine Kontrolle für RNAi-Wirksamkeit bei dem Homöostaseexperiment waren (siehe Text für Details). abrt, abgebrochene Regeneration; smll, kleines Blastem; vsmll, sehr kleines Blastem; littlesmll, Blasteme geringfügig klein; na, nicht erhältlich (z.B. falls RNAi Lyse bewirkt); TLBLST, Schwanzblastemgröße anormal. Screen BLST, Größe von Blastemen aus RNAi-Tieren in dem Screen. 24hH3P bezieht sich auf die Anzahl von αH3P-markierten Zellen nach Fixierung nach entweder 16 oder 24 Stunden, verglichen mit der Kontrolle unc-22-RNAi. Kriterien für Kategorisierung sind in der Legende der 5C beschrieben. Kontrolltiere, die nicht fraßen und die 16 Stunden nach der zweiten Amputation (B) fixiert worden waren, hatten 310 ± 59 Zellen/mm. Deshalb wurden nach den in 5 dargelegten Regeln Versuchstiere mit gleich oder weniger als 192 Zellen/mm als LOW(s) kategorisiert, Tiere mit gleich oder weniger als 128 Zellen/mm LOW, Tiere mit gleich oder weniger als 64 Zellen/mm LOW(v), Tiere mit gleich oder mehr als 428 Zellen/mm HIGH(s), Tiere mit gleich oder mehr als 492 Zellen/mm HIGH und Tiere mit gleich oder mehr als 556 Zellen/mm HIGH(v). Kontrolltiere, die fraßen und 16 Stunden nach der zweiten Amputation (B) fixiert worden waren, hatten 366 ± 89 Zellen/mm. Kontrolltiere, die nicht fraßen und 24 Stunden nach der zweiten Amputation fixiert worden waren, hatten 455 ± 44,4 Zellen/mm. Kontrolltiere, die fraßen und 24 Stunden nach der zweiten Amputation fixiert worden waren, hatten 513 ± 31,3 Zellen/mm. Kontrolltiere, die fraßen und 16 Stunden nach der ersten Amputation fixiert worden waren, hatten 666 ± 126,8 Zellen/mm.
  • Figure 00850001
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  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf verbesserte Verfahren zum Schwächen der Expression eines Zielgens in einer eukaryotischen Zelle mit dsRNA, Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen, die verantwortlich sind für das Verleihen eines bestimmten Phänotyps an eine Zelle, Vermindern des Schädlingsbefalls in Pflanzen und Ändern der Genexpression in einer undifferenzierten Stammzelle oder den differenzierten Nachfahren davon. Transkription der RNA, welche die dsRNA bilden wird, wird durch eine oder mehrere Terminatorsequenzen beendet, wodurch die Effizienz der Inhibition gesteigert wird.
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Claims (61)

  1. Verfahren zum Schwächen der Expression einer Zielnukleotidsequenz in einer eukaryotischen Zelle, wobei dieses Verfahren umfasst: Einführen doppelsträngiger RNA (dsRNA) in die eukaryotischen Zelle, um die Expression der Zielnukleotidsequenz zu schwächen; worin die dsRNA eine Nukleotidsequenz umfasst, die unter stringenten Bedingungen an die Zielnukleotidsequenz hybridisiert; und worin diese dsRNA von einem Vektor exprimiert wird, der einen oder mehrere Transkriptionsterminatoren enthält.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Einführen der dsRNA in die eukaryotische Zelle das Einführen eines Expressionsvektors umfasst, einschließend wenigstens eine Nukleotidsequenz, die zu der Zielnukleotidsequenz ähnlich ist; und worin dieser Vektor die dsRNA in einer Menge erzeugt, die ausreichend ist, die Expression der Zielnukleotidsequenz zu schwächen, wenn diese wenigstens eine Nukleotidsequenz transkribiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin Transkription der wenigstens einen Nukleotidsequenz sowohl in Sinn- als auch in Gegensinnrichtungen gestartet wird; worin die wenigstens eine Nukleotidsequenz funktionell an zwei Transkriptionsregulationssequenzen gekoppelt ist; worin diese Transkriptionsregulationssequenzen die Transkription in beiden Richtungen an Punkten beenden, die ausreichend sind, komplementäre Transkripte zu bilden, und worin diese komplementären Transkripte miteinander Doppelstrang bilden, um diese dsRNA zu bilden.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, worin dieser Expressionsvektor wenigstens zwei Nukleotidsequenzen einschließt; worin die wenigstens zwei Nukleotidsequenzen nach Transkription jeweils wenigstens zwei komplementäre RNA-Sequenzen erzeugen; und worin diese RNA-Sequenzen Doppelstrang bilden, um diese dsRNA zu bilden.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, worin wenigstens eine dieser wenigstens zwei Nukleotidsequenzen eine Haarnadel nach Transkription erzeugt und worin diese Haarnadel Doppelstrang bildet, um diese dsRNA zu bilden.
  6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2, 4 oder 5, worin dieser Expressionsvektor wenigstens eine Transkriptionsregulationssequenz einschließt, die die Transkription dazu bringt, aufzuhören.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin dieser Expressionsvektor wenigstens zwei Transkriptionsregulationssequenzen einschließt.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Einführen der dsRNA in die eukaryotische Zelle das Einführen eines Expressionsvektors mit wenigstens zwei Promotoren in die eukaryotische Zelle umfasst; worin diese zwei Promotoren so orientiert sind, dass die Nukleotidsequenz, welche an die Zielnukleotidsequenz hybridisiert, zwischen den Promotoren flankiert ist, und nach Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die beiden Promotoren sind die beiden Promotoren in der Lage, die Transkription der Nukleotidsequenz, die an die Zielnukleotidsequenz hybridisiert, zu starten; und worin Transkription dieser Nukleotidsequenz, die an die Zielnukleotidsequenz hybridisiert, unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, die dsRNA in einer Menge zu bilden, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens zu schwächen.
  9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin diese Zielnukleotidsequenz im Wege der Gateway®-Klonierstrategie kloniert wird.
  10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 9, worin dieser Expressionsvektor eine Nukleotidsequenz einschließt, die wenigstens einen selektierbaren Marker kodiert.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin diese Nukleotidsequenz, die den selektierbaren Marker kodiert, ein Kanamycinresistenzgen kodiert.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin die eukaryotische Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer undifferenzierten Stammzelle, den Nachfahren einer undifferenzierten Stammzelle, einer embryonalen Stammzelle, einer embryonalen Stammzelle mit Planarienursprung, einer Pflanze, einem Vertebraten, einem Invertebraten und anderen eukaryotischen Zellen.
  13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin die eukaryotische Zelle eine Planarienzelle ist.
  14. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin die eukaryotische Zelle Caenorhabditis elegans oder Schmidtea mediterranea ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, worin Einführen der dsRNA in die eukaryotische Zelle umfasst: Klonieren der Nukleotidsequenz, die an das Zielgen hybridisiert, in einen Expressionsvektor; Transformieren einer Bakterienzelle mit dem Expressionsvektor; und in Kontakt bringen der Bakterienzelle mit der Planarienzelle.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das In-Kontakt-Bringen der Bakterienzelle mit der Planarienzelle das Füttern der Bakterienzelle an einen Planarienorganismus umfasst.
  17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 und sämtlichen von Anspruch 8 abhängigen Ansprüchen, weiterhin umfassend: Konstruieren einer Bibliothek aus Zielnukleotidsequenzen, die in einen Expressionsvektor kloniert sind, wodurch folglich eine dsRNA-Bibliothek hergestellt wird; in Kontakt bringen der dsRNA-Bibliothek mit einer Vielzahl von eukaryotischen Zellen; Identifizieren von Mitgliedern der dsRNA-Bibliothek, welche einer eukaryotischen Zelle einen bestimmten Phänotypen verleihen oder anderweitig eine zelluläre Änderung in der eukaryotischen Zelle bewirken; und Bestimmen der Nukleotidsequenz, die dem Bibliotheksmitglied entspricht, welches den bestimmten Phänotypen verleiht oder anderweitig die zelluläre Änderung in der eukaryotischen Zelle bewirkt.
  18. Verfahren zum Entdecken eines Arzneimittels mit einer Wirkung auf eine Zelle, wobei dieses Verfahren umfasst: Identifizieren eines Zielgens, welches eine phänotypisch wünschenswerte Antwort verleiht, wenn es durch RNAi mit dem Verfahren nach Anspruch 17 inhibiert wird; Identifizieren von Mitteln, die in der Lage sind, die Expression des Zielgens zu inhibieren oder zu aktivieren oder die Aktivität eines Expressionsproduktes des Zielgens zu inhibieren oder zu aktivieren; Durchführen der Erstellung eines therapeutischen Profils der identifizierten Mittel oder weiterer Analoga davon im Hinblick auf Effizienz und Toxizität in Tieren; und Formulieren einer pharmazeutischen Zubereitung, einschließend eines oder mehrere Mittel, die als ein annehmbares therapeutisches Profil aufweisend identifiziert worden sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Einführen der dsRNA in die eukaryotische Zelle das Einführen einer Haarnadelnukleinsäure in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens in der eukaryotischen Zelle zu schwächen.
  20. Verfahren zur Verminderung von Schädlingsbefall oder Infektion eines Organismus, wobei dieses Verfahren umfasst: Identifizieren eines Zielgens dieses Schädlings mit dem Verfahren nach Anspruch 17, welches für das Überleben, Wachstum, die Vermehrung oder Fortpflanzung des Schädlings kritisch ist; Klonieren einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an das Zielgen oder ein Fragment davon hybridisiert, in einen Vektor, der in der Lage ist, dsRNA zu exprimieren; und in Kontakt bringen dieses Vektors mit dem Organismus unter Bedingungen, die wirksam sind, den Schädlingsbefall oder die Infektion zu vermindern.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin ein oder mehrere gewebesepzifische Promotoren verwendet werden, um die Expression dieser dsRNA auf eines oder mehrere spezifische Gewebe des Organismus zu beschränken.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, worin dieser Schädling ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Nematodenwurm, einem Insekt, einem Bakterium, einem Pilz und einer Planarie.
  23. Verfahren nach Anspruch 20, worin diese Zielgensequenz von diesem Schädling keine genomische Sequenz von diesem Organismus ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 20, worin dieser Organismus ein Tier ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 20, worin dieser Organismus eine Pflanze ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 12, worin diese embryonale Stammzelle das Ergebnis von Kerntransfer ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, worin ein Donorkern zu einer zuvor modifizierten Empfänger-Oocyte transferiert wird; und worin diese Empfänger-Oocyte durch das Einführen von einer oder mehreren dsRNA in diese Oocyte unter Bedingungen, die wirksam sind, diese Oocyte zu modifizieren, modifiziert ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, worin eine embryonale Stammzelle, die aus dieser modifizierten Empfänger-Oocyte gewonnen worden ist, oder die differenzierten Nachfahren davon, weiter modifiziert ist durch das Einführen von einer oder mehreren dsRNA in die Zelle unter Bedingungen, die wirksam sind, diese Stammzelle oder diese differenzierten Nachfahren davon zu modifizieren.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Modifikation dieser Empfänger-Oocyte eine oder mehrere Änderungen in der Expression eines Gens oder Proteins der Oocyte umfasst, die wirksam sind, die erfolgreiche Implantation eines aus der modifizierten Oocyte erlangten Embryos zu verhindern.
  30. Verfahren nach Anspruch 28, worin diese Änderung unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, die Expression des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) zu reduzieren oder zu eliminieren.
  31. Verfahren nach Anspruch 28, worin diese Änderung unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, die Expression eines oder mehrerer Gene zu reduzieren oder zu eliminieren, die für die virale oder bakterielle Infektion dieser Zelle erforderlich sind.
  32. Verfahren nach Anspruch 28, worin diese Änderung unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, die Expression eines oder mehrerer Gene zu reduzieren oder zu eliminieren, die für die virale oder bakterielle Infektion dieser Zelle erforderlich sind.
  33. Kit zum Durchführen des Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 32.
  34. dsRNA zum Inhibieren der Expression eines Gens, wobei diese dsRNA umfasst: eine erste Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Zielsequenz hybridisiert, worin die Zielsequenz mit dieser ersten Nukleotidsequenz komplementär ist und worin diese stringenten Bedingungen einen Waschschritt mit 0,2 × SSC bei 65 °C einschließt.
  35. Haarnadelnukleinsäure zum Inhibieren der Expression eines Zielgens, wobei diese Haarnadelnukleinsäure die dsRNA nach Anspruch 34 umfasst.
  36. Zelle, umfassend die dsRNA nach Anspruch 34 oder die Haarnadelnukleinsäure nach Anspruch 35.
  37. dsRNA nach Anspruch 34, worin diese erste Nukleotidsequenz wenigstens 20 Nukleotide umfasst.
  38. dsRNA nach Anspruch 34, worin diese erste Nukleotidsequenz wenigstens 25 Nukleotide umfasst.
  39. dsRNA nach Anspruch 34, worin diese erste Nukleotidsequenz wenigstens 100 Nukleotide umfasst.
  40. dsRNA nach Anspruch 34, worin diese erste Nukleotidsequenz wenigstens 400 Nukleotide umfasst.
  41. dsRNA nach Anspruch 34, worin diese erste Nukleotidsequenz ein Eukaryotengen umfasst.
  42. dsRNA nach Anspruch 41, worin das Eukaryotengen tierischen Ursprungs ist.
  43. dsRNA nach Anspruch 34, worin diese erste Nukleotidsequenz im Wesentlichen mit einer Nukleotidseqeuenz identisch ist, welche wenigstens einer nicht-kodierenden Sequenz von wenigstens einem Eukaryotengen entspricht, worin das wenigstens eine Eukaryotengen nicht in einem Genom eines Wirts gefunden wird.
  44. Expressionsvektor, umfassend die dsRNA nach Anspruch 34.
  45. Expressionsvektor nach Anspruch 44, weiterhin umfassend einen oder mehrere Promotoren, die im Verhältnis zu einer Nukleotidsequenz so orientiert sind, dass der eine oder die mehreren Promotor(en) in der Lage ist/sind, die Transkription dieser Zielgen-DNA-Sequenz zu starten, um dsRNA zu erzeugen.
  46. Expressionsvektor nach Anspruch 45, worin zwei Promotoren die erste Nukleotidsequenz flankieren.
  47. Expressionsvektor nach Anspruch 46, worin die erste Nukleotidsequenz von zwei Transkriptionsterminationssequenzen flankiert wird.
  48. Expressionsvektor nach Anspruch 44, umfassend wenigstens einen selektierbaren Marker.
  49. Expressionsvektor nach Anspruch 34, worin dieser Expressionsvektor in der Lage ist, das Gateway®-Verfahren zu verwenden, um diese DNA-Sequenz zu klonieren.
  50. Expressionsvektor nach Anspruch 44, umfassend Transkriptionsterminatoren.
  51. Zelle nach Anspruch 36, worin die Zelle eine Bakterienzelle umfasst.
  52. Zelle nach Anspruch 36, worin die Zelle eine transgene eukaryotische Zelle umfasst.
  53. Zelle nach Anspruch 52, worin diese transgene eukaryotische Zelle eine Keimbahnzelle ist.
  54. Zelle nach Anspruch 52, worin dieses Transgen in ein Chromosom der transgenen eukaryotischen Zelle integriert ist.
  55. Zelle nach Anspruch 54, worin das dsRNA-Konstrukt konditionell exprimiert ist.
  56. Zelle nach Anspruch 54, worin das dsRNA-Konstrukt transient transfiziert ist.
  57. Expressionsvektor nach Anspruch 44, worin der Expressionsvektor ein Plasmid umfasst, das als pDONRdT7 identifiziert ist.
  58. Bibliothek aus ersten Nukleotidsequenzen, umfassend den Vektor nach Anspruch 57.
  59. Bibliothek nach Anspruch 58, weiter umfassend eine Vielzahl von ersten Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen an eine Vielzahl von Zielsequenzen hybridisieren.
  60. Nukleotidsequenz, bestimmt mit dem Verfahren nach Anspruch 17.
  61. Nukleotidsequenz nach Anspruch 60, aufweisend eine Sequenz von einer der Genidentifikationsnummern (Gen-ID) in einer der Tabellen 4 bis 8.
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