DE10359610A1

DE10359610A1 - Bakterielles Einschrittverfahren zum TNT-Abbau

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Publication number: DE10359610A1
Application number: DE10359610A
Authority: DE
Inventors: Harald Claus; Helmut König; Isabelle Lehmler; Johannes Preuß; Ulrich Dehner; Tobias Bausinger
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: DE10359610B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nitroaromaten-abbauende bakterielle Isolate, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102). Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben, umfassend Bereitstellen eines Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolats, Bereitstellen einer Nitroaromat-kontaminierten Probe und Behandeln der Probe mit dem bakteriellen Isolat auf eine Weise, daß der Nitroaromat durch das Isolat produktiv abgebaut wird. Zuletzt betrifft die Erfindung entsprechende Verwendungen der Isolate.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nitroaromaten-abbauende bakterielle Isolate, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102). Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromatenkontaminierten Proben, umfassend Bereitstellen eines Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolats, Bereitstellen einer Nitroaromat-kontaminierten Probe, und Behandeln der Probe mit dem bakteriellen Isolat auf eine Weise, daß der Nitroaromat durch das Isolat produktiv abgebaut wird. Zuletzt betrifft die Erfindung entsprechende Verwendungen der Isolate allein oder in Kombination.

Beschreibung

Die Gesamtproduktion von 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT), des wichtigsten Explosivstoffs des 2. Weltkrieges, belief sich im Dritten Reich auf über 800.000 t. In Folge der Produktion, durch Havarien und schließlich durch unsachgemäße Demontage von Anlagen gelangte er weiträumig in Boden und Grundwasser, so daß TNT, sowie seine Vorläufer- und Nebenprodukte heute eine Gruppe von zentralen Kontaminanten bei Rüstungsaltlasten sind. TNT ist infolge seiner guten Sprengkraft und Brisanz, wegen seiner Gießbarkeit in günstigem Temperaturbereich (ca. 80° C) und wegen seiner Handhabungssicherheit der am meisten gebrauchte militärische Sprengstoff. Er ist darüber hinaus ein wesentlicher Bestandteil gewerblicher Sprengstoffe [Meyer 1985]. TNT bildet schwach gelbliche Kristalle oder Schuppen und hat eine Wasserlöslichkeit von 130 mg/l. In kontaminierten Bereichen liegt TNT je nach Eintragungsart als feiner Staub oder als auskristallisierter Klumpen vor. Die heterogene Verteilung im Boden behindert die Mobilität und damit die Bioverfügbarkeit und erschwert zudem die Analytik.

Ein Report des Umweltbundesamtes (2000) in Berlin weist zwanzig Produktionsstätten für TNT aus, die im Zeitraum von vor dem ersten Weltkrieg bis 1990 in Deutschland betrieben wurden [Thieme et al. 1996]. Die weltweit erste TNT-Fabrik war in Leverkusen-Schlebusch von 1904 bis 1926 in Betrieb [Homburg 1995]. In Schönebeck an der Elbe wurde TNT noch bis 1990 produziert [Thomas et al. 2001]. Seit Einstellung der Produktion und Demontage der relevanten Installationen werden die Gelände verschiedener ehemaliger Rüstungsfabriken heute teilweise zu Wohn- und/oder Gewerbegebieten genutzt [Schneider 1989]. Ein bemerkenswertes Beispiel ist das Gelände der ehemaligen TNT-Fabrik in Krümmel bei Hamburg, auf dem heute ein Atomkraftwerk steht. Lediglich die Standorte bei Clausthal-Zellerfeld im Harz ("Werk Tanne") [Braedt et al. 1998], Hallschlag ("Espagit") in der Eifel [Schmitz 1995], Elsnig bei Leipzig [Trimborn 1995] und Schönebeck an der Elbe [Thieme et al. 1996] liegen heute brach. Im Dritten Reich wurde bis zum Ende des 2. Weltkrieges nicht nur in diesen zwanzig Produktionsstätten Munition produziert und gelagert. Munitionsanstalten waren über das ganze Land verteilt [Preuß und Wiegand 1992]. Eine Studie von 1996 listet 3.240 Rüstungsaltlasten-Verdachtsflächen auf, von denen mindestens 750 potentiell mit Explosivstoffen kontaminiert sind [Preuß 1996]. Es wird geschätzt, daß sich die kontaminierten Flächen zu über 10.000 km² aufsummieren [Preuß 1996]. Für die Produktion des Sprengstoffs waren enorme Wassermengen notwendig. Im "Werk Tanne" fielen z.B. bei einer Produktion von 4.000 t TNT pro Monat täglich 5.000 bis 6.000 m³ saure Abwässer aus den TNT-Wäschen an, die bis an die Löslichkeitsgrenze mit TNT kontaminiert waren. Weitere 35.000 m³ wurden täglich als Kühlmittel benötigt, um den Nitrierungsprozeß zu kontrollieren. Die Gesamtabwassermenge belief sich im "Werk Tanne" auf ca. 40.000 m³ pro Tag [Kayed 1989]. Diese große Menge verunreinigten Abwassers wurde nur neutralisiert und direkt in die Vorfluter eingeleitet, auf dem Werksgelände versickert oder über Schluckbrunnen in den Untergrund versenkt. Bedingt durch diesen enormen Wasserverbrauch lagen Sprengstoffwerke in wasserreichen Gegenden – unseren heutigen Trinkwassereinzugsgebieten. Durch Produktion, Havarien (Explosionen), Bombenangriffe und schließlich die Demontage durch die Alliierten wurden die Gelände weiträumig mit Nitroaromaten (Mono-, Di- und Trinitrotoluole) kontaminiert. Und noch heute, mehr als 50 Jahre nach Ende des zweiten Weltkrieges, werden die Nitroaromaten bei jedem Regen ausgespült, so daß teure Aktivkohle-Filteranlagen das Grundwasser schützen müssen.

In mehreren Untersuchungen wurde nachgewiesen, daß 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT) und viele Abbauprodukte sowohl auf Fische [Osmon und Klausmeier 1972], Ratten und Mäuse [Ashby et al. 1985], als auch auf Algen und aquatische Pflanzen [Sunahara et al. 1999] toxisch wirken. Auf verschiedene Mikroorganismen, wie Hefen, Pilze, Actinomyceten und Grampositive Bakterien wirkt TNT ab einer Konzentration von 50 mg/l toxisch. [Klausmeier et al. 1973]. Aber auch die Vorstufen des TNT, die Dinitrotoluole, werden als sehr toxisch eingestuft und wirken zudem kanzerogen und mutagen [Schneider et al. 2000]. Die Symptome der Vergiftungen beim Menschen nach inhalativer oder dermaler Aufnahme von Mononitrotoluol, Dinitrotoluol und TNT sind wenige Tage nach Expositionsbeginn wie folgt beschrieben: Allgemeine Schwäche, Kopfschmerzen, Appetitlosigkeit, Benommenheit, Übelkeit, Schlaflosigkeit, Gliederschmerzen, Gefühllosigkeit verschiedener Hautpartien und Durchfall. Starke Veränderungen des Blutbildes sind die Folge der Exposition. Besonders auffällig ist eine Cyanose, eine blaurote Verfärbung von Lippen, Fingernägeln und Haut infolge Sauerstoffunterversorgung. Hervorgerufen wird sie durch Metabolite des TNT, die für vermehrte Methämoglobinbildung und Hämolyse verantwortlich gemacht werden. Die Metaboliten des TNT wirken leberschädigend [Koss et al. 1989].

TNT ist aufgrund seiner chemischen Eigenschaften weitgehend persistent gegenüber einem mikrobiellen Abbau. Der elektronenziehende Charakter der drei Nitrogruppen verhindert einen initial oxidativen (elektrophilen) Angriff am Ring. Deshalb ist die verbreitetste Reaktion die Reduktion der Nitrogruppen zu den entsprechenden Aminogruppen. Unter aeroben Bedingungen werden als Reduktionsprodukte oft 2-Hydroxylamino-4,6-dinitrotoluol (2-HADNT) und 4-Hydroxylamino-2,6-dinitrotoluol (4-HADNT), 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT) und 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT), sowie 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DANT) beschrieben. Nur unter strikt anaeroben Bedingungen (Eh = -200 eV) wird auch die dritte Nitrogruppe unter Bildung von Triaminotoluol reduziert [Blotevogel und Gorontzy 2000, Spain 1995]. "Nitroreduktasen", die diese Reaktionen katalysieren, sind ubiquitär bei Bakterien und höheren Organismen (Pilze, Pflanzen, Tiere) vorhanden [Spain 1995].

Es gibt einige Berichte über aeroben wie anaeroben Abbau von TNT durch Bakterien (Boopathy und Kulpa, 1994; Ederer et al., 1997; Esteve-Núñez und Ramos, 1998; Kalafut et al., 1998; Hawari et al., 2000). Meistens sind anaerobe Bakterien oder Pilze untersucht worden. Berichte über Abbauversuche mit aeroben Bakterien sind neueren Datums.

Bei der TNT-Metabolisierung durch bakteriellen Einfluß wurde bisher eine geringe oder keine Mineralisierung beobachtet. Von strikt anaeroben Bakterien wie Clostrdium sp., Desulfovibrio sp. und Archaebakterien wie Methanococcus sp. wird TNT zu 2,4,6-Triaminotoluol reduziert (Boopathy und Kulpa 1994; Crawford, 1995; Ederer et al., 1997). Einige Clostridien können TNT auch zu Hydroxylaminodinitrotoluol reduzieren, das weiter abgebaut wird (Esteve-Núñez et al., 2001).

Unter aeroben Bedingungen wird TNT durch Bakterien meist zu Aminoderivaten über Nitroso- und Hydroxylamino-Zwischenprodukte reduziert (Esteve-Núñez et al., 2001). Diese reaktionsfähigen Metabolite werden nicht weiter abgebaut (Vorbeck et al., 1998), sondern an die organische Bodenmatrix immobilisiert.

Die dieser Umsetzungen von TNT durch Mikroorganismen finden kometabolisch statt. Es sind erst einige Bakterien, vor allem Pseudomonas-Stämme und Pilze entdeckt worden, die TNT als Stickstoffquelle bei aeroben Bedingungen unter Entfernung des Stickstoffes aus dem aromatischen Ringes nutzen (Duque et al., 1993; Boopathy und Kulpa, 1994). Zum Beispiel Pseudomonas sp. JLR 11 nutzt diesen Weg. Dabei wird Nitrit freigesetzt und dann weiter zu Ammonium reduziert. Fast 85% des Stickstoffes des TNT kann als organischer Stickstoff in die Zellen eingebaut werden (Esteve-Núñez und Ramos, 1998; Esteve-Núñez et al., 2000). Als Zwischenprodukt der Stickstofffreisetzung findet man in manchen Fällen nach Hydrogenierung des aromatischen Ringes einen -Meisenheimer-Komplex (French et al., 1998, Heiss und Knackmus 2002).

Andere fakultative Pseudomonas-Stämme nutzen TNT als einen alternativen Elektronenakzeptor in der Atmungskette und bilden dabei ATP (Esteve-Núñez et al., 2000). In einem Fall wurde sogar berichtet, daß TNT durch einen Stamm von Serratia marcescens als einzige Kohlenstoff und Energie-Quelle, aber nicht gleichzeitig als Stickstoffquelle genutzt werden kann (Montpas et al. 1997). Auch Weißfäulepilze wie Phanerochaete chrysosporium können TNT in beachtlichem Umfang mineralisieren. Verantwortlich für diesen Abbau ist das sogenannte ligninolytische Enzymsystem [Bumbus und Tatarko 1994, Spain 1995]. Das ligninolytische Enzymsystem der Weißfäulepilze besteht unter anderem aus einer Reihe von extrazellulären Peroxidasen (Lignin-Peroxidase, manganabhängige Peroxidase) und Oxidasen (Laccase), die den Abbau des Holzbestandteils Lignin katalysieren. Der Stoffwechsel beginnt aber dennoch reduktiv, wobei der Pilz zunächst eine Nitrogruppe zu 4-ADNT bzw. 2-ADNT reduziert. Danach finden verschiedene Acylierungsreaktionen statt, die zu einer Vielzahl von formylierten und acetylierten Produkten führen [Hawari et al. 1999]. Eines dieser formylierten Produkte, 2-Amino-4-formamido-6-nitrotoluol, konnte schließlich als Substrat der Lignin-Peroxidase identifiziert werden [Spain 1995]. Die anderen Produkte werden unter ligninolytischen Bedingungen ebenfalls abgebaut [Hawari et al. 1999]. Die Mangan-abhängige Peroxidase vermag 4-ADNT direkt zu mineralisieren, wie mit dem Ligninperoxidasenegativen Pilz Nematoloma frowardii gezeigt werden konnte [Scheibner et al, 1997]. Kürzlich konnte auch ein intrazelluläres Cytochrom P-450-abhängiges Enzymsystem identifiziert werden, das an der Mineralisierung von TNT bei Bjerkandera adusta beteiligt ist [Eifers et al. 1999].

Ende der 80er Jahre lagen bundesweit noch keine Erfahrungen zur Reinigung von mit TNT verunreinigtem Boden vor. Das BMFT (heute BMBF) hat sich damals im Rahmen der MOSAL-Ausschreibung (Modellhafte Sanierung von Altlasten) zur Förderung des FuE-Vorhabens "Modellhafte Sanierung von Altlasten am Beispiel des TNT-Sanierungsprojektes Stadtallendorf/Hessen" entschlossen (Laufzeit 01.07.1990 bis 30.04.1999). Eine Dokumentation dieses Vorhabens ist im Rahmen der "Fachübergreifenden Auswertung von Forschungsergebnissen" kürzlich vom Umweltbundesamt veröffentlicht worden (Umweltbundesamt, PT AWAS (Hrsg.). FKZ 1490900. CD-ROM.). Weitere Standorte, an denen die Sanierung bereits begonnen wurde, sind Hessisch-Lichtenau/Hirschhagen und Leverkusen-Schlebusch. Dabei wurde u.a. belasteter Oberboden ausgetauscht und je nach Belastungsgrad entweder der Verbrennung, der Bodenwäsche oder dem Bergversatz zugeführt. Um eine Vorstellung von Sanierungskosten und -aufwand zu bekommen, seien die folgenden Zahlen vom Standort Stadtallendorf genannt: Mehr als 4.000 der 11.000 Stadtallendorfer Bürger wohnen auf dem heutigen Werksgelände, 8.000 Leute arbeiten dort [Weingran 1995]. Die Sanierungsmaßnahmen finden statt, ohne die Menschen umzusiedeln oder Industrien zu schließen. Obwohl das Gelände über 420 ha groß ist, mußten bisher nur ca. 100.000 t TNT kontaminiertes Bodenmaterial behandelt werden [Böhmer und Rölle 1999]. Dagegen wird die noch aus dem ersten Weltkrieg stammende Sprengstoff-Fabrik "Espagit" bei Hallschlag nicht saniert, sondern nur in der Kernzone ("Exotentrichter") durch Erdabdeckung gesichert. Anfallendes Sicherwasser wird durch eine unterirdische Ringleitung aufgefangen und über Aktivkohle gereinigt. Die Entscheidung gegen die Sanierung wird im Landkreis nach wie vor heftig diskutiert, wie zahlreiche Zeitungsberichte dokumentieren [Kölner Stadt-Anzeiger 2001]. Zur Produktion und Geschichte des Werkes "Espagit" bei Hallschlag ist vor kurzem ein Buch erschienen [Preuß und Eitelberg 1999]. Unabhängig von der Sanierungsfrage muß auch die Finanzierung geklärt werden. Wenn möglich sollten verschiedene Optionen des Flächenrecyclings geprüft werden. Daß dieses auch bei Rüstungsaltlasten möglich ist, zeigt das Beispiel der Sanierung der ehemaligen Munitionsanstalt "Kleinkötz" in der Nähe von Günzburg, Bayern. Hier ist die Wertschöpfung durch die Sanierung die wichtigste Finanzierungsstütze. Das genannte Gelände wird nach Abschluß der Sanierung an den dänischen Konzern LEGOLAND verkauft werden, die dort einen Freizeitpark errichten wollen [IABG 2001, Lauer et al. 1999].

Tatsächlich ist der Gedanke des Flächenrecyclings unter Ausnutzung der Wertschöpfung auch eine Chance für biologische Sanierungsverfahren, nicht nur auf Rüstungsaltlasten. Eine 1999 veröffentlichte Studie zur Ökonomie verschiedener Sanierungsverfahren von Bodenmaterialien kam zu dem Ergebnis, daß biologische Bodensanierungsverfahren in Deutschland aus technischen Gründen günstiger sind als Bodenverbrennungs- oder Bodenwaschverfahren [Jansky und Neumann 1999]. Aber solange die Deponierung von kontaminiertem Bodenmaterial die vordergründig günstigste Alternative zur Verwertung des Bodenmaterials darstellt, ist die Politik gefragt, den nachhaltigen Umgang mit der Ressource Boden zu unterstützen, so wie das Bundesbodenschutzgesetz es in § 1 fordert [Bundesbodenschutzgesetz 1998].

In der Vergangenheit wurden verschiedene On site-Verfahrensansätze zur biologischen Bodenbehandlung im Rahmen von Machbarkeitsstudien getestet: In Hessisch-Lichtenau/Hirschhagen wurde ein zweistufiges Reaktorverfahren (Bodensuspension) mit 30 t getestet [Lenke et al. 1998]. In Hallschlag wurde ein zweistufiges Reaktorverfahren (Bodensuspension) mit 50 t und ein anaerob/aerobes Kompostierungsverfahren mit 50 t getestet [Schmitz 1995]. In Leverkusen/Schleebusch wurde ein anaerob/aerobes Kompostierungsverfahren mit 45 t getestet [Warrelmann und Walter 1997] Das "Werk Tanne" bei Clausthal-Zellerfeld war und ist häufig "Testobjekt" von biologischen Verfahren zur Sanierung TNT-belasteter Böden. Im Kleinmaßstab wurden dort On site-Mieten mit Weißfäulepilzen [Braedt et al, 1998] und streuabbauenden Pilzen [Herre et al. 1997] getestet. Zur Zeit wird auch eine In situ-Behandlung auf einer Fläche von 175 qm durchgeführt [Warrelmann et al. 2000]. Die abschließenden Ergebnisse liegen aber noch nicht vor. Im Rahmen der maßstabsgerechten Erprobung biologischer Sanierungsverfahren wurden ein anaerob/aerobes Kompostierungsverfahren, ein dynamisches Beetverfahren und ein Mietenverfahren mit Weißfäulepilzen jeweils im 70-t-Maßstab erprobt.

Bei Experimenten mit radioaktiv markiertem TNT wurde immer wieder festgestellt, daß TNT und seine Metabolite unabhängig vom untersuchten Prozeß schnell und in hohen Quantitäten irreversibel an die Bodenmatrix binden. Das konnte in einem anaerob-aeroben Bodensuspensionsverfahren (> 99 %), bei verschiedenen Kompostierungsvarianten (bis 80 %), wenn der Bodenanteil 25 % nicht überstieg, sonst deutlich höher [Drzyga et al. 1998; 1999] und beim Einsatz von Pilzen (86 %) [Spain et al. 2000] gezeigt werden. Die Radioaktivität wurde jeweils in den wäßrig- und methanolisch-extrahierbaren, und in den organischen Fraktionen Fulvosäuren, Huminsäuren und Huminen bestimmt.

Es stehen heute vier verschiedene Verfahren für die biologische Sanierung TNT-kontaminierter Bodenmaterialien zur Verfügung, die nachweislich auf dem Prinzip der Humifizierung von Schadstoffen beruhen:

1. Anaerob-aerobes Bodensuspensionsverfahren des Fraunhofer Institutes für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik, Stuttgart
2. Anaerob-aerobes Kompostierungsverfahren der Fa. Umweltschutz Nord, Ganderkesee
3. Dynamisches Beetverfahren der Fa. Plambeck ContraCon, Cuxhaven
4. Pilzverfahren der Fa. AWIA Umwelt, Göttingen
5. Beetverfahren (WASAG, Haltern)

Es wurden oder werden noch weitere biologische Off site- und In situ-Verfahren zur Reinigung TNT-kontaminierter Böden/Bodenmaterialien in Deutschland entwickelt oder bereits angeboten. Diesen fehlt zur Zeit aber der Nachweis der Nachhaltigkeit [Reinhard und Feldmann 1998, Thomas et al. 2001] oder eine großmaßstäbliche Erprobung [Held et al. 1997]. Die bisher eingesetzten Pilzverfahren weisen einige gravierende Nachteile auf:

• Der Abbau von TNT erfordert den engen Kontakt mit dem Mycel, ausreichende Belüftung und Substratlimitierung, um das ligninolytische System zu induzieren.
• Ein weitere Nachteil für Feldanwendungen ist die Tatsache, daß die Weißfäulepilze in den Böden schlecht mit der vorhandenen Flora konkurrieren können und der Abbau von TNT durch Bodenversuche ist viel langsamer als unter optimalen Laborbedingungen.
• Weiterhin betreiben Weißfäulepilze den TNT-Abbau als Kometabolismus, während die Hauptkohlenstoffquelle durch den Abbau von Polysacchariden (Kohlenhydraten) bereitgestellt wird. Außerdem werden Radikale erzeugt, die schädlich für andere Bodenorganismen sind.
• Auch ist der reduktive (membranassoziiertes System) und oxidative Schritt (Exoenzyme) räumlich getrennt.
• Der TNT-Abbau durch Weißfäulepilze erfolgt nur teilweise über Mineralisation, sondern überwiegend durch Festlegung reduzierter bzw. oxidierter Metabolite als Polymerisate in die Bodenmatrix.(„Bioattenuation")

Wenn man die biologischen Verfahren für die in situ Sanierung verbessern würde, könnten damit Kosten gespart werden. Außerdem ist der Abbau von Schadstoffen durch Mikroorganismen eine sehr umweltfreundliche Methode, da die Struktur und die biologische Funktion des Bodens erhalten bleibt (Fritsche, 1998).

Es ist somit eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, mit der ein Abbau von Schadstoffen, und insbesondere Nitroaromaten, besonders einfach und effizient vorgenommen werden kann. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, effiziente Verfahren für eine effektive, schnelle und kostengünstige Dekontamination von Nitroaromaten-kontaminierten Proben auf bakterieller Basis zur Verfügung zu stellen.

Diese erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Nitroaromaten-abbauendes bakterielles Isolat, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102) gelöst.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung untersuchten die Erfinder die Fähigkeit von Mikroorganismen aus kontaminierten Umgebungen, 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT) zu metabolisieren. Bakterien, die in der gesättigten Zone leben, da sie hoch mit TNT und anderen Nitro-substituierten Verbindungen belastet ist, wurden isoliert. Zwei Stämme, Klebsiella terrigena HB und Serratia sp. M3 wurde genauer im Hinblick auf den TNT Abbau untersucht. Beide Isolate metabolisierten TNT bei Konzentrationen von bis zu 100 mg 1^–1 unter aeroben Bedingungen, sogar bei niedrigen Konzentrationen von Glucose (≤ 0,03%). Der TNT Abbau war in synthetischen Minimalmedien sowie in Ausgangs-kontaminierten Oberflächenwässern und Bodenextrakten effizient. Zusätzlich wurde gezeigt, daß die Isolate TNT als eine Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle verwenden konnten. Ungefähr 50% von ¹⁴C markiertem TNT wurde in die Biomasse eingebaut, jedoch wurde die Produktion von ¹⁴C-CO₂ nicht nachgewiesen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben, umfassend Bereitstellen eines Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolates, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102), Bereitstellen einer Nitroaromat-kontaminierten Probe, und Behandeln der Probe mit dem bakteriellen Isolat auf eine Weise, daß der Nitroaromat durch das Isolat produktiv abgebaut wird.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromatenkontaminierten Proben, welches das Bereitstellen des Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolats, die Isolierung oder teilweise Gewinnung des Isolats aus einer Wasser- oder Bodenprobe umfaßt. Diese Gewinnung kann ein Zentrifugieren oder die Kultur oder Vorkultur in einem geeigneten Medium umfassen.

Gemäß eines weiteren besonders bevorzugten Aspekts des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben ist die Nitroaromaten-Kontaminante ausgewählt aus 2,4,6-Trinitrotoluol (2,4,6-TNT oder TNT). Erfindungsgemäß kann die Probe weitere Kontaminationen enthalten, die ausgewählt sind aus 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT), 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT), 2-Hydroxylamino-4,6-dinitrotoluol (2-HADNT), 4-Hydroxylamino-2,6-dinitrotoluol (4-HADNT), 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT) und 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT), 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DANT), 1,3,5-Trinitrobenzol (TNB), 2-Nitroanilin (2-NA), 3,5-Dinitroanilin (3,5-DNA), 1,8-Dinitronaphthalin (1,8-DNN), Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (Hexogen), 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT), 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DANT), 2-Nitroanilin (2-NA), 1,3-Dinitrobenzol (1,3-DNB) und Octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazozin (Octagen). Obwohl experimentell noch nicht vollständig belegt, wird davon ausgegangen, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch in Anwesenheit dieser und anderer Nitroaromaten und Nitrosaminen verwendet werden konnte. Das vorliegende Verfahren konnte bei Konzentrationen von bis zu 100 mg 1^–1 2,4,6-TNT angewendet werden, wobei natürlich auch durchaus höhere oder niedrigere Konzentrationen vorliegen können.

Gemäß eines weiteren Aspekts des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Dekontaminierung von Nitroaromat-kontaminierten Proben umfaßt das Bereitstellen oder Aufbereiten des Nitroaromate-kontaminierten Probe ein Aufbereiten der Probe. Dieses Bereitstellen oder Aufbereiten kann ein Zentrifugieren und/oder die vollständige oder teilweise Isolierung der Probe aus einer Wasser- oder Bodenprobe umfassen.

Gemäß eines noch weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung erfolgt die Dekontaminierung der Nitroaromat-kontaminierten Proben unter zur Verfügung stellen einer Quelle an zusätzlichem Stickstoff und/oder Kohlenstoff. Obwohl nicht unbedingt erforderlich, fördert die Zugabe einer Quelle an zusätzlichem Stickstoff und/oder Kohlenstoff die Dekontaminierung der Nitroaromat-kontaminierten Probe. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Dekontaminierung von Nitroaromat-kontaminierten Proben gemäß der Erfindung ist die Quelle an zusätzlichem Stickstoff und/oder Kohlenstoff ausgewählt aus Glucose und NH₄Cl. Beispielsweise können 0.03-0.3 g l^–1 Glucose oder 0,4 g l^–1 NH₄Cl zugesetzt werden. Für den verbesserten TNT-Abbau benötigten die Isolate offensichtlich nur kleine Mengen einer weiteren Energiequelle. Ein Mol an TNT wurde zu nicht mehr als 0,1 Mol der reduzierten Derivate 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT) und 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT) metabolisiert, jedoch wurden 0,70 Mol als Nitrit gefunden. Die Freisetzung von Nitrit aus TNT macht den aromatischen Ring möglicherweise leichter gegenüber oxidativen Enzymen zugänglich.

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung erfolgt das Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromat-kontaminierten Proben vollständig oder teilweise unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen. Dies entspricht den üblicherweise in der natürlichen Umgebung vorhandenen Bedingungen. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromatenkontaminierten Proben, wobei das Verfahren vollständig oder teilweise in vitro oder in situ durchgeführt wird. Der TNT Abbau und das Wachstum durch die vorliegenden neuen bakteriellen Isolate fand auch unter in situ-ähnlichen Bedingungen statt, d.h. in Medien mit Oberflächenwasser und Bodenextrakten, die mit Nitro-substituierten Verbindungen kontaminiert waren. Die Ergebnisse sind im Hinblick auf mikrobiologische Bioremediationszwecke von früheren Munitions-Produktionsstätten ermutigend (Boopathy et al. 1997). Weiterhin können diese Isolate auch brauchbare Kandidaten für die Behandlung von anderen nitro-aromatisch kontaminierten Quellen, d.h. industriellen Abwässern, sein.

Das Verfahren wird erfindungsgemäß z.B. zur effizienten Sanierung von kontaminierten Sickerwässern, Oberflächenwässern und Bodenextrakten in Altlaststandorten eingesetzt.

Darüber hinaus sind die Neuisolate aussichtsreiche Kandidaten für die Behandlung anderer Nitroaromaten-haltiger Kontaminations-Quellen, z. B Industrieabwässer.

Mit der Isolierung kompetenter Bakterien und der Evaluierung der Reaktionsbedingungen liefert die vorliegende Erfindung die Grundlage für ein bakterielles Verfahren zum TNT-Abbau. Im Vergleich zu den etablierten Verfahren

• dient TNT hier als Wachstumssubstrat für die Mikroorganismen,
• wird TNT in Biomasse eingebaut und nicht lediglich transformiert,
• erfolgt der Abbau in einfachen synthetischen Wachstumsmedien mit zugesetztem TNT und in TNT kontaminierten Umweltproben,
• erfordert der Abbau nur geringe Mengen eines zusätzlichen Energielieferanten.

Das Verfahren soll zur Sanierung von Sickerwässern in Altlaststandorten eingesetzt werden. Darüber hinaus sind die Neuisolate aussichtsreiche Kandidaten für die Behandlung anderer Nitroaromaten-haltiger Kontaminations-Quellen, z. B Industrieabwässer.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung zeigen die Erfinder die Fähigkeit von Bakterien, die aus kontaminierten früheren Munitions-Herstellungstätten isoliert wurden, nicht nur hohe Konzentrationen von 2,4,6-TNT (100 mg l^–1) zu tolerieren, sondern sogar mit diesem zu wachsen. Als Klebsiella terrigena und Serratia sp. vorläufig identifizierte Isolate bauten diese Verbindung unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen als eine Quelle von zusätzlichem oder ausschließlichem Stickstoff und Kohlenstoff ab. Mitglieder dieser Genera wurden bereits beschrieben, die TNT biotransformieren (Fuller und Manning 1997; Hawari et al. 2000). Das hauptsächliche Produkt der kometabolischen Transformation durch Serratia plymuthica B7 war 4-Amino-2,6-dinitrotoluol. Eine Spaltung des aromatischen Ringes fand nicht statt. Obwohl das radio-markierte TNT nicht mineralisiert wurde, wurde 32 % als Zell-assoziierte ^l4C-Aktivität gemessen (Drzyzga et al. 1998). Ein ähnliches Ergebnis wurde mit dem Bakterium Pseudomonas pseudoalcaligenes JS52 erhalten, das TNT in der Anwesenheit von Nitrobenzol umwandelte. Die Autoren spekulierten, daß reduzierte Metaboliten von TNT Addukte mit Biomolekülen bilden könnten (Fiorella und Spain 1997). Ein aerober kometabolischer Umwandlung von TNT durch Stämme von Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., und Bacillus sp. wurde in kürzlichen Experimenten gezeigt. Hauptmetaboliten des Abbaus waren 2-Amino-4,6-dinitrotoluol, 4-Amino-2,6-dinitrotoluol, 2-Amino-4-nitrotoluol, und Nitrit.

Während in den oben erwähnten Untersuchungen TNT in einer nicht-produktiven kometabolischen Weise in Derivate ohne Spaltung des aromatischen Ringes umgewandelt wurde, konnten in den Experimenten der Erfinder K. terrigena HB und S. spec. M3 TNT als die einzige Quelle für Stickstoff und Kohlenstoff verwenden. Ähnlich isolierten Duque et al. (1993) einen Pseudomonas Stamm C1S1, der in der Lage war, auf TNT als der einzigen Quelle für Stickstoff zu wachsen, jedoch eine weitere Kohlenstoffquelle benötigte. Nitrit wurde im Medium angereichert. Eine Chargenkultur-Anreicherung wurde durchgeführt, um einen Derivatstamm, Pseudomonas sp. Klon A, zu isolieren, der schneller auf TNT wuchs und kein Nitrit im Kulturmedium akkumulierte. Es wurde gezeigt, daß beide Stämme TNT denitrierten, um 2,4- und 2,6-Dinitrotoluol, 2-Nitrotoluol und Toluol zu ergeben. Enterobacter cloacae PB2 kann Nitratester als einzige Stickstoffquellen verwenden, wie zum Beispiel Pentaerythritoltetranitrat (French et al. 1998). Unter anoxischen Bedingungen kann Pseudomonas sp. Stamm JLR11 mit TNT als der einzigen N Quelle, aber nicht Kohlenstoffquelle, wachsen, unter Abspaltung von Nitrit von dem aromatischen Ring und anschließender Reduktion zu Ammonium und Inkorporation in die Biomasse. Dieses Bakterium kann auch TNT als einen terminalen Elektronenakzeptor in Atmungsketten (Esteve-Núñez et al. 2000) verwenden.

In Abweichung von den meisten anderen Berichten ergab die vorliegende Erfindung starke Hinweise darauf, daß TNT als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle für K. terrigena HB und S. sp. M3 dienen kann: (1) Das Wachstum war in der Anwesenheit von TNT (3, 4) signifikant höher. Das geringe Wachstum ohne diese Verbindung wird den restlichen Nährstoffen zugeordnet, die mit dem Inokulum übertragen wurden. (2) Die Maxima der Wachstumsraten fielen parallel mit denjenigen von TNT-Eliminierung zusammen. (3) Reduzierte Endmetabolite von TNT (4-Amino-2,6-dinitrotoluol, 2-Amino-4,6-dinitrotoluol) wurden weniger als 10 % des erhältlichen TNT gefunden: nur 61 μM und 86 μM wurden jeweils aus 1 M TNT durch K. terrigena HB und S. spec. M3 gebildet. Keine anderen nitroaromatischen Metaboliten wurden in bemerkenswerten Mengen nachgewiesen. Auf der anderen Seite wurde Nitrit in fast equimolarer Menge freigesetzt, während TNT verbraucht wurde. (4) Ungefähr 50 % der anfänglichen ¹⁴C-Radioaktivität wurde in der Biomasse gefunden. Die restliche Radioaktivität in den Überständen (20 – 30%) kann der unvollständigen Verwendung von TNT zugeordnet werden, insbesondere unter den mikroaerophilen Kulturbedingungen, die in diesen spezifischen Experimenten angewendet wurden und der Bildung von kleinen Mengen von reduzierten aromatischen Metaboliten. Jedoch können die Erfinder die Produktion einiger anderer Metaboliten nicht ausschließen, die durch die vorliegenden Verfahren nicht nachgewiesen werden könnten. Die Bildung einer Fraktion von nicht-identifizierten Metaboliten, die im Kulturüberstand verbleiben, wurde in kürzlichen Studien berichtet (Drzyzga et al. 1998; van Aken et al. 1999). Van Aken et al. (1999) vermuteten, daß die restlichen nicht-identifizierten Metaboliten polare Ringspaltungsprodukte sein könnten, wie zum Beispiel Formiat, Acetat, Glyoxalat und/oder Malonat.

Insgesamt lassen die Daten vermuten, daß beide Stämme TNT nicht nur in einer kometabolischen, sondern auf eine produktive Weise nutzen, d.h. der Inkorporation von N und C in die Biomasse. Das Versagen ¹⁴C-CO₂ nachzuweisen, und das Fehlen von Wachstum mit TNT ohne die Anwesenheit von zusätzlichen Nährstoffen zeigt an, daß sehr geringe Mengen einer zusätzliche C-Quelle zu Beginn des Wachstums benötigt wird. Bereits geringe Glucosekonzentrationen (= 0,03% w/v) ausreichend, um die Biomasseproduktion mit TNT in einem signifikant höheren Ausmaß zu verstärken, als dies Glucose allein tat. Denselben Effekt hatte die Zugabe von ca. 1,5 % Standard I Medium zu dem Minimalmedium. Ähnlich zu den Ergebnissen der Erfindung baute ein Stamm von Serratia marcescens, isoliert aus dem Boden einer kontaminierten Stätte, 2,4,6-Trinitrotoluol als die einzige Quelle von Kohlenstoff und Energie ab (Montpas et al. 1997), aber eine Stickstoffquelle mußte zugegeben werden. Bei einer anfänglichen Konzentration von 50 mg 1^–1, wurde TNT in 48 h unter aeroben Bedingungen in einem Minimalsalzmedium vollständig abgebaut. Reduzierte Zwischenprodukte (4-Amino-2,6-dinitrotoluol; 2-Amino-4,6-dinitrotoluol) waren die einzigen von den Autoren genannten Metaboliten. Sie trugen zu weniger als 20 % des anfänglichen TNT bei.

Einige der folgenden kontrovers diskutierten metabolischen Routen könnten berücksichtigt werden. Pikrinsäure, die gewisse Strukturähnlichkeiten zu TNT besitzt, wird durch Rhodococcus erythropolis HLPM-1 als die einzige Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle verwendet (Rieger et al. 1999). Der Abbau wird via Bildung von Hydrid-Meisenheimer-Komplexen katalysiert, d.h. der Hydrogenierung des aromatischen Kerns, wie auch mit einem Nocardiodes sp. Stamm CB 22-2 gefunden wurde (Behrend und Heesche-Wagner 1999). Die Reaktion schließt die Funktion von Koenzym F₄₂₀ und seiner Reduktase ein, die für methanogene Archaea typisch sind, jedoch überraschenderweise aus dem aeroben Bakterium Nocardia simplex FJ2-1A isoliert wurden (Ebert et al. 1999). Hydridkomplexe werden auch gefunden, wenn Rhodococcus erythropolis HLPM-1 gegenüber TNT ausgesetzt wurde, jedoch wurde kein weiterer produktiver Abbau beobachtet (Heiss und Knackmus 2002). Im Gegensatz dazu wurde von einer gereinigten Pentaerythritoltetranitratreduktase aus E. cloacae PB2 gefunden, daß sie TNT zu seinen Hydrid- und Dihydrid-Meisenheimer-Komplexen transformiert, die weiter unter der Freisetzung von 1 mol Nitrit pro mol TNT abgebaut werden (French et al. 1998). Der TNT Metabolismus von Pseudomonas sp. Klon A und zwei anderen Bakterien wurde durch Vorbeck et al. (1998) untersucht. Die mögliche Quelle von Stickstoff für das Wachstum wurde als von Hydroxylaminodinitrotoluol stammend spekuliert, um so nicht-identifizierte polare Produkte zu ergeben, die eine wichtige Rolle im produktiven Abbau von TNT spielen könnten. Es wurde über eine viel versprechende aerobe Route für den TNT Metabolismus berichtet, die zu der Produktion von 2-Amino-4-nitrotoluol führte. Dieser Metabolit ergibt sich aus dem Verlust einer der anfänglichen Nitrogruppen, was zwei aneinander angrenzende nicht-substituierte Kohlenstoffatome ergibt, die als ein Substrat für Oxygenasen dienen können.

Der TNT Abbau und das Wachstum durch die vorliegenden neuen bakteriellen Isolate fand auch unter in situ-ähnlichen Bedingungen statt, d.h. in Medien mit Oberflächenwasser und Bodenextrakten, die mit Nitro-substituierten Verbindungen kontaminiert waren. Die Ergebnisse sind im Hinblick auf mikrobiologische Bioremediationszwecke von früheren Munitions-Produktionsstätten ermutigend. Weiterhin können diese Isolate auch brauchbare Kandidaten für die Behandlung von anderen nitro-aromatisch kontaminierten Quellen, d.h. industriellen Abwässern, sein.

Die Erfindung soll nun im Folgenden in Beispielen unter Bezug auf die beigefügten Figuren näher schrieben werden, ohne darauf beschränkt zu sein. In den Figuren zeigt

1 Wachstum und kometabolischer Abbau von 2,4,6-TNT in der Anwesenheit von Glucose und NH₄Cl (0,4 g l^–1). A: K. terrigena HB mit hoher Glucose (3,0 g l^–1); B: K. terrigena HB mit geringer Glucose (0,3 g l^–1), C: S. sp. M3 mit hoher Glucose (3,0 g l^–1), D: S. sp. M3 mit geringer Glucose (0,3 g¹).
-⎕- Wachstum mit TNT -o- Wachstum ohne TNT * (gepunktete Linie) TNT Konzentration (photometrische Bestimmung)

2 Wachstum mit 2,4,6-TNT als Stickstoffquelle in der Anwesenheit von Glucose. A: K. terrigena HB mit hoher Glucose (3,0 g l^–1); B: K terrigena HB mit geringer Glucose (0,3 g l^–1) C: S. spec. M3 mit hoher Glucose (3,0 g l^–1), D: S. spec. M3 mit geringer Glucose (0,3 g¹).
-⎕- Wachstum mit TNT -o- Wachstum ohne TNT * (gepunktete Linie) TNT Konzentration (photometrische Bestimmung)

3 Wachstum mit 2,4,6-TNT als Kohlenstoffquelle mit und ohne NH₄Cl(0,4 g l^–1). A: K. terrigena HB mit NH₄Cl, B: K. terrigena HB ohne NH₄Cl, C: S. spec. M3 mit NH₄Cl, D: S. spec. M3 ohne NH₄Cl.
-⎕- Wachstum mit TNT -o- Wachstum ohne TNT * (gepunktete Linie) TNT Konzentration (photometrische Bestimmung)

4 Wachstum nach 7 Tagen mit 2,4,6-TNT als Kohlenstoffquelle bei verschiedenen Konzentrationen von Standard-I-Medium oder Glucose im Minimalmedium. A: K. terrigena HB, B: S. sp. M3.
-⎕- Wachstum mit TNT -o- Wachstum ohne TNT * (gepunktete Linie) TNT Konzentration (photometrische Bestimmung)

5: SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 zeigen die ermittelten Sequenzen der l6S rDNA der beiden Isolate
Probenmaterialien und Isolierung von TNT abbauenden Mikroorganismen
Wasser- und Bodenproben wurden von aufgegebenen kontaminierten TNT Lagerstätten in Deutschland (Hallschlag/Rheinland-Pfalz, Moschwig/Sachsen-Anhalt) erhalten. Die Mikroorganismen wurden zuerst in 0,1 × Standard I Medium (Merck, Darmstadt, Deutschland) angereichert und anschließend in demselben Medium kultiviert, ergänzt mit TNT (10 mg l^–1). Aus diesen Kulturen wurden einzelne Kolonien auf Standard I Agar + TNT (10 mg l^–1) erhalten und weiter charakterisiert. Das für die Abbauexperimente verwendete TNT stammte aus einer festen Probe, die in einer früheren Sprengstoff Herstellungsstätte in Deutschland gefunden wurde; es wurde aus absolutem Ethanol rekristallisiert. In dem erhaltenen Produkt konnten durch GC und HPLC keine Unreinheiten nachgewiesen werden. Die Identität wurde durch Schmelzpunkt, Retentionszeiten, UV-Spektrum und EI- Massenspektrum gegen eine Referenzprobe von TNT (Dynamit Nobel, Troisdorf, Germany) bestätigt.
Makrorestriktionsanalyse und Plasmidscreening
Isolate von verschiedener Koloniemorphologie wurden durch die von Claus et al. (1992) beschriebene Makrorestriktionsanalyse weiter differenziert. Pulsfeld Elektrophorese von Xba I DNA Restriktionsfragmenten wurde unter der Verwendung des Rotaphor Type V Apparats (Biometra, Göttingen, Deutschland) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Spannung (250 V); Intervallzeit (lineare Rampe von 3 auf 30 Sek); Rotorwinkel (logarithmische Rampe von l20° to 95°); Temperatur (l3°C); Zeit (21 h). Durch dieses Verfahren wurden 20 verschiedene DNA Muster (Isolate) aufgetrennt, die auf die Anwesenheit von Plasmiden untersucht wurden. In acht Stämmen wurden unter der Verwendung des Verfahrens von Kado und Liu (1981) ein oder mehrere Plasmide nachgewiesen.
Identifizierung der Isolate
Die Isolate wurden durch Sequenzieren ihrer l6S rRNA? Gene identifiziert, die durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wurden. Die Templat-DNA wurde mit InstaGene Matrix (Biorad, München, Deutschland) isoliert. Etwaige kontaminierende DNA wurde durch die Zugabe von 5 μl gesättigter Xanthotoxin-Lösung in 100 μl PCR Assay inaktiviert. Diese Lösung wurde vor der Zugabe der Templat-DNA für 40 Minuten UV bestrahlt. Die PCR Assays enthielten in 100 μl PCR Puffer: 50 pmol Oligonukleotidprimer, 200 nmol MgCl₂, 15 nmol dNTP Mix, 2.5 Einheiten Taq DNA Polymerase und 2 μl Templat-DNA. Die PCR wurde für einen Durchschnitt von 30 Amplifikationszyklen programmiert (Mastercycler-Gradient, Eppendorf Deutschland). 1^st Zyklus: Denaturierungsschritt: 5 min 95 °C; 30 weitere Zyklen: 1 min 95 °C; Annealing 90 s 58 °C; Verlängerung: 2 min 72 °C. Letzter Zyklus 5 min 72 °C. Die verwendeten Primer waren Eubak 338F (ACTCCTACGGGAGGCAG, SEQ ID Nr. 1) und C l992R (CCACGGGCGGTGTGTAC SEQ ID Nr. 2). Die PCR Amplifikate wurden durch Genterprise Inc. (Johannes-Gutenberg University Mainz, Deutschland) sequenziert.
Photometrische Bestimmung von TNT
Der mikrobielle Abbau von TNT wurde durch ein photometrisches Verfahren gemäß Oh et al. (2000) durchgeführt. Für den Test wurden 1,5 ml von angezogener Kultur zentrifugiert (16000 g, 5 min), 160 μl von 1 M NaOH wurden zu 1,0 ml Überstand hinzugefügt und nochmals wie oben zentrifugiert. Unter dieser Ausgangsbedingung, wurde das rot-gefärbte Meisenheimer-Anion von TNT gebildet (Wollin und Levsen, 1999). Der Meisenheimer Komplex ist für mindestens 30 min stabil und kann in einem Spektrophotometer (Shimadzu UV-l60A, Kyoto, Japan) bei λ 447 nm gemessen werden. Die Eichkurve war innerhalb einer Konzentration von 0-100 mg l^–1 TNT linear.
Bestimmung von TNT und anderen Nitro-substituierten Verbindungen durch HPLC Die Proben für die HPLC Analyse wurden vor den Bestimmungen zentrifugiert (16000 g, 5 min) und filtriert (Membran-Porengröße: 0,2 μm). Die folgende HPLC-DAD Ausrüstung wurde verwendet (alle Teile von Gynkotek, Deutschland): Pumpe M 480, on-line Entgaser, Autosampler Gina 50, Diodenarraydetektor UVD 340 S, Säulenofen STH. Die Trennung wurde auf einer Nucleodursäule l00-3 C₁₈ec 250 × 4 mm mit einer Guardsäule Nucleodur l00-5 C₁₈ 8 × 4 mm (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) unter der Verwendung eines Multischritt Methanol/Wasser-Gradienten durchgeführt: 1. Schritt: 0-10 min, 40-50% Methanol; 2. Schritt: 10-35 min, isokratisch 50% Methanol; 3. Schritt: 35-80 min, 50-85% Methanol bei einer Flußrate von 0,4 ml Min^–1 und einer Säulentemperatur von 20 °C. Das Injektionsvolumen war 50 μl, die Nachweis-Wellenlänge wurde auf 230 nm eingestellt.
Um so viele Explosivstoffe und Metaboliten wie möglich in den authentischen Umweltproben und den Lösungen aus den mikrobiologischen Abbauexperimenten nachzuweisen, wurde eine HPLC-DAD Datenbank mit ungefähr 50 UV Spektren und Rückhaltezeiten von typischen Nitroaromaten und Nitrosaminen verwendet. In allen untersuchten Proben wurden nur zwölf dieser Substanzen in Mengen oberhalb ihrer Nachweisgrenzen nachgewiesen. Die Quantifizierung von TNT und den anderen identifizierten Verbindungen wurde unter der Verwendung von Standardlösungen der zwölf Substanzen durchgeführt, die in Acetonitril hergestellt wurden: 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT), 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT), 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DANT), (LGC Promochem, Wesel, Deutschland); Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (Hexogen), Octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazozin (Octagen), 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT) (Dynamit Nobel, Troisdorf, Deutschland); 3,5-Dinitroanilin (3,5-DNA), 1,8-Dinitronaphthalin (1,8-DNN), 2-Nitroanilin (2-NA), 1,3,5-Trinitrobenzol (TNB) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland); 1,3-Dinitrobenzol (1,3-DNB), 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT) (Merck, Darmstadt, Deutschland).
Bestimmung von Nitrit
Für die Bestimmung von Nitrit wurden 1,5 ml der Kulturen zentrifugiert (5 Min, 16000 g), 1,0 ml des Griess Ilosvays Reagenz (Merck, Darmstadt, Deutschland) wurden zu 1,0 ml des Überstands hinzugefügt und nochmals wie oben zentrifugiert. Die Bildung einer gefärbten Azo-Verbindung wurde in einem Spektrophotometer (Shimadzu UV-l60A) bei λ 530 nm gemessen. Die Kalibrierungskurve war innerhalb einer Konzentration von 0-50 mg l^-1 NaNO₂ linear.
TNT Abbauexperimente
Das Mineralsalzmedium (MM) von Kalafut et al. (1998) wurde verwendet, um die TNT Abbaufähigkeiten der bakteriellen Isolate zu messen. Es enthielt (g l^-1): MgSO₄ (2,0), CaCl₂ (0,05), FeSO₄. 7 H₂O (0,05), CuSO₄ (0,01), NaH₂PO₄ (0,78), Na₂HPO₄ (3,86), NH₄Cl (0,4) und Glucose (0,3 oder 3,0). TNT wurde direkt zu dem MM in Konzentrationen von 10, 50 und 100 mg l^-1 vor dem Autoklavieren (15 min, 121°C) der Medien hinzugegeben. Phosphat- und Glucoselösungen wurden getrennt hergestellt und steril zu den restlichen Komponenten hinzugefügt.
Um natürlichere Bedingungen zu simulieren, wurden Kulturmedien auch in kontaminierten Wasser- und Bodenextrakten von der Ausgangsstätte der mikrobiellen Isolate hergestellt. Die Bodenextrakte wurden durch Schütteln einer 10 % Boden/Wasser (w/v) Suspension für 2 h (200 U/Min) vor dem Autoklavieren (20 min, 121 °C) hergestellt. Das wasserunlösliche Material wurde durch Zentrifugieren pelletiert (10000 g, 30 min) und der Überstand wurde durch einen Papierfilter hindurch passiert (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland, No. 589).
Das MM wurde (1) mit Glucose und NH₄Cl hergestellt, um den kometabolischen mikrobiellen Abbau von TNT zu untersuchen, (2) ohne NH₄Cl, um die mikrobielle Verwendung von TNT als die einzige Quelle an Stickstoff zu untersuchen, (3) ohne Glucose, um die mikrobielle Verwendung von TNT als eine Kohlenstoffquelle zu untersuchen und (4) ohne NH₄Cl und Glucose, um die mikrobielle Verwendung von TNT als der einzigen Quelle von Stickstoff und Kohlenstoff zu untersuchen. TNT als Energiequelle wurde in demselben Medium bei ansteigenden Konzentrationen (0 – 3 %) von Standard I Medium (Merck, Darmstadt, Deutschland) oder Glucose (0 – 1,0 %) getestet. Die Medien wurden entweder in Volumina von 50 ml in 100 ml Erlenmeyerflaschen oder 3 ml in 16 ml Schraubdeckelröhrchen hergestellt.
Die für die Inokula verwendeten Zellen wurden in Standard-I Medium für 8 h bei 30 °C auf einem Schüttler präkultiviert. Die Zellen wurden entweder direkt verwendet oder zweimal in Mineralsalzmediun gewaschen, bevor sie in MM (1 ml auf 50 ml oder 50 μl auf 3,0 ml) beimpft wurden. Die Kulturen wurden bis zu 7 Tage bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (200 U/Min) inkubiert.
Experimente mit radiomarkiertem TNT
[Ring U-¹⁴C]TNT (2,2 mCi mmol^–1) wurden durch W. Fels (Department of Organic Chemistry, Universität Paderborn, Deutschland) synthetisiert. Die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung (1414 Wallac WinSpectral Liquid Scintillation Counter, Turku, Finnland) mit Rotiszint Ecoplus (Roth, Karlsruhe, Deutschland) als Cocktail bestimmt.
Um die Inkorporation von Radioaktivität in die Biomasse zu testen, wurden sterile Minimalmedien (3 ml) ohne Glucose und NH₄Cl mit nicht-radioaktivem TNT (100 mg l^–1) und 30 000 dpm ml^–1 [Ring U-¹⁴C]TNT hergestellt. Die Medien wurden mit 50 μl Vorkultur (nicht gewaschen) inokuliert und für 7 Tage bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (200 U/Min) inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und dreimal mit Wasser gewaschen. Ein ml der gewaschenen Zellen wurden durch Nitrocellulosefilter (0,2 μm) filtriert und in 4 ml Rotiszint Ecoplus gelöst. Einhundert μl wurden zur Messung der Radioaktivität in den Kulturüberständen abgenommen. Die Inkorporation von Radioaktivität in die Zellproteine wurde wie folgt nachgewiesen: Ein ml jeder Kultur wurde zentrifugiert und die Zellen zweimal mit Wasser gewaschen. Die Zellpellets wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und für 10 Min auf 100 °C erhitzt. Der Zelldebris wurde zentrifugiert (16000 g, 5 Min) und 20 μl von jedem Zellextrakt wurden auf ein SDS Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 150 V durchgeführt, bis der Markerfarbstoff Bromphenolblau, das Ende des Gels erreichte. Die Proteine wurden über Nacht bei 4 °C auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (Millipore, Eschborn, Deutschland) mit einer Tankblot Vorrichtung (Biorad, München, Deutschland) transferiert. Die Membran wurde mit Coomassieblau gefärbt. Die Proteinbanden wurden ausgeschnitten und Membranstücke in 4 ml Rotiszint Ecoplus über Nacht vor der Messung der Radioaktivität gelöst.
Für die Respirationsstudien wurden 10 ml sterile Minimalmedien ohne Glucose und NH₄Cl mit nicht-radioaktivem TNT (100 mg l^–1) und 30 000 dpm ml^–1 [Ring U-¹⁴C]TNT präpariert. Die Medien wurden mit 100 μl Vorkultur (nicht-gewaschen) beimpft und für 7 Tage bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler (200 U/min) inkubiert. Die Experimente wurden in 125 ml Serumflaschen, dicht verschlossen mit Butylseptum und Aluminiumschraubdeckeln, durchgeführt. Ein mit 4 N NaOH durchnäßtes gefaltetes Papier wurde innerhalb eines kleinen Röhrchens innerhalb der Serumflasche plaziert. Am Ende der Experimente wurden die Kulturen auf pH 1,0 mit H₂S0₄ (10%) angesäuert, um jegliches freigesetztes ¹⁴CO₂ in der Filterfalle zu immobilisieren. Die Filter wurden in 4 ml Szintillationsgefäße übertragen, mit Rotiszint Ecoplus bedeckt, und die Radioaktivität wurde gemessen.
Isolierung und Charakterisierung von TNT abbauenden Mikroorganismen
Die Mikroorganismen wurden aus Wasser- und Bodenproben und von früheren Munitionsproduktionsstätten isoliert. Nitro-substituierte Verbindungen in diesen Umweltproben wurden durch HPLC in den folgenden Konzentrationen (mg l^–1) nachgewiesen. Oberflächenwasser von der Stätte Hallschlag (H): TNT (12,4), 2-ADNT (1,34), 4-ADNT (1,06), 1,3,5-TNB (0,16), 2-NA (0,06), 3,5-DNA (0,04). Oberflächenwasser von der Stätte Moschwig (M): TNT (10,02), 4-ADNT (2,14), 2-ADNT (1,91), 1,3,5 TNB (0,05), Hexogen (4,91). Bodenextrakt I: TNT (82,39), 2-ADNT (5,99), 4-ADNT (4,55), 1,3,5-TNB (2,05), 2,4-DNT (0,31), 3,5-DNA (0,23), 1,3-DNB (0,12), Octogen (0,64), Hexogen (0,06). Im Bodenextrakt II: TNT (66,56), 2-ADNT (7,96), 4-ADNT (5,12), 1,3,5-TNB (0,83), 2,4-DNT (0,16), 3,5-DNA (0,13), 1,3-DNB (0,07), Octogen (0,20), Hexogen (0,03). Bakterien aus diesen Umgebungen, die auf Komplex-Nährstoffmedien in der Anwesenheit von TNT (10 mg l^–1) wuchsen, wurden weiter charakterisiert. Zwanzig verschiedene Isolate wurden auf Basis ihrer genomischen DNA Fingerprints isoliert. Acht von diesen trugen Plasmide verschiedener Größe, die möglicherweise eine spezifische metabolische Adaption an die mit Xenobiotika kontaminierte Umgebung darstellten. Zwei Isolate, die TNT (10 mg l^–1) am effizientesten kometabolisch abbauen konnten, wurden genau untersucht. Auf der Basis der Sequenz ihrer l6S rDNA (700 Nukleotide sequenziert) wurden sie als Klebsiella terrigena und Serratia sp. identifiziert. Der Letztgenannte zeigte 99% Homologie zu S. grimesii und S. proteamaculus, die durch Routine-biochemische Tests schwer zu unterscheiden sind und zu der S. liquefaciens Gruppe gehören (Holt et al. 1994).
Die beiden Stämme wurden am 8. Dezember 2003 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig hinterlegt (Klebsiella terrigena HB unter der Hinterlegungsnummer DSM 16101 und Serratia sp. M3 unter der Hinterlegungsnummer DSM 16102).
Kometabolischer Abbau von TNT
Der kometabolische Abbau wurde bei folgenden TNT Konzentrationen getestet, jeweils 10, 50 und 100 mg l^–1. In der Anwesenheit von Glucose (3,0 g l^–1), bauten die Isolate K terrigena HB und S. sp. M3 TNT bei allen drei Konzentrationen innerhalb von 14 h unterhalb der Nachweisgrenze des photometrischen Verfahrens (< 1 mg l^–1 TNT) ab. Das Wachstum der Stämme wurde durch sogar die höchsten Konzentration von TNT (1) nicht inhibiert. Bei niedrigen Konzentrationen von Glucose in dem Kulturmedium (0.3 g l^–1) baute K. terrigena HB wiederum TNT innerhalb von 14 h ab, jedoch benötigte S. spec. M3 38 h um TNT unterhalb von 10 mg l^–1 zu eliminieren. Das Wachstum von beiden Stämmen war in der Anwesenheit von TNT signifikant besser als ohne dieses und nahm gleichzeitig zu, während TNT abnahm.
TNT als eine Stickstoffquelle
TNT wurde als eine Stickstoffquelle bei Konzentrationen von 0,3 und 3,0 g l^–1 Glucose (2) getestet. Unter beiden Bedingungen bauten jeweils K terrigena HB TNT innerhalb von 14 h und S. spec. M3 innerhalb von 38 h ab. Die Zelldichten beider Stämme waren in der Anwesenheit von TNT signifikant höher. Bei geringer Glucosekonzentrationen schritt das Wachstum bis zum Ende der Inkubation fort.
TNT als eine Kohlenstoffquelle
Ohne Glucose begann das Wachstum von K terrigena HB und S. spec. M3 nach einer Lagphase von ungefähr 14 h und der TNT Abbau nach 20 h. Nach 94 h wurde TNT auf ungefähr 20 % der anfänglichen Konzentration abgebaut (3A, C).
TNT als die einzige Quelle von Kohlenstoff und Stickstoff
Die mikrobielle Verwendung von TNT als die einzige Quelle von Kohlenstoff und Stickstoff ist in 3 (B, D) gezeigt. Beide Isolate wuchsen in dem Minimalmedium in der Anwesenheit von TNT das am Ende der Inkubationen auf eine Konzentration von unterhalb von 20 mg l^-1 abgebaut war.
TNT als die einzige Energiequelle
TNT konnte nur als die einzige Quelle von Kohlenstoff verwendet werden, wenn mikrobielle Inokula direkt aus der Vorkultur entnommen werden konnten (Tabelle 1). Wenn die Zellen vor der Beimpfung intensiv gewaschen wurden, traten kein Wachstum und TNT Abbau in der Abwesenheit von Glucose in dem Minimalmedium auf. Unabhängig von der Inokulum-Präparation konnte TNT als die einzige Quelle von Stickstoff verwendet werden. Die Erfinder vermuten, daß die restlichen Nährstoffe, die durch die als Vorkultur verwendeten Komplexmedien als eine Energiequelle zugeführt wurden und die nötig und erforderlich waren, um den Abbau von TNT zu initiieren.
Wie in 4 gezeigt förderten zunehmende Mengen eines Komplexmediums (Standard I-Broth) oder Glucose signifikant den mikrobiellen Abbau von TNT. Bei Konzentrationen von jeweils = 1,75 % Standard I-Broth oder = 0,03-0,06% Glucose in dem Minimalmedium, wurde TNT nach 7 Tagen Inkubation vollständig abgebaut. Das Wachstum in der Anwesenheit von TNT stieg signifikant bei geringen Mengen zusätzlicher Nährstoffen an, jedoch wurde das Wachstum ohne TNT nur leicht stimuliert.
Inkorporation von TNT in die Biomasse
Die Verwendung von TNT für die Produktion von Zellmasse wurde in Experimenten mit U¹⁴C-Ring-markiertem TNT untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, konnte ungefähr 50-60 % der anfänglichen Radioaktivität in der gesamten Biomasse nachgewiesen werden und ca. 11 % wurde als Zellprotein gefunden. Unter der Annahme der Hälfte der mikrobiellen Trocken-Biomasse als Protein, von dem eine weitere Hälfte Kohlenstoff ist, liegen die experimentellen Daten in guter Übereinstimmung mit dem theoretischen Wert. Alle Versuche ¹⁴CO₂ nachzuweisen schlugen fehl, was anzeigte, daß TNT sehr wahrscheinlich nicht veratmet und nicht als eine Energiequelle verwendet wurde. Die 20-30 % an restlicher Radioaktivität in den Überständen können durch (i) die unvollständige Verwendung von TNT, insbesondere unter den in den Experimenten angewendeten mikroaerophilen Kulturbedingungen um ein Entkommen von ¹⁴CO₂ in die Atmosphäre zu verhindern und (ii) der Bildung von reduzierten TNT Metaboliten (Tabelle 3) erklärt werden.
Metaboliten des TNT Abbaus
Der TNT Abbau durch die Isolate K. terrigena HB und S. sp. M3 was durch HPLC bestätigt (Tabelle 3). In Übereinstimmung mit dem photometrischen Verfahren wurde ein Abnahme oder sogar ein Verschwinden von TNT in allen Experimenten nachgewiesen. Die einzigen in größeren Mengen gefundenen aromatischen Metaboliten (=10% der anfängliche TNT Konzentration) waren reduzierte Aminoderivate von TNT: 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT) und zu einem kleineren Ausmaß 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT). Nitrit wurde in nahezu equimolaren Konzentrationen zu TNT gebildet, was seine Freisetzung aus dem aromatischen Ring anzeigte. Die mikrobielle Beseitigung von TNT trat auch unter mehr natürlichen Bedingungen auf, d.h. in mit Nitro-substituierten organischen Verbindungen kontaminierten Oberflächenwässern (Tabelle 3). Zur selben Zeit nahmen die reduzierten Metaboliten 4-ADNT und 2-ADNT, die bereits in diesen Umgebungen vorhanden waren, zu. Wenn die Wässer zusätzlich mit hohen Konzentrationen von TNT beimpft wurden, war dies am Ende der Inkubationen auch vollständig beseitigt. Zur selben Zeit war die Konzentration von reduzierten Metaboliten nur leicht erhöht. Offensichtlich war das Wachstum der Isolate am besten in ihren individuellen ursprünglichen Habitaten. Nitrit wurde aus TNT in Experimenten mit dem Oberflächenwasser H (Hallschlag) freigesetzt. Auf der anderen Seite beobachteten die Erfinder mit Oberflächenwasser M (Moschwig), das bereits von Anfang an viel Nitrit enthielt eine Abnahme des Anions. Der mikrobielle Abbau von TNT trat auch in Bodenextrakten auf, die hoch mit Nitroaromaten und Nitrosaminen (Hexogen, Octogen) kontaminiert waren.
Tabelle 1 Einfluß der Inokulum-Herstellung auf den TNT Abbau*
Tabelle 3 Inkorporation von radiomarkiertem ¹⁴C-TNT (%) in die mikrobielle Biomasse
Literatur

Ashby, J., Burlinson, P. A. Lefevre und J. Topham. 1985. Non-genotoxicity of 2,4,6-Trinitrotolune(TNT) to the mouse bone marrow and the rat liver: implications for its carcinogenicity. Arch. Toxicol. 58:9-14.
Behrend C, Heesche-Wagner K (1999) Formation of Hydride-Meisenheimer complexes of picric acid (2,4,6-trinitrophenol) and 2,4-dinitrophenol during mineralization of picric acid by Nocar diodes sp. strain CB 22-2. Appl Environ Microbiol 65:1372-1377
Blotevogel, K.-H. und T. Gorontzy. 2000. Microbial degradation of compounds with nitrofunctions. In: H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler (ed.) Biotechnology Vol. 11b, Environmental processes -soil decontamination, waste gas treatment, potable water preparation. VCH-Wiley, Weinheim. 274-294.
Böhmer, V. und P. Rölle. 1999. Jahresbericht 1998 der Hessischen Industriemüll GmbH, Bereich Altlastensanierung (HIM-ASG), Klenkes Druck und Verlag GmbH, Aachen.
Boopathy R, Manning J, Kulpa CF (1997) Optimization of environmental factors for the biological treatment of trinitrotoluene-contaminated soil. Arch Environ Contam Toxicol 32:94-98
Boopathy R., Kulpa C. F. 1994. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by a Methanococcus sp. (strain B) isolated from a lake sediment. Can J Microbiol 40: 273-278 Braedt, M., H. Hörseljau, F. Jacobs und F. Knolle. 1998. Die Sprengstoffabrik "Tanne" in Clausthal-Zellerfeld. Geschichte und Perspektive einer Harzer Rüstungsaltlast. Papierflieger, Clausthal-Zellerfeld.
Bumpus J. A. und M. Tatarko. 1994. Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Phanerochaete chrysosporium: identification of initial degradation products and the discovery of a TNT metabolite that inhibits lignin peroxidases. Curr. Microbiol. 28:185-190.
Bundesbodenschutzgesetz. 1998. Gesetz zum Schutz vor schädlichen Bodenveränderungen und zur Sanierung von Altlasten vom 17. März 1998.
Crawford R. L. 1995.The microbiology and treatment of nitroaromatic compounds. Curr Opin Biotechnol 6: 329-336
Daun, G., H. Lenke, M. Reuss und H.-J. Knackmuss. 1998. Biological treatment of TNT contaminated soil 1. Anaerobic cometabolic reduction and interaction of TNT and metabolites with soil components. Environ. Sci. Technol. 32:1956-1963. Zitat fehlt im Text?
Dawel G., M. Kästner, J. Michels, W. Poppitz, W. Günther und W. Fritsche. 1997. Structure of laccase mediated product of coupling 2,4-diamino-6-nitrotoluene to guaiacol, a model for coupling of 2,4,6-trinitrotoluene metabolites to a humic organic soil matrix. Appl. Environ. Microbiol. 63:2560-2565. Zitat fehlt im Text
Drzyzga, O., D. Bruns-Nagel, T. Gorontzy, K. H. Blotevogel und E. von Löw. 1999. Anaerobic incorporation of the radiolabeled explosive TNT and metabolites into the organic soil matrix of contaminated soil after different treatment procedures. Chemosphere 38:2081-2095.
Drzyzga, O., D. Bruns-Nagel, T. Gorontzy, K. H. Blotevogel, D. Gemsa und E. von löw. 1998. Incorporation of 14C-labeled 2,4,6-trinitrotoluene metabolites into different soil fractions after anaerobic-aerobic treatment of soil/molasses mixtures. Environ. Sci. Technol. 32:3529-3535.
Duque, E., A. Haidour, F. Godoy und J. L. Ramos. 1993. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6-trinitrotoluene. J. Bacteriol. 175:2278-2283.
Ebert S, Rieger PG, Knackmus H-J (1999) Function of coenzyme F42o in aerobic catabolism of 2,4,6-trinitrophenol and 2,4-dinitrophenol by Nocardiodes simplex FJ2-1A. J Bact 181:2669-2674
Ederer M. M., Lewis 7. A., Crawford R. L. 1997. 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) transformation by Clostidia isolated from a munition-fed bioreactor: comparison with non-adapted bacteria. J Ind Microbiol Biotechnol 18: 82-88
Eilers, A., E. Rüngeling, U.M. Stündl und G. Gottschalk. 1999. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by the white rot fungus Bjerkandera adusta DSM 3375 depends on cytochrome P450. Appl. Microbiol. biotechnol. 53:75-80.
Esteve-Núñez A, Caballero A, Ramos JL (2001) Biological degradation of 2,4,6-trinitrotoluene. Microbiol Mol Biol Rev 65:335-352
Esteve-Núñez A., Lucchesi G., Philipp B., Schink B., Ramos J. L. 2000. Respiration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. strain JLR 11.J Bact 182:1352-1355
Esteve-Núñez A., Ramos J. L.1998.Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. JLR11. Environ Sci Technol 32: 3802-3808
Fiorella PD, Spain JC. (1997) Transfomation of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas pseudoalcaligenes JS52. Appl Env Microbiol 63:2007-2015
French C. E., Nicklin S., Bruce N. 1998. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetranitrate reductase. Appl. Env. Microbiol 64: 2864-2868
Fritsche, W. 1998. Umweltmikrobiologie – Grundlage und Anwendungen. Gustav Fischer Verlag Jena
Fuller ME, Manning Jr JF (1997) Aerobic gram-positive and gram-negative bacteria exhibit differential sensitivity to and transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Curr Microbiol 35:77-83
Hawari, J., A. Halasz, S. Beaudet, G. Ampleman und S. Thiboutot. 1999. Biotransformation of 2,4,6,-trinitrotoluene (TNT) with Phanerochaete chrysosporium in agitated cultures at pH 4.5. Appl. Environ. Microbiol. 65:2977-2986.
Hawari, J., S. Beaudet, A. Halasz, S. Thiboutot und G. Ampleman. 2000. Microbial degradation of explosives: biotransformation versus mineralization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:605-618.
Heiss G., Knackmus H.J. 2002. Bioelimination of trinitroaromatic compounds: immobilization versus mineralization. Curr Opinion Microbiol 5: 282-287.
Held, T., G. Draude, F. R. J. Schmidt, A. Brokamp und K. H. Reis. 1997. Enhanced humification as an in-situ bioremediation technique for 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) contaminated soil. Environ. Technol. 18: 479-487.
Herre, A., J. Michels, K. Scheibner und W. Fritsche. 1997. Bioremediation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) contaminated soil by a litter decaying fungus. In: Preprints of the fourth intenational in-situ and on-site bioremediation symposium. April 28 – May 01, 1997. New Orleans 2: 493-498.
Homburg, A. 1995. Entwicklung der Explosivstoffindustrie in Deutschland. In: Trimborn, F. Explosivstoffabriken in Deutschland. Ein Nachschlagewerk zur Geschichte der deutschen Explosivstoffindustrie. Verlag Locher, Köln.
IABG, Bereich Umwelt. 2001. Konversion einer Rüstungsaltlast zum Freizeitpark. Firmeninformation. im Internet unter http://www.iabg.de.
Jansky, H.-J. und V. Neumann 1999. Preisentwicklung in der Bodendekontamination wirtschaftliche und technische Rahmenbedingungen. TerraTech 2/99:25-29.
Kalafut T, Wales ME, Rastogi VK, Naumova RP, Zaripoca SK, Wild JR (1998) Biotransformation patterns of 2,4,6-trinitrotoluene by aerobic bacteria. Current Microbiol 36:45-54
Kayed, A. 1989. Ergebnisse und Erfahrungen bei der Gefährdungsabschätzung für die Rüstungsaltlasten des ehemanigen Sprengstoffwerkes "Tanne" bei Clausthal-Zellerfeld. In: Der Niedersächsische Umweltminister (Hrsg.). Expertengespräch Rüstungsaltlasten 25./26. April 1989 in Hannover. S. 249-259.
Klausmeier, R. E., J. L. Osmon und D. R. Walls. 1973. The effect of trinitrotoluene on microorganisms. Dev. Ind. Microbiol. 15: 309-317.
Kölner Stadt-Anzeiger. 2001. Recherche im Internet unter http://www3.ksta.de/archiv/, Stichwort "Espagit".
Koss, G., A. Lommel, I. Ollroge, I. Tesseraux, R. Haas und A. D. Kappos. 1989. Zur Toxikologie der Nitrotoluole und weiterer Nitroaromaten aus rüstungsbedingten Altlasten. Bundesgesundhbl. 32:527-536.
Lauer, U., A. Dahn und I. Le Dren. 1999. Mikrobiologische Sanierung von Rüstungsaltlasten -Verfahren und Wege in die Praxis. In: S. Heiden, R. Erb, J. Warrelmann, und R. Dierstein (Hrsg.) Biotechnologie im Umweltschutz. Bioremediation: Entwicklungsstand-Anwendungen-Perspektiven. Erich-Schmidt-Verlag, Berlin, S. 218 – 223.
Lenke, H., J. Warrelmann, G. Daun, K. Hund, U. Sieglen, U. Walter und H.-J. Knackmuss. 1998. Biological treatment of TNT-contaminated soil II: Biological induced immobilization of the contaminants and full-scale application. Environ. Sci. Technol. 32:1964-1971.
Meyer, R. 1985. Explosivstofflexikon. 6. Aufl., VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim Michels, J., und G. Gottschalk. 1994. Inhibition of the lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium by hydroxylamino-dinitrotoluene, an early intermediate in the degradation of 2,4,6-trinitrotoluene. Appl. Environ. Microbiol. 60:187-194.
Modellhafte Sanierung von Altlasten am Beispiel des TNT-Sanierungsprojektes Stadtallendorf/Hessen. 2000. In: Modellhafte Sanierung von Altlasten MOSAL. Fachübergreifende Auswertung von Forschungsergebnissen. Probiotec GmbH (Redaktion und Bearbeitung). Umweltbundesamt, PT AWAS (Hrsg.). FKZ 1490900. CD-ROM.
Montpas S, Samson J,Langlois E, Lei J, Piche Y, Ch?nevert R. 1997. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Serratia marcescens. Biotechnol Lett 19:291-294
Osmon, J. L. und R. E. Klausmeier. 1972. The microbial degradation of explosives. Dev. Ind. Microbiol. 14:247-252.
Preuß, J. 1996. Alte Rüstungsstandorte -Erfassung und Bewertung von Umweltkontaminationen. Forschungsmagazin der Johannes-Gutenberg-Universität Mainz. 1:35-51.
Preuß, J. und C. C. Wiegandt. 1992. Rüstungsstandorte des deutschen Reiches auf dem Gebiet der Bundesrepublik Deutschland. Geographische Rundschau 44:175-178.
Preuß, J. und F. Eitelberg. 1999. Hallschlag. ISBN 3-88250-045-X (Erhältlich beim Geographischen Institut der Universität Mainz, Saarstr. 21, 55121 Mainz).
sReinhard, S. und R. Feldmann. 1998. Von der Forschung in die Praxis. Umweltmagazin 12/98:48.
Rieger P-G, Sinnwell V, Preuß A, Francke W, Knackmus H-J (1999) Hydride-Meisenheimer complex formation and protonation as key reactions of 2,4,6-trinitrophenol biodegradation by Rhodococcus erythropolis. J Bact 181:1189-1195
Scheibner, K., M. Hofrichter, A. Herre, J. Michels und W. Fritsche. 1997. Screening for fungi intensively mineralizing 2,4,6-trinitrotoluene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:452-457.
Scheibner, K., M. Hofrichter und W. Fritsche. 1997. Mineralization of 2-amino-4,6-dinitrotoluene by manganese peroxidase of the white-rot fungus Nematoloma frowardii. Biotechnol Lett. 19:835-839.
Schmidt T. C., K. Steinbach, E. v. Löw, G. Stork. 1998. Highly polar metabolites of nitroaromatic compounds in ammunition waste water. Chemosphere 37:1079-1091.
Schneider, K., J. Oltmanns, M. Hassauer und U. S. Schuhmacher. 2000. Ermittlung von Prüfwerten für ausgewählte rüstungsaltlastenspezifische Schadstoffe, 1998-1999. Im Auftrag des Umweltbundesamtes Berlin F+E-Vorhaben 298 76 251.
Schneider, U. 1989. Erfahrungen aus systematischen Untersuchungen von Standorten ehemaliger Rüstungsbetriebe. In: Der Niedersächsische Umweltminister (Hrsg.). Expertengespräch Rüstungsaltlasten 25./26. April 1989 in Hannover. S. 261-279.
Spain J. C., J. B. Hughes, H.-J. Knackmuss (eds.). 2000. Biodegradation of nitroaromatic compounds and explosives. CRC Press, Boca Raton.
Spain, J. C. (ed.). 1995. Biodegradation of nitroaromatic compounds. Environmental Science Research Series, Vol. 49, Plenum Press, New York.
Sunahara, G. I., S. Dodard, M. Sarrazin, L. Paquet, G. Ampleman, S. Thiboutot, J. Hawari und A.-Y. Renoux. 1999. Ecotoxicological characterization of energetic substances using a soil extraction procedure. Ecotoxicol. Environ. Safety 43:138-148.
Thieme, J.,R. Haas und Kopecz, P. 1996. Bestandsaufnahme von Rüstungsaltlastverdachtsstandorten in der Bundesrepublik Deutschland, Teil II. UFOPLAN-Nr. 103 40 102, Berichtsnummer UBA-FB 90-030/1, UBA-Texte 25/96.
Thomas. H., A. Gerth, B. Eulering, A. Böhler. 2001. Neue Erkenntnisse zur biologischen Insitu-Sanierung TNT-kontaminierter Böden. TerraTech 2/01: 52-54.
Trimborn, F. 1995. Explosivstoffabriken in Deutschland. Ein Nachschlagewerk zur Geschichte der deutschen Explosivstoffindustrie. Verlag Locher, Köln.
Van Aken B, Hofrichter M, Scheibner K, Hatakka AI, Naveau H, Agathos SN (1999) Transformation and mineralization of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by the white rot basidiomycete Phlebia radiata. Biodegradation 10:83-91
Vorbeck, C., H. Lenke, P. Fischer, J. C. Spain und H.-J. Knackmuss. 1998. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene. Appl. Environ. Microbiol. 64:246-252.
Warrelmann, J. und U. Walter. 1997. Eprobung und Anwendung mikrobiologischer Verfahren bei der Sanierung von Rüstungsaltlasten. In: V. Franzius, K. Wolf, und E. Brandt (Hrsg.). Handbuch der Altlastensanierung. C.F. Müller Verlag, Heidelberg.
Warrelmann, J., H. Koehler, T. Frische, I. Dobner, U. Walter und W. Heyser. 2000. Erprobung und Erfolgskontrolle eines Phytoremediationsverfahrens zur Sanierung Sprengstoffkontaminierter Böden. Teil I: Konzeption und Einrichtung eines Freilandexperimentes. UWSF -Z. Umweltchem. Ökotox 12: 351-357.
Weingran, C. 1995. Projektstrukturplanung am Beispiel des Rüstungsaltlastenstandortes Stadtallendorf Entwicklung einer Sanierungsstrategie. TerraTech 4/95:37-40.

Claims

Nitroaromaten-abbauendes bakterielles Isolat, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102).
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromat-kontaminierten Proben, umfassend – Bereitstellen eines Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolats, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102), – Bereitstellen einer Nitroaromat-kontaminierten Probe, und – Behandeln der Probe mit dem bakteriellen Isolat auf eine Weise, daß der Nitroaromat durch das Isolat produktiv abgebaut wird.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromat-kontaminierten Proben nach Anspruch 2, wobei das Bereitstellen des Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolats die Gewinnung des Isolats aus einer Wasser- oder Bodenprobe umfaßt.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Nitroaromat-Kontaminante ausgewählt ist aus: 2,4,6-TNT
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromat-kontaminierten Proben nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Probe weitere Kontaminationen, ausgewählt aus 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT), 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT), 2-Hydroxylamino-4,6-dinitrotoluol (2-HADNT), 4-Hydroxylamino-2,6-dinitrotoluol (4-HADNT), 2-Amino-4,6-dinitrotoluol (2-ADNT) und 4-Amino-2,6-dinitrotoluol (4-ADNT), 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DANT), 1,3,5-Trinitrobenzol (TNB), 2-Nitroanilin (2-NA), 3,5-Dinitroanilin (3,5-DNA), 1,8-Dinitronaphthalin (1,8-DNN), Hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (Hexogen), 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT), 2,4-Diamino-6-nitrotoluol (2,4-DANT), 2-Nitroanilin (2-NA), 1,3-Dinitrobenzol (1,3-DNB) und Octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazozin (Octagen) enthält.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das Bereitstellen des Nitroaromaten-kontaminierten Probe ein Aufbereiten der Probe umfaßt.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach Anspruch 2, wobei das Bereitstellen des Nitroaromate-kontaminierten Probe die Gewinnung der Probe aus einer Wasser- oder Bodenprobe umfaßt.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Bereitstellen oder Aufbereiten der Nitroaromatenkontaminierten Probe ein Zentrifugieren umfaßt.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach einem der Ansprüche 2 bis 8, weiterhin umfassend das zur Verfügung stellen einer Quelle an zusätzlichem Stickstoff und/oder Kohlenstoff.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach Anspruch 9, wobei die Quelle an zusätzlichem Stickstoff und/oder Kohlenstoff ausgewählt ist aus Glucose und NH₄Cl.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei das Verfahren vollständig oder teilweise unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen durchgeführt wird.
Verfahren zur Dekontaminierung von Nitroaromaten-kontaminierten Proben nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei das Verfahren vollständig oder teilweise in vitro oder in situ durchgeführt wird.
Verwendung eines Nitroaromat-abbauenden bakteriellen Isolats, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102) zur Sanierung von kontaminierten Sickerwässern, Oberflächenwässern und Bodenextrakten in Altlaststandorten.
Verwendung eines Nitroaromaten-abbauenden bakteriellen Isolats, ausgewählt aus Klebsiella terrigena HB (DSM 16101) oder Serratia sp. M3 (DSM 16102) zur Dekontaminierung Nitroaromaten-haltiger Kontaminations-Quellen, z. B Industrieabwässern.