DE10359097A1

DE10359097A1 - Enzyme-loaded carriers and methods for the gentle treatment of sensitive surfaces

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Publication number: DE10359097A1
Application number: DE10359097A
Authority: DE
Inventors: Meriem Dr. Nouaimi-Bachmann; Hans Prof. Dr. Bisswanger
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2003-12-17
Publication date: 2005-07-28
Also published as: WO2005059128A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Träger mit darauf immobilisierten Enzymen und ein Verfahren zur schonenden Behandlung sensitiver Oberflächen. Der Träger ist dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme auf dem Träger irreversibel immobilisiert sind und der Träger mehrfach wiederverwendbar ist. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Trägers bevorzugt zur Reinigung von Hautpartien in kosmetischen Anwendungen, von Gemälden, wertvollen Dokumenten oder sonstigen empfindlichen Oberflächen sowie zur Wundenbehandlung.The present invention relates to a carrier having immobilized thereon enzymes and a method for the gentle treatment of sensitive surfaces. The carrier is characterized in that the enzymes are irreversibly immobilized on the carrier and the carrier is multiply reusable. The invention further relates to the use of the carrier for the cleaning of skin areas in cosmetic applications, of paintings, valuable documents or other sensitive surfaces and wound treatment.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Artikel sowie ein Verfahren zur schonenden Behandlung sensitiver Oberflächen mittels kovalent auf Trägern immobilisierter Enzyme. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des Trägers bevorzugt zur Reinigung von Hautpartien in kosmetischen Anwendungen, von Gemälden, wertvollen Dokumenten oder sonstigen empfindlichen Oberflächen sowie zur Wundenbehandlung.The The present invention relates to an article and a method for the gentle treatment of sensitive surfaces by means of covalently immobilized on carriers Enzymes. Furthermore, the invention preferably relates to the use of the carrier for cleaning skin areas in cosmetic applications, paintings, valuable Documents or other sensitive surfaces as well as wound treatment.

Für Hautreinigung ist aus dem Stand der Technik eine Vielzahl von physikalischen Verfahren bekannt. Das Patent US 5,466,456 beschreibt einen Reinigungsstreifen, der gegenüberliegende Oberflächen besitzt, die mit unterschiedlichen Agenzien behandelt werden und somit zur Gesichtreinigung eingesetzt werden kann. Die Agenzien wie Sonnenkrem, Gesichtskrem oder Antiseptika werden auf einen aufnahmefähigen Gummi aufgetragen, der bei der Reinigung das Mittel freisetzt und nach der Anwendung wieder abgezogen wird.For skin cleansing For example, a variety of physical methods are known in the art known. The patent US 5,466,456 describes a cleaning strip, the opposite surfaces which are treated with different agents and thus can be used for facial cleansing. The agents such as sun cream, face cream or antiseptics are applied to a receptive gum, which releases the agent during cleaning and after use is subtracted again.

In US5,026,552 wird eine Gesichtsmaske beschrieben, die aus einer Netzstruktur mit eingelagertem hydratisierbaren Gel besteht. Die Maske passt sich dabei den Gesichtsunebenheiten an bildet eine Haftung zur Haut aus. Nach Trocknung des Gels kann die Maske am Stück zusammen mit abgestorbenen Hautpartikeln entfernt werden.In US5,026,552 a face mask is described which consists of a network structure consists of incorporated hydratable gel. The mask fits The facial unevenness forms an adhesion to the skin out. After drying the gel, the mask can be put together in one piece be removed with dead skin particles.

US5,968,537 zeigt die Anwendung eines flexiblen Trägers, der mit einer anionischen nichtionischen Polymerschicht belegt ist. Dabei werden nur im feuchten Zustand klebrige Eigenschaften erhalten. Zur Anwendung wird entweder die Schicht selbst oder aber die Gesichtspartie befeuchtet. Nach Trocknen kann der Träger mit den Hautverunreinigungen abgezogen werden. Eine ähnliche Reinigungsmethode wird in US6,106,818 erläutert.US5,968,537 shows the application of a flexible carrier containing an anionic nonionic polymer layer is occupied. These are only in the humid Condition sticky properties obtained. The application is either the layer itself or the face moistened. To The carrier can be dried with be deducted from the skin contaminants. A similar cleaning method will be used in US6,106,818.

EP0323652 beschreibt eine polymerisierbare Schicht, die sich ebenfalls zur Hautreinigung einsetzten lässt. Dabei werden Cyanacrylate eingesetzt, die mittels eines Klebestreifens nach der Polymerisation von der Haut abgezogen werden und auf diese Weise Verunreinigungen entfernen.EP0323652 describes a polymerizable layer which is also suitable for Use skin cleansing. This cyanoacrylates are used, which by means of an adhesive strip be removed from the skin after the polymerization and on this Remove impurities.

Ein entscheidender Nachteil solcher physikalischen Verfahren liegt darin, dass die Hautbehandlung unsanft erfolgt und zur Hautirritationen führen kann, was ihre Anwendung bei Menschen mit empfindlicher Haut problematisch machen kann. Auch die Reinigung von anderen empfindlichen Oberflächen wie Gemälden, Dokumenten, elektronischen Leiterplatten mit konventionellen physikalischen Methoden erweist sich wegen unsanfter Behandlung und als Folge wegen starker Oberflächenschäden meistens als ungeeignet. Ein weiterer Nachteil dieser Verfahren besteht darin, dass damit nur eine sehr oberflächliche Behandlung möglich ist, bei der nur oberflächliche, lose Verunreinigungen entfernt werden. Eine Tiefenwirkung, wie Lösen fest haftender Verunreinigungen, ist mit den physikalischen Verfahren nicht möglich.One decisive disadvantage of such physical methods is that that the skin treatment is rash and skin irritation to lead What makes their use problematic in people with sensitive skin can make. Also, the cleaning of other delicate surfaces such as paintings Documents, electronic circuit boards with conventional physical Methods prove because of rough treatment and as a consequence of strong surface damage mostly as unsuitable. Another disadvantage of these methods is that's just a very superficial one Treatment possible is, with only superficial, loose impurities are removed. A depth effect, like loosening tight Adhesive contamination, is with the physical process not possible.

Dieses Problem wurde von der Industrie erkannt und neue Reinigungsverfahren basierend auf einem Einsatz von Enzymen wurden entwickelt. Vor allem bei der Behandlung sensibler Oberflächen zeigt sich die Verwendung von Enzymen wegen der sehr schonenden Reaktionsbedingungen gegenüber physikalischen oder chemischen Verfahren als besonders vorteilhaft.This Problem has been recognized by the industry and new cleaning methods based on a use of enzymes have been developed. Especially the use of sensitive surfaces is shown of enzymes because of the very mild reaction conditions compared to physical or chemical process as particularly advantageous.

Solche enzymatischen Reinigungsverfahren und entsprechende Produkte sind insbesondere in der kosmetischen und in der Waschmittelindustrie bekannt. So beschreibt US5,830,449 eine wässrige Zusammensetzung zum Auftragen auf die Haut, die neben einem Enzym zu seiner Stabilisierung Polyol und weitere stabilisierende Substanzen enthält. Das Patent US6,303,119 beschreibt die Verwendung von an ein wasserunlösliches Substrat gebundenem Enzym Protease G in einer Zusammensetzung für hygienische Wischtücher.Such enzymatic purification processes and corresponding products especially in the cosmetic and detergent industries known. Thus US5,830,449 describes an aqueous composition for Applying to the skin, in addition to an enzyme to its stabilization Contains polyol and other stabilizing substances. The US Pat. No. 6,303,119 describes the use of a water-insoluble material Substrate bound enzyme protease G in a composition for hygienic Wipes.

In US4,556,554 wird die kosmetische Anwendung von immobilisierten Enzymen gezeigt, wobei in einem ersten Schritt Lipasen, Proteasen oder zuckerspaltende Enzyme physikalisch oder chemisch auf einem Träger immobilisiert werden. Bei der Anwendung werden die Enzyme durch den sauren pH-Wert der Haut freigesetzt, wo sie ihre enzymatische Aktivität entfalten können. Der entscheidende Nachteil dieser Methode besteht darin, dass die Enzyme nach der Behandlung von der Haut nicht vollständig entfernt werden und können somit der Haut durch eine unerwünschte Weiterverdauung einen Schaden anrichten und allergische Reaktionen hervorrufen. Außerdem können zur Behandlung eingesetzte Enzyme nur einmal verwendet werden, was zu einem hohen Preis für das fertige Produkt wegen relativ teuerer Herstellungsverfahren für Enzyme führt.In US Pat. No. 4,556,554 describes the cosmetic application of immobilized enzymes in which, in a first step, lipases, proteases or sugar-cleaving Enzymes are physically or chemically immobilized on a support. at The enzymes are used by the acidic pH of the skin released where they can develop their enzymatic activity. Of the decisive disadvantage of this method is that the enzymes after treatment of the skin can not be completely removed and thus can the skin by an undesirable Further digestion can cause harm and allergic reactions cause. Furthermore can used for treatment enzymes are used only once, resulting in a high price for the finished product because of relatively expensive manufacturing processes for enzymes leads.

Aus dem Stand der Technik ist die Verwendung von Enzymen zur Reinigung auch bei Wundversorgung bekannt. US4,904,469 beschreibt eine Wundenversorgung auf der Basis von Polysacchariden, die nicht-immobilisierte Enzyme beinhalten. Auf diese Weise kann eine deutlich beschleunigte Wundheilung erreicht werden. Nach Ablösung des Wundverbandes werden die Enzyme allerdings nicht komplett abgelöst, was zu allergischen Reaktionen bei dermatologischen Anwendungen führen kann.From the state of the art, the use of enzymes for cleaning even in Wundversor known. US4,904,469 describes a wound care based on polysaccharides containing non-immobilized enzymes. In this way, a significantly accelerated wound healing can be achieved. After detachment of the wound dressing, however, the enzymes are not completely detached, which can lead to allergic reactions in dermatological applications.

In US 6,368,595 wird als Lösung für solche Probleme der Einschluss von Enzymen in abziehbare Polyvinylalkoholfilme beschrieben. Auf diese Weise kann eine Freisetzung von Enzymverunreinigungen nach der Anwendung verhindert werden. Patent US6,410,017 beschreibt eine Zusammensetzung, die wasserunlöslichen Träger mit immobilisierten Enzymen enthält, die nach der Anwendung durch Abziehen des Trägermaterials komplett entfernt werden und dadurch das Risiko einer allergischen Reaktion ebenfalls verringert wird. Bei diesem Verfahren werden die Enzyme über einen polymeren beweglichen Spacer angebunden, wodurch ihre Mobilität erhöht und damit Reinigungseigenschaften verbessert werden können. In GB 2240040 wird die Verwendung von an Textilmaterial kovalent angebundenen Enzymen als Verbandmaterial zur Wundbehandlung beschrieben.In US 6,368,595 As a solution to such problems, the inclusion of enzymes in peelable polyvinyl alcohol films is described. In this way, release of enzyme contaminants after use can be prevented. US Pat. No. 6,410,017 describes a composition containing water-insoluble carriers with immobilized enzymes which, after application, are completely removed by stripping off the carrier material, thereby also reducing the risk of an allergic reaction. In this method, the enzymes are attached via a polymeric movable spacer, which increases their mobility and thus cleaning properties can be improved. In GB 2240040 describes the use of covalently attached to fabric textile enzymes as dressing material for wound treatment.

Auch die Verwendung von immobilisierten Enzymen zur Reinigung beim Waschen ist aus dem Stand der Technik bekannt. EP 0476915 beschreibt die Verwendung von immobilisierten Lipasen aus Pseudomonas zur Modifizierung von faserartigen Stoffen, die durch eine Komplexbildung mit dem Enzym eine verbesserte Ölfleckenentfernung und eine Anti-Redesorptionswirkung beim Waschen aufweisen. In US 4,771,739 ist die Anwendung von immobilisierten Enzymen in der Waschmittelindustrie in Form von WO-Emulsionen bei einem pH-Bereich von 5-9 beschrieben.The use of immobilized enzymes for cleaning during washing is also known from the prior art. EP 0476915 describes the use of immobilized lipases from Pseudomonas to modify fibrous matter which, by complexing with the enzyme, has improved oil stain removal and anti-resorption activity on washing. In US 4,771,739 describes the use of immobilized enzymes in the detergent industry in the form of WO emulsions at a pH range of 5-9.

Aus US 6,030,933 ist eine detergente Zusammensetzung bekannt, die ein oder mehrere über kovalente Bindungen auf einen aktivierten Polymerträger wie Polyethylenglycole immobilisierte Enzyme enthält, wobei die Bindung bevorzugt über einen Spacer erfolgt. Dadurch können z.B. eine verbesserte Temperaturstabilität, verbesserte Stabilität gegenüber Autoproteolyse und eine reduzierte Ablösung der Enzyme vom Träger erreicht werden.Out US 6,030,933 For example, a detergent composition is known which contains one or more enzymes immobilized via covalent bonds on an activated polymer carrier, such as polyethylene glycols, wherein the binding preferably takes place via a spacer. As a result, for example, an improved temperature stability, improved stability to autoproteolysis and a reduced detachment of the enzymes from the carrier can be achieved.

In US 4,855,234 wird gezeigt, wie auf einem mit Plasma vorbehandelten faserigen Polymerträger immobilisierte Enzyme auch zur Reinigung von medizinischen Geräten oder Kontaktlinsen eingesetzt werden können.In US 4,855,234 It is shown how enzymes immobilized on a plasma pretreated fibrous polymer carrier can also be used to clean medical devices or contact lenses.

Trotz vieler Vorteile, die die Verwendung von Enzymen in bekannten Reinigungsverfahren mit sich bringt, stehen ihrem breiten Einsatz auch gravierende Nachteile gegenüber. So benutzt eine Reihe von bekannten Verfahren einen direkten Auftrag von Enzymlösungen auf die zu behandelnde Oberfläche. Dieses Vorgehen resultiert jedoch zwangsläufig im Verbleib der Enzyme auf der Oberfläche, was zum einen den Verlust des Enzyms bewirkt, zum anderen die Wirkung des auf der Oberfläche verbleibenden Enzyms nicht kontrolliert und vor allem unkontrollierte Nachwirkungen durch Eindringen des Enzyms in das Objekt befürchtet werden müssen.In spite of Many benefits include the use of enzymes in known purification processes brings with them, their widespread use also has serious disadvantages across from. Thus, a number of known methods use a direct order of enzyme solutions on the surface to be treated. However, this procedure inevitably results in the fate of the enzymes on the surface, which on the one hand causes the loss of the enzyme, on the other hand the effect of the on the surface remaining enzyme not controlled and especially uncontrolled After-effects must be feared by penetration of the enzyme into the object.

Um dieses Problem zu umgehen, werden Enzyme in einigen bekannten Verfahren durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung an unlösliche Trägeroberflächen fixiert und dadurch von der zu behandelnden Oberfläche nach der Reaktion entfernt. Die bekannten Methoden zur Fixierung der Enzyme auf Trägern erhöhen jedoch teilweise die Instabilität und verringern die Aktivität der Enzyme und begrenzen somit deren Anwendung noch mehr.Around To circumvent this problem, enzymes are used in some known processes fixed by covalent or non-covalent binding to insoluble support surfaces and thereby removed from the surface to be treated after the reaction. However, the known methods for fixing the enzymes on carriers increase partly the instability and decrease the activity enzymes and thus limit their use even more.

Die zumeist aufwändigen Verfahren zur Enzymgewinnung und vor allem die große Sensitivität gegenüber Umwelteinflüssen und ihre sehr begrenzte Haltbarkeit stellen ein weiteres Problem dar. Einmal zur Behandlung verwendete Enzyme können nach einer Reaktion meist nicht wieder verwendet werden und die entsprechenden Produkte sind folglich relativ teuer.The mostly elaborate Process for enzyme production and especially the high sensitivity to environmental influences and Their very limited durability is another problem. Once used for treatment enzymes can usually after a reaction not be reused and the corresponding products are consequently relatively expensive.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Methoden zur Behandlung von Oberflächen zu umgehen und ein effektives und preiswertes Verfahren sowie einen Artikel insbesondere zur schonenden Reinigung von empfindlichen Oberflächen bereit zu stellen.Of the The present invention is therefore based on the object, the disadvantages the well-known methods of handling surfaces and an effective and inexpensive method and an article especially for gentle To provide cleaning of sensitive surfaces.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung in erster Linie einen Artikel mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen vor. Weiterbildungen der Erfindung sowie das dazugehörige Verfahren und die Verwendung sind Gegenstand der übrigen abhängigen Ansprüche 2 bis 22. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.To solve this problem, the invention proposes primarily an article with the features mentioned in claim 1. Further developments of the invention and the associated method and use are the subject of the remaining dependent claims 2 to 22. The wording of all claims hereby incorporated by reference into the content of the description.

Das oben genannte Ziel wird gemäß der Erfindung durch einen Artikel erreicht, der aus einem Träger besteht, an dem Enzyme permanent und irreversibel gebunden sind, die über längere Zeit stabil und aktiv bleiben, so dass der Artikel mehrfach wieder verwendet werden kann.The The above object is according to the invention achieved by an article consisting of a carrier on which enzymes permanently and irreversibly bound, which are stable and active for a long time remain so that the article can be reused several times.

Um den gestellten Anforderungen an den erfindungsgemäßen Artikel nach einer lang andauernden Stabilität und Wiederverwendbarkeit zu genügen, muss ein speziell entwickeltes Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf Trägern angewendet sowie passende Träger eingesetzt werden. Das grundsätzliche Verfahren zur Immobilisierung von ausgewählten Enzymen ist in Nouaimi et al. (2001) und Moeschel et al. (2003) ausführlich beschrieben und wird in der vorliegenden Erfindung in einer modifizierten und erweiterten Form zur Herstellung von erfindungsgemäßen Artikeln zur schonenden Behandlung von Oberflächen verwendet. Das Herstellungsverfahren wird im Folgenden in Grundzügen dargestellt und an konkreten Ausführungsbeispielen erläutert.Around the requirements of the article of the invention after a long lasting stability and reusability to suffice, must have a specially developed method for the immobilization of Enzymes on carriers applied as well as suitable carriers be used. The fundamental Immobilization of selected enzymes is in Nouaimi et al. (2001) and Moeschel et al. (2003) and is described in detail in the present invention in a modified and extended Mold for the production of articles according to the invention for gentle Treatment of surfaces uses. The manufacturing process is presented below in outline and explained in concrete examples.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäß als Trägermaterial flexible synthetische polymere Vliese verwendet. Die Wahl des Trägermaterials hängt dabei vom jeweiligen Verwendungszweck ab. Insbesondere zwei Materialtypen erweisen sich als besonders geeignet für eine stabile Immobilisierung von Enzymen: Polyamid- und Polyestervliese. Polyestervliese sind zwar rigider und somit formbeständiger, passen sich aber Oberflächen weniger gut an. Sie werden immer dann bevorzugt, wenn relativ flache Oberflächen z.B. bei Dokumenten behandelt werden sollen. Auch bei Gemälden, wo zumeist nicht das gesamte Bild, sondern unter genauer Kontrolle kleine Teilbereiche behandelt werden, sind die resistenteren Polyester von Vorteil. Je größer die Unebenheiten der Oberfläche und das Bedürfnis nach einem sehr engen Kontakt, ist dem mehr flexiblen Polyamidgewebe der Vorzug zu geben. Auch andere polymere Stoffe können als Trägermaterial verwendet werden. Prinzipiell können alle Polymere verwendet werden, die eine permanente stabile Immobilisierung von Enzymen ermöglichen. So wurden gute Ergebnisse auch mit Polyester/Viskose-Mischgeweben erziel. Auch kommen grundsätzlich natürliche Polymere, insbesondere Cellulose und entsprechend Papier in den verschiedensten Fertigungen als Trägermaterial in Frage.In a preferred embodiment are used according to the invention as a carrier material flexible synthetic nonwoven fabrics used. The choice of the carrier material depends on it from the respective purpose. In particular, two types of materials prove to be particularly suitable for a stable immobilization of enzymes: polyamide and polyester nonwovens. Polyester fleeces are although more rigid and thus more dimensionally stable, But surfaces adapt less good. They are always preferred when relatively flat surfaces e.g. to be treated with documents. Also in paintings, where usually not the whole picture, but under close control small sub-areas are treated, the more resistant polyester of Advantage. The bigger the Unevenness of the surface and the need after a very close contact, that is more flexible polyamide fabric to give preference. Other polymeric substances may as well support material be used. In principle, you can All polymers are used which have a permanent stable immobilization of enzymes. So good results were also with polyester / viscose blended fabrics recoverable. Also come in principle natural Polymers, especially cellulose and according to paper in the various production as a carrier material in question.

Die Form und die Größe des Trägers können variabel sein und der zu behandelnden Oberfläche angepasst werden. So kann die Trägerform rechteckig sein, wenn eine Behandlung von ganzen Dokumenten oder Gemälden beabsichtigt wird, streifenförmig, wenn kleinere Hautpartien gereinigt werden sollen, oder eine andere geeignete Form aufweisen. Die Form kann erfindungsgemäß sowohl vom Hersteller vorgegeben werden als auch vom Nutzer bestimmbar sein. Das Letztere kann beispielsweise vorteilhaft sein, wenn Oberflächen mit unregelmäßigen Konturen wie Wunden oder ausgewählte Hautpartien behandelt werden müssen. Synthetischen Vliese, die als Trägermaterial benutzt werden, haben hierfür günstige Eigenschaften und können mit einer üblichen Haushaltsschere in eine gewünschte Form gebracht werden.The Shape and size of the carrier can be variable be adapted to the surface to be treated. So can the carrier form be rectangular when handling whole documents or paintings it is intended to be strip-shaped, if smaller areas of skin should be cleaned, or another have appropriate shape. The mold can according to the invention both specified by the manufacturer as well as the user determined be. The latter may be advantageous, for example, if surfaces with irregular contours like wounds or selected Skin must be treated. synthetic Nonwovens as carrier material be used for this favorable Properties and can with a usual Household scissors in a desired Be brought form.

Vor der eigentlichen Immobilisierung von Enzymen auf dem Träger kann in einigen Fällen ein Anätzen der Träger zur Vergrößerung der zugänglichen Oberfläche, Erhöhung der Wasserbenetzbarkeit und Entfernung von Zusatzstoffen von Vorteil sein. Vor allem bei der Verwendung von Vliesen aus Polyamid und Polyester empfiehlt sich eine solche Vorbehandlung. Zum Anätzen der Trägeroberfläche kann beispielsweise eine Calciumchloridlösung in wässrigem Methanol verwendet werden.In front the actual immobilization of enzymes on the carrier can in some cases an etching of the carrier to enlarge the accessible Surface, increase Water wettability and removal of additives beneficial be. Especially in the use of nonwovens made of polyamide and Polyester is recommended such a pretreatment. For etching the Carrier surface can For example, a calcium chloride solution in aqueous methanol is used become.

Zur weiteren Vorbereitung der Trägeroberfläche für eine Immobilisierung müssen funktionelle Gruppen des Trägermaterials freigesetzt werden. Es handelt sich dabei vorwiegend um Carboxy- und Aminogruppen. Für jedes Trägermaterial muss hierfür ein geeignetes Verfahren angewendet werden. So empfiehlt sich bei Vliesen aus Polyamid oder Polyester eine Säurebehandlung z.B. mit Salzsäure oder eine alkalische Behandlung z.B. mit Natronlauge zur partiellen Hydrolyse.to further preparation of the support surface for immobilization have to functional groups of the support material be released. These are predominantly carboxy- and amino groups. For every carrier material must do this a suitable method can be used. This is recommended for fleeces of polyamide or polyester, an acid treatment e.g. with hydrochloric acid or an alkaline treatment e.g. with sodium hydroxide for partial hydrolysis.

Die durch die Vorbehandlung freigesetzten funktionellen Gruppen werden im nächsten Schritt aktiviert. Bei Polyester oder Polyamid können z.B. die Carboxygruppen mit N-Hydroxysuccinimid und N,N'-Dicylclohexylcarbodiimid in Dioxan aktiviert werden. Aminogruppen können z.B. mit Glutaraldehyd oder durch eine Diazotierung mit salpetriger Säure aktiviert werden.The be released by pretreatment functional groups in the next Step activated. For polyester or polyamide, e.g. the carboxy groups with N-hydroxysuccinimide and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide activated in dioxane. Amino groups can e.g. with glutaraldehyde or activated by a diazotization with nitrous acid.

Für eine Erhöhung der Aktivität und eine stabile Immobilisierung der Enzyme erweist sich die Verwendung von Abstandshaltern (Spacer) bei der Ankopplung der Enzymmoleküle an die Trägeroberfläche als vorteilhaft. Wegen der Inertheit und einer für die Enzymaktivitäten guten Verträglichkeit eignen sich Protein-Spacer hierfür am besten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Rinderserumalbumin (BSA) als Spacer verwendet. Andere Moleküle, wie beispielsweise Dextrane und Polyethylenglykol, sind als Spacer ebenfalls geeignet.For an increase in activity and a stable immobilization of the enzymes, the use of spacers proves to be advantageous in the coupling of the enzyme molecules to the support surface. Because of the inertness and good compatibility for the enzyme activities, protein spacers are best suited for this purpose. In a particularly preferred embodiment bovine serum albumin (BSA) is used as a spacer. Other molecules, such as dextrans and polyethylene glycol, are known as Spacer also suitable.

Zur effektiveren Anheftung empfiehl es sich, das Enzym nicht unmittelbar kovalent an den Spacer zu knüpfen, sondern eine kleine bifunktionelle Verbindung, in der Regel, Glutardialdehyd, dazwischen zu koppeln.to more effective attachment, it does not recommend the enzyme directly covalently attach to the spacer, but a small bifunctional compound, usually, glutaraldehyde, to couple in between.

Die zu immobilisierende Enzymmenge richtet sich nach der erforderlichen Aktivität, die selbst vom jeweiligen Verwendungszweck abhängt. So kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, dass die enzymatischen Reaktionen langsam verlaufen, damit der Behandlungsverlauf kontrolliert und rechtzeitig gestoppt werden kann. Das kann beispielsweise bei der Reinigung von Gemälden oder alten Dokumenten der Fall sein, weil hier die Verunreinigungen schichtweise abgetragen werden müssen, um nicht die eigentlich Gemälde- oder Dokumentsubstanz zu beschädigen. In diesem Fall empfiehlt sich der Einsatz von Trägern mit einer niedrigeren Enzymdichte. In anderen Fällen ist eine schnelle Reaktion von Vorteil, wie z.B. bei der Hautreinigung oder Wundenbehandlung. Hier wird ein Träger mit einer höheren Enzymdichte bevorzugt.The amount of enzyme to be immobilized depends on the required Activity, which itself depends on the respective intended use. So it may be in some make desirable be that the enzymatic reactions are slow so that the course of treatment is controlled and stopped in good time can. This can, for example, in the cleaning of paintings or old documents be the case, because here the impurities layer by layer have to be removed not the actual painting or document substance. In this case, the use of carriers with a lower one is recommended Enzyme density. In other cases a fast reaction is advantageous, e.g. at the skin cleansing or wound treatment. Here becomes a carrier with a higher enzyme density prefers.

Erfindungsgemäß können beliebige Enzyme auf der Trägeroberfläche immobilisiert werden, abhängig von der angestrebten Behandlungsart und von den Eigenschaften der zu behandelnden Oberfläche. Besonders bevorzugt werden hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen, Dextranasen, RNasen, DNasen, Hyaluronidasen, Elastasen, Ureasen oder bakteriolytische Enzyme wie Lysozym verwendet. Diese Enzyme können vor allem bei oberflächlichen Veränderungen vorteilhaft eingesetzt werden, wie Reinigungsprozeduren, bei denen durch den enzymatischen Abbau die Schmutzpartikel aufgelöst werden. Auch andere Enzyme abhängig von der jeweiligen Fragestellung können auf dem Träger immobilisiert werden, wie beispielsweise Superoxid-Dismutase und Peroxidase für die Wundbehandlung bei entzündlichen Prozessen. Weitere Möglichkeiten werden unten bei Anwendungsbeispielen beschrieben. Erfindungsgemäß können auf einem Träger sowohl Enzyme einer einzigen Sorte als auch Mischungen aus unterschiedlichen Enzymen immobilisiert werden, abhängig vom jeweiligen Verwendungszweck.According to the invention, any Enzymes immobilized on the support surface be dependent on the desired type of treatment and the properties of the treating surface. Particular preference is given to hydrolytic enzymes such as proteases, lipases, Amylases, cellulases, dextranases, RNases, DNases, hyaluronidases, Elastases, ureases or bacteriolytic enzymes such as lysozyme. These enzymes can especially in the superficial changes be used advantageously, such as cleaning procedures, in which the enzymatic degradation dissolves the dirt particles. Also dependent on other enzymes from the respective question can be immobilized on the support such as superoxide dismutase and peroxidase for wound treatment in inflammatory Processes. More options are described below in application examples. According to the invention can a carrier both enzymes of a single variety as well as mixtures of different ones Enzymes are immobilized, depending on the intended use.

Die auf dem erfindungsgemäßen Artikel immobilisierten Enzyme bleiben stabil und behalten ihre Aktivität über einen längeren Zeitraum. So konnte beispielsweise für Träger mit unterschiedlichen Proteasen gezeigt werden, dass die entsprechenden Enzymaktivitäten über einen Zeitraum von zumindest einem Jahr erhalten bleiben. Auch für andere Enzyme konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Diese Eigenschaft der erfindungsgemäßen Träger kann vorteilhaft dazu genutzt werden, sie zur Behandlung von Oberflächen mehrfach zu verwenden, wie unten beschrieben wird.The on the article according to the invention immobilized enzymes remain stable and retain their activity longer Period. For example, for carriers with different proteases be shown that the corresponding enzyme activities over a Period of at least one year. Also for others Enzymes were comparable results can be achieved. This property of Carrier according to the invention can be used to advantage, they repeatedly for the treatment of surfaces to use, as described below.

Das eigentliche Verfahren zur schonenden Behandlung von Oberflächen mit den erfindungsgemäßen Artikeln ist sehr einfach und nutzerfreundlich. Nachdem die Form des Vliesträgers, soweit notwendig, an die Oberflächenkonturen angepasst ist, muss der Träger oder die zu behandelnde Oberfläche nur mit passender Flüssigkeit, bevorzugt mit Wasser, befeuchtet und auf die zu behandelnde Oberfläche aufgelegt werden. Die Enzyme müssen vor der Behandlung nicht extra aktiviert werden. Um eine hohe Wirksamkeit zu erreichen, soll der Träger auf der Oberfläche möglichst dicht aufliegen, damit die Enzyme einen direkten Kontakt zur Oberfläche haben. Bei einigen Behandlungen empfiehlt sich, auf den Träger einen gleichmäßigen Druck auszuüben, indem man beispielsweise ein Gewicht auflegt (z.B. bei flachen Oberflächen wie Gemälden). Nach Ablauf einer für eine enzymatische Reaktion notwendigen Zeit, die von der Beladungsdichte, der Temperatur und der Aktivität des jeweiligen Enzyms abhängt (normalerweise zwischen 10 und 60 min), wird der Träger von der Oberfläche entfernt. In vielen Fällen empfiehlt sich, die abgebauten Schmutzreste nach der Behandlung von der Unterlage zu entfernen, wobei sie nach dem enzymatischen Abbau nicht mehr fest haften und durch einfaches Waschen z.B. mit sauberem Wasser zu entfernen sind. In einzelnen Fällen stören diese Reste auch nicht weiter.The actual process for the gentle treatment of surfaces with the articles of the invention is very simple and user friendly. After the shape of the fleece carrier, as far as necessary, to the surface contours adjusted, the carrier must or the surface to be treated only with suitable liquid, preferably with water, moistened and placed on the surface to be treated become. The enzymes must not be activated before the treatment. To be highly effective to reach, the carrier should on the surface preferably lie tight so that the enzymes have a direct contact with the surface. For some treatments, it is recommended to apply to the wearer even pressure exercise by For example, you can apply a weight (for example, on flat surfaces such as Paintings). After expiry of a for an enzymatic reaction necessary time, which depends on the loading density, the temperature and the activity of the respective enzyme (usually between 10 and 60 min), the carrier of the surface away. In many cases It is recommended to remove the debris after treatment to remove from the pad, according to the enzymatic Degradation no longer adhere firmly and by simply washing e.g. With clean water are to be removed. In some cases, these disturb Remains not further.

Der zur Oberflächenbehandlung eingesetzte enzymbeladene Träger ist mehrfach wiederverwendbar, wobei, je nach Verschmutzungsgrad, der Träger nach einer oder mehreren Einsätzen zu reinigen ist. Dies erfolgt je nach Art der Verschmutzung z.B. durch Spülen mit wässriger, gepufferter Lösung mit höherer Kochsalzkonzentration (z.B. 0,4 M NaCl), oder, insbesondere bei Lipiden, mit verdünnter (z.B. 30%iger) ethanolischer Lösung. Die Behandlung des Trägers mit Ethanol erweist sich auch als vorteilhaft, wenn ein möglichst steriles Verfahren zur Behandlung der Oberfläche angestrebt wird, z.B. bei Hautreinigung oder Wundenversorgung. Kurzfristig empfiehlt sich die Aufbewahrung des Trägers in neutraler wässriger gepufferter Lösung gekühlt unter 8°C, bevorzugt bei 4°C. Für längerfristige Lagerung muss die Salzlösung durch Waschen mit entionisiertem Wasser entfernt und der Träger bei Raumtemperatur luftgetrocknet werden. Der luftgetrocknete Träger kann dann bei Raumtemperatur über Monate gelagert werden, ohne die Enzymaktivität zu verlieren. Nach Wässern in gepufferter Lösung ist er sofort wieder einsetzbar.Of the for surface treatment used encyclopedic carriers is reusable several times, whereby, depending on the degree of soiling, the carrier after one or more operations to clean. This is done depending on the type of contamination e.g. by rinsing with watery, buffered solution with higher Saline concentration (e.g., 0.4 M NaCl), or, especially at Lipids, with dilute (e.g., 30%) ethanolic solution. The treatment of the carrier Using ethanol also proves to be beneficial if possible sterile treatment of the surface is desired, e.g. at Skin cleansing or wound care. In the short term, it is recommended the storage of the carrier in neutral aqueous buffered solution chilled below 8 ° C, preferably at 4 ° C. For longer term Storage must be the saline solution removed by washing with deionized water and the carrier at Room temperature are air dried. The air-dried carrier can then at room temperature Months are stored without losing the enzyme activity. After watering in buffered solution he can be used immediately.

Keine der bekannten Verfahren zur Behandlung von Oberflächen vereinigt in einem die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich die Verwendung von mehrfach wiederverwendbaren Trägern aus synthetischen Polymeren mit irreversibel gebundenen und über längere Zeit aktiv bleibenden Enzymen. Die am Anfang dargestellten Nachteile der bekannten Verfahren werden durch eine direkte permanente Fixierung von Enzymen an flexible Trägermaterialien, die sich der zu behandelten Oberfläche genau anpassen können, vermieden. Durch die irreversible Immobilisierung gehen die Enzyme nicht verloren, sondern werden mit Ablösung des Trägermaterials quantitativ zurückgewonnen und sind für wiederholte Einsätze verwendbar. Das Enzym reagiert zwangsläufig nur oberflächlich, tieferes Eindringen und Verbleib des Enzyms im Objekt ist ausgeschlossen. Dieses Verfahren eröffnet über die für die bekannten Verfahren bislang zugängigen Einsatzgebiete hinaus noch weitere Anwendungsmöglichkeiten. Die erfindungsgemäßen Artikel sind vor allem immer dort einzusetzen, wo organische, durch Enzyme angreifbare Verunreinigungen auftreten, die Anwendung herkömmlicher Reinigungsmittel sich jedoch verbietet. Das gilt immer für sensible Oberflächen, die beispielsweise durch Hautkontakt verunreinigt werden, als Beispiel seinen hier Verschmutzung an elektronischen Leiterplatten erwähnt. Einige von den zahlreichen möglichen Anwendungen wurden bereit oben an mehreren Stellen erwähnt, drei davon werden als Beispiel im Folgenden ausführlich beschrieben.None united the known method for the treatment of surfaces in a the advantages of the method according to the invention, namely the Use of multi-reusable synthetic polymer backings with irreversibly bound and over longer Time remaining active enzymes. The disadvantages presented at the beginning The known methods are characterized by a direct permanent fixation of Enzymes to flexible carrier materials, which can adapt to the surface to be treated exactly avoided. Due to the irreversible immobilization, the enzymes are not lost, but with detachment of the carrier material recovered quantitatively and are for repeated missions usable. The enzyme inevitably reacts superficially, deeper penetration and fate of the enzyme in the object is excluded. This procedure opens over the for the previously available methods Fields of application also other applications. The articles of the invention Above all, they are always used where organic, by enzymes vulnerable contaminants occur, the use of conventional However, cleaning agent prohibits. This is always true for sensitive Surfaces, which are contaminated, for example, by skin contact, as an example his here mentioned pollution on electronic circuit boards. Some of the many possible Applications have been mentioned above in several places, three thereof will be described in detail below as an example.

Reinigung von Oberflächen empfindlicher und wertvoller Dokumente und KunstwerkeCleaning surfaces more sensitive and valuable documents and works of art

Die Art der Reinigung ist immer abhängig von der Art der Verschmutzung, so liegen bei verschiedenartigen Dokumenten und Kunstwerken auch unterschiedliche Arten der Verschmutzung vor, denen das Reinigungsverfahren genügen muss, insofern ist hier eine möglichst weitgehende Flexibilität erforderlich. Bei dieser Anwendung muss insbesondere gegen drei Verschmutzungsarten vorgegangen werden: Fette und Lipide, Proteinreste sowie Kohlenhydrate. Alle diese drei Arten kommen in unterschiedlichem Maße vor. Fett- und Lipidablagerungen resultieren durch häufige Benutzung aber auch als Folge einer Beimengung zu Verschmutzungen durch Staub, wie sich über Jahrhunderte an ungeschützten Kunstwerken insbesondere an exponierten Stellen, wie Gemälden, Fresken oder (häufiger Berührung ausgesetzten) Plastiken. Proteinablagerungen haben ihre Ursache ebenfalls in häufiger Benutzung, besonders bei Kontamination mit Speiseresten. Kohlenhydrate finden sich vielfach in Form von Stärke, als Klebstoffrückstände, auch als zunächst nicht sichtbare Verunreinigungen und Flecken, die im Laufe der Zeit eine dunkle, zumeist sehr störende Färbung annehmen. Die Auswahl der Enzymbeladung des Trägers richtet sich nach diesen Gegebenheiten, wobei Lipase, Protease, oder Amylase besonders bevorzugte Enzyme sind. Bei unklaren Verhältnissen können auch Mischbelegungen der Träger verwendet werden.The Type of cleaning is always dependent on the type of pollution, so are different Documents and works of art also different types of pollution that the cleaning process must satisfy is insofar as here one possible extensive flexibility required. In this application, in particular against three Pollution types are: fats and lipids, protein residues as well as carbohydrates. All of these three types come in different Dimensions. Fat and lipid deposits result from frequent use but also as Consequence of an admixture to dirt by dust, how over centuries on unprotected Works of art especially in exposed places, such as paintings, frescoes or (more often contact exposed) sculptures. Protein deposits have their cause also in more frequent Use, especially in case of food waste contamination. carbohydrates can often be found in the form of starch, as adhesive residues, too as first invisible contaminants and stains over time a dark, mostly very disturbing coloring accept. The selection of the enzyme charge of the wearer depends on these Conditions, with lipase, protease, or amylase particularly preferred Enzymes are. In unclear circumstances can also mixed assignments of the carriers be used.

Behandlung von Hautpartientreatment of skin areas

Gerade für Hautbehandlungen, die eine äußerst schonende Vorgehensweise erfordern, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren ganz besonders. Hautbehandlungen mit Proteinen, wie Enzymen, sind nicht ganz unproblematisch weil durch den unmittelbaren Körperkontakt, insbesondere im Gesicht-, Mund- und Nasenbereich (z.B. bei Gesichtsmasken), die Entwicklung oder die Manifestierung von Allergien besonders groß ist. Auch sonst ist der unkontrollierte Verbleib hochaktiver Enzyme an empfindlichen Hautstellen keinesfalls wünschenswert. Das Verfahren ermöglicht ein kontrolliertes Einwirken der Enzyme auf oberflächliche Hautpartien, z.B. in Form einer Gesichtsmaske. Dabei werden oberflächlich Talg- und Fettreste, sowie auch Proteine abgebaut, ohne dass die Enzyme (Lipasen und Proteasen) in tiefere Hautpartien eindringen können. Dies bewirkt insgesamt eine oberflächliche Hautreinigung, die als Auffrischung bzw. als Verjüngung empfunden wird. Durch Einbeziehung von Enzymen, die speziell die Zellwand und Membranstruktur von Bakterien angreifen (z. B. Lysozym, Muraminidase) kann auch eine bakterizide Wirkung hervorgerufen werden. Solche bakteriziden Enzyme können auch bei der Wundbehandlung mit Vorteil benutzt werden, wobei der mit diesen Enzymen beladene Artikel durch ein einfaches Auflegen auf Wundpartien seine reinigende Wirkung entfalten kann.Just for skin treatments, the one very gentle Require procedure, the inventive method is suitable most notably. Skin treatments with proteins, such as enzymes, are not completely unproblematic because of the direct physical contact, especially in the face, mouth and nose area (for example in face masks), the development or manifestation of allergies especially is great. Even otherwise, the uncontrolled whereabouts of highly active enzymes is on sensitive skin is not desirable. The procedure allows a controlled action of the enzymes on superficial Skin, e.g. in the form of a face mask. At the same time, superficial sebaceous and fat remnants, as well as proteins degraded without the enzymes (Lipases and proteases) can penetrate deeper skin. This causes a total of a superficial Skin cleansing, which felt as a refresher or as a rejuvenation becomes. By including enzymes that specifically target the cell wall and attack the membrane structure of bacteria (eg lysozyme, muraminidase) can also be caused a bactericidal effect. Such bactericidal enzymes can be used with advantage in the wound treatment, wherein the with these enzymes loaded articles by simply hang up it can develop its cleansing effect on wounds.

Auftragen von Farbmustern auf eine OberflächeApplication of color samples on a surface

Eine Oberfläche wird mit einem Farbstoff in seiner farblosen Form („Leukoform") belegt, die erst durch einen oxidativen (oder reduktiven) Vorgang die Farbe annimmt. Durch Auflegen eines Trägers mit an bestimmten Stellen immobiliserter Oxidase bzw. Reduktase wird die Farbe an gezielten Stellen entwickelt.A surface is occupied with a dye in its colorless form ("leuco form"), the first by an oxidative (or reductive) process takes the color. By placing a carrier with immobilized oxidase or reductase at certain points The color is developed in specific places.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung sollen nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.Further Advantages, features and applications of the invention are intended below with reference to the embodiments be explained in more detail. Also without further explanations It is assumed that a professional has the above description to the fullest extent. The preferred embodiments and examples of the inventive method are therefore merely descriptive, not by any means Way limiting disclosure to understand.

Ausführungsbeispieleembodiments

Herstellung eines Trägers mit darauf immobilisierten EnzymenProduction of a carrier with immobilized enzymes

Als Trägermaterial wird ein Polyestervlies benutzt. Zur Erhöhung der Wasserbenetzbarkeit und Entfernung von Zusatzstoffen (Ausrüstung, Appretur) sowie zur Vergrößerung der Oberfläche wird das Gewebe mit 18,6%iger Calciumchloridlösung in wässrigem Methanol angeätzt. Eine partielle Hydrolyse durch 30 min Behandlung mit 10%ige Natronlauge oder durch 60 min Behandlung bei 50°C mit 3,65 M Salzsäure zur Freisetzung funktioneller Gruppen wird vorgenommen. Die Aktivierung der Carboxyfunktion der freigesetzten funktionellen Gruppen erfolgt mit 0,2 M N-Hydroxysuccinimid und 0,2 M N,N'-Dicylclohexylcarbodiimid in Dioxan für 70 min bei Raumtemperatur. Im nächsten Schritt wird im Fall einer Immobilisierung von Protease oder α-Amylase Rinderserumalbumin (BSA) als Spacer angeheftet. Dazu wird das Lösungsmittel vollständig entfernt und durch 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,6 ersetzt. Unmittelbar darauf erfolgt die Immobilisierung durch Zusatz des Spacermoleküls, 1 %ig in gepufferter wässriger Lösung pH 7,5 für 16 Stunden bei 4°C. Zur Anheftung des Enzyms wird der mit dem Spacer beladene Träger für 20 min bei Raumtemperatur mit 5% Glutaraldehyd in 0,2 M Boratpuffer pH 8,5 behandelt und nach dem Waschen des Trägers die Enzymlösung (0,2-0,5 mg/ml) in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 für 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Die zu immobilisierende Enzymmenge richtet sich nach der erforderlichen Aktivität.When support material a polyester fleece is used. To increase water wettability and removal of additives (equipment, finish) and to Magnification of the surface The tissue is etched with 18.6% calcium chloride solution in aqueous methanol. A partial hydrolysis by treatment with 10% sodium hydroxide solution for 30 minutes or by 60 min treatment at 50 ° C with 3.65 M hydrochloric acid for Release of functional groups is made. The activation the carboxy function of the released functional groups occurs with 0.2 M N-hydroxysuccinimide and 0.2 M N, N'-dicyclohexylcarbodiimide in dioxane for 70 min at room temperature. In the next Step is in the case of immobilization of protease or α-amylase Bovine serum albumin (BSA) attached as a spacer. This is the solvent Completely and replaced with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.6. immediate then the immobilization takes place by addition of the spacer molecule, 1% strength in buffered aqueous solution pH 7.5 for 16 hours at 4 ° C. To attach the enzyme, the spacer loaded with the carrier for 20 min at room temperature with 5% glutaraldehyde in 0.2 M borate buffer pH 8.5 and after washing the carrier the enzyme solution (0.2-0.5 mg / ml) in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5 for 4 hours at 4 ° C. The amount of enzyme to be immobilized depends on the required Activity.

Drei verschiedene, für die diskutierten Anwendungen bedeutsame Enzyme wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren auf dem Träger immobilisiert: Protease (Trypsin, Thermolysin), α-Amylase, und Lipase. Die jeweiligen Aktivitäten konnten auf dem Träger nachgewiesen werden, wie es in folgenden Beispielen für Trypsin und Lipase gezeigt wird.Three different, for the applications discussed significant enzymes were after the one described above Procedure on the carrier immobilized: protease (trypsin, thermolysin), α-amylase, and lipase. The respective ones activities could on the carrier be detected, as in the following examples of trypsin and lipase is shown.

Das unerwünschte nicht kovalent gebundene Enzym wird durch Waschen mit 0,5 M Kochsalzlösung in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 vollständig von der Trägeroberfläche entfernt. Vergleichende Versuche zeigten, dass beim Auflegen unbehandelter und enzymbeladener Träger auf feuchtes Papier der anschließend gemessene Enzymgehalt auf dem Papier in beiden Fällen nicht zu unterscheiden und praktisch gleich null war. Dies deutet darauf hin, dass aus dem Träger kein Enzym in das Objekt eindringt.The undesirable non-covalently bound enzyme is purified by washing with 0.5 M saline 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5 completely removed from the support surface. Comparative tests showed that when applying untreated and encyclopedic vehicle on wet paper the subsequently measured enzyme content on paper in both cases indistinguishable and practically zero. This indicates out that from the carrier no enzyme enters the object.

Behandlung einer Oberfläche mit einem Träger mit darauf immobilisiertem Trypsintreatment a surface with a carrier with trypsin immobilized on it

Zur Prüfung und Messung der Wirksamkeit eines Trägers mit darauf immobilisierten Enzymen wurde eine mit Gelatine überzogene Oberfläche mit einem Trypsin-beladenen Träger behandelt. Proteolytische Enzyme wie Trypsin sind in der Lage, Gelatineschichten von der Oberfläche her zu verflüssigen. Trägerstücke definierter Größe (z.B. 10×10 mm) aufgelegt auf eine glatte, erstarrte Gelatineoberfläche zeigen bereits nach einer Stunde bei Raumtemperatur deutliche Spuren der oberflächlichen Verflüssigung gegenüber den unbehandelten Stellen. Zeitabhängig bildet sich an der Stelle des Trägerstückes eine deutliche Vertiefung. Durch Entnahme der überstehenden Flüssigkeit kann nach dem Ninhydrinverfahren die Abbaurate quantifiziert werden. Durch Immobilisierung unterschiedlicher Enzymmengen auf dem Träger kann die Effizienz des Abbaus gesteuert werden. Für die Enzymwirkung ist ein direkter Kontakt mit der Oberfläche über einen wässrigen Flüssigkeitsfilm erforderlich.to exam and measuring the effectiveness of a carrier immobilized thereon Enzyme became a gelatin coated surface with a trypsin-loaded vehicle treated. Proteolytic enzymes such as trypsin are capable of gelatin layers from the surface to liquefy her. Carrier pieces defined Size (e.g. 10 x 10 mm) placed on a smooth, solidified gelatin surface after only one hour at room temperature clear traces of superficial liquefaction across from the untreated areas. Time-dependent forms at the site the support piece a clear depression. By removing the supernatant liquid can be quantified according to the ninhydrin method, the degradation rate. By immobilization of different amounts of enzyme on the support can the efficiency of the degradation are controlled. For the enzyme effect is a direct contact with the surface via a aqueous liquid film required.

Tabellen 1 und 2 demonstrieren die Langzeitstabilität der über BSA an Polyestervlies immobilisierten Protease Trypsin im Vergleich zum direkt immobilisierten Enzym. Direkt gebundenes Trypsin zeigt eine relativ niedrige Aktivität, die innerhalb einer Woche Lagerung fast vollständig verschwindet, während das über BSA immobilisierte Trypsin innerhalb einer Woche eine gute Lagerstabilität mit nur geringen Abnahmen der Enzymaktivitäten zeigt. Die Lagerung des Trägers bis zum nächsten Einsatz erfolgte in 0,1 M Kaliumphosphat pH 7,6 oder PBS.tables Figures 1 and 2 demonstrate the long term stability of the protease immobilized on polyester nonwoven via BSA Trypsin compared to directly immobilized enzyme. Directly bound Trypsin shows a relatively low activity within a week Storage almost completely disappears while the above BSA immobilized trypsin within a week with only a good shelf life shows small decreases in enzyme activities. The storage of the carrier Until next time Use was in 0.1 M potassium phosphate pH 7.6 or PBS.

Tabelle 1. Abhängigkeit der Aktivität des auf Polyestervlies immobilisierten Typsins von der Immobilisierungsart: Immobilisierung erfolgt entweder direkt oder über BSA. Die Trypsin-Aktivität wurde über die Umsetzung des Substrats N-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) bestimmt: A) Enzymaktivität direkt nach der Immobilisierung; B) Enzymaktivität nach Lagerung in 0,1 M Kaliumposphat pH 7,5 bei 4°C über eine Woche.

Table 1. Dependence of activity of type immobilized on polyester nonwoven on immobilization type: Immobilization is carried out either directly or via BSA. The trypsin activity was determined by the reaction of the substrate N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA): A) enzyme activity immediately after immobilization; B) Enzyme activity after storage in 0.1 M potassium phosphate pH 7.5 at 4 ° C for one week.

Für einen Einsatz der immobilisierten Enzyme in technischen Prozessen ist wichtig, dass diese ihre Aktivität auch nach wiederholten Einsätzen beibehalten. Um solche Einsätze zu simulieren, wurde ein 1 cm² großes mit Trypsin beladenes Vliesstück mit 0,1 M Kaliumphosphat pH 7,5 dreimal gewaschen, wobei die Aktivität des Trypsins durch die Umsetzung des Substrats BAPNA nach den Waschvorgängen jeweils neu bestimmt wurde. Die direkt nach dem Herstellungsprozess gemessene Aktivität diente als Referenz für 100 %. Die Enzymaktivität wurde in jeweils zehn Versuchen wiederholt gemessen und im Verhältnis zur anfänglich gemessenen Aktivität berechnet. Die Daten zur Enzymaktivität nach wiederholten Einsätzen zeigen deutlich, dass selbst nach mehrfachen Waschvorgängen die gemessene Aktivität erhalten bleibt (Tabelle 2).For use of the immobilized enzymes in technical processes is important that they retain their activity even after repeated use. To simulate such operations, a 1 cm ² trypsin-loaded nonwoven piece was washed three times with 0.1 M potassium phosphate pH 7.5, the activity of the trypsin being respectively re-determined by the reaction of the substrate BAPNA after the washes. The activity measured directly after the manufacturing process served as a reference for 100%. The enzyme activity was measured repeatedly in ten experiments and calculated in relation to the initially measured activity. The enzyme activity data after repeated missions clearly show that even after multiple washes the measured activity is maintained (Table 2).

Behandlung einer Oberfläche mit einem Träger mit darauf immobilisierter LipaseTreatment of a surface with a carrier with lipase immobilized thereon

Lipase verträgt apolare Umgebungseinflüsse, so dass für dieses Enzym eine Zwischenschaltung von BSA als Spacer zwischen Enzym und Oberfläche nicht erforderlich ist. Aus diesem Grund wurde das Enzym direkt auf einem aktivierten Vlies immobilisiert. Zur Prüfung der Enzymaktivität wurde auf eine Folie Olivenöl aufgebracht und in Kontakt mit dem Vlies gebracht. Nach zweistündiger Lagerung bei Raumtemperatur wurde das Vlies abgezogen. Die durch die enzymatische Wirkung freigesetzten Fettsäuren lassen sich mit Kupferacetat-Pyridin-Reagenz nachweisen. Nur in Gegenwart von freien Fettsäuren wird die typische grüne Verfärbung erhalten. Diese wurde nur in dem Bereich der Folie beobachtet, die mit dem Lipase-beladenem Vlies in Kontakt kam. In einer Kontrollreaktion wurde das Olivenöl mit einem Vlies ohne immobilisiertes Enzym behandelt. Eine Farbänderung der Kupferlösung konnte nicht beobachtet werden, die Oberfläche blieb blau.lipase withstand apolar environmental influences, so for this enzyme involves an interposition of BSA as a spacer between Enzyme and surface is not required. Because of this, the enzyme became direct immobilized on an activated nonwoven. To check the enzyme activity was applied to a slide of olive oil and brought into contact with the fleece. After two hours of storage at room temperature, the web was peeled off. Which by the enzymatic Effect of released fatty acids can be detected with copper acetate-pyridine reagent. Only in Presence of free fatty acids becomes the typical green discoloration receive. This was observed only in the area of the film which came in contact with the lipase-loaded web. In a control reaction became the olive oil treated with a nonwoven without immobilized enzyme. A color change the copper solution could not be observed, the surface remained blue.

Tabelle 2: Enzymaktivität des über BSA immobilisierten Trypsins bei mehrmaliger Verwendung.

Table 2: Enzyme activity of BSA-immobilized trypsin with repeated use.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr sind viele Abwandlungen möglich, die durch Fachleute erzielbar sind, und damit im Bereich dieser Erfindung eingeschlossen sind.The The present invention is not limited to the described embodiments limited. Rather, many modifications are possible by professionals are achievable, and thus included within the scope of this invention are.

Literaturliterature

Nouaimi, M., Möschel, K., Bisswanger, H. (2001) Immobilization of trypsin on polyester fleece via different spacers. Enzyme Microbial Techn. 29, 567-574
Moeschel, K., Nouaimi, M., Steinbrenner, C. Bisswanger, H. (2003) Immobilization of thermolysin to polyamide non-woven materials. Biotechnol Bioeng. 82.190-199.

Claims

Carrier with immobilized enzymes for the gentle treatment of surfaces by enzymatic reaction, characterized in that the enzymes are irreversibly immobilized on the carrier and the carrier is reusable several times.

carrier according to claim 1, characterized in that the enzymes on the carrier their activity when stored in liquid at a temperature between 0 ° C and 8 ° C over at least a week or air-dried at room temperature over at least keep at least 90% for one month.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that it is manufactured or manufacturable by a process that following steps include: a. If necessary, etching the Support surface; b. Partial hydrolysis of the carrier surface; c. Activation of functional groups on the support surface; d. Possibly Attachment of Spacer Molecules to the carrier surface; e. Coupling of the enzymes to the carrier surface by means of a bifunctional compound.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that to the etching the carrier surface a Calcium chloride solution in watery Methanol is used.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that partial hydrolysis of the support surface by alkaline or acid treatment he follows.

Carrier according to one of the preceding claims, characterized in that the activation of Carboxy groups with N-hydroxysuccinimide and N, N'-dicylclohexylcarbodiimide in dioxane takes place.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that activation of amino groups with glutaraldehyde or by a diazotization with nitrous acid takes place.

carrier according to one of the preceding claims, characterized the bifunctional compound is glutaraldehyde.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the enzymes on the support via spacers, preferably over Protein spacers, in particular via Bovine serum albumin, coupled to the support surface are.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that as a carrier material synthetic polymeric nonwovens, in particular of polyamide or polyester used become.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that as a carrier material blended fabric or natural Polymers, in particular cellulose or paper, are used.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the carrier form of Manufacturer prefabricated or defined by the user.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the enzyme density on the carrier is variable and according to the desired Speed of the enzymatic reaction is adjusted.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the enzymes are on the carrier hydrolytic enzymes, in particular proteases, lipases, amylases, Cellulases, dextranases, RNases, DNases, hyaluronidases, elastases, Ureases or bacteriolytic enzymes.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the enzymes are on the carrier Oxidases, reductases, superoxide dismutases or peroxidases are.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the enzymes are on the carrier belong to one or at least two different varieties.

carrier according to one of the preceding claims, characterized that the treatment involves a cleaning, a disinfection, a coloring or another enzymatic reaction is.

Process for the gentle treatment of a surface with a carrier according to one of the preceding claims, characterized by the following steps: a. Humidification of the carrier and / or the surface to be treated with a suitable liquid, preferably with water; b. Placing the carrier on the surface; c. Removal of the carrier from the surface after expiration of a for the enzymatic reaction necessary time; d. Possibly a conditioner the surface with a suitable liquid, preferably with water.

Method for multiple reuse of a carrier according to one of the preceding claims, characterized in that the carrier according to one or more inserts with a suitable liquid, especially with aqueous buffered solution with high salt concentration or with dilute ethanolic solution becomes.

Method for multiple reuse of a carrier according to one of the preceding claims, characterized in that the carrier between the inserts in neutral aqueous buffered solution at a temperature between 0 ° C and 8 ° C is kept.

Method for multiple reuse of a carrier according to one of the preceding claims, characterized in that the carrier between the inserts with washed deionized water, air dried at room temperature and at a temperature below 25 ° C is kept.

Use of a carrier according to claims 1 to 17 and a method according to 18 bis 21 for the cleaning of areas of skin, paintings, documents, electronic Circuit boards or other sensitive surfaces, for wound treatment, for coloring of surfaces or other superficial enzymatic Transformations.