DE1087550B

DE1087550B - Method for purifying a preparation containing amyloglucosidase enzyme

Info

Publication number: DE1087550B
Application number: DEC16491A
Authority: DE
Inventors: Ralph Waldo Kerr
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1957-12-30
Filing date: 1958-03-15
Publication date: 1960-08-25

Description

Verfahren zum Reinigen einer Amyloglukosidaseenzym enthaltenden Zubereitung Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen einer Amyloglukosndaseenzym enthaltenden Zubereitung für das Verzuckern von stärkehaltigen Stoffen und ihren Abbauprodukten.A method for purifying a preparation containing amyloglucosidase enzyme The invention relates to a method for purifying an amyloglucose enzyme containing preparation for the saccharification of starchy substances and their Degradation products.

Es ist bekannt, Enzyme durch Adsorption zu reinigen, indem man die schwach angesäuerte Lösung des Enzyms mit einer Suspension des Adsorbens [Al(OH)3, Calciumphosphatgel, Bentonit, Silikagel u. a.] versetzt und das Gemisch nach kurzer Zeit zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Enzym dann in schwach alkalischem Medium mit einem geeigneten Solvent eluiert. Dabei sind aber Adsorption und Elution zwei sehr verlustreiche Verfahrensschritte.It is known to purify enzymes by adsorption by using the weakly acidic solution of the enzyme with a suspension of the adsorbent [Al (OH) 3, Calcium phosphate gel, bentonite, silica gel, etc.] and the mixture after a short time Centrifuged time; the supernatant liquid is discarded and then the enzyme eluted in a weakly alkaline medium with a suitable solvent. But there are Adsorption and elution are two very lossy process steps.

Außerdem ist es bekannt, daß Amylase durch Stoffe wie Bentonit absorbiert wird.It is also known that amylase is absorbed by substances such as bentonite will.

Überraschend wurde nun gefunden, daß wasserhaltiges, unlösliches synthetisches Magnesiumsilikat in sehr wirksamer Weise durch Adsorption aus rohen Pilzkulturflüssigkeiten Enzyme, insbesondere Transglukosidase, und andere Verunreinigungen entfernt, welche 'die enzymatische Erzeugung von Dextrose aus Stärke beeinträchtigen, aber nicht das gewünschte Dextrose erzeugende Enzym, Amyloglukosidase, beseitigt.It has now surprisingly been found that water-containing, insoluble synthetic Magnesium silicate very effectively by adsorption from raw fungal culture fluids Enzymes, especially transglucosidase, and other impurities removed which 'but not affect the enzymatic production of dextrose from starch eliminates the desired dextrose-producing enzyme, amyloglucosidase.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bleibt das gewünschte Enzym in Lösung und wird nicht wie bei den bekannten Verfahren adsorbiert.In the method according to the invention, the desired enzyme remains in Solution and is not adsorbed as in the known processes.

Demgemäß unterscheidet sich das Verfahren nach der Erfindung von den bekannten Reinigungsverfahren vor allem vorteilhaft dadurch, daß eine wäßrige Lösung einer Amyloglukosidaseenzym enthaltenden Zubereitung mit etwa 2 bis etwa 5%. eines wasserunlöslichen, wasserhaltigen synthetischen Magnesiumsilikats bei einem pE[ von etwa 3,8 bis etwa 4,5 behandelt, die Mischung geschleudert und die flüssige, die Amyloglukosidase enthaltende Phase gewonnen wird.Accordingly, the method of the invention differs from that known cleaning method is particularly advantageous in that an aqueous solution a preparation containing amyloglucosidase enzyme at about 2 to about 5%. one water-insoluble, water-containing synthetic magnesium silicate with a pE [ treated from about 3.8 to about 4.5, the mixture spun and the liquid, the phase containing amyloglucosidase is obtained.

Mit dem erfindungsgemäß gereinigten Produkt erhält man durch enzymatische Hydrolyse von Stärke oder Stärkeprodukten Stärkehydrolysate, welche wesentlich weniger unerwünschte Bestandteile oder Verunreinigungen enthalten, welche das Raffinieren erschweren, als in durch bekannte enzymatische Verfahren erhaltenen Stärkehydrolysaten vorhanden sind, und ferner in weiter fortgeschrittenen Hydrolysen größere mögliche Dextroseausbeuten in der Hydrolysaten und größere wirkliche Dextroseausbeuten, wenn die Hydrolysate raffiniert, konzentriert und kristallisiert werden und die kristallisierte Dextrose von den Mutterlaugen abgetrennt wird, als sie aus nach bekannten Verfahren erhaltenen Hydrolys-aten gewonnen werden. Demgemäß ist ein besonderes Ziel der Erfindung, ein technisches Verfahren zur Herstellung kristalliner Dextrose durch enzymatische Hydrolyse zu schaffen, welches eine höhere Ausbeute an dem Zucker ergibt als bei den bekannten Verfahren erhalten wird. Andere Ziele werden sich aus dem Folgenden ergeben: , Die Existenz eines Enzyms, welches Stärkemoleküle oder sauer konvertierte Stärkemoleküle unmittelbar zu dem Monomer, Dextrose, hydrolysieren würde, ist schon seit mindestens 15 fahren erkannt worden.The product purified according to the invention is obtained by enzymatic Hydrolysis of starch or starch products, which are much less starch hydrolysates contain undesirable constituents or impurities that may cause refining more difficult than in starch hydrolysates obtained by known enzymatic processes are present, and furthermore larger possible ones in more advanced hydrolyses Dextrose yields in the hydrolysates and greater real dextrose yields, though the hydrolysates are refined, concentrated and crystallized and the crystallized Dextrose is separated from the mother liquor when it is removed by known methods obtained hydrolysis data are obtained. Accordingly, a particular object of the invention is a technical process for the production of crystalline dextrose by enzymatic To create hydrolysis, which gives a higher yield of the sugar than with the known method is obtained. Other goals will emerge from the following reveal: 'The existence of an enzyme which converted starch molecules or acidic Starch molecules would hydrolyze directly to the monomer, dextrose, is nice has been recognized for at least 15 driving.

Schon 1941 betonten K e r r und S c h i n k (Ind. Chem.33, S.1418 [1941], und später 34, S.1232 [1942]) die Anwesenheit einer a-Glukosidase in gewissen Pilzextrakten, welche Dextroseeinheiten unmittelbar aus den langen Polysaccharidmolekülen in mit Säure vörhydrolysierter Säure abzuspalten schien, und daß keine Grenze der Wirkung nahezu bis zur völligen Hydrolyse zu Dextrose zu bestehen schien. Obgleich ihren Ergebnissen nicht allgemein zugestimmt wurde, ist diese Ansicht jetzt angenommen.As early as 1941, K e r r and S c h i n k (Ind. Chem. 33, p.1418 [1941], and later 34, p.1232 [1942]) the presence of an α-glucosidase in certain Mushroom extracts, which are dextrose units directly from the long polysaccharide molecules seemed to split off in acid pre-hydrolyzed with acid, and that no limit of the Effect seemed to exist almost to complete hydrolysis to dextrose. Although Their results were not generally agreed, this view is now accepted.

In der Zwischenzeit hat dieses hypothetische Enzym verschiedene Namen durch verschiedene Forscher erhalten. Es wurde a-Glukosidase, Amyloglukosidase, Glukamylase, Stärkeglukogenase und Maltase genannt. Der letztere Name wurde durch einige sehr frühe Forscher unter der Annahme, welche sich jetzt als irrtümlich erwiesen hat, verwendet, daß das Enzym, welches Glukose unmittelbar aus Stärkeerzeugt; nicht von einem früher bekannten, Maltase genannten Enzym verschieden wäre, welches Dextrose aus Malfose erzeugt, aber ein spezifisches Substrat für das Disaccharid ist. Im folgenden wird dieses stärkehydrolysierende Enzym als Amyloglukosidase bezeichnet.In the meantime, this hypothetical enzyme has gone by different names obtained by various researchers. It was a-glucosidase, amyloglucosidase, Called glucamylase, starch glucogenase, and maltase. The latter name was due some very early investigators on what has now been proven erroneous has used that the enzyme which produces glucose directly from starch; would not be different from a previously known enzyme called maltase, which Dextrose made from Malfose, but a specific substrate for the disaccharide is. This starch-hydrolyzing enzyme is referred to below as amyloglucosidase.

Dieses Enzym kommt in wäßrigen Extrakten oder Kulturfiltraten von Mikroorganismen, insbesondere Pilzen, vor. Gewisse Stämme von Aspergillus niger beispielsweise sind eine sehr gute Quelle. Naturgemäß treten auch andere Enzyme aus den lebenden Zellen in diesen Extrakten auf, und Trennung der Amyloglukosidase sogar von anderen Carbohydrasen, beispielsweise a-Amylasen, Transglukosidasen und Grenzdextrinen, hat bisher ein unüberwindbares Problem :dargestellt. Tatsächlich ist Amyloglukosidase eine von sehr wenigen verbleibenden Carbohydrasen, welche bis jetzt noch nicht in einer genügend reinen Form abgetrennt wurde, um kristallisiert zu werden.This enzyme comes from in aqueous extracts or culture filtrates Microorganisms, especially fungi. Certain strains of Aspergillus niger for example are a very good source. Naturally, other enzymes also occur from the living cells in these extracts, and separation of the amyloglucosidase even from other carbohydrases, for example α-amylases, transglucosidases and Border dextrins, so far has presented an insurmountable problem: Indeed amyloglucosidase is one of the very few remaining carbohydrases which up to has not yet been separated in a sufficiently pure form to crystallize to become.

Trotz der optimistischen Voraussagen von einigen früheren Forschern auf diesem Gebiet, daß keine Grenze der Hydrolyse von Stärke bis zur fast völligen Hydrolyse zu Dextrose sein würde und daß ein enzymatisches Dextroseverfahren erheblich der üblichen sauren Hydrolyse in bezug auf Dextrosezuckerausbeute und hinsichtlich des Raffinierens überlegen wäre, beweisen die Zahlen aus den bisherigen Verfahren zur enzymatischen Dextrosegewinnung, daß diese Hoffnungen sich noch nicht erfüllt hatten. Es schienen Probleme bei dem enzymatischen Verfahren analog der sauren Hydrolyse vorzuliegen.Despite the optimistic predictions made by some previous researchers in this field that no limit of hydrolysis from starch to almost total Hydrolysis to dextrose and that a dextrose enzymatic process would be significant common acid hydrolysis in terms of dextrose sugar yield and in terms of would be superior to refining, prove the figures from previous processes for enzymatic dextrose production that these hopes have not yet been fulfilled had. Problems appeared with the enzymatic process analogous to acid hydrolysis to be present.

Probleme bei dem üblichen Säureverfahren sind von K e r r (Chemistry and Industry of Starch, 2. Auflage, Chapter XIV) dargestellt worden. So besteht bei der sauren Hydrolyse das Problem unvollständiger Hydrolyse infolge der größeren Widerstandsfähigkeit der anomalen 1,6-a-Glukosidbindungen in der Stärke gegenüber der Hydrolyse. Weiterhin tritt die synthetische Reaktion oder Umkehr auf, veranlaßt durch Säure, wodurch Dextrose oder niedere Zucker sich zu säurebeständigeren Dimeren oder Polymeren wieder verbinden. Diese zwei Umstände setzen nicht nur erheblich die mögliche Dextroseausbeute in dem Hydrolysat herab, sondern verringern auch stark bei der Kristallisation und Abtrennung von Dextrose aus diesen Hydrolysaten die tatsächliche Ausbeute des erhaltenen Zuckers (Chem. and Ind. öf Starch, S. 385). Wenn Stärke durch Pilzextrakte hydrolysiert wird, zeigt eine Untersuchung der Hydrolysate die Anwesenheit von erheblichen Mengen von Dimeren und Polymeren von Dextrose mit anomalen Bindungen, was entweder unvollständige Hydrolyse oder synthetische Wirkung oder beides anzeigt.Problems with the usual acid process have been reported by K e r r (Chemistry and Industry of Starch, 2nd Edition, Chapter XIV). So there is in acid hydrolysis, the problem of incomplete hydrolysis due to the larger Resistance to the anomalous 1,6-α-glucoside bonds in starch of hydrolysis. Furthermore, the synthetic reaction or reversal occurs, causing by acid, which causes dextrose or lower sugars to become more acid-resistant dimers or reconnect polymers. These two circumstances are not just significant the possible dextrose yield in the hydrolyzate, but also greatly reduce it in the crystallization and separation of dextrose from these hydrolysates actual yield of the sugar obtained (Chem. and Ind. öf Starch, p. 385). If starch is hydrolyzed by mushroom extracts, an examination of the hydrolyzates shows the presence of significant amounts of dimers and polymers of dextrose having abnormal bonds, indicating either incomplete hydrolysis or synthetic action or display both.

Bei der sauren Hydrolyse gibt es auch zersetzende Reaktionen, in welchen Protein oder stickstoffhaltige Verunreinigungen eineRolle spielen. DieseReaktiörien und die Anwesenheit von Salzen vermehren die Schwierigkeit des Raffinierens des Hydrolysats und tragen zu verringerten Ausbeuten an fertigem Zucker bei. Selbstverständlich, wenn fremdes Protein und Salze absichtlich zu Stärkeflüssigkeiten in Form von Pilzextrakten oder Kulturfiltraten zugefügt werden, ist es nicht überraschend, daß die erwähnten Probleme hinsichtlich des Raffinierens bei den bekannten enzymatischen Verfahren erschwert und weiter verringerte Dextroseausbeuten erhalten werden.In acid hydrolysis there are also decomposing reactions in which Protein or nitrogenous impurities play a role. These reactions and the presence of salts increase the difficulty of refining the Hydrolyzate and contribute to decreased yields of finished sugar. Of course, when foreign protein and salts are intentionally turned into starch liquids in the form of mushroom extracts or culture filtrates are added, it is not surprising that the mentioned Refining problems with known enzymatic processes difficult and further reduced dextrose yields can be obtained.

Verschiedene USA.-Patente sind in der letzten Zeit auf verbesserte Verfahren der Hydrolyse von Stärke mit Enzymen erteilt worden: 2 305 168, 2 53199ß, 2 583 451, 2 717 852. Wenn die bisher bekannten enzymatischenDextroseverfahren zur Hydrolyse von Stärke oder Stärkeprodukten angewendet werden, werden Hydrolysate erhalten, welche nicht mehr als etwa 850/a Dextrose (Trockenbasis), selbst unter besten Arbeitsbedingungen, enthalten. Ferner zeigt dieAmylase dieser Hydrolysate auf Gesamtzucker oder reduzierende Stoffe nach der bekannten von L a n e und E y n o n modifizierten Fehlings-Prüfung und Berechnung der Ergebnisse als Dextroseäquivalent (D. E.), daß zusätzliche 5 0/0 oder mehr von Nichtdextrosezuckern anwesend sind und ein Rest an höheren Polysacchariden und Nichtkohlehydratverunreinigungen auf gesamt 100% vorhanden ist.Various USA patents have been improved in the recent past Process of hydrolysis of starch with enzymes has been granted: 2 305 168, 2 53199ß, 2,583,451, 2,717,852. When the previously known enzymatic dextrose processes for Hydrolysis of starch or starch products are used as hydrolysates get no more than about 850 / a dextrose (dry basis), even under best working conditions. Furthermore, the amylase shows these hydrolysates on total sugar or reducing substances according to the well-known of L a n e and E y n o n modified Fehlings test and calculation of the results as dextrose equivalent (D.E.) that an additional 50/0 or more of non-dextrose sugars are present and a balance of higher polysaccharides and non-carbohydrate impurities total 100% is available.

Wenn dieseHydrolysate durchLeitenüberKnochenkohle, Filtration und Konzentration raffiniert und durch die üblichen Verfahren der Technik kristallisiert werden, werden keine höheren Ausbeuten an kristalliner Dextrose als etwa 60% (Trockenbasis) erhalten. Dies ist im wesentlichen die gleiche Ausbeute, wie sie bei der alten Säurekonvertierung von Stärke unter Anwendung vergleichbarer Raffinierungs- und Kristallisierungsverfahren erhalten wird. In beiden Fällen haben die in den Hydrolysaten vorhandenen, nicht aus Dextrose bestehenden festen Stoffe die Kristallisation von etwa 25 bis 30%Dextrose, berechnet auf Trockenbasis, verhindert, welche bekanntlich in dem Hydrolysat noch anwesend sind.When these hydrolyzates are passed over charcoal, filtration and Concentration refined and crystallized by the usual methods of engineering no higher yields of crystalline dextrose than about 60% (dry basis) obtain. This is essentially the same yield as the old acid conversion of starch using comparable refining and crystallization processes is obtained. In both cases, those present in the hydrolyzates do not have solid substances consisting of dextrose the crystallization of about 25 to 30% dextrose, calculated on a dry basis, prevents which is known in the hydrolyzate are present.

Wenn die Mutterlaugen aus den enzymatischen Verfahren wieder konzentriert und wieder kristallisiert werden, kann eine Ausbeute an zweitgradigem Zucker bis zu etwa 200/0 (Trockenbasis) aus den ursprünglichen in den Hydrolysaten vorhandenen festen Stoffen erzielt werden. Somit wird eine Gesamtausbeute an Zucker von etwa 800% erhalten. Wenn die Mutterlaugen aus dem sauren Konvertierungsverfahren raffiniert, wieder durch Säure hydrolysiert, konzentriert und kristallisiert werden, kann auch eine zusätzliche Ausbeute an zweitgradigem Zucker bis zu 200% erhalten werden, was auch eine Gesamtausbeute von 80% an erst- und zweitgradigem Zucker ergeben würde.When the mother liquors are concentrated again from the enzymatic process and recrystallized, a yield of second degree sugar can be up to about 200/0 (dry basis) from the original ones present in the hydrolysates solid substances can be achieved. Thus, a total sugar yield of about Get 800%. When the mother liquors are refined from the acidic conversion process, Can also be hydrolyzed, concentrated and crystallized again by acid an additional yield of second degree sugar up to 200% can be obtained what would also give an overall yield of 80% first and second degree sugars.

Selbstverständlich können die Rekonvertierungen, weiteres Raffinieren und Rekristallisieren viele Male wiederholt werden, um die Ausbeute über 80% bei sowohl dem sauren wie dem enzymatischen Verfahren zu erhöhen, aber die anteiligen Kosten wachsen mit jeder Wiederholung.Of course, the reconverts can, further refining and recrystallization are repeated many times to increase the yield over 80% both the acidic and the enzymatic process increase, but the proportionate Costs grow with each repetition.

Aus einer kritischen Prüfung -des Standes der Technik ist augenscheinlich, daß die Bearbeiter glaubten, daß die enttäuschend niedrige Dextroseausbeute, wie sie bei Stärkehydrolysaten aus der enzymatischen Konvertierung gefunden wurde, und daß die nicht höheren tatsächlichen Ausbeuten an kristallinem Pro-Bukt als bei vergleichbaren saurenHydrolyseverfahren entweder auf einem oder auf einer Kombination von zwei oder mehreren der folgenden Umstände beruhen würden 1. daß das Dextrose erzeugende Enzym an sich unfähig wäre, die Konvertierung bis auf einen beliebig höheren Grad durchzuführen, das ist, daß eine Grenzkonvertierung analog der mit dem Maltose erzeugenden Enzym, ,B-Amylase, vorhanden wäre, 2. daß die Grenzkonvertierung mit der Glukosidasequelle schwanken würde und daß höhere Dextroseausbeuten möglicherweise durch Auffindung eines Pilzextraktes mit einer höheren Konvertierungsgrenze erhalten würden, 3. daß das Dextrose erzeugende Enzym ein Maltasesubstrat, spezifisch für Maltose oder niedere Polysaccharide wäre und demgemäß die Dextroseausbeute aus Stärke völlig von der Anwesenheit anderer Enzyme in dem Pilzextrakt abhängig wäre, von welchen bekannt war, daß sie Maltose erzeugen, z. B. a-Amylasen, 4. .daß wegen notwendigerweise in der Praxis aus wirtschaftlichen Gründen angewendeter Bedingunden oder aus dem einen oder anderen Grund in einer oder mehreren Stufen des Herstellungsverfahrens von Dextrose keine höheren Dextroseausbeuten erhalten werden könnten als die tatsächlich gefundenen; dabei erwogene Bedingungen waren beispielsweise Konzentration der Stärke oder des Stärkeprodukts, welche für die Hydrolyse durch das Enzym verwendet wurden, der Grad oder die Weise, in welcher die Stärke vor der Enzymhydrolyse vorbehandelt wurde, wie z. B. mit Säure, ,der pH-Wert, Temperatur und andere Variablen der Enzymhydrolyse und die Weise, in welcher die Fermentation zur Gewinnung des Pilzextraktes durchgeführt wurde, 5. daß, obwohl eine Funktion des Amyloglukosidasemoleküle sei, Stärke zu Dextrose zu hydrolysieren, diese Wirkung wie eine Transferase wäre und demgemäß von diesem gleichen Enzymmolekül Entfaltung von Transglukosidaseaktivität als eine Nebenfunktion erwartet werden könnte, von welcher Verringerung der Dextroseausbeute angenommen werden.From a critical examination of the state of the art it is evident that that the compilers believed the disappointingly low dextrose yield, such as it was found in starch hydrolysates from enzymatic conversion, and that the actual yields of crystalline Pro-Bukt are not higher than with comparable ones acid hydrolysis processes on either one or a combination of two one or more of the following circumstances would be based on 1. that the dextrose producing Enzyme per se would be incapable of converting to an arbitrarily higher degree to carry out, that is, that a limit conversion analogous to that produced with the maltose Enzyme,, B-amylase, would be present, 2. that converting the boundary with the glucosidase source would stagger, and that higher dextrose yields may through discovery a mushroom extract with a higher conversion limit would be obtained, 3. that the dextrose producing enzyme is a maltase substrate, specific for maltose or lower polysaccharides and accordingly the dextrose yield from starch completely would depend on the presence of other enzymes in the mushroom extract, which ones was known to produce maltose, e.g. B. a-amylases, 4. .that because of necessarily in practice for economic reasons applied conditions or from the one or another reason in one or more stages of the manufacturing process no higher dextrose yields than that actually could be obtained from dextrose found; The conditions considered were, for example, starch concentration or the starch product used for hydrolysis by the enzyme the degree or manner in which the starch is pretreated prior to enzyme hydrolysis became such. With acid,, pH, temperature and other enzyme hydrolysis variables and the manner in which the fermentation to obtain the mushroom extract is carried out 5. That although a function of the amyloglucosidase molecule is, starch increases To hydrolyze dextrose, this effect would be like a transferase and accordingly of this same enzyme molecule display of transglucosidase activity as one Secondary function could be expected from what reduction in dextrose yield be accepted.

Jede beliebige und alle diese und ähnliche Theorien stehen im auffallenden Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung.Any and all of these and similar theories stand in the striking Contrasted with the present invention.

Es wurde gefunden, daß das Amyloglukosidasemolekül nicht nur eine Funktion besitzt, nämlich die Bindungen von Stärkemolekülen so zu hydrolysieren, um Dextrose zu erzeugen, und daß alle anderen in Pilzextrakten vorhandenen Enzyme (oder alle andere enzymatische Aktivität) von diesem Amyloglukosidasemolekül abgetrennt werden können. Es wurde weiter gefunden, daß Amyloglukosidase die nicht rudzierenden Enden von Stärkemolekülen angreift, Dextrose unmittelbar von diesen Enden abspaltet und so längs des Stärkemoleküls fortfährt, bis es im wesentlichen vollständig zu Dextrose hydrolysiert ist. Niedrige Ausbeuten in durch Verwendung von rohen Amyloglukosidase enthaltenden Pilzextrakten erhaltenen Stärkehydrolysaten sind demgemäß auf andere störende Enzyme einschließlich Transglukosidasen, welche andere Endprodukte als Dextrose ergeben, zurückzuführen. Wenn Stärke oder Stärkeprodukte mit gereinigten Extrakten hydrolysiert werden, welche nur Amyloglukosidaseaktivität enthalten und Ausbeuten bis zu etwa 100% erhalten werden und so gewonnene Hydrolysate immer noch gewisse Raffinierprobleme darbieten, so beruht dies vor allem auf fremdem Protein und Salzen, welche mit dem gereinigten Extrakt zugeführt werden und gegebenenfalls einen Teil des Hydrolysats bilden.It has been found that the amyloglucosidase molecule is not just one Function, namely to hydrolyze the bonds of starch molecules in such a way that to produce dextrose, and that all other enzymes present in mushroom extracts (or any other enzymatic activity) separated from this amyloglucosidase molecule can be. It was further found that amyloglucosidase does not reduce the Attacks ends of starch molecules, cleaving dextrose directly from these ends and so continues along the starch molecule until it is essentially completely closed Dextrose is hydrolyzed. Low yields in using crude amyloglucosidase starch hydrolysates obtained containing mushroom extracts are accordingly to others interfering enzymes including transglucosidases, which end products other than Dextrose yielded to be attributed. When starch or starch products with purified Extracts are hydrolyzed which only contain amyloglucosidase activity and Yields up to about 100% can be obtained and hydrolyzates obtained in this way still present certain refining problems, this is mainly due to foreign protein and salts, which are supplied with the purified extract and optionally form part of the hydrolyzate.

Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Reinigen von Amyloglukosidase enthaltender Zubereitung, wonach eine wäßrige Lösung dieser Zubereitung mit etwa 2 bis etwa 5% eines wasserunlöslichen, wasserhaltigen synthetischen Magnesiumsilikats bei einem pH-Wert von etwa 3,8 bis etwa 4,5 behandelt, die Mischung zentrifugiert und die flüssige, die Amyloglukosidase enthaltende Phase gewonnen wird. Die Erfindung schafft ferner ein Verfahren zur Herstelliuig von Dextrose aus Stärke, wobei die Stärke in wäßrigem System mit einer Amyloglukosidase enthaltenden Enzymzubereitung zu einem maximalen D. E. und wahren Dextrosegehalt hydrolysiert, das Hydrolysat geklärt, durch Verdampfen konzentriert und kristallisieren gelassen und die kristallisierte Dextrose von der- Mutterlauge abgetrennt wird, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Stärke mit einer Amyloglukosidase enthaltenden Enzymzubereitung hydrolysiert wird, welche durch das eben erwähnten Verfahren gereinigt wurde. Diese Hydrolyse führt zu einem schließlichen Hydrolysat, welche maximale D. E.-Werte von etwa 95 bis 96% und maximale wahre Dextrosegehalte von etwa 93 bis 94% Trockenbasis besitzt.The invention provides a method for purifying amyloglucosidase containing preparation, after which an aqueous solution of this preparation with about 2 to about 5% of a water-insoluble, water-containing synthetic magnesium silicate treated at a pH of about 3.8 to about 4.5, the mixture centrifuged and the liquid phase containing the amyloglucosidase is recovered. The invention also provides a process for the production of dextrose from starch, the Starch in an aqueous system with an enzyme preparation containing amyloglucosidase hydrolyzed to a maximum D.E. and true dextrose content, the hydrolyzate clarified, concentrated by evaporation and allowed to crystallize and the crystallized Dextrose is separated from the mother liquor, which process is characterized is that the starch is hydrolyzed with an enzyme preparation containing amyloglucosidase which has been purified by the above-mentioned method. This hydrolysis leads to a final hydrolyzate which has maximum D.E. values of about 95 up to 96% and a maximum true dextrose content of about 93 to 94% dry basis.

Im besonderen schafft die Erfindung ein verbessertes, praktisches enzymatisches Verfahren zur Gewinnung von Dextrose in außergewöhnlich hoher Ausbeute aus Stärke und Stärkeprodukten, wobei eine Amyloglukosidase enthaltende Zubereitung verwendet wird, welche vorbehandelt wurde zu ihrer Reinigung von störenden Enzymen einschließlich beispielsweise Transglukosidase, welche zur Erzeugung anderer Zucker als Dextrose wirkt. Vorzugsweise sollte auch die Amyloglukosidase von fremdem Protein und Salzen gereinigt werden, welche, wenn sie ein Teil der Hydrolysatflüssigkeit werden, die Schwierigkeit des Raffinierens dieser Flüssigkeiten zwecks schließlicher Erzeugung reinen kristallinen Zuckers (Dextrose) vergrößern.In particular, the invention provides an improved, practical one enzymatic process for obtaining dextrose in exceptionally high yield of starch and starch products, a preparation containing amyloglucosidase is used, which has been pretreated to clean them from disruptive enzymes including, for example, transglucosidase which is used to produce other sugars acts as dextrose. Preferably also the amyloglucosidase should be from foreign protein and salts are purified, which when they become part of the hydrolyzate liquid become, the difficulty of refining these liquids for the purpose of eventual Increase production of pure crystalline sugar (dextrose).

Es ist bevorzugt, obwohl nicht notwendig, zuerst jegliche unlöslichen, festen, in der Suspension der Enzymzubereitung vorhandenen Stoffe zu entfernen. Die Enzymzubereitung kann aus der ganzen Kulturflüssigkeit aus untergetauchtem Wachstum eines Amylase erzeugenden Mikroorganismus oder aus der aus der untergetauchten Kultur erhaltenen geklärten Flüssigkeit oder aus einer Suspension einer ganz oder teilweise getrockneten Zubereitung, welche Kleie, Stärke oder verschiedene andere zum Standardisieren der Amylasezubereitung benutzten Zusätze enthält, oder aus einer Lösung von völlig löslicher Enzymzubereitung bestehen. Im allgemeinen sollte die Behandlung der Enzymzubereitung bei einem p$ ausgeführt werden, bei welchem das gewünschte Enzym beständig ist, das -ist bei einem sauren pH. Weil das synthetische Magnesiumsilikat das p$ nach der alkalischen Seite verändert, ist erwünscht, das p$ nach der sauren Seite einzustellen und dann die Behandlung unter sauren Bedingungen durchzuführen. Im Anschluß an den Zusatz des Absorbierungsmittels zu und Einstellung des pH-Wertes der Lösung oder Suspension der Enzymzubereitung wird die Mischung gerührt, und dann werden die feste und flüssige Phase voneinander getrennt. Die Transglukosidaseaktivität der Kulturflüssigkeit, fremdes Protein, färbende Stoffe und andere Verunreinigungen werden in der festen Phase zurückgehalten, während die gewünschte Carbohydrase, insbesondere Amyloglukosidase, in der flüssigen Phase verbleibt.It is preferred, although not necessary, to first remove any insoluble, to remove solid substances present in the suspension of the enzyme preparation. The enzyme preparation can be made from the whole culture liquid from submerged growth an amylase producing microorganism or from the submerged culture clarified liquid obtained or from a suspension of a wholly or partially dried preparation, what bran, starch or various others to standardize the amylase preparation contains additives used, or from a solution of completely soluble enzyme preparation. In general, the treatment should be the enzyme preparation be carried out with a p $ at which the desired enzyme is stable, that -is at an acidic pH. Because the synthetic magnesium silicate the p $ after changed on the alkaline side, it is desirable to adjust the p $ to the acidic side and then to carry out the treatment under acidic conditions. Following the Adding the absorbent to and adjusting the pH of the solution or Suspension of the enzyme preparation, the mixture is stirred, and then the solid and liquid phase separated from each other. The transglucosidase activity of the culture fluid, foreign protein, coloring matter and other impurities are in the solid Phase held back while the desired carbohydrase, especially amyloglucosidase, remains in the liquid phase.

Im allgemeinen wurde gefunden, daß die meisten rohen Pilzextrakte in sehr wirksamer Weise in bezug auf die Amyloglukosidase gereinigt werden, wenn von etwa 2 bis etwa 5 Gewichtsprozent pro Volumen an dem Absorbierungsmittel zu den rohen Flüssigkeiten zugesetzt und diese Flüssigkeiten auf einem pH-Wert von etwa 3,8 bis etwa 4,5 während der Behandlung gehalten werden. Geringere Anteile an dem Magnesiumsilikat-Absorbierungsmittel entfernen üblicherweise nicht alleEnzyme, welche dieDextroseausbeuten während der enzymatischen Hydrolyse von Stärke herabsetzen, und größere Anteile können durch einfache mechanische Absorption merkliche Mengen des gewünschten Enzyms Amyloglukosidase beseitigen. Bevorzugte Behandlungstemperaturen sind von etwa 5 bis etwa 30° C und bevorzugte Behandlungszeiten von etwa 30 bis etwa 60 Minuten.In general, most raw mushroom extracts have been found to be can be purified in a very effective manner with respect to amyloglucosidase, if from about 2 to about 5 weight percent by volume of the absorbent added to the raw liquids and these liquids to a pH of about 3.8 to about 4.5 are maintained during treatment. Lower proportions on the magnesium silicate absorbent usually remove not all enzymes which yield the dextrose during the enzymatic hydrolysis of Reduce strength, and larger proportions can be achieved by simple mechanical absorption eliminate significant amounts of the desired enzyme amyloglucosidase. Preferred Treatment temperatures are from about 5 to about 30 ° C and preferred treatment times from about 30 to about 60 minutes.

Amyloglukosidase-Aktivitätseinheiten werden wie folgt bestimmt: Das Substrat ist ein 15 bis 18 D. E. saures Hydrolysat von Maisstärke, gelöst in Wasser und auf 4,0 g Trockensubstanz pro 100 ccm Lösung verdünnt. Genau 50 ccm Lösung werden in eine 100 ccm volumetrische Flasche pipettiert. Zu der Flasche werden 5 ccm von 1,Omolarem Natriumacetat-Essigsäurepuffer, p$ 4,3, zugesetzt. Die Flasche wird in ein Wasserbad bei 60° C gebracht, und nach 10 Minuten wird die genaue Menge an Enzymzubereitung zugesetzt. Genau 120 Minuten nach dem Zusatz der Enzymzubereitung wird die Lösung auf einen Phenolphthalein-Endpunkt mit 1 n-Natriumhydroxyd eingestellt. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur gekühlt und auf das Volumen verdünnt. Ein reduzierender Zuckerwert, berechnet als Dextrose, wird an dem verdünnten Muster und an einem Kontrollmuster mit keiner zugesetzten Enzymzubereitung bestimmt.Amyloglucosidase units of activity are determined as follows: Das The substrate is a 15 to 18 D. E. acid hydrolyzate of corn starch dissolved in water and diluted to 4.0 g dry matter per 100 ccm solution. Exactly 50 cc solution will be pipetted into a 100 cc volumetric bottle. 5 cc of 1, Omolar Sodium Acetate-Acetic Acid Buffer, p $ 4.3, added. The bottle is in Put a water bath at 60 ° C, and after 10 minutes the exact amount of enzyme preparation is made added. Exactly 120 minutes after the addition of the enzyme preparation, the solution becomes adjusted to a phenolphthalein endpoint with 1N sodium hydroxide. The solution is then cooled to room temperature and diluted to volume. A reducing one Sugar value, calculated as dextrose, is measured on the diluted sample and on a control sample determined with no added enzyme preparation.

Amyloglukosidase-Aktivität wird dann wie folgt berechnet worin A = Amyloglukosidase-Aktivitätseinheiten pro ccm oder pro g Enzymzubereitung, S = reduzierende Zucker im durch Enzym konvertiertem Muster, g%100 ccm, B = reduzierende Zucker in dem Kontrollmuster g/100 cmm, E = Menge an angewandter Enzymzubereitung ccm oder g bedeutet. Die reduzierende Zuckerkonzentration in dem enzymkonvertierten Muster sollte nicht mehr als 1,0 g/ 100 ccm sein.Amyloglucosidase activity is then calculated as follows where A = amyloglucosidase activity units per ccm or per g enzyme preparation, S = reducing sugars in the enzyme-converted pattern, g% 100 ccm, B = reducing sugars in the control pattern g / 100 cmm, E = amount of enzyme preparation used ccm or g . The reducing sugar concentration in the enzyme-converted sample should not be more than 1.0 g / 100 cc.

Alle Variationen von Stärke oder Stärkeprodukten und stärkehaltigen Stoffen können bei dem neuen Amyloglukosi-dase-Hydrolyse verwendenden Verfahren benutzt werden. Vorzugsweise jedoch sollte für Dextrosezuckergewinnung eine reine Stärke verwendet werden, vorzugsweise aus wirtschaftlichen Gründen eine reine Stärke, welche schon durch ein Mittel teilweise hydrolysiert oder konvertiert ist, um so die sehr hohe Viskosität nativer Stärke zu verringern, wenn sie in Wasser suspendiert oder gelöst ist. Verringerung der Viskosität erleichtert die Verwendung von Stärkesubstanz mit höheren Gehalten an festen Stoffen bei der Amyloglukosidase-Hydrolyse. Vorbehandlung der Stärke kann in beliebiger Weise nach bekannten Verfahren erfolgen, z. B. durch vorhergehende Stärkehydrolysen, Vorbehandlung mit einer gereinigten a-Amylase; welche sehr stark mindestens in den Anfangsphasen der Hydrolyse in gleicher Weise wie Säure auf Stärke einwirkt, oder Vorbehandlung durch physikalische Mittel, wie das Schicken der Paste durch einen Votator oder Homogenisator. Die Vorbehandlung kann eine Kombination von zwei oder mehr Verfahren sein, beispielsweise Behandlung mit Säure unter Druck oder mit einer a-Amylase, kombiniert mit dem Durchgang durch einen Votator. In jedem Fall sollte die Vorbehandlung geeignet sein., um die Viskosität des Substrats bis zu einem Grad zu verringern, daß bearbeitbare Flüssigkeiten mit einer Konzentration an festen Stoffen von 25 bis 5o- Gewichtsprozent erhalten werden und vorzugsweise mit etwa 350/0 festen Stoffen, wenn die Temperatur der Flüssigkeit zwischen 45 und 60° C ist. jedoch sollte diese Vorbehandlung nicht über den erwähnten Grad hinaus erstreckt werden, .denn sonst können einige unerwünschte Merkmale der bei der Vorbehandlung angewendeten Hydrolyse oder Konvertierung die Ergebnisse überlagern, welche bei der nachfolgenden Amyloglukosidase-Hydrolyse erhalten werden.All variations of starch or starch products and starchy ones Substances can be used in the new amyloglucosidase hydrolysis method to be used. Preferably, however, a pure dextrose sugar should be used Starch are used, preferably a pure starch for economic reasons, which has already been partially hydrolyzed or converted by an agent, so much so reduce the very high viscosity of native starch when suspended in water or is resolved. Reducing the viscosity facilitates the use of starch substance with higher solids content in amyloglucosidase hydrolysis. Pretreatment the strength can be made in any manner by known methods, e.g. B. by previous starch hydrolysis, pretreatment with a purified α-amylase; Which very strong at least in the initial stages of hydrolysis in the same way as acid interacts with starch or pre-treatment by physical means, such as sending the paste through a votator or homogenizer. The pretreatment can be a combination of two or more methods, e.g., treatment with acid under pressure or with an α-amylase combined with passage through a votator. In each Case, the pretreatment should be suitable to keep the viscosity of the substrate up to a degree that workable liquids decrease with a concentration of solids from 25 to 5o percent by weight and preferably with about 350/0 solids when the temperature of the liquid is between 45 and 60 ° C. however, this pretreatment should not go beyond the mentioned degree because otherwise some undesirable features may occur during the pretreatment applied hydrolysis or conversion superimpose the results which at subsequent amyloglucosidase hydrolysis.

Somit wird beispielsweise bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Stärke mit sehr verdünnter Säure unter Druck in der üblichen Weise konvertiert, wobei ein Stärkesirup hergestellt und der Sirup bei etwa 33% Konzentration an festen Stoffen zu Dextrose mit gereinigter Amyloglukosidase hydrolysiert wird. Wenn die Stärke so in vergleichsweise dünnen Dispersionen bis zu einem Grad von etwa 10 bis 20 D. E. konvertiert ist, kann das Produkt der Amyloglukosidase-Hydrolyse bei der bevorzugten Konzentration unterworfen werden und Hydrolyse mit einem Dextrosegehalt in dem außergewöhnlich hohen Bereich von 90 bis 98% Trockenbasis erhalten werden. Wenn jedoch die Säurebehandlung wesentlich ausgedehnter ist, dann wird, obwohl sogar konzentriertereLösungen angewendet werden können, nichtsdestoweniger die Amyloglukosi,dase-Hydrolyse nicht so vollständig verlaufen erscheinen, weil die Säure eine gewisse Menge von enzymwiderstandsfähigen Reversionsprodukten in den fortgeschritteneren Phasen der Säurebehandlung erzeugt hat.Thus, for example, in a preferred embodiment of the Invention starch is converted in the usual way with very dilute acid under pressure, being made a corn syrup and the syrup at about 33% concentration of solids Substances are hydrolyzed to dextrose with purified amyloglucosidase. If the Starch so in comparatively thin dispersions up to a degree of about 10 to 20 D. E. is converted, the product of amyloglucosidase hydrolysis in the preferred concentration and hydrolysis with a dextrose content can be obtained in the exceptionally high range of 90 to 98% dry basis. However, if the acid treatment is much more extensive, then it will be, though more concentrated solutions can be applied, nonetheless the amyloglucosi, thee-hydrolysis do not appear to run as completely because the acid has a certain amount of enzyme-resistant reversion products in the more advanced phases of the Acid treatment generated.

jedenfalls sollte das Säuresubstrat in Wasser dispergiert und die Lösung auf einen Säuregrad eingestellt und die Temperatur so ausgewählt werden, daß die Amyloglukosidase die Hydrolyse in kürzester Zeit und mit bester Wirtschaftlichkeit in bezug auf die Menge an angewendetem Enzym vollenden kann. Säuregrad und Temperatur sind voneinander abhängige Variablen. Calcinierte Soda, Natriumhydroxyd u. dgl. sind geeignete alkalische Stoffe, und Salzsäure ist eine geeignete Säure, um diese Einstellungen des pH-Wertes der Flüssigkeiten für die Amyloglukosi-dase-Hydrolysen herbeizuführen.in any case, the acid substrate should be dispersed in water and the Solution adjusted to a degree of acidity and the temperature selected so that that the amyloglucosidase the hydrolysis in the shortest possible time and with the best economic efficiency in terms of the amount of enzyme used. Acidity and temperature are interdependent variables. Calcined soda, sodium hydroxide, and the like are suitable alkaline substances, and hydrochloric acid is a suitable acid for these Adjustments of the pH of the liquids for the amyloglucosidase hydrolyses bring about.

Die beste Temperatur für die Hydrolyse bei einer Amy loglukosidase liegt zwischen 35 und 60° C, obwohl die beste Temperatur von einem pH-Wert abhängig ist, wie es mit vielen anderen Enzymen der Fall ist. Dementsprechend ist der beste PH-Wert-Bereich, welcher im allgemeinen zwischen 4 und 6,5 liegt, von der Temperatur abhängig. Im allgemeinen werden beste Hydrolysegeschwindigkeiten für reine Amyloglukosidase im unteren p],-Wert-Bereich von 4 bis 5 erreicht, wenn die angewendete Temperatur im unteren Bereich von 35 bis 45° C liegt, und wenn die Temperatur erhöht wird, werden beste Geschwindigkeiten durch Erhöhen des pH Wertes in entsprechender Weise erzielt.The best temperature for hydrolysis in an amyloglucosidase is between 35 and 60 ° C, although the best temperature depends on a pH value is, as is the case with many other enzymes. Accordingly, it is the best The pH range, which is generally between 4 and 6.5, depends on the temperature addicted. In general, best rates of hydrolysis will be for pure amyloglucosidase in the lower p], - value range from 4 to 5 reached when the applied temperature is in the lower range of 35 to 45 ° C, and when the temperature is increased, get the best speeds by increasing the pH accordingly achieved.

Bei der Hydrolyse von, Stärke oder Stärkeprodukten mit Amyloglukosi.dase zur Gewinnung von Dextrose wird eine weitere Beschränkung in. bezug auf den PH-Wert und und die Temperatur auferlegt wegen der nachlassenden Beständigkeit des Produkts Dextrose bei höheren px Werten und höheren Temperaturen. Demgemäß sind bei Ausführung der Lehre dieser Erfindung die bevorzugten Arbeitsbereiche zur Hydrolyse mit Amyloglukosidase ein pH-Wert von 4,0 bis 4,8 und eine Temperatur von 45 bis 60° C. Die Länge der Zeit für die Stärkehydrolyse hängt von verschiedenen Betriebsvariablen ab. Am wichtigsten von diesen sind Verhältnis von Amyloglukosidase zu Substrat, Vorbehandlung der Stärke, Zusatz von unterstützenden Enzymen, angewendete Temperaturen und pH-Werte und .die Substratkonzentration. Jedoch und in jedem Fall kann die Hydrolyse in der Praxis durch bekannte analytische Bestimmungen verfolgt werden, wie z. B. das Sichert-Bleyer-Verfahren für die Bestimmung von Dextrose, und die Hydrolyse wird fortgesetzt, bis es durch Analyse augenscheinlich ist, daß die Wirkung ':der Amyloglukosidase im wesentlichen unter den gewählten Arbeitsbedingungen vollendet ist, d. h. bis die Konzentration von Dextrose in dem Hydrolysat ein Optimum erreicht hat. Im allgemeinen wird ein praktisches Optimum vorhanden sein, wenn die löslichen festen Stoffe in dem Hydrolysat durch Analyse zu 90 bis 98% Dextrose auf Trockenbasis gefunden werden. Die erforderliche Länge der Zeit, um zu diesem Optimum zu gelangen, wird zwischen etwa 10 und 90 Stunden, in Abhängigkeit von den Betriebsbedingungen, wie sie im vorstehenden erörtert wurden, schwanken. Ein zweckmäßiger Arbeitsbereich für den Zusatz an gereinigter Amyloglukosidase ist etwa 10 bis 20 Amyloglukosi@dase-Aktivitätseinheiten auf 100 g Stärkesubstrat oder etwa 90 bis 180 Einheiten pro kg Stärke.In the hydrolysis of starch or starch products with amyloglukosi.dase for the production of dextrose there is a further limitation in relation to the pH value and and the temperature imposed due to the deteriorating durability of the product Dextrose at higher px values and higher temperatures. Accordingly, are upon execution the teaching of this invention the preferred working areas for hydrolysis with amyloglucosidase a pH of 4.0 to 4.8 and a temperature of 45 to 60 ° C. the Length of time for starch hydrolysis depends on various operational variables away. The most important of these are the ratio of amyloglucosidase to substrate, Pretreatment of starch, addition of supporting enzymes, temperatures used and pH values and the substrate concentration. However, in any case, hydrolysis can can be followed in practice by known analytical determinations, e.g. B. the Sichert-Bleyer method for the determination of dextrose, and hydrolysis continues until it is evident by analysis that the effect ': the Amyloglucosidase essentially completed under the chosen working conditions is, d. H. until the concentration of dextrose in the hydrolyzate reaches an optimum Has. In general, there will be a practical optimum if the soluble solids in the hydrolyzate by analysis to be 90 to 98% dextrose on a dry basis being found. The length of time required to get to this optimum takes between about 10 and 90 hours, depending on the operating conditions, as discussed above. A functional work area for the addition of purified amyloglucosidase is about 10 to 20 amyloglucosidase activity units on 100 g of starch substrate or about 90 to 180 units per kg of starch.

Im Anschluß an die Hydrolysestufe des Verfahrens wird das Hydrolysat raffiniert, konzentriert, kristallisiert und zentrifugiert, um die kristalline Dextrose in reiner Form zu gewinnen unter Verwendung von in der Glukose-Raffimerungsindustrie bekannten Anlagen und allgemeinen Verfahren, wobei zu bedenken ist, daß die gemäß der Erfindung erzeugten Hydrolysate niedrigere Konzentrationen an färbenden Stoffen, Elektrolyten und anderen Verunzeinigungen und dementsprechend höhere Konzentrationen an Dextrose aufweisen und gereinigte Hydrolysatflüssigkeiten darstellen, welche leichter und vollständiger als die bisher bekannten Hydrolysate kristallisieren.Following the hydrolysis stage of the process, the hydrolyzate Refined, concentrated, crystallized and centrifuged to produce the crystalline dextrose obtainable in pure form using in the glucose refining industry known systems and general procedures, it should be borne in mind that according to of the invention, hydrolyzates produced lower concentrations of coloring substances, Electrolytes and other impurities and, accordingly, higher concentrations of dextrose and are purified hydrolyzate liquids which crystallize more easily and more completely than the previously known hydrolysates.

Die Erfindungsoll an den folgenden Beispielen erläutert werden, welche typisch und unterrichtend, aber nicht beschränkend sind.The invention is to be illustrated by the following examples, which are typical and instructive, but not limiting.

Beispiel 1 Eine Probe von roher A.-niger-Kulturflüssigkeit wurde zu einer wäßrigen Lösung von sauer konvertierter Maisstärke mit einem D. E. von 17%, Trockenbasis, einem pH von 4,0 und einem Gehalt an festen Stoffen von 35 Gewichtsprozent zugesetzt. Der Anteil der rohen Kulturflüssigkeit zu den festen Stoffen im Hydrolysat war 10 ccm/100 g. Jedes ccm enthielt 1,5 Amyloglukosidase-Aktivitätseinheiten. Die enzymatische Hydrolyse wurde- während 72 Stunden bei 60' C vonanschreiten gelassen. Die Flüssigkeit wurde dann filtriert und analysiert. Die Ergebnisse folgen in der Tabelle.Example 1 A sample of crude A. niger broth was added to an aqueous solution of acid converted corn starch having a DE of 17%, dry basis, a pH of 4.0 and a solids content of 35% by weight. The proportion of the crude culture liquid to the solids in the hydrolyzate was 10 cc / 100 g. Each cc contained 1.5 amyloglucosidase units of activity. The enzymatic hydrolysis was allowed to proceed for 72 hours at 60 ° C. The liquid was then filtered and analyzed. The results follow in the table.

Eine andere Probe der erwähnten rohen A.-niger-Kulturflüssigkeit wurde durch Zusatz eines synthetischen, wasserunlöslichen Magnes-iumsilikats, verkauft durch die Westvaco Chlor-Alkali Division der Food. and Machinery Chemical Corporation, behandelt: Das Adsorbierungsmittel wurde in einem Anteil von 4 g auf 100 ccm mit ausreichender Salzsäure zugesetzt, um ein pg von 4,0 bis 4,5 während der Behandlung aufrechtzuerhalten. Die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur etwa 1 Stunde gerührt und filtriert.Another sample of the aforementioned crude A. niger culture fluid was by adding a synthetic, water-insoluble magnesium silicate by the Westvaco Chlor-Alkali Division of Food. and Machinery Chemical Corporation, treated: The adsorbent was in a proportion of 4 g per 100 ccm with Sufficient hydrochloric acid is added to maintain a pg of 4.0 to 4.5 during treatment maintain. The mixture was then stirred at room temperature for about 1 hour and filtered.

Das Filtrat wurde zu einer Probe des erwähnten Stärkehydrolysats in einer Menge von 10 ccm Filtrat zu 100g festen Stoffen des Hydrolysats zugegeben. Jedes ccm enthielt 1,5 Amyloglukoisidase-Aktivitätseinheften. Die Hydrolyse wurde 72 Stunden bei 60' C voranschreiten gelassen. Die Flüssigkeit wurde dann filtriert und analysiert. Die Ergebnisse folgen auch in der Tabelle. Konzentration Tatsächliche***) . der festen Stoffe D. E. ** OptisdieDidite*) ) Dextrose Hydrolysat aus im Hydrolysat % Trocken- o rocken- in Gewichts- bei Ä=39 me. bass /o T basis prozent roher A.-niger-Flüssigkeit ...................... 35,56 0,208 90,2 84,0 roher A.-niger-Flüssigkeit, mit dem Adsorptions- mittel behandelt .............................. 35,50 0,126 95,2 92,7 *) Verwendung eines Coleman-Modells 14-Spektrophotometer, **) nach der modifizierten Fehlingschen Prüfung, ***) nach der Smogyi-Hefe-Fermentationsmethode. Es ist zu beachten, daß eine Zunahme von 8,7% mehr Dextrose in den festen Stoffen des Hydrolysats war, wenn die rohe Kulturflüssigkeit gemäß der Erfindung zur Entfernung schädlicher Stoffe für die Dextroseausbeute und zur Entfernung von Enzymen, welche anderen Zucker als Dextrose erzeugen, behandelt worden war. Daß weit mehr Nichtdextrosezucker durch die rohe Pilzflüssigkeit erzeugt werden, ist augenscheinlichdurch Vergleich der Werte für unter D. E. gefundenen Gesamtzucker mit den Werten für die wirklichen Dextrosegehalte. Im Fall des mit der rohenFlüssigkeit erzeugtenHydrolysats wurden 6,201o Nichtdextrosezucker erzeugt, während imFall des mit der behandelten Pilzflüssigkeit erzeugten Hydrolysats nur 2,5 % Nichtdextrosezucker erzeugt wurden. Somit wären fast 4% mehr Nichtdextrosezucker, welche in dem Hydrolysat von .der rohen Pilzflüssigkeit erzeugt wurden. Der zusätzliche Gewinn an Dextroseausbeute über diese 40% Nichtdextrosezucker bis zu 8,7% mehr Dextrosekonvertierung mit der gereinigten Amyloglukosidase kann durch die Beseitigung fremden Proteins und anderer Stoffe, welche die Carbohydrase während. der Hydrolyse stören, infolge der Behandlung erklärt wenden. Optische Dichtewerte in der Tabelle zeigen, daß die Färbung des Stärkehydrolysats um 40 % durch Verwendung des gereinigten Enzyms verringert wurde.The filtrate was added to a sample of the aforementioned starch hydrolyzate in an amount of 10 cc of filtrate to 100 g of solids of the hydrolyzate. Each cc contained 1.5 amyloglucoisidase activity labels. The hydrolysis was allowed to proceed for 72 hours at 60 ° C. The liquid was then filtered and analyzed. The results also follow in the table. Concentration Actual ***) . of solids DE ** OptisdieDidite *)) Dextrose Hydrolyzate from% dry o rock- in weight at Ä = 39 me. bass / o T basis percent crude A. niger liquid ...................... 35.56 0.208 90.2 84.0 raw A. niger liquid, with the adsorption medium treated .............................. 35.50 0.126 95.2 92.7 *) Using a Coleman model 14 spectrophotometer, **) according to the modified Fehling's test, ***) using the smogyi yeast fermentation method. It should be noted that an increase of 8.7% more dextrose was in the solids of the hydrolyzate when the crude culture liquid according to the invention was used to remove substances harmful to the dextrose yield and to remove enzymes which produce sugars other than dextrose, had been treated. The fact that far more non-dextrose sugar is produced by the raw fungal liquid can be seen by comparing the values for total sugar found under DE with the values for the actual dextrose contents. In the case of the hydrolyzate produced with the raw liquid, 6,201o non-dextrose sugar was produced, while in the case of the hydrolyzate produced with the treated fungal liquid, only 2.5% non-dextrose sugar was produced. Thus there would be almost 4% more non-dextrose sugars generated in the hydrolyzate of the raw mushroom liquor. The additional gain in dextrose yield over this 40% non-dextrose sugar up to 8.7% more dextrose conversion with the purified amyloglucosidase can be achieved by removing foreign protein and other substances that the carbohydrase takes during. interfere with hydrolysis, as a result of the treatment explained. Optical density values in the table show that the color of the starch hydrolyzate was reduced by 40% by using the purified enzyme.

Beispiel 2 Chromatographische Analysen von Hydrolysaten Hydrolysatmuster aus Beispiel 1, genommen zu verschiedenen Zeiten während .der enzymatischen Konvertierung, wurden durch Papierchromatographie untersucht. In jedem - Fall wurden 0,025 ccm Teile von Muster, eingestellt auf 12% Konzentration an festen Stoffen, auf das Papier gebracht, das Papier getrocknet und das Chromatogramm entwickelt mit einem Lösungsmittelgemisch aus 3 Volumteilen Butanol, 5 Volumteilen Propanol und 2 Volumteilen Wasser. Nach einer Zeit, während welcher die Dextrosefraktion sich etwa 400 mm von ihrem Ursprung bewegte, wurden die Papiere getrocknet und dann mit einer Acetonlösung von Anilindiphenylamin und Phosphorsäure besprüht. Der ursprüngliche saure hydrolysierte Stärkesirup allein und dieser zugesetzte Isomaltose und Panose enthaltende Sirup wurden auch chromatographiert als Kontrollen und um Beziehungspunkte für bekannte Saccharide zu geben. Während der gegebenen Zeit bewegten sich Maltose etwa 190 mm, Isomaltose 150 mm, Trisaccharide etwa 80 bis 90 mm, Tetrasaccharide 40 mm und Pentasaccharide 15 mm. Alle diese Flecken waren leicht in den Kontrollchromatogrammen als unterschieden unä wohlgetrennt voneinander ersichtlich.Example 2 Chromatographic Analyzes of Hydrolyzates Hydrolyzate samples from Example 1, taken at different times during the enzymatic conversion, were examined by paper chromatography. In each case, 0.025 ccm part of sample, adjusted to 12% concentration of solids, was applied to the paper, the paper was dried and the chromatogram was developed with a solvent mixture of 3 parts by volume of butanol, 5 parts by volume of propanol and 2 parts by volume of water. After a time during which the dextrose fraction was moving about 400 mm from its origin, the papers were dried and then sprayed with an acetone solution of aniline diphenylamine and phosphoric acid. The original acid hydrolyzed corn syrup alone and this added syrup containing isomaltose and panose were also chromatographed as controls and to give points of reference for known saccharides. During the given time, maltose moved about 190 mm, isomaltose 150 mm, trisaccharides about 80 to 90 mm, tetrasaccharides 40 mm and pentasaccharides 15 mm. All of these spots were easily seen in the control chromatograms as distinct and well separated from one another.

Wenn Hydrolysatmuster von Beispiel 1 untersucht wurden, worin nur das rohe A.-niger-Kulturfiltratzum Hydrolysieren des säurehydroly sierten Stärkesirups benutzt worden war, bestand das Hydrolysat dem Augenschein nach zum großen Teil aus Dextrose. Jedoch waren ein ausgesprochener Fleck für die synthetische Trisaccharidpantose, schwächere Flecken für Maltose und Isomaltose und noch schwächere Flecken für -Tetra- und Pentasaccharide alle nach 24 Stunden Hydrolysierzeit bei 60° C vorhanden. Alle diese Flecken außer für Dextrose und Isomaltose wurden schwächer nach 72 Stunden Hydrolysierzeit, obwohl der Fleck für das synthetische Trisaccharid Pantose immer noch verhältnismäßig stark war.When hydrolyzate samples of Example 1 were examined in which only the crude A. niger culture filtrate for hydrolyzing the acid hydrolyzed corn syrup had been used, the hydrolyzate apparently existed for the most part from dextrose. However, a definite stain for the synthetic trisaccharide pantose, weaker stains for maltose and isomaltose and even weaker stains for -Tetra- and pentasaccharides all present after hydrolyzing for 24 hours at 60 ° C. All these spots except for dextrose and isomaltose became weaker after 72 hours Hydrolysis time, although the stain for the synthetic trisaccharide pantose is always was still relatively strong.

Isomaltose ist bekanntlich ein normales Produkt der Hydrolyse von Stärke, selbst wenn die Stärke durch Säure hydrolysiert wird und die Säurehydrolyse sogar unter wenig günstigen Bedingungen für die Bildung von Isomaltose durch Wiedervereinigung von zwei Dextrosemolekülen durchgeführt wird (W o 1 f -r o m u. a., J. Am. Chem. Soc., 73, 4927 [1951]).Isomaltose is known to be a normal product of the hydrolysis of Starch even if the starch is hydrolyzed by acid and the acid hydrolysis even under less favorable conditions for the formation of isomaltose by reunification is carried out by two dextrose molecules (W o 1 f -r o m et al., J. Am. Chem. Soc., 73, 4927 [1951]).

In Stärkehydrolysaten anwesende Panose entsteht in großem Umfange synthetisch durch Vereinigung von Maltose mit Dextrose über eine 1,6-a-Glukosidbindung mittels des Enzyms Transglukosidase (Pan u. a., Science, 112, 115 [1950]).Panose present in starch hydrolysates arises to a large extent synthetic by combining maltose with dextrose via a 1,6-α-glucoside linkage by means of the enzyme transglucosidase (Pan et al., Science, 112, 115 [1950]).

Wenn Hydrolysate geprüft wurden, welche mit durch Behandlung von A.-niger-Kulturflüssigkeit mit wasserhaltigem, unlöslichem synthetischem Magnesiumsilikat gereinigter Amyloglukosidase hergestellt waren, dann waren nach 24 Stunden Enzymkonvertierung etwa die gleichen Mengen an Trisaccha.riden und Maltose wie in dem nicht durch Enzym hydrolysierten Kontrollmuster und mehr Isomaltose und sehr viel mehr Dextrose vorhanden. Nach 72stündiger Enzymkonvertierung war das Hydrolysat fast nur Dextrose mit einer Spur von Isomaltose und nur den schwächsten Spuren von Maltose und Panose. Es waren nicht ausreichende Mengen von höheren Sacchariden anwesend, um dies auf dem Chromatogramm anzuzeigen.If hydrolysates were examined which were obtained by treating A. niger culture fluid Amyloglucosidase purified with water-based, insoluble synthetic magnesium silicate then were about the same after 24 hours of enzyme conversion Amounts of trisaccha.riden and maltose as in the one not hydrolyzed by enzyme Control pattern and more isomaltose and a lot more dextrose present. After 72 hours Enzyme conversion, the hydrolyzate was almost entirely dextrose with a trace of isomaltose and only the faintest traces of maltose and panose. They weren't enough Amounts of higher saccharides present to indicate this on the chromatogram.

Diese Ergebnisse beweisen, daß die Magnesiumsilikatbehandlung des A.-niger-Extrakts in wirksamer Weise Transglukosidase entfernte, so daß sie nicht die Dextroseausbeute durch Synthetisierung von Zuckern, wie Panose, verringerte. Die Ergebnisse zeigen ferner, daß nach Behandlung der A.-niger-Kulturflüssigkeit mit Magnesol die sich ergebende gereinigte Enzymzubereitung im wesentlichen nur eine solche die Stärke hydrolysierende Aktivität entfaltete, welche dem gereinigten Enzym Amyloglukosidase zugeschrieben wird. Dies ist der endgültige Angriff auf jedes Stärkemolekül (oder sauer hydrolysiertes Stärkemolekül) und das Abspalten nur von Dextroseeinheiten von Molekülenden, bis die Hydrolyse praktisch vollendet ist.These results prove that the magnesium silicate treatment of the A. niger extract effectively removed transglucosidase so that it does not decreased the dextrose yield by synthesizing sugars such as panose. The results also show that after treating the A. niger culture fluid with Magnesol the resulting purified enzyme preparation essentially only exhibited such starch hydrolyzing activity which the purified Enzyme amyloglucosidase is attributed. This is the final attack on everyone Starch molecule (or acid hydrolyzed starch molecule) and the cleavage of only Dextrose units from the ends of the molecule until hydrolysis is practically complete.

Beispiel 3 Mit Wasser gewaschene Stärke wird auf 10° Be mit Wasser aufgeschlämmt, auf etwa 0,02normale Säure mit Salzsäure eingestellt und dann in einem Autoklav bei 1,40 kg/cm2 Dampfdruck konvertiert, bis die Konvertierungsflüssigkeit etwa 17 D. E. aufwies, d. h., der reduzierende Wert der gelösten festen Stoffe in der Flüssigkeit, gemessen durch eine-modifizierte Fehlingsche Prüfung (Fetzer, W. J., Analytical Chem., 24, 1129 bis 1137 [1952], Bezugsnummer 37 bis 41) und der als Dextrose berechnete Wert ist 17% Trockenbasis. Die Stärkesirupflüssigkeiten werden dann mit 0,5% Trockenbasis Bentonit behandelt und auf einem vorher mit Dicalite-Filterhilfe überzogenen Filter filtriert. Die Flüssigkeiten werden auf pg 5 durch Zusatz von calcinierter Soda eingestellt und durch Eindampfen unter verringertem Druck auf etwa 35% feste Stoffe konzentriert. Die Flüssigkeiten werden jetzt auf pg 4,0 bis 4,2 bei 60° C eingestellt und für jedes kg an vorhandener Trockensubstanz etwa 180 Aktivitätseinhenten einer gereinigten Amyloglukosi.dasezubereitung zugesetzt. Die Amyloglukosidase war durch Behandeln eines A.-niger-Kulturextrakts mit wasserhaltigem, unlöslichem synthetischem Magnesiumsilikat Adsorbierungsmittel in der im Beispiel 1, Abs. 2, geschilderten Weise gereinigt worden. Enzymatische Hydrolyse wird bei 60° C 72 Stunden voranschreiten gelassen, wonach höchste Werte von etwa 95 bis 96 für D. E. und etwa 93 0/0 Trockenbasis für wahre Dextrose durch die Smogyi-Hefe-Fermentationsmethode erhalten werden.Example 3 Starch washed with water is adjusted to 10 ° Be with water Slurried, adjusted to about 0.02 normal acid with hydrochloric acid and then in an autoclave at 1.40 kg / cm2 vapor pressure converted to the conversion liquid had about 17 D.E., i.e. i.e., the reducing value of the dissolved solids in of the liquid, measured by a modified Fehling's test (Fetzer, W. J., Analytical Chem., 24, 1129 to 1137 [1952], reference numbers 37 to 41) and der value calculated as dextrose is 17% dry basis. The corn syrup liquids are then treated with 0.5% dry basis bentonite and on a beforehand with Dicalite filter aid coated filter filtered. The liquids are reduced to pg 5 by adding Calcined soda adjusted and concentrated by evaporation under reduced pressure about 35% solids concentrated. The liquids are now down to pg 4.0 4.2 set at 60 ° C and about 180 for each kg of dry matter present Activity units of a purified amyloglucosidase preparation added. the Amyloglucosidase was obtained by treating an A. niger culture extract with hydrous, insoluble synthetic magnesium silicate adsorbent in the example 1, para. 2, has been cleaned as described. Enzymatic hydrolysis is involved 60 ° C allowed to proceed for 72 hours, after which highest values of about 95 to 96 for D. E. and about 93% dry basis for true dextrose by the Smogyi yeast fermentation method can be obtained.

Die konvertierten Flüssigkeiten werden mit etwa 1% Kohle behandelt, filtriert und auf etwa 70 bis 75% Trockensubstanzgehalt eingedampft, bevor sie in den Kristallisator gehen. Wegen der höheren Reinheit dieser Flüssigkeiten im Vergleich zu Kristallisatorflüssigkeiten aus bisher bekannten Verfahren neigt die Dextrose viel schneller zum Kristallisieren, welche Eigenschaft die Verwendung einer weniger konzentrierten Flüssigkeit ermöglicht, als gewöhnlich bei den üblichen Dextrosekristallisierverfanren erforderlich ist. Eine anfängliche Temperatur von 42° C wird im Kristallisator- gebraucht. mit dem üblichen Zusatz von Dextrosesaatkristallen, und die Flüssigkeiten werden unter Rühren während 2 Tagen auf etwa 16 bis 18° C gekühlt. Die Flüssigkeiten werden dann zentrifugiert, um die Dextrosekristalle zu gewinnen, und die Flüssigkeiten werden nochmals nach Eindampfen auf etwa 75 bis 80% Trockensubstanzgehalt und Rühren während des Kühlens über einen Temperaturbereich von etwa 42 bis 18° C innerhalb 4 Tagen zum Kristallisieren gebracht.The converted liquids are treated with about 1% coal, filtered and evaporated to about 70 to 75% dry matter content before being put into go to the crystallizer. Because of the higher purity of these liquids in comparison Dextrose tends to crystallize liquids from previously known processes much faster to crystallize, which property to use a less concentrated liquid than usual dextrose crystallization procedures is required. An initial temperature of 42 ° C is achieved in the crystallizer second hand. with the usual addition of dextrose seed crystals, and the liquids are cooled to about 16 to 18 ° C. for 2 days with stirring. The liquids are then centrifuged to recover the dextrose crystals and the liquids are again after evaporation to about 75 to 80% dry matter content and stirring while cooling over a temperature range of about 42 to 18 ° C within Brought to crystallize for 4 days.

Ausbeuten von sehr hoher Reinheit, erstgradiger kristalliner Dextrose von etwa 85% ergeben sich bei diesem Verfahren, wobei ein Abzug für die bei der Kristallisation des konzentrierten Hydrolysats zugesetzten Saatkristalldextrosen gemacht ist. Diese Ausbeute ist etwa 20% mehr Dextrose, als aus Stärke nach bekannten Säurekonvertierungsverfahren unter Verwendung einer einstufigenSäurekonvertierung und vergleichbaren Raffinierverfahren erhalten wird, und 5 bis 10% oder mehr Ausbeute an Dextrose als bei bisherigen Enzymkonvertierungsverfahren unter Verwendung einer einstufigen Enzymkonvertierung von sauerhy.drolysierter Stärke unter vergleichbaren Raffinierverfahren und vergleichbarer doppelstufiger Kristallisation.Very high purity yields, first grade crystalline dextrose of about 85% result from this method, with a deduction for the Crystallization of the seed crystal dextrose added to the concentrated hydrolyzate is made. This yield is about 20% more dextrose than from starch according to known Acid conversion process using a one-step acid conversion and comparable refining processes, and 5 to 10% or more yield of dextrose than previous enzyme conversion processes using one one-step enzyme conversion of acid hydrolyzed starch among comparable ones Refining process and comparable double-stage crystallization.

Claims

Claim: Method for purifying an amyloglucosidase enzyme containing preparation for the saccharification of starch-like substances and their Degradation products, characterized in that an aqueous solution of this preparation with about 2 to about 5% of a water-insoluble, water-containing synthetic magnesium silicate treated at a pH of about 3.8 to about 4.5, the mixture spun and the liquid phase containing the amyloglucosidase is recovered. Considered Publications: Chemisches Zentralblatt, 1951, 11, p. 2672, L. A. Underkofler and D. K. Roy; "Enzymology" by O. Hoffmann-Ostenhof, Vienna, 1954, p.35.