DE10351543A1 - Optimizing detection of prions including a pathological form in body fluid or homogenized tissue, precipitates prion protein which is made visible by addition of dye bonded to substrate - Google Patents

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Abstract

The prion protein PrP is precipitated from a sample of the body fluid or of the homogenized tissue and is made visible by addition of a dye bonded to a substrate : The dye substrate is a pectin, e.g. an amylopectin. The prion protein is made visible by formation of a correspondingly-colored pellet on the base of the reaction vessel by centrifugation in the presence of the dye-marked substrate. The PrP rendered visible, is then investigated for the existence of the pathological form PrPSc, in an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), a western blot, a conformation dependent immunoassay (CDI) or another prion detection method.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Optimierung der Detektion von Prionen in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebehomogenat humanen oder tierischen Ursprungs, die ein Prionprotein (PrP) enthält, das eine erste, nicht pathologische Form PrPc und eine pathologische Form, PrPSc genannt, umfasst.The invention relates to a method for optimizing the detection of prions in a body fluid or a tissue homogenate of human or animal origin containing a prion protein (PrP) comprising a first non-pathological form PrP c and a pathological form called PrP Sc .

Prionenerkrankungen wie die Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung (CJD) können sowohl durch vererbte genetische Defekte entstehen als auch über noch nicht vollständig verstandene Infektionswege erworben werden. Darüber hinaus treten sie auch als spontane, sogenannte sporadische Formen auf, für die eine somatische Mutation im Gen für das Prionenprotein postuliert wird (Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 13363–13383 (1998)). Iatrogene Infektionswege entstehen zum Beispiel durch Behandlung mit prionen-verseuchten Wachstumshormonen, Geschlechtshormonen oder Hornhaut- und Hirnhauttransplantaten. Auch die Verwendung von nicht ausreichend sterilisiertem chirurgischem Material stellt eine mögliche Infektionsquelle dar.prion diseases like the Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) can be both inherited genetic defects arise as well as not yet fully understood Acquired infection routes. In addition, they also occur as spontaneous, so-called sporadic forms, for the one somatic mutation in the gene for the prion protein is postulated (Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 13363-13383 (1998)). Iatrogenic infection pathways arise, for example, through treatment with prion-infected growth hormones, sex hormones or Corneal and meningeal transplants. Even the use of not sufficiently sterilized surgical material presents a potential source of infection represents.

Die 33 bis 35 kD großen Prionenproteine (abgekürzt PrP) kommen in einer natürlichen physiologischen Isoform (PrPc) sowie in einer pathologisch infektiösen Isoform (PrPSc) vor, wobei die infektiöse Isoform durch eine Umfaltung der Sekundär- und Tertiärstruktur aus der nichtinfektiösen physiologischen Form entsteht. Das PrPSc ist höchstwahrscheinlich die einzige stoffliche Komponente der Prionen, die für die Transmission und die Pathogenese der Prionenerkrankungen benötigt wird (Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 13363–13383 (1998)).The 33 to 35 kD prion proteins (abbreviated PrP) occur in a natural physiological isoform (PrP c ) and in a pathologically infectious isoform (PrP Sc ), wherein the infectious isoform by a refolding of the secondary and tertiary structure of the non-infectious physiological form arises. The PrP Sc is most likely the only material component of the prions needed for the transmission and pathogenesis of prion diseases (Prusiner, Proc Natl Acad Sci., USA, 95, 13363-13383 (1998)).

Aus Prusiner et al., Cell 38, 127 (1984) sowie Biochemistry 21, 6942 (1982) ist es bereits bekannt, dass Prionenproteine einer partiellen Proteolyse zugänglich sind. In der Folgezeit hat es sich gezeigt, dass PrPc nahezu vollständig einer Proteolyse zugänglich ist, wohingegen PrPSc sich lediglich bis zu einer Größe von 27 bis 30 kD abbauen lässt. Diese einer weiteren Proteolyse nicht zugängliche Proteinform wird als ein gegen Protease beständiger Kern, kurz PrP27–30, bezeichnet. Sie entsteht durch Abbau von ca. 67 Aminosäuren am NH2-Terminus und besteht selbst aus ca. 141 Aminosäuren.It is already known from Prusiner et al., Cell 38, 127 (1984) and Biochemistry 21, 6942 (1982), that prion proteins are susceptible to partial proteolysis. In the following years it has been shown that PrP c is almost completely accessible to proteolysis, whereas PrP Sc can only be degraded to a size of 27 to 30 kD. This protein form, which is not accessible to further proteolysis, is referred to as a protease-resistant core, or PrP 27-30 for short. It is produced by breaking down about 67 amino acids in the NH 2 -terminus and consists of about 141 amino acids.

Einige Verfahren zum Nachweis der pathologischen Prionen-Isoformen sind bereits bekannt. So beschreiben beispielsweise Barry und Prusiner J. Infect. Dis. 154, 518-521 (1986) einen Westernblot-Test unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Prionenprotein Antikörpers (MAK) 13A5. Dieser Hamster-PrP spezifische MAK wurde in Mäusen gewonnen, die mit gereinigtem, denaturiertem PrP27–30, isoliert aus Scrapie-infizierten Hamstern, immunisiert worden waren.Some methods for detecting the pathological prion isoforms are already known. For example, Barry and Prusiner J. Infect. Dis. 154, 518-521 (1986), a Western blot assay using an anti-prion protein monoclonal antibody (MAb) 13A5. This hamster PrP specific MAb was obtained in mice immunized with purified, denatured PrP 27-30 isolated from scrapie-infected hamsters.

Andere Antikörper, die wie der MAK 13A5 sowohl gegen PrPc als auch gegen PrPSc, sofern dieses denaturiert vorliegt, gerichtet sind, sind aus dem US Patent 4806627 bekannt. Des weiteren sind Immunisierungen mit rekombinanten Prionenproteinen, welche in Bakterien exprimiert worden waren, durchgeführt worden, so beschrieben in Zanusso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 95, 8812–8816 (1998). Ebenso gelang die Herstellung monoklonaler Antikörper mittels Peptidimmunisierung, so beschrieben in Harmeyer et al., J. Gen. Virology, 79, 937–945 (1998) und mittels Nukleinsäure-Immunisierung, wie in Krasemann et al., J. Biotechnology, 73, 119–129 (1999) erläutert.Other antibodies, such as MAK 13A5, directed against both PrP c and PrP Sc , if denatured, are known from US Patent 4,806,627. Furthermore, immunizations with recombinant prion proteins expressed in bacteria have been performed as described in Zanusso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8812-8816 (1998). Likewise, the production of monoclonal antibodies by means of peptide immunization, described in Harmeyer et al., J. Gen. Virology, 79, 937-945 (1998) and by nucleic acid immunization as described in Krasemann et al., J. Biotechnology, 73, 119-129 (1999).

Eine weitere Anwendung dieser Antikörper neben dem Western Blot wurde in dem US Patent 4806627 erwähnt, nämlich ein so genannter ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). In diesem ELISA wurden Prionen, welche auf einer Mikrotiter-Platte fixiert waren, von dem MAK 3F4 gebunden und dieser dann mittels eines Zweitantikörpers, der über ein an ihm gekoppeltes Enzym eine Farbstoffreaktion katalysiert, detektiert.A further use of these antibodies in addition The Western Blot was mentioned in US patent 4806627, namely so-called ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). In this ELISA For example, prions fixed on a microtiter plate were from MAK 3F4 and this then by means of a secondary antibody, which has a enzyme coupled to it catalyzes a dye reaction.

In all diesen Nachweisverfahren wird die Probe mit dem Enzym Proteinase K vorbehandelt, um in der Probe befindliches, normales Prionenprotein zu entfernen und somit den alleinigen Nachweis des Protease-resistenten, pathogenen Prionenproteins zu gewährleisten, da ja die Antikörper auch das normale Prionenprotein mit hoher Affinität binden können.In All this detection method is the sample with the enzyme proteinase K pretreated to normal prion protein present in the sample and thus the sole detection of the protease-resistant, To ensure pathogenic prion protein, since the antibodies also can bind the normal prion protein with high affinity.

Schließlich ist auch schon aus der internationalen Patentanmeldung WO 98/37411 ein Nachweisverfahren bekannt, mit dem der Nachweis der pathogenen Konformation des Prionenproteins in einer Probe möglich ist. Die Probe wird dabei in zwei Portionen aufgeteilt und die erste Portion an einen festen Träger gebunden und dann mit einem markierten Antikörper kontaktiert. Dieser Antikörper bindet an die nicht-pathogene Form des Prionenproteins mit höherer Affinität als an die nicht denaturierte, pathogene Form des Proteins. Die zweite Portion der Probe wird dann einer Behandlung unterzogen, durch die sich die Konformation des pathogenen Prionenproteins ändert und dadurch sich die Zugänglichkeit und damit die Affinität für den markierten Antikörper drastisch erhöht. Die so behandelte zweite Probe wird dann mit einem zweiten Träger in Berührung gebracht und mit einem markierten Antikörper umgesetzt. Dann werden die Mengen des in der ersten und in der zweiten Portion gebundenen markierten Antikörpers gemessen und miteinander verglichen. Der Unterschied zwischen beiden Messergebnissen zeigt an, ob die pathogene Form des Prionenproteins in der Probe vorhanden war. Dieses Nachweisverfahren wird konformationsabhängiger Immunoassay genannt, im Englischen mit der Abkürzung CDI für conformation-dependent Immunoassay versehen. Die Empfindlichkeit des CDIs lässt sich erhöhen, wenn die Probe einer Vorbehandlung mit einem proteolytischen Enzym, beispielsweise der Proteinase K oder der Dispase unterworfen wird. Durch die Behandlung mit Proteasen werden PrPc und nichtrelevante Proteine in der Probe zerstört und das Protease-resistente PrP27–30 bleibt in der Probe übrig.Finally, from the international patent application WO 98/37411 a detection method is known with which the detection of the pathogenic conformation of the prion protein in a sample is possible. The sample is divided into two portions and the first portion is bound to a solid support and then contacted with a labeled antibody. This antibody binds to the non-pathogenic form of the prion protein with higher affinity than to the undenatured, pathogenic form of the protein. The second portion of the sample is then subjected to a treatment which alters the conformation of the pathogenic prion protein and thereby drastically increases the accessibility and thus the affinity for the labeled antibody. The second sample thus treated is then contacted with a second carrier and reacted with a labeled antibody. Then, the amounts of the labeled antibody bound in the first and second portions are measured and compared with each other. The difference between the two measurement results indicates whether the pathogenic form of the prion protein was present in the sample. This detection method is called conformation-dependent immunoassay, in English with the abbreviation CDI for conformation-dependent immunoassay provided. The sensitivity of the CDI can be increased if the sample is subjected to a pretreatment with a proteolytic enzyme, for example proteinase K or dispase. Treatment with proteases destroys PrP c and non-relevant proteins in the sample and leaves the protease-resistant PrP 27-30 in the sample.

Die Untersuchung auf Anwesenheit des pathogenen Prionenproteins erfordert sehr empfindliche und spezifische Nachweissysteme, die sich auch für die Automatisierung eignen. Erschwert wird der Nachweis dadurch, dass die physiologischen Grundlagen für die pathologische Wirkung von Prionen noch nicht bekannt sind. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Nachweissysteme ist es erforderlich, die in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Prionen anzureichern. Dazu eignet sich ihre Ausfällung unter Zusatz eines Fällungsreagenzes wie NaCl oder Phosphorwolframsäure (PTA). Hierbei entstehen Pellets, die zwar abzentrifugiert werden können, aber sehr klein und nahezu unsichtbar ist. Zudem schwimmen sie zum Teil sehr leicht auf, was zu Verlusten führen kann. Gesucht wurde deshalb ein Reagenz, welches die Fällung und den sich anschließenden Prionennachweis nicht negativ beeinflusst und gleichzeitig das Pellet sichtbar macht.The Requires investigation for the presence of the pathogenic prion protein very sensitive and specific detection systems that are also suitable for automation suitable. The proof is complicated by the fact that the physiological Basics for the pathological effects of prions are not yet known. to increase Sensitivity of the detection systems requires that in to enrich the prion to be examined. To their precipitation is suitable under Addition of a precipitating reagent such as NaCl or phosphotungstic acid (PTA). This produces pellets, which are indeed centrifuged off can, but very small and almost invisible. In addition, they swim to Part very easily, which can lead to losses. So we searched a reagent which precipitates and the subsequent Prionennachweis does not adversely affect and at the same time make the pellet visible.

Es wurde nun ein Verfahren zur Optimierung der Detektion von Prionen in einer Körperflüssigkeit bzw. Gewebehomogenaten humanen oder tierischen Ursprunges gefunden, welche PrP enthalten, das eine erste, nicht-pathologische Form PrPc und eine zweite pathologische Form, PrPSc genannt, umfasst, bei dem das Prionenprotein PrP aus einer Probe der Körperflüssigkeit oder des Gewebehomogenates ausgefällt und das Präzipitat durch Zugabe eines an einen Träger gebundenen Farbstoffes, der mit dem Prionenprotein kopräzipitiert, sichtbar gemacht wird. Hierbei kann als Träger für den Farbstoff ein im Probenpuffer unlösliches Polymer natürlichen oder synthetischen Ursprungs, z.B. ein Pektin, vorzugsweise ein Amylopektin, eingesetzt werden.We have now discovered a method for optimizing the detection of prions in a body fluid or tissue homogenates of human or animal origin containing PrP comprising a first non-pathological form PrP c and a second pathological form called PrP Sc The prion protein PrP is precipitated from a sample of body fluid or tissue homogenate and the precipitate is visualized by the addition of a carrier-bound dye co-precipitated with the prion protein. In this case, the carrier used for the dye can be a polymer insoluble in the sample buffer of natural or synthetic origin, for example a pectin, preferably an amylopectin.

Das Prionenprotein wird dann in Gegenwart des mit Farbstoff markierten Trägers durch Zentrifugieren und unter Ausbildung eines entsprechend gefärbten Pellets am Boden des Reaktionsgefäßes angereichert und sichtbar gemacht. Die Trennung von Überstand und Pellet lässt sich daher optisch kontrollieren.The Prion protein is then in the presence of the dye labeled carrier by centrifuging and forming a correspondingly colored pellet enriched at the bottom of the reaction vessel and made visible. The separation of supernatant and pellet can be therefore visually check.

Ein hierfür besonders geeignetes Pektin ist ein mit einem Farbstoff markiertes, unlösliches Amylopektin. Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde die unlösliche Form des Amylopektins, welche aus Mais gewonnen wird, verwendet. Dabei wird eine 0,2%-ige Suspension in Wasser angesetzt. Von dieser Suspension werden jedem Fällungsansatz 10 μl zugesetzt. Durch Zentrifugieren des Ansatzes, z.B. in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit einer Tischzentrifuge über einen Zeitraum von 30 min bei etwa 21 000g, entsteht ein blau gefärbtes Pellet, das sich gut gegen den klaren Überstand abhebt. Der Überstand kann dann sicher abgenommen werden. Ohne Zusatz eines an einen Träger gebundenen Farbstoffes ist der entstandene Niederschlag kaum sichtbar und schwimmt beim Abnehmen des Überstandes sehr leicht ab. Das führt dann zu falsch negativen Testergebnissen mit hohen Fehlerraten.One therefor particularly suitable pectin is a dye labeled insoluble Amylopectin. For the inventive method became the insoluble Form of amylopectin, which is derived from corn used. In this case, a 0.2% suspension in water is used. Of this Suspension will be any precipitation approach 10 μl added. By centrifuging the batch, e.g. in a 1.5 ml reaction vessel with a Table centrifuge over a period of 30 minutes at about 21,000g, a blue-colored pellet is formed, that works well against the clear supernatant takes off. The supernatant can then be safely removed. Without the addition of a bound to a carrier Dye, the resulting precipitate is barely visible and floating when removing the supernatant very easy off. Leading then to false negative test results with high error rates.

Ein Vorteil des an einen Träger, wie einem unlöslichen Amylopektin, gebundenen Farbstoffes besteht darin, dass er nicht mit den anderen Bestandteilen des Präzipitats reagiert und auch bei der weiteren Durchführung des Prionennachweises nicht stört.One Advantage of to a wearer, like an insoluble one Amylopectin, bound dye is that he does not reacts with the other constituents of the precipitate and also in the further implementation the prion proof does not bother.

Die erfindungsgemäß eingesetzten, mit einem Farbstoff markierten Trägerstoffe sind ungiftig, leicht handhabbar, auch in Verdünnung stabil (kein Ausbluten), unlöslich in der zu untersuchenden Probe und dem Probenpuffer, gut abzentrifugierbar, als Niederschlag gut sichtbar, bilden einen festen Niederschlag und stören nicht die weiteren Untersuchungen der abzentrifugierten Probe. Das Pellet kann nach der Abtrennung des Überstandes resuspendiert werden und zum Prionennachweis in ELISA, Westernblot, CDI oder anderen Prionennachweisverfahren eingesetzt werden.The used according to the invention, Dyes labeled with a dye are non-toxic, light manageable, also in dilution stable (no bleeding), insoluble in the sample to be examined and the sample buffer, easily centrifuged, as precipitate well visible, form a solid precipitate and disturb not the further investigations of the centrifuged sample. The Pellet can be resuspended after separation of the supernatant and for prion detection in ELISA, Western blot, CDI or others Prion detection method can be used.

Claims (5)

Verfahren zur optimierten Detektion von Prionen in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebehomogenat humanen oder tierischen. Ursprungs enthaltend ein PrP-Protein, das eine erste nicht-pathologische Form PrPc und eine zweite pathologische Form, PrPSc genannt, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Prionenprotein PrP aus einer Probe der Körperflüssigkeit oder des Gewebehomogenates ausgefällt und durch Zugabe eines an einen Träger gebundenen Farbstoffes sichtbar gemacht wird.Method for the optimized detection of prions in a body fluid or a tissue homogenate human or animal. Containing a PrP protein comprising a first non-pathological form PrP c and a second pathological form called PrP Sc , characterized in that the prion protein PrP is precipitated from a sample of the body fluid or tissue homogenate and added by addition of a to a Carrier bound dye is visualized. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für den Farbstoff ein Pektin ist.Method according to claim 1, characterized in that that the carrier for the Dye is a pectin. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für den Farbstoff ein Amylopektin ist.Process according to claims 1 and 2, characterized in that the carrier for the color is an amylopectin. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Prionenprotein in Gegenwart des mit Farbstoff markierten Trägers durch Zentrifugieren und unter Ausbildung eines entsprechend gefärbten Pellets am Boden des Reaktionsgefäßes sichtbar gemacht wird.Process according to claims 1 to 3, characterized that the prion protein in the presence of the dye-labeled Carrier through Centrifuge and form a suitably colored pellet visible at the bottom of the reaction vessel is done. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das sichtbar gemachte PrP anschließend in einem ELISA, einem Westernblot, einem konformationsabhängigen Immunoassay (CDI) oder einem anderen Prionennachweisverfahren auf das Vorliegen der pathologischen Form PrPSc untersucht wird.Process according to claims 1 to 4, characterized in that the visualized PrP is subsequently examined for the presence of the pathological form PrP Sc in an ELISA, a Western blot, a conformation-dependent immunoassay (CDI) or another prion detection method.
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