DE10335107A1

DE10335107A1 - Preparing nucleic acid reaction mixture for analysis on a microarray comprises binding cDNA to membrane, washing, drying and eluting, synthesizing cRNA and binding to membrane before washing, drying and eluting

Info

Publication number: DE10335107A1
Application number: DE2003135107
Authority: DE
Inventors: Ulrike Lieberwirth
Original assignee: MWG Biotech AG
Current assignee: MWG Biotech AG
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2005-03-03

Abstract

Method for preparation, starting from RNA or mRNA, of a reaction mixture (A) that can be analyzed using a microarray comprises binding cDNA to membrane, washing, drying and eluting, synthesizing cRNA and binding to membrane before washing, drying and eluting. Method for preparation, starting from RNA or mRNA, of a reaction mixture (A) that can be analyzed using a microarray comprises: (a) synthesis of cDNA (I); (b) binding (I) to a membrane filter in presence of binding buffer; (c) washing, drying and eluting adsorbed material into a sample vessel; (d) concentration of the eluate; (e) synthesis of cRNA (II) from the DNA solution; (f) binding (II) to a membrane filter in presence of binding buffer; (g) washing, drying and eluting adsorbed material into a sample vessel; (h) concentration of the eluate; and (i) adjusting the concentration of (II) in solution, then fragmenting it. An independent claim is also included for a device for fully automated performance of the new method.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung eines Reaktionsgemisches für eine nachfolgende Mikroarrayanalyse und eine Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.The The present invention relates to a method of providing a reaction mixture for a subsequent microarray analysis and an apparatus for performing a inventive method.

DNA ist ein Nukleinsäure-Makromolekül, aufgebaut aus aufeinanderfolgenden Basen Adenin (A) und Thymin (T), sowie Guanin (G) und Cytosin (C), wobei A und T und C und G jeweils im Verhältnis 1:1 darin vorkommen. Die Basenpaare A, T und G, C ergänzen einander komplementär. Die Abfolge der einzelnen Basen innerhalb eines DNA-Moleküls stellt einen genetischen Code dar. Der in der DNA von Lebewesen befindliche genetische Code ist die Grundlage der Proteinbiosynthese. Im ersten Schritt zur Proteinbiosynthese wird die Basenfolge eines DNA-Stranges in die komplementäre Basenfolge eines Boten-RNA-Stranges, auch mRNA genannt, umgeschrieben. Eine bestimmte Basenabfolge wird auch als Sequenz bezeichnet. Jedes Gen hat eine andere Sequenz, die Teilsequenzen aufweisen kann, die in vielen Genen vorkommen, aber auch Teilsequenzen, die einzigartig oder charakteristisch für das jeweilige Gen sind. Die Gene sind darum anhand Ihrer charakteristischen Teilsequenzen voneinander unterscheidbar.DNA is a nucleic acid macromolecule from successive bases adenine (A) and thymine (T), as well as Guanine (G) and cytosine (C), where A and T and C and G are each in the relationship 1: 1 occur in it. The base pairs A, T and G, C complement each other complementary. The sequence of individual bases within a DNA molecule provides a genetic code. The genetic substance contained in the DNA of living things Code is the basis of protein biosynthesis. In the first step For protein biosynthesis, the base sequence of a strand of DNA in the complementary one Base sequence of a messenger RNA strand, also called mRNA, rewritten. A particular sequence of bases is also called a sequence. each Gen has a different sequence, which may have partial sequences that occur in many genes, but also partial sequences that are unique or characteristic of the respective gene. The genes are therefore based on their characteristic Partial sequences distinguishable from each other.

RNA bedeutet Ribonukleinsäure. Dabei handelt es sich um ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit der Base Uracil (U) anstelle von Thymin (T). Je drei Basen der Boten-RNA bilden ein Codewort, das in eine bestimmte Aminosäure übersetzt wird. Eine bestimmte Abfolge von aneinandergeketteten Aminosäuren ergibt ein Protein, also einen Eiweißstoff. Durch entsprechende Vorgänge in den Zellen von Lebewesen werden auf diese Weise die für die biochemischen Abläufe im Körper notwendigen Proteine bereitgestellt. RNA weist ebenso wie DNA Sequenzen auf, die charakteristisch für das jeweilige Gen sind.RNA means ribonucleic acid. It is a single-stranded nucleic acid molecule with the Base uracil (U) instead of thymine (T). Three bases of the messenger RNA each form a codeword that translates into a specific amino acid becomes. A particular sequence of chained amino acids results Protein, so a protein. Through appropriate processes in the cells of living things are in this way the for the biochemical procedures in the body provided necessary proteins. RNA has sequences as well as DNA on that characteristic of the respective gene.

Die Gesamtheit von Genen eines Lebewesens bezeichnet man als dessen Genom, die Gesamtheit von Eiweißstoffen eines Lebewesens als dessen Proteom. Während das Genom einiger Lebewesen bereits entschlüsselt ist, und die Entschlüsselung weiterer Genome zur Routine wird, stellt die Untersuchung der jeweiligen Proteome eine große Herausforderung dar. Ein Grund dafür ist, dass die Zusammensetzung des Proteoms eines Lebewesens variieren kann. Wie ein Proteom zusammengesetzt ist, hängt unter anderem davon ab, ob und wie viel einer bestimmten mRNA erzeugt wird.The The totality of genes of a living being is called his Genome, the totality of proteins of a living being as its proteome. While the genome of some living things already decrypted is, and the decryption Further genomes will become routine, the study of the respective Proteome a big one Challenge. One reason is that the composition of the proteome of a living being can vary. Like a proteome put together is, hangs among other things, whether and how much of a particular mRNA is generated becomes.

Die Erzeugung von mRNA innerhalb einer Zelle oder eines Lebewesens bezeichnet man auch als Genexpression, das heißt als einen Vorgang, bei dem Gene exprimiert werden. Dabei können verschiedene Gene in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Parametern gar nicht, in nicht nachweisbarer Menge, oder aber in unterschiedlich hoher Konzentration exprimiert werden.The Generation of mRNA within a cell or a living organism also called gene expression, that is, as a process in which Genes are expressed. It can different genes depending from a variety of parameters not at all, in undetectable Quantity, or expressed in different high concentrations become.

Einen Überblick über den Expressionsgrad bestimmter Gene bezeichnet man als Expressionsmuster dieser Gene oder als Genexpressionsmuster. Aus der Analyse derartiger Muster unter Berücksichtigung der jeweils vorherrschenden Parameter erhofft man sich, Erkenntnisse über das Proteom eines Organismus zu gewinnen. Zu diesem Zweck müssen eine Vielzahl von Genexpressionmustern ermittelt und analysiert werden. Hierzu bedient man sich moderner analytischer Methoden, vorzugsweise solcher Methoden, mit denen eine Vielzahl von Einzelanalysen gleichzeitig durchgeführt werden können.An overview of the Expression level of certain genes is called the expression pattern of these Gene or gene expression pattern. From the analysis of such patterns considering the prevailing parameter is expected to be, knowledge about the To gain a proteome of an organism. For this purpose, a must Variety of gene expression patterns are detected and analyzed. For this one uses modern analytical methods, preferably such Methods that allow a variety of single analyzes simultaneously carried out can be.

Eine zunehmend wichtige Methode ist die Untersuchung von Nukleinsäuren mit Mikroarrays. Auf Mikroarrays sind Sondenmoleküle in geordneten Rastern von Messpunkten auf einer Oberfläche angeordnet. Die Sondenmoleküle bestehen aus Nukleinsäuren, zum Beispiel synthetischen DNA-Abschnitten, die mittels Amplifikation ausgehend von natürlichen Nukleinsäuren hergestellt wurden, oder aber aus synthetisch hergestellten Oligonukleotiden, die nicht mittels PCR erzeugt wurden. Sie weisen bestimmte Sondensequenzen auf, die zu Zielsequenzen komplementär sind. Die Zielsequenzen entsprechen charakteristischen Teilsequenzen von Genen, anhand derer man die Gene voneinander unterscheidet. Durch Hybridisierung von Zielsequenzen mit dazu komplementären Sondensequenzen erhält man nachweisbare Hybridmoleküle. Sind solche Moleküle in einem Messpunkt nachweisbar, so ist dies ein Hinweis auf das Vorhandensein des Moleküls, zu dessen Zielsequenz Sondensequenzen innerhalb eines Messpunktes komplementär sind.A increasingly important method is the study of nucleic acids with Microarrays. On microarrays, probe molecules are in ordered grids of Measuring points on a surface arranged. The probe molecules consist of nucleic acids, for example, synthetic DNA sections by amplification starting from natural nucleic acids or from synthetically produced oligonucleotides, that were not generated by PCR. They have certain probe sequences which are complementary to target sequences. The target sequences correspond characteristic partial sequences of genes by means of which the Genes are different from each other. By hybridization of target sequences with complementary ones Receives probe sequences detectable hybrid molecules. Are such molecules detectable in one measuring point, this is an indication of this Presence of the molecule, to its target sequence probe sequences within a measurement point complementary are.

Durch die Vielzahl unterschiedlicher Messpunkte auf einem Mikroarray kann eine entsprechende Vielzahl unterschiedlicher Gene beziehungsweise deren Exprimierung von einer identischen Probe zeitgleich untersucht werden. Durch die Parallelisierung von Analyseschritten auf einem Mikroarray kann der Probendurchsatz erhöht werden, und unterschiedliche Proben werden unter gleichen Bedingungen nachgewiesen.By the multitude of different measuring points on a microarray can a corresponding variety of different genes or examining their expression from an identical sample at the same time become. By the parallelization of analysis steps on one Microarray, the sample throughput can be increased, and different Samples are detected under the same conditions.

Um die Expression von mRNA, bzw. von RNA in Zellen bzw. biologischem Ausgangsmaterial mittels eines Mikroarrays zu ermitteln, wird bei geringen Ausgangsmengen an RNA diese üblicherweise zunächst in cDNA umgewandelt, welche aufgereinigt wird.Around the expression of mRNA, or of RNA in cells or biological Starting material is determined by means of a microarray is at small starting amounts of RNA usually this first in cDNA converted, which is purified.

Nach Aufreinigung und Aufkonzentrierung wird aus der cDNA eine cRNA generiert. Diese kann biotinyliert sein, um einen Farbstoff mittels Streptavidin-Biotin-Kopplung an die cRNA binden zu können. Ein weiteres Verfahren, mit dem die Bindung von Farbstoffen beziehungsweise Markierungsagenzien an cRNA ermöglicht wird, ist das Vorsehen von Aminoallylgruppen, die bei der Herstellung von cRNA darin eingebaut werden. Schließlich kann alternativ die cRNA-Synthese auch unter Einsatz modifizierter Nukleotide erfolgen, welche Reste tragen, die durch Fluoreszenzmessung nachgewiesen werden können. Das mit Biotin- oder Aminoallylgruppen, bzw. mit mo difizierten Nukleotiden versehene Syntheseprodukt wird gereinigt und auf eine bestimmte Konzentration eingestellt.To Purification and concentration, a cRNA is generated from the cDNA. This may be biotinylated to a dye by streptavidin-biotin coupling to be able to bind to the cRNA. Another method by which the binding of dyes, respectively Labeling agents to cRNA allows is the provision of aminoallyl groups in the production of cRNA are incorporated therein. Finally, alternatively, the cRNA synthesis also be carried out using modified nucleotides, which residues carry, which can be detected by fluorescence measurement. The with biotin or aminoallyl groups, or with mo modified nucleotides provided synthesis product is purified and to a specific Concentration set.

Die resultierenden cRNA-Lösungen werden einer Fragmentierung unterworfen, um cRNA-Abschnitte zu erhalten, die eine für die Durchführung von Mikroarray-Hybridisierungs-Experimenten geeignete Länge aufweisen.The resulting cRNA solutions are subjected to fragmentation to obtain cRNA sections, the one for the implementation of microarray hybridization experiments suitable length exhibit.

Derartige Verfahren sind Stand der Technik, wobei es keine Probleme darstellt, die cDNA- oder die cRNA-Synthese zu automatisieren.such Methods are the state of the art, where there is no problem to automate the cDNA or cRNA synthesis.

Problematisch für eine Automatisierung stellt sich allerdings die Reinigung der Syntheseprodukte cDNA und cRNA dar.Problematic for one Automation, however, is the purification of the synthesis products cDNA and cRNA.

Diese erfolgt nach dem Stand der Technik mit sogenannten Spin-columns. Dabei werden Probengefäße, deren Boden eine Membran aufweist, mit dem jeweiligen Reaktionsproduktgemisch befüllt und zentrifugiert. Während das gewünschte Produkt an der Membran adsorbiert wird, bleiben unerwünschte Nebenprodukte und Reaktionslösung in Lösung und werden verworfen. Nach entsprechendem Waschen des an die Membran adsorbierten Reaktionsproduktes wird das Reaktionsprodukt anschließend aus der Membran eluiert, wobei eine bestimmte Lösungsmittelmenge verwendet wird, um eine bestimmte Endkonzentration zu erhalten. Diese Schritte sind bisher nicht automatisiert, bzw. eine Automatisierung derartiger Schritte stellt sich als sehr aufwendig dar, weil die Proben in eine Vorrichtung zum Zentrifugieren eingebracht werden müssen. Dieser Schritt erfolgt daher bisher manuell. Das ist für die Hochdurchsatzanalytik von RNA ein wesentlicher Engpass. Für die Untersuchung von Expressionsmustern, die zur Aufklärung der Vorgänge in Zellen wesentlich ist, ist das Verfahren nach dem Stand der Technik im Hochdursatzverfahren darum denkbar ungeeignet. Eine Automatisierung, stellt sich wegen der Zentrifugation jedenfalls als umständlich und sehr wahrscheinlich störanfällig dar.These takes place according to the prior art with so-called spin-columns. Thereby sample vessels, whose Soil has a membrane, with the respective reaction product mixture filled and centrifuged. While the wished Product adsorbed on the membrane, remain unwanted by-products and reaction solution in solution and are discarded. After appropriate washing to the membrane adsorbed reaction product, the reaction product is then from eluted the membrane, using a certain amount of solvent is to get a certain final concentration. These steps are not yet automated, or an automation of such Steps turns out to be very costly because the samples in a device for centrifuging must be introduced. This step So far, it is done manually. That's for high-throughput analytics RNA is a major bottleneck. For the study of expression patterns, the enlightenment the processes in cells is essential, the method is the prior art in Hochdursatzverfahren therefore conceivably unsuitable. An automation, In any case, because of the centrifugation turns out to be cumbersome and very likely to be susceptible to interference.

Ein weiteres Verfahren zur Reinigung des oben angeführten Syntheseproduktes cDNA stellt die Extraktion mit Phenol/Chloroform mit nachfolgendem Ausfällen der Produkte dar. Dabei werden die Verunreinigungen denaturiert und sammeln sich in der organischen Phase oder in der Grenzschicht zwischen den beiden Phasen an. Die DNA verbleibt in der wässrigen Lösung und wird anschließend mit Ethanol und Ammoniumacetat ausgefällt. Diese Vorgehensweise ist schwer automatisierbar, da hierbei Zentrifugationsschritte notwendig sind und außerdem zwei Phasen getrennt werden müssen. Das ausgefällte und gewaschene Produkt wird anschließend in einer definierten Menge Lösungsmittel aufgenommen, wodurch man zu Lösungen gelangt, in denen das Produkt in einer Konzentration in einem bestimmten Konzentrationsbereich vorhanden ist.One Another method for purifying the above-mentioned synthesis product cDNA provides the extraction with phenol / chloroform with subsequent precipitation of the In this case, the impurities are denatured and accumulate in the organic phase or in the boundary layer between the two phases. The DNA remains in the aqueous solution and is subsequently mixed with Ethanol and ammonium acetate precipitated. This procedure is difficult to automate, since in this case centrifugation steps necessary are and besides two phases must be separated. The precipitated and washed product is then in a defined amount solvent taken up, which leads to solutions in which the product is concentrated in one particular concentration Concentration range is present.

Aus dem QIAquick 96 PCR Purification Kit Protocol (abgedruckt in QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook 03/2001, 19–21) ist es bekannt, PCR-Produkte unter Zuhilfenahme einer Vakuum- bzw. Unterdruckvorrichtung aufzureinigen. Dabei wird das PCR-Produkt mit einem Puffer PM versetzt, durchmischt und in Vertiefungen einer speziellen Mikrotiterplatte eingebracht, deren Böden eine durchlässige Membran darstellen, an die ein Vakuum angelegt werden kann. Der Puffer bewirkt, dass das PCR-Produkt an die Membran der jeweiligen Vertiefung der Mikrotiterplatte adsorbiert wird. Nach Waschen und Trocknen der Membran im Vakuum wird das Filtrat verworfen und das Adsorbat mittels eines Puffers EB (10 mM Tris·Cl) in Probengefäße eluiert.Out the QIAquick 96 PCR Purification Kit Protocol (reprinted in QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook 03/2001, 19-21) it is known PCR products purify with the help of a vacuum or vacuum device. The PCR product is mixed with a buffer PM, mixed and placed in wells of a special microtiter plate, their soils a permeable one Represent membrane to which a vacuum can be applied. Of the Buffer causes the PCR product to the membrane of the respective Well of the microtiter plate is adsorbed. After washing and Drying of the membrane in vacuo, the filtrate is discarded and the Adsorbate eluted by means of a buffer EB (10 mM Tris · Cl) in sample vessels.

Ein ähnliches Protokoll (RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup, RNeasy 96 Handbook 01/2002) beschreibt die Reinigung von RNA. Als erster Puffer fungiert ein Puffer RLT mit Ethanol. Nach Filtration im Vakuum werden die Filtrate verworfen. Anschließend kann ein DNase-Verdau stattfinden. Vor Eluierung muss die Membran vollständig getrocknet werden, um frei von Ethanol zu sein, wozu ein 10-minütiges Vakuum angelegt wird. Die Eluierung erfolgt mit RNase-freiem Wasser, wobei mehrere Elutionsschritte vorzunehmen sind, um die Ausbeute an adsorbierter RNA zu erhöhen. Die Flüssigkeitsmenge hängt dabei von der zu eluierenden Menge und der Größe der Filtermembran ab.A similar protocol (RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup, RNeasy 96 Handbook 01/2002) describes the purification of RNA. The first buffer is a buffer RLT with ethanol. After filtration in vacuo, the filtrates are discarded. Subsequently, a DNase digestion can take place. Before elution, the membrane must be completely dried to be free of ethanol, for which a 10 minute vacuum is applied. The elution is carried out with RNase-free water, whereby several elution steps are to be carried out in order to increase the yield of adsorbed RNA. The amount of liquid depends on the one to be eluted Quantity and the size of the filter membrane.

Die Vakuumverfahren haben den Nachteil, dass durch die Anwendung von Unterdruck ein Teil des Produkts verloren gehen kann, indem es durch die jeweilige Membran hindurchgezogen wird, wenn es nicht vollständig mittels Adsorption an die Membran gebunden ist. Bei der nachfolgenden Elution wird ein Teil der Probe auch nicht wieder von der Membran gelöst. Nach Elution ist man mit unterschiedlich konzentrierten Proben konfrontiert, die erheblich verdünnt sein können. Für die nachfolgende Fragmentierung muss die Ausgangskonzentration an cRNA zumindest 0,6 μg/μl betragen. Um vergleichbare Ergebnisse bei der Analyse auf Mikroarrays zu erhalten, muss außerdem eine genau definierte Menge an cRNA eingesetzt werden. Manche Experimente lassen sich gar nicht oder nur sehr schwer durchführen, weil die Verdünnung der eluierten Proben zu groß ist. Eine Weiterverarbeitung derartiger Proben erscheint dann sinnlos, beziehungsweise sehr aufwändig, zumal wenn die erhaltenen Produktlösungen Zwischenprodukte darstellen.The Vacuum processes have the disadvantage that through the application of Vacuum a part of the product can be lost by passing it through the respective membrane is pulled through, if it is not completely by means of Adsorption is bound to the membrane. In the subsequent elution a part of the sample is not released from the membrane again. To Elution is confronted with differently concentrated samples, which dilutes considerably could be. For the subsequent fragmentation must be the initial concentration of cRNA at least 0.6 μg / μl. To get comparable results when analyzing on microarrays, must also a well-defined amount of cRNA can be used. Some experiments can not be performed at all or only with great difficulty because the dilution the eluted sample is too large. Further processing of such samples then seems pointless or very expensive, especially when the product solutions obtained represent intermediates.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren, mit dem ein zu analysierendes Gemisch ausgehend von mRNA bzw. RNA erhalten werden kann, das leicht automatisierbar ist, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung eines entsprechenden Verfahrens zur Verfügung zu stellen.It Object of the invention, a method with which to be analyzed Mixture can be obtained from mRNA or RNA, the easily is automatable, as well as a device for carrying out a appropriate method to provide.

Die Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.The Task is solved with respect to the method by a method Claim 1.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen 2–9.advantageous Embodiments of the method according to the invention arise from the dependent claims 2-9.

Hinsichtlich der Vorrichtung wird die Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung nach Anspruch 10.Regarding the device is achieved by a device according to the object Claim 10.

Vorteilhafte Ausgestaltungen einer Erfindungsgemäßen Vorrichtung ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen.advantageous Embodiments of an inventive device arise from the respective subclaims.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bereitstellung eines mittels eines Mikroarrays analysierbaren Reaktionsgemisches ausgehend von mRNA oder RNA weist folgende Schritte auf:

a) Synthetisieren von cDNA,
b) Binden der cDNA an einen Membranfilter in Gegenwart eines Bindepuffers,
c) Waschen, Trocknen und Eluieren des an den Membranfilter adsorbierten Produktes in ein Probengefäß,
d) Aufkonzentrieren des Eluats aus Schritt c),
e) Synthese von cRNA ausgehend von der cDNA-Lösung aus Schritt d),
f) Binden der cRNA an einen Membranfilter in Gegenwart eines Bindepuffers,
g) Waschen, Trocknen und Eluieren des an den Membranfilter adsorbierten Produktes in ein Probengefäß,
h) Aufkonzentrieren des Eluats aus Schritt g),
i) Einstellen der cRNA-Konzentration in der Lösung aus Schritt h) und Fragmentieren der cRNA.

The method according to the invention for providing a reaction mixture which can be analyzed by means of a microarray starting from mRNA or RNA has the following steps:

a) synthesizing cDNA,
b) binding the cDNA to a membrane filter in the presence of a binding buffer,
c) washing, drying and elution of the product adsorbed on the membrane filter into a sample vessel,
d) concentrating the eluate from step c),
e) synthesis of cRNA starting from the cDNA solution from step d),
f) binding the cRNA to a membrane filter in the presence of a binding buffer,
g) washing, drying and elution of the product adsorbed on the membrane filter into a sample vessel,
h) concentrating the eluate from step g),
i) adjusting the cRNA concentration in the solution from step h) and fragmenting the cRNA.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Aufreinigung der jeweiligen Produkte aus cDNA- und cRNA-Synthese nicht wie bisher mittels eines Ausfäll- oder Spin-Column-Verfahrens aufgereinigt wird, sondern dass das jeweilige Reaktionsprodukt dadurch isoliert wird, dass das jeweilige Reaktionsgemisch an einer Membran gebunden, gewaschen, getrocknet und aus der Membran in ein Probengefäß eluiert wird.The inventive method is characterized by the fact that the purification of the respective products from cDNA and cRNA synthesis not as previously by means of a precipitation or Spin-column method is cleaned up, but that the respective Reaction product is isolated by the respective reaction mixture bound to a membrane, washed, dried and removed from the membrane eluted into a sample vessel becomes.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt das Binden an einen Membranfilter in Schritt b) und/oder Schritt f) und/oder das Waschen, Trocknen und Eluieren in Schritt c) und/oder Schritt g) jeweils unter Zuhilfenahme eines an das Membranfilter angelegten Unterdruckes. Besonders vorteilhaft ist es, in all diesen Schritten eine solchen Unterdruck anzulegen.According to one advantageous embodiment of the method, the binding takes place a membrane filter in step b) and / or step f) and / or the Washing, drying and elution in step c) and / or step g) respectively with the aid of a negative pressure applied to the membrane filter. It is particularly advantageous in all these steps such Apply negative pressure.

Das jeweilige Produkt wird dann im Vakuum mit Hilfe einer Vakuumkammer, die für die direkte Automatisierung konstruiert wurde, an einer Membran filtriert, wobei das Produkt an die Membran adsorbiert. Das Filtrat wird verworfen, und der Rückstand wird nach Waschen und Trocknen aus der Membran in entsprechende Probengefäße beziehungsweise Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eluiert. Auf diese Weise wird das gesamte Verfahren sehr viel leichter automatisierbar, als wenn man die einzelnen Reaktionsgemische in Vorrichtungen zum Zentrifugieren überführen müsste.The respective product is then vacuumed using a vacuum chamber, the for the direct automation was constructed on a membrane filtered, whereby the product adsorbed to the membrane. The filtrate is discarded, and the residue is after washing and drying from the membrane into appropriate Sample vessels or Wells of a microtiter plate eluted. This way will the whole process is much easier to automate than if one would have to transfer the individual reaction mixtures in devices for centrifuging.

Im Gegensatz zum Verfahren mit den aufwendigen Ausfäll- oder Zentrifugierschritten erfordert das erfindungsgemäße Verfahren allerdings eine Aufkonzentrierung des im Elutionsmittel gelösten Produktes. Eine derartige Aufkonzentrierung kann mit Hilfe von Magnetpartikeln oder von Filterplatten durchgeführt werden, wie sie dem Fachmann schon seit langem zur Verfügung stehen. Derartige Vorrichtungen bzw. Mittel sind in einem automatisierten Verfahren sehr leicht einzusetzen.In contrast to the process with the elaborate precipitation or Zentrifugierschritten requires he inventive method, however, a concentration of the dissolved product in the eluent. Such a concentration can be carried out with the aid of magnetic particles or filter plates, as they are available to the skilled person for a long time. Such devices or means are very easy to use in an automated process.

Die Reinigung der biotinylierten cRNA bzw. der cDNA mittels des vorgeschlagenen Reinigungsschrittes im Vakuum erfordert im Gegensatz zum bisherigen Verfahren eine Aufkonzentrierung, da mit mehr Lösungsmittel gearbeitet werden muss und da ein Arbeiten mit Membranen in Verbindung mit Vakuumtechnik im Vergleich zum Einsatz von spin-columns bzw. Ausfäll-Techniken zu einem Verlust von Produkt führt, das durch den Unterdruck durch die Membran gezogen wird, aus dieser nicht vollständig eluierbar ist und/oder mit schwer zu kontrollierenden Konzentrationsschwankungen der einzelnen Proben einhergeht.The Purification of the biotinylated cRNA or the cDNA by means of the proposed Cleaning step in vacuum requires in contrast to the previous one Process a concentration, since to work with more solvent must and since working with membranes in conjunction with vacuum technology in comparison to the use of spin-columns or precipitation techniques leads to a loss of product, which is pulled by the negative pressure through the membrane, from this not completely elutable and / or with difficult to control concentration variations associated with each sample.

Durch das Vorsehen des jeweiligen Aufkonzentrierungsschrittes ist es aber überraschenderweise gelungen, die jeweiligen Zwischenprodukte in Konzentrationen zu erhalten, die zu einem Produkt führen, das zuverlässig mittels eines Mikroarrays analysierbar ist. Dies war bisher nicht möglich. Aufgrund der in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehenen Aufkonzentrierungsschritte der jeweiligen Zwischenprodukte steht einer Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens nichts im Wege. Insbesondere ist es nicht erforderlich, in ein automatisiertes Verfahren einen Schritt einzubauen, bei dem die Proben in eine Zentrifugiervorrichtung eingebracht werden müssen. Dadurch steht nun erstmals ein Verfahren zur Verfügung, mit dem ausgehend von RNA bzw. mRNA bis zum Reaktionsgemisch, das auf einen Mikroarray aufgetragen wird, jeder Schritt leicht und auf ökonomisch sinnvolle Weise automatisiert zur Verfügung gestellt werden kann.By however, the provision of the respective concentration step is surprisingly succeeded in the respective intermediates in concentrations too obtained that lead to a product that reliable can be analyzed by means of a microarray. This has not been so far possible. Due to the provided in the method according to the invention Concentration steps of the respective intermediates is one Automation of the method according to the invention in the way. In particular, it is not required in an automated procedure to incorporate a step in which the samples are placed in a centrifuging device must be introduced. As a result, a method is now available for the first time, with from RNA or mRNA to the reaction mixture a microarray is applied, each step easily and economically meaningful automated manner can be provided.

Mit einer entsprechenden Vorrichtung, die zur Durchführung des Verfahrens ausgebildet ist, kann man auf sehr effektive Weise eine biologische Probe für eine nachfolgende Analyse mittels Mikroarray vorbereiten, in der man am einen Ende die Vor richtung mit RNA bzw. mRNA füttert, und am anderen Ende die fragmentierte, markierte cRNA fertig für die Hybridisierung auf Mikroarrays erhält.With a corresponding device, which is designed for carrying out the method is, one can very effectively a biological sample for a subsequent Prepare analysis by microarray, in one end feeds the device with RNA or mRNA, and at the other end the fragmented, labeled cRNA ready for hybridization to microarrays receives.

Gemäß einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Schritt d) ausgeführt, indem Lösungsmittel verdunstet wird.According to one Embodiment of the method according to the invention step d) is carried out by solvent is evaporated.

Dies ist eine besonders einfache Art und Weise, eine Lösung zu konzentrieren, die besonders leicht in bekannten Vorrichtungen implementierbar ist, etwa durch entsprechende Programmierung und Verwendung eines Thermocyclers.This is a particularly easy way to get a solution focus, which is particularly easy to implement in known devices is, for example, by appropriate programming and use of a Thermocycler.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/werden Schritt d) oder/und Schritt h) ausgeführt, indem das Produkt mit Hilfe von Magnetpartikeln aufkonzentriert wird.According to one Another embodiment of the method is / are Step d) or / and step h) carried out by the product with Help is concentrated by magnetic particles.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/werden Schritt d) und/oder Schritt h) ausgeführt, indem das Produkt mit Hilfe von Filterplatten, zum Beispiel der Fa. Millipore (96er SeqDye Terminator Platte unter Verwendung des SEQ96 CleanupKit, Best. Nr. LSKS 09601), aufkonzentriert wird.According to one Another embodiment of the method is / are Step d) and / or step h) carried out by the product with Help of filter plates, for example the company Millipore (96er SeqDye Terminator plate using the SEQ96 Cleanup Kit, order no. CSC 09601), is concentrated.

Sowohl cRNA als auch cDNA sind auf diese Weise gut aufkonzentrierbar.Either cRNA and cDNA are easily concentrated in this way.

Gemäß weiteren Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahren wird folgender zusätzlicher Schritt ausgeführt:

j) Auftragen des Produkts aus Schritt i) auf einen Mikroarray und Durchführen eines Mikroarray-Hybridisierungsexperimentes, gegebenenfalls gefolgt von Schritt
k) Auswerten des Mikroarray-Hybridisierungsexperimentes aus dem vorhergehenden Schritt.

According to further embodiments of the method according to the invention, the following additional step is carried out:

j) applying the product of step i) to a microarray and performing a microarray hybridization experiment, optionally followed by step
k) Evaluating the microarray hybridization experiment from the previous step.

Solche Verfahren haben den Vorteil, dass sie Hybridisierungsexperiment und Analyse direkt nacheinander im Anschluss an die Fragmentierung ermöglichen.Such Methods have the advantage of being hybridization experiment and analysis directly after the fragmentation enable.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sämtliche Schritte des Verfahrens bis zur fragmentierten, biotinylierten oder markier ten cRNA automatisiert.According to one Preferred embodiment of the method according to the invention are all Steps of the procedure to fragmented, biotinylated or labeled cRNA automated.

Ein derartiges Verfahren ermöglicht die vollständige Automatisierung der Erstellung eines Reaktionsgemischs, das mittels eines Mikroarrays analysierbar ist, ausgehend von RNA oder mRNA aus lysiertem Material, ohne dass Zwischenschritte erforderlich wären, bei denen Zentrifugationen stattfinden. Ein solches Verfahren ist platz- und kostensparend in einem Roboter implementierbar.One this method allows the complete Automation of the creation of a reaction mixture by means of a microarray, starting from RNA or mRNA from lysed material without requiring intermediate steps would, where centrifugations take place. One such method is space and cost saving implementable in a robot.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird es ohne menschliches Zutun maschinell ausgeführt.According to one Further embodiment of the method according to the invention, it is without human intervention performed by machine.

Ein solches Verfahren ist vorteilhaft, da es den Einsatz menschlicher Arbeitskraft für ein an sich repetitives Vorgehen vermeidet und so Ressourcen freisetzt.One Such method is advantageous because it requires the use of human Worker for avoids a repetitive procedure and thus releases resources.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Sinne der Aufgabe ist eine Vorrichtung zur vollautomatisierten, maschinellen Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.A inventive device in the sense of the task is a device for fully automated, machine execution a method according to the invention.

Derartige Vorrichtungen verwirklichen die Vorteile des Verfahrens.such Devices realize the advantages of the method.

Verfahren und Vorrichtung vereinfachen die Vorbereitung von Proben, die auf einem Mikroarray aufgetragen werden, so erheblich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung, mit der das Verfahren durchgeführt wird, die Forschung wesentlich beschleunigt.method and device simplify the preparation of samples on applied to a microarray, so considerably that a device according to the invention, with which the procedure is carried out significantly accelerates research.

Genaue Beschreibung der Erfindung:Detailed description of Invention:

Aus zu untersuchenden eukaryotischen Zellen oder Zellkulturen wird die RNA oder die mRNA isoliert, wobei darauf geachtet wird, dass möglichst keine RNase in Kontakt mit der isolierten RNA oder mRNA kommt. Derartige Isolierungen lassen sich beispielsweise Durchführen mit dem High Pure RNA Isolation Kit der Fa. Roche (Katalog-Nr. 1828.665) oder dem entsprechenden mRNA Isolation Kit.Out The eukaryotic cells or cell cultures to be examined are Isolated RNA or mRNA, taking care that as possible no RNase comes in contact with the isolated RNA or mRNA. such Isolations can be carried out, for example, with the High Pure RNA Isolation Kit from Roche (catalog No. 1828.665) or equivalent mRNA isolation kit.

Nach Überprüfung der Qualität der isolierten RNA oder mRNA setzt man eine reverse Transkriptase ein, um unter Einsatz eines bestimmten Primers einen ersten cDNA-Strang aus mRNA oder RNA zu generieren.After checking the quality the isolated RNA or mRNA is a reverse transcriptase, using a specific primer, a first cDNA strand to generate from mRNA or RNA.

Die Generierung der cDNA kann beispielsweise unter Verwendung eines Kits „cDNA Synthesis System" der Fa. Roche, Kat. Nr. 1 117 831, erfolgen. Dabei wird nach Erzeugung des ersten cDNA-Stranges die RNA mit RNaseH modifiziert, so dass sie eine Primerfunktionen für eine Polymerase aufweist, mit deren Hilfe der zweite Strang erzeugt wird. Die in einem Enzymcocktail zugefügte Polymerase I weist Exonuklease-Aktivität auf, mittels derer der Primer in Syntheserichtung verdaut wird, wobei die Nukleotide durch die Polymeraseaktivität ersetzt werden. Eine E.Coli-Ligase verknüpft die Lücken zwischen den Polymeraseprodukten auf dem zweiten Strang, wodurch eine vollständige doppelsträngige cDNA entsteht. Um Überhänge an den 3'-Enden der doppelsträngigen cDNA zu vermeiden, wird eine T4-DNA-Polymerase eingesetzt.The Generation of the cDNA can be carried out, for example, using a Kits "cDNA Synthesis System "the Fa. Roche, Cat. No. 1,117,831. It is after generation modified the RNA with RNaseH of the first cDNA strand, so that they have primer functions for has a polymerase, generated by means of which the second strand becomes. The polymerase I added in an enzyme cocktail exhibits exonuclease activity by means of of which the primer is digested in the synthesis direction, wherein the nucleotides by the polymerase activity be replaced. An E. coli ligase links the gaps between the polymerase products on the second strand, resulting in a complete double-stranded cDNA arises. To overhangs to the 3 'ends of the double-stranded cDNA To avoid, a T4 DNA polymerase is used.

Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen sich neben dem angeführten Roche-Kit auch andere, dem Fachmann bekannte Verfahren zur Generierung von cDNA, wie zum Beispiel das „Superscript Choice System for cDNA-Synthesis" der Fa. Invitrogen Life Technologies, P/N 18090-019. Alle derartigen Verfahren basieren auf dem Einsatz reverser Transkriptasen.to execution The present invention is useful in addition to the cited Roche kit also other methods known to those skilled in the generation of cDNA, such as the "Superscript Choice System for cDNA Synthesis " Fa. Invitrogen Life Technologies, P / N 18090-019. All such Methods are based on the use of reverse transcriptases.

Nach erfolgter cDNA-Synthese ist Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beendet.To Successful cDNA synthesis is step a) of the method according to the invention completed.

Die cDNA wird nach dem Versetzen der Reaktionslösung mit Puffer PM an einen Membranfilter gebunden. Dazu werden die Proben in eine für eine Filtrierung geeignete Vorrichtung eingebracht, zum Beispiel eine speziell ausgebildete Mikrotiterplatte, beispielsweise eine QIAquick 96-well-Mikrotiterplatte der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 28181, bei der die Böden der Vertiefungen, in die die Proben eingebracht werden, aus einer durchlässigen Membran ausgebildet sind. Eine solche Mikrotiterplatte gestattet die gleichzeitige Filtration mehrerer Proben gleichzeitig. Sie wird im folgenden als Membran-Mikrotiterplatte bezeichnet. Sie wird in einer speziellen Vorrichtung eingebracht, die es gestattet, auf der Unterseite der Membran-Mikrotiterplatte einen Unterdruck anzulegen, der auch als Vakuum bezeichnet wird. Durch den Unterdruck wird die flüssige Phase durch die Membran „hindurchgezogen", cDNA wird dabei durch Adsorption an die Membran gebunden.The cDNA is added after adding the reaction solution with buffer PM to a Bound membrane filter. For this purpose, the samples are placed in a filter suitable device introduced, for example, a specially trained Microtiter plate, for example a QIAquick 96-well microtiter plate the company QIAgen, order no. 28181, in which the bottoms of the wells, in the the samples are introduced, formed from a permeable membrane are. Such a microtiter plate allows simultaneous filtration several samples at the same time. It is referred to below as a membrane microtiter plate designated. It is inserted in a special device, which allows on the bottom of the membrane microtiter plate apply a negative pressure, which is also referred to as vacuum. By the negative pressure becomes the liquid Phase "pulled through" the membrane, cDNA is doing bound by adsorption to the membrane.

Mit dem Binden an die Membran ist Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens beendet.With the binding to the membrane is step b) of the method according to the invention completed.

Die Vertiefungen der Membran-Mikrotiterplatte werden mit Hilfe eines Waschpuffers mehrfach gewaschen, beispielsweise eines Waschpuffers PE wie im QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook auf Seite 20 unter 3., 4. angegeben. Daraufhin wird die Membran-Mikrotiterplatte bei angelegtem Vakuum, das heißt bei Unterdruck, unter Durchleitung von Luft oder einem Schutzgas wie beispielsweise N₂ oder Argon durch die Membranen getrocknet. Hierdurch wird der Waschpuffer vollständig entfernt. Danach wird die Membran-Mikrotiterplatte aus der Filtrationsvorrichtung entnommen, eventuelle Flüssigkeitsrückstände an den Außenseiten der Membran-Mikrotiterplatte werden entfernt, die Filtrate werden verworfen und die Membran-Mikrotiterplatte wird über einem Probengefäß wieder in der Unterdruckvorrichtung angebracht. Die Membran-Mikrotiterplatte wird über einer konventionellen Mikrotiterplatte mit Vertiefungen oder über einer entsprechenden Ansammlung von Probengefäßen positioniert. Ein Elutionspuffer, zum Beispiel ein Puffer EB (0,5 mM Tris·Cl, pH 8,5) oder Wasser wird in die Vertiefungen der Membran-Mikrotiterplatte eingebracht, eine Weile stehen gelassen, beispielsweise eine Minute, und anschließend mittels Unterdruck durch die Membranen gezogen. Hierdurch wird das Eluat in die Probengefäße oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte überführt, die sich unterhalb der Membran-Mikrotiterplatte befinden. Der Elutionsvorgang kann zur Erzielung einer möglichst quantitativen Elution der cDNA aus der jeweiligen Membran mehrfach wiederholt werden, wie im QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook auf Seite 21 unter 8. angegeben. Anstelle einer Membran-Mikrotiterplatte kann auch ein anderes Format gewählt werden, beispielsweise eine Einzelmembran oder dergleichen. Wichtig ist nur, dass ein Vakuum daran angelegt werden kann, dass eine Filtration durch eine Membran ermöglicht, an der cDNA adsorbierbar ist.The wells of the membrane microtiter plate are washed several times with the aid of a wash buffer, for example a wash buffer PE as indicated in the QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook on page 20 under 3., 4. Thereafter, the membrane microtiter plate is dried under vacuum, that is, at reduced pressure, while passing air or an inert gas such as N ₂ or argon through the membranes. This completely removes the wash buffer. Thereafter, the membrane microtiter plate is removed from the filtration device, any liquid residues on the outsides The membrane microtiter plate is removed, the filtrates are discarded, and the membrane microtiter plate is placed back into the vacuum device over a sample vessel. The membrane microtiter plate is positioned over a conventional microtiter plate with wells or over a corresponding collection of sample tubes. An elution buffer, for example a buffer EB (0.5 mM Tris • Cl, pH 8.5) or water, is introduced into the wells of the membrane microtiter plate, allowed to stand for a while, for example one minute, and then by vacuum through the membranes drawn. As a result, the eluate is transferred to the sample vessels or wells of a microtiter plate, which are located below the membrane microtiter plate. The elution process can be repeated several times to obtain the most quantitative elution of the cDNA from the respective membrane, as indicated in the QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook on page 21 at 8. Instead of a membrane microtiter plate, another format can also be selected, for example a single membrane or the like. What is important is that a vacuum can be applied to allow filtration through a membrane to which the cDNA is adsorbable.

Mit der Eluierung ist Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens abgeschlossen.With the elution is completed step c) of the process according to the invention.

Die Eluate sind gegenüber cDNA-Lösungen, die durch Ausfällen, Zentrifugieren der cDNA, Dekantieren der überstehenden Lösung, Waschen und Wiederaufnahme in Lösung gewonnen werden, verdünnt. Damit eine zufriedenstellende Weiterverarbeitung der cDNA gewährleistet werden kann, werden die Eluate darum aufkonzentriert.The Eluates are opposite cDNA solutions by failures, Centrifuge the cDNA, decant the supernatant, wash and recovery in solution be recovered, diluted. In order to ensure a satisfactory processing of the cDNA can be, the eluates are concentrated around it.

Diese Aufkonzentrierung entspricht einer Einengung der Eluate. Sie kann erfolgen durch Isolieren der cDNA mittels Magnetpartikeln, an die die cDNA gebunden wird, die mit einem Magneten im Probengefäß festgehalten werden – hierbei kann das Lösungsmittel auch durch ein anderes ersetzt werden, falls dies gewünscht ist.These Concentration corresponds to a narrowing of the eluates. she can take place by isolating the cDNA by means of magnetic particles to which the cDNA is bound, which is held with a magnet in the sample vessel be - here can the solvent also be replaced by another, if desired.

Die Einengung kann auch durch Filtration an Filterplatten und Elution in kleineren Volumina Lösungsmittel bewerkstelligt werden. Dazu sind beispielsweise Filter der Fa. Millipore grundsätzlich geeignet.The Concentration can also be achieved by filtration on filter plates and elution in smaller volumes of solvent be accomplished. These include, for example, filters from Millipore in principle suitable.

Die Einengung der Eluate kann auch durch Verdunstung von Lösungsmittel aus den Eluaten erfolgen, beispielsweise indem man einen für PCR-Reaktionen vorgesehenen Heizblock entsprechend ansteuert, in dem die Probengefäße oder Mikrotiterplatte mit Proben untergebracht ist, oder indem man die Proben auf sonstige Weise erwärmt. Die Proben werden bis zur Trockne eingeengt und anschließend in einer definierten Menge Lösungsmittel wieder aufgenommen.The Constraint of the eluates may also be due to evaporation of solvent from the eluates, for example by adding one for PCR reactions provided heating block accordingly controls in which the sample vessels or Microtiter plate is housed with samples, or by placing the Heat samples in any other way. The samples are concentrated to dryness and then in a defined amount of solvent resumed.

Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit beendet.step d) of the method according to the invention is over.

Die resultierende cDNA-Lösung dient als Edukt für die nun folgende cRNA-Synthese. Diese kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise unter Verwendung des BioArray^TM HighYieId^TMRNA Transcript Labeling Kit der Fa. Enzo, das von Affymetrix vertrieben wird (Part. Nr. 900182) gemäß der dazugehörenden Anleitung. Mit diesem Kit werden Proben für den Einsatz mit Mikroarrays der Fa. Affymetrix vorbereitet.The resulting cDNA solution serves as starting material for the subsequent cRNA synthesis. This can be carried out by methods known to those skilled in the art, for example using the BioArray ^™ HighYieID ^™ RNA Transcript Labeling Kit from Enzo, which is sold by Affymetrix (Part No. 900182) according to the associated instructions. This kit prepares samples for use with microarrays from Affymetrix.

Der cDNA werden nach dieser Anleitung ein Reaktionspuffer, biotinylierte Ribonukleotide, DTT, ein RNase-Inhibitor-Mix, eine T7 RNA-Polymerase und Wasser hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend bei 37°C fünf bis neun Stunden inkubiert. Nach Abschluss der RNA-Synthese wird das Produkt direkt weiterverarbeitet. Es kann aber auch bei –70°C oder –20°C zwischengelagert werden. Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist abgeschlossen.Of the cDNA becomes a reaction buffer, biotinylated, according to this guide Ribonucleotides, DTT, an RNase inhibitor mix, a T7 RNA polymerase and water added. The reaction mixture is then incubated at 37 ° C for five to nine hours. After completion of the RNA synthesis, the product is processed directly. It can also be stored at -70 ° C or -20 ° C become. Step e) of the method according to the invention is complete.

Die Proben werden mit RNase-freiem Wasser und einem Bindepuffer versetzt, zum Beispiel auf 100 μl mit RNase-freiem Wasser aufgefüllt und mit 350 μl Puffer RLT gemäß der Anleitung „RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup" aus dem RNeasy Handbook 01/2002, S.36, der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 74181.The Samples are spiked with RNase-free water and a binding buffer, for example, to 100 μl filled with RNase-free water and with 350 μl Buffer RLT according to the instructions "RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup " the RNeasy Handbook 01/2002, p.36, the company QIAgen, order no. 74,181th

Die Proben werden durchmischt, mit Ethanol versetzt, und erneut durchmischt.The Samples are mixed, ethanol added, and mixed again.

Die Proben werden in eine Membran-Mikrotiterplatte überführt und mittels Unterdruck in der dafür vorgesehenen Vorrichtung wie oben bezüglich der cDNA-Aufreinigung erläutert filtriert.The Samples are transferred to a membrane microtiter plate and vacuum in the for as described above with respect to cDNA purification explained filtered.

Im Anschluss daran fügt man einen weiteren Puffer, zum Beispiel den Puffer RW1 gemäß der Anleitung „RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup" aus dem RNeasy Handbook 01/2002, S.36, der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 74181, den Proben hinzu. Nach einer gewissen Verweildauer, beispielsweise 5 Minuten, wird das Reaktionsgemisch durch Anlegen eines Vakuums filtriert. Die Filtrate werden verworfen, die Adsorbate werden mit einem mit Waschpuffer mehrfach gewaschen, beispielsweise einem ethanolischen Puffer RPE gemäß der Anleitung „RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup" aus dem RNeasy Handbook 01/2002, S.37, der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 74181, indem der Waschpuffer jeweils aufgetragen und durch Anlegen eines Vakuums filtriert wird.Following this, another buffer is added, for example the buffer RW1 according to the instructions "RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup" from RNeasy Handbook 01/2002, p. 36, from QIAgen, Be Vice-No. 74181, added to the samples. After a certain residence time, for example 5 minutes, the reaction mixture is filtered by applying a vacuum. The filtrates are discarded, the adsorbates are washed several times with a wash buffer, for example, an ethanolic buffer RPE according to the instructions "RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup" from RNeasy Handbook 01/2002, p.37, the company QIAgen, order No. 74181, by applying the washing buffer in each case and filtering by applying a vacuum.

Das Äußere der Membran-Filterplatte wird von daran befindlichen Flüssigkeitsresten befreit und die Membran-Filterplatte wird getrocknet, indem ein Vakuum angelegt wird, das Luft oder ein Schutzgas durch die Membranen zieht. Hierdurch werden Reste von Ethanol aus der Membran entfernt.The exterior of the Membrane filter plate is caused by residual liquid freed and the membrane filter plate is dried by a Vacuum is applied, the air or a protective gas through the membranes draws. As a result, residues of ethanol are removed from the membrane.

Die Membran-Mikrotiterplatte wird über einer normalen Mikrotiterplatte oder einer entsprechenden Ansammlung von Probengefäßen angeordnet, und die an die jeweilige Membran adsorbierte cRNA wird mittels RNase-freiem Wasser in die Probengefäße oder Vertiefungen der Mikrotiterplatte eluiert, indem man das Wasser den Vertiefungen der Membran-Mikrotiterplatte hinzufügt, es einwirken lässt und mittels Vakuum durch die Membran hindurch in die darunter befindlichen Probengefäße oder Vertiefungen der Mikrotiterplatte überführt.The Membrane microtiter plate is over a normal microtiter plate or a corresponding collection arranged by sample vessels, and the adsorbed to the respective membrane cRNA is by means of RNase-free Water in the sample containers or Wells of the microtiter plate eluted by mixing the water it adds to the wells of the membrane microtiter plate lets and by vacuum through the membrane into the underlying Sample containers or Recesses of the microtiter plate transferred.

Dieser Vorgang wird einmal wiederholt, um eine quantitative Eluierung an die Membran adsorbierter cRNA zu gewährleisten.This The process is repeated once to indicate quantitative elution to ensure the membrane of adsorbed cRNA.

Die Schritte f) und g) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind damit abgeschlossen.The Steps f) and g) of the method according to the invention are thus completed.

Die Eluate werden nun aufkonzentriert. Dies kann erfolgen durch Isolieren der cRNA mittels magnetischer Partikel, an die die cRNA gebunden wird, die mit einem Magneten im Probengefäß oder in der jeweiligen Vertiefung einer Mikrotiterplatte festgehalten werden – hierbei kann das Lösungsmittel auch durch ein anderes ersetzt werden, falls dies gewünscht ist.The Eluates are now concentrated. This can be done by isolating the cRNA by means of magnetic particles to which the cRNA bound with a magnet in the sample vessel or in the respective well a microtiter plate are held - this may be the solvent also be replaced by another, if desired.

Die Aufkonzentrierung kann auch durch Filtration an Filterplatten bis zum Erreichen der gewünschten Lösungsmittelmenge bewerkstelligt werde, beispielsweise unter Zuhilfenahme von Filterplatten der Fa. Millipore, wie etwa Millipore Montage Seq 96Cleanup Kit, Bestell-Nr. LSKS09601.The Concentration can also be achieved by filtration on filter plates to achieve the desired amount of solvent be accomplished, for example, with the aid of filter plates Millipore, such as Millipore Assembly Seq 96Cleanup Kit, Order no. LSKS09601.

Schritt h) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit abgeschlossen.step h) of the method according to the invention is finished.

Die cRNA liegt nun in einer bestimmten Konzentration in Lösung vor. Diese Konzentration ist bestimmbar. Um eine Fragmentation möglichst erfolgreich durchführen zu können, wird die Konzentration der cRNA-Lösungen nun eingestellt, indem die Lösungen in Abhängigkeit von der vorgefundenen Konzentration verdünnt werden. Die Konzentration wird dabei mittels optischer Messungen kontrolliert und auf einen vorgegebenen Wert eingestellt, der vom verwendeten Fragmentierungsprotokoll ab hängt. Die Konzentration sollte so eingestellt werden, dass sie im Fragmentierungsgemisch nach Zugabe der Reaktanden RNA/Lösungsmittel in etwa im Größenordnungsbereich 1 μg/μl liegt, beispielsweise zwischen 0,5 und 2 μg/μl. Die Messung und Einstellung der Konzentration kann nach dem Protokoll „Quantifying the cRNA (IVT Product)" der Fa. Affymetrix erfolgen ((Affymetrix, Expression Analysis Technical Manual, P/N 700236 rev.3 (Version 2000), Eukarytoic Sample and Array Processing, Seite 2.1.21).The cRNA is now in solution at a certain concentration. This concentration is determinable. To a fragmentation as possible successfully perform to be able to The concentration of cRNA solutions is now adjusted by the solutions dependent on be diluted from the concentration found. The concentration is controlled by optical measurements and on a default value set by the fragmentation protocol used depends on. The concentration should be adjusted so that it is in the fragmentation mixture after addition of the reactants RNA / solvent roughly on the order of magnitude 1 μg / μl, for example, between 0.5 and 2 μg / μl. The measurement and adjustment The concentration can be calculated according to the protocol "Quantifying the cRNA (IVT Product) "of the Fa. Affymetrix ((Affymetrix, Expression Analysis Technical Manual, P / N 700236 rev.3 (Version 2000), Eukaryotic Sample and Array Processing, page 2.1.21).

Sobald die gewünschte Konzentration eingestellt ist, wird die Probe mit einem Fragmentierungspuffer versehen, beispielsweise gemäß dem Protokoll „Fragmenting the cRNA for Target Preparation" der Fa. Affymetrix (Affymetrix, Expression Analysis Technical Manual, P/N 700236 rev.3 (Version 2000), Eukarytoic Sample and Array Processing, Seiten 2.1.22–23).As soon as the desired Concentration is set, the sample is provided with a fragmentation buffer, for example, according to the protocol "Fragmenting the cRNA for Target Preparation " Affymetrix (Affymetrix, Expression Analysis Technical Manual). P / N 700236 rev.3 (version 2000), Eukaryotic Sample and Array Processing, Pages 2.1.22-23).

Das Reaktionsgemisch wird gemäß dem verwendeten Protokoll inkubiert, anschließend gekühlt, gegebenenfalls ein Aliquot daraus mittels Gelektrophorese analysiert. Die fragmentierte cRNA-Lösung kann bei –20°C aufgehoben werden, aber auch sofort mit einem Mikroarray in Kontakt gebracht werden.The Reaction mixture is used according to the Protocol incubated, then cooled, optionally, an aliquot thereof analyzed by gel electrophoresis. The fragmented cRNA solution can be stored at -20 ° C but also immediately brought into contact with a microarray become.

Diese beschriebenen Schritte lassen sich alle von einem Roboter durchführen, der entsprechend programmiert ist, und auf dem eine heizbare Station für Mikrotiterplatten vorgesehen ist, beispielsweise ein Heizblock, wie er für PCR-Raktionen verwendet wird, und eine Vorrichtung zum Filtrieren unter Vakuum mittels Membran-Mikrotiterplatten. Da keine Zentrifuge in den Roboter implementiert werden muss, ist das Verfahren leicht automatisierbar.These All these steps can be performed by a robot, which is programmed accordingly, and on which a heatable station for microtiter plates is provided, for example, a heating block, as for PCR is used, and a device for filtering under vacuum using membrane microtiter plates. Since no centrifuge needs to be implemented in the robot, is the procedure easily automatable.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels erläutert.in the The following is the invention with reference to a specific embodiment explained.

Ausführungsbeispiel:Embodiment:

Schritt a): Synthese von ds c-DNA:Step a): Synthesis of ds c-DNA:

Zur cDNA-Synthese wurde das cDNA Synthesis System der Fa. Roche, Order-Nr.: 1 117 831, verwendet. Ausgangsmaterial waren vier Proben Nr.1 -Nr. 4 mRNA, m-RNA sowie zwei weitere Proben Nr, 5 und Nr.6 einer total RNA aus Rattenleber. In der c-DNA Synthese werden von den Proben Nr.1 – 4 jeweils 19 μl eingesetzt, von den Proben Nr. 5 und 6 jeweils 10 μg. Dazu werden in einer PCR-Platte jeweils 19 μl der Proben Nr.1 – 4 mit 2 μl Oligo[(dT)₂₄T7 promoter]₆₅ Primer (vial 6)_versetzt Σ:
21 μl. Von den Proben Nr. 5 und 6 (2 μg/μl) werden je 5 μl mit 2 μl Oligo[(dT)24T7 promoter]65 Primer (vial 6) und 14 μl Wasser (vial 12) versetzt. Alle Probengefäße enthalten die gleiche Flüssigkeitsmenge von 21 μl. Die Proben Nr. 1 – 6 werden 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Für die Erststrangsynthese wird für alle Proben (m-RNA und total RNA) dasselbe Protokoll verwendet:

For cDNA synthesis, the cDNA synthesis system of the company. Roche, Order No .: 1 117 831 was used. Starting material was four samples No.1-No. 4 mRNA, m-RNA and two further samples Nr, 5 and Nr.6 of a total RNA from rat liver. In c-DNA synthesis, 19 μl each of samples Nos. 1-4 are used, of samples Nos. 5 and 6 10 μg each. For this purpose, in a PCR plate in each case 19 .mu.l of the samples Nr.1 - 4 with 2 .mu.l Oligo [(dT) ₂₄ T7 promoter] ₆₅ primer (vial 6) offset _ Σ:
21 μl. For samples Nos. 5 and 6 (2 μg / μl), 5 μl each are mixed with 2 μl oligo [(dT) 24T7 promoter] 65 primers (vial 6) and 14 μl water (vial 12). All sample vials contain the same amount of liquid of 21 μl. Sample Nos. 1-6 are incubated at 70 ° C for 10 minutes. For the first-strand synthesis, the same protocol is used for all samples (m-RNA and total RNA):

Zugabe des Mastermixes (jeweils 19 μl) zum RNA/Primer Ansatz (Proben Nr. 1 – 6). Das Gesamtvolumen der Proben beträgt nun jeweils 40 μl. Die Proben werden 60 min. bei 42°C inkubiert.encore of the master mix (19 μl each) to the RNA / primer approach (samples Nos. 1-6). The total volume of Samples is now each 40 ul. The samples are 60 min. at 42 ° C incubated.

Für die Zweitstrangsynthese wird für alle Proben (m-RNA und total RNA) dasselbe Protokoll verwendet:

For the second-strand synthesis, the same protocol is used for all samples (m-RNA and total RNA):

Zugabe des Mastermixes (jeweils 110 μl) zum Erststrangansatz (Proben 1 – 6).encore of the master mix (each 110 μl) to the first strand set (samples 1 - 6).

Das Gesamtvolumen der Proben beträgt nun jeweils 150 μl. Die Proben werden 120 Min. bei 16°C inkubiert. Daraufhin werden jeweils 20 μl (20 U) T4 DNA Polymerase (vial 11) zugegeben und die Proben werden 5 Min. bei 16°C inkubiert. Den Proben Nr.1 – 4 werden jeweils 17 μl EDTA 0.2 M pH 8.0 zugegeben, den Proben Nr. 5 und 6 jeweils 17 μl EDTA 0.2 M pH 8.0 und 1.5 μl (15 U) RNase I (vial 13). Die Proben Nr. 5 und 6 werden 30 Minuten bei 37°C inkubiert, jeweils mit 5 μl (3 U) Proteinase K (vial 14) versetzt und erneut 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit abgeschlossen.The Total volume of samples is now each 150 ul. The samples are left for 120 min. At 16 ° C incubated. Then 20 .mu.l (20 U) T4 DNA polymerase (vial 11) are added and the samples are incubated at 16 ° C for 5 min. Sample Nos. 1 - 4 each 17 ul EDTA 0.2 M pH 8.0 was added, samples Nos. 5 and 6 each had 17 μl EDTA 0.2 M pH 8.0 and 1.5 μl (15 U) RNase I (vial 13). Sample Nos. 5 and 6 become 30 minutes at 37 ° C incubated, each with 5 ul (3 U) Proteinase K (vial 14) and incubated again at 37 ° C for 30 minutes. Step a) of the method according to the invention is finished.

Schritte b) und c) : Reinigung der ds c-DNA:Steps b) and c): Cleaning the ds c DNA:

Diese Schritte erfolgen unter Verwendung des QIAquick 96 PCR purification Kit der Fa. Qiagen (Bestellnr.: 28181) und bei Raumtemperatur unter Zuhilfenahme eines Vakuums wie folgt, wobei das jeweilige Vakuum immer langsam aufgebaut wird: Der Puffer PE wird durch Zugabe von 96%igem Ethanol zu Puffer PE entsprechend der Anleitung auf der Pufferflasche vorbereitet. Es werden 540 μl Bindepuffer PM in eine DWP (= deep well plate) vorgelegt. Es werden jeweils 180 μl c-DNA Synthesereaktion in die DWP mit dem Bindepuffer transferiert und gut durchmischt. Die Gemische werden in die Filterplatte transferiert. An der Unterseite der Filterpatte wird ein einminütiges Vakuum von –400 mbar angelegt. Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit abgeschlossen.These Steps are performed using the QIAquick 96 PCR purification Kit from the company Qiagen (order no .: 28181) and at room temperature under Using a vacuum as follows, wherein the respective vacuum is always built up slowly: the buffer PE is replaced by the addition of 96% ethanol to buffer PE according to the instructions on the Buffer bottle prepared. There are 540 μl binding buffer PM in a DWP (= deep well plate). There are each 180 ul c-DNA synthesis reaction transferred into the DWP with the binding buffer and mixed well. The mixtures are transferred to the filter plate. At the bottom of the Filter plate becomes a one-minute Vacuum of -400 created mbar. Step b) of the method according to the invention is thus completed.

In die Filterplatte werden 900 μl Waschpuffer PE zugegeben. An der Unterseite der Filterplatte wird ein einminütiges Vakuum von –600 mbar angelegt. Der Vorgang wird erneut mit 900 μl Waschpuffer PE wiederholt. Anschließend wird die Filterplatte auf eine Touchposition transferiert, an welcher die verbleibende Flüssigkeit entfernt wird, und danach maximal 20 Minuten unter Vakuum getrocknet. Die Filterplatte wird erneut auf die Touchposition transferiert. Eine Auffangplatte wird in die Vakuumkammer transferiert. Zur Elution der Proben in die Vertiefungen der Auffangplatte werden 100 μl verdünnter Elutionspuffer EB (0,5 mM Tris-HCl) zugegeben, es wird drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und ein fünfminütiges Vakuum von –400 mbar an der Unterseite der Filterplatte angelegt. Der Vorgang wird mit weiteren 100 μl verdünntem Elutionspuffer EB (0,5 mM Tris-HCl) wiederholt.In the filter plate will be 900 μl Wash buffer PE added. At the bottom of the filter plate is a one-minute Vacuum of -600 created mbar. The procedure is repeated again with 900 μl washing buffer PE. Subsequently, will the filter plate is transferred to a touch position on which the remaining liquid is removed is dried under vacuum for a maximum of 20 minutes. The Filter plate is transferred again to the touch position. A Collecting plate is transferred to the vacuum chamber. For elution of the samples in the wells of the collection plate add 100 μl of diluted elution buffer EB (0.5 mM Tris-HCl) is added, it is left for three minutes at room temperature incubated, and a five-minute vacuum from -400 mbar applied to the bottom of the filter plate. The process will with another 100 μl diluted Elution buffer EB (0.5 mM Tris-HCl) repeated.

Schritt d): Aufkonzentrierung der ds c-DNA:Step d): Concentration the ds c DNA:

Zur Aufkonzentrierung wurden die Proben in eine Thermosprintplatte transferiert und im Thermocycler über Nacht bei 50°C eingeengt (15 Stunden).to Concentration, the samples were transferred to a thermosprinting plate and in the thermocycler over Night at 50 ° C concentrated (15 hours).

Schritt e) Synthese der c)-RNA:Step e) Synthesis of c) RNA:

Die Synthese der c-RNA erfolgt unter Verwendung des BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit der Fa, Enzo (Bestellnr.: 900182, beziehbar bei Affymetrix) Vorgehensweise: Die Reaktionen wurden in der Thermosprintplatte angesetzt, in der die Proben auf dem Thermocycler eingeengt wurden.The Synthesis of c-RNA is performed using the BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit of the Fa, Enzo (Order No. 900182, available at Affymetrix) Procedure: The reactions were in the thermosprint plate set in which the samples were concentrated on the thermal cycler.

Synthese der biotinmarkierten c-RNA: Mastermix ansetzen (auf Eis):

Synthesis of biotin-labeled c-RNA: prepare master mix (on ice):

Zugabe des Mastermixes (jeweils 40 μl) zu der getrockneten DNA (Proben 1 – 6); 5,5 Stunden Inkubation im Thermocycler bei 37°C.encore of the master mix (40 μl each) to the dried DNA (samples 1-6); 5.5 hours incubation in a thermocycler at 37 ° C.

Schritte f) und g) (Reinigung der c-RNA)Steps f) and g) (cleaning the c-RNA)

Verwendet wurde der RNeasy 96 Kit der Fa. Qiagen (Bestellnr.: 74181); die folgenden Schritte erfolgten bei Raumtemperatur. Zunächst wurde der Puffer RPE durch Zugabe von 96%igem Ethanol (4-faches Volumen des Konzentrates) vorbereitet. Es wurden bezogen auf eine Probe jeweils 350 μl Puffer RLT in eine DWP vorgelegt. Zu den Proben wurden 60 μl RNasefreies Wasser gegeben, damit das Probenvolumen 100 μl beträgt. Die Proben wurden in die DWP transferiert und gut gemischt. Jede Probe wurde mit 250 μl Ethanol versetzt und gut durchmischt. Die Proben wurden in die Vertiefungen der Filterplatte transferiert. Es wurde ein einminütiges Vakuum von – 650 mbar an der Unterseite der Filterplatte angelegt. Anschließend wurde jeweils 1 ml Puffer RW 1 in jedes Filterwell eingebracht, und ein 30-sekündiges Vakuum von – 650 mbar wurde an der Unterseite der Filterplatte angelegt. In jedes Filterwell wurde 1 ml Puffer RPE eingebracht und es wurde erneut ein 30-sekündiges Vakuum von – 650 mbar an der Unterseite der Filterplatte angelegt. Der Vorgang wurde mit jeweils 1 ml Puffer RPE wiederholt. Die Filterplatte wurde zum Entfernen von Tropfen auf einem Stück Papier abgetupft und durch Anlegen eines Vakuums von –800 mbar 20 Minuten getrocknet. In die Vakuumkammer wurden Elutionsröhrchen gestellt. In jedes Well wurden 70 μl RNasefreies Wasser eingebracht und es wurde drei Minuten bei bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Vakuum von – 500 mbar wurde 2 Minuten angelegt. Der Vorgang wurde mit weiteren 70 μl RNasefreiem Wasser für jedes Well wiederholt. Die Konzentrationen der Eluate der Proben 1 – 6 wurden mittels Messungen der jeweiligen optischen Dichte bei 260 und bei 280 nm bestimmt. Sie ergeben sich aus der nachfolgenden Tabelle 1.The RNeasy 96 kit from Qiagen (order no .: 74181) was used; the following steps were carried out at room temperature. First, the buffer RPE was prepared by adding 96% ethanol (4 times the volume of the concentrate). In each case, 350 μl of buffer RLT were initially introduced into a DWP in relation to one sample. To the samples was added 60 μl of RNase-free water, so that the sample volume 100 μl. The samples were transferred to the DWP and mixed well. Each sample was mixed with 250 μl of ethanol and mixed well. The samples were transferred to the wells of the filter plate. A one minute vacuum of -650 mbar was applied to the underside of the filter plate. Subsequently, each 1 ml of buffer RW 1 was introduced into each filter well, and a 30-second vacuum of - 650 mbar was applied to the underside of the filter plate. Into each filterwell was placed 1 ml of Buffer RPE and again a 30 second vacuum of -650 mbar was applied to the bottom of the filter plate. The procedure was repeated with 1 ml buffer RPE. The filter plate was dabbed to remove drops on a piece of paper and dried by applying a vacuum of -800 mbar for 20 minutes. Elution tubes were placed in the vacuum chamber. Into each well, 70 μl of RNase-free water was added and incubated for 3 minutes at room temperature. A vacuum of -500 mbar was applied for 2 minutes. The procedure was repeated with another 70 μl of RNase-free water for each well. The concentrations of the eluates of samples 1-6 were determined by measurements of the respective optical density at 260 and at 280 nm. They are shown in Table 1 below.

Tabelle 1:

Table 1:

Schritte h) (Aufkonzentrierung):Steps h) (concentration):

Dieser Schritt erfolgt unter Verwendung eines Montage SEQ96 Cleanup Kit der Fa. Millipore (Bestellnr.: LSKS09601) in Anlehnung an das Millipore Protokoll. Dazu werden die Proben in die Filterplatte transferiert, wobei 95 μl vollständig in die Filterwells pipettiert werden können. Es wird ein Vakuum von – 675 mbar angelegt, bis die Fil terplatte leer ist (15 min). Das restliche Probenvolumen wird in die Filterplatte transferiert, es wird erneut ein Vakuum von – 675 mbar angelegt, bis die Filterplatte leer ist. Zur Resuspension werden 25 μl Wasser zugegeben und ständig bewegt. Die resultierenden Suspensionen werden in eine neue Platte transferiert.This Step is done using a mounting SEQ96 Cleanup Kit Millipore (order no .: LSKS09601) based on the Millipore Protocol. For this, the samples are transferred into the filter plate, where 95 μl Completely can be pipetted into the filter wells. It is created a vacuum of - 675 mbar, until the filter plate is empty (15 min). The remaining sample volume is transferred to the filter plate, it is again a vacuum from - 675 mbar until the filter plate is empty. Become a resuspension 25 μl of water admitted and constantly emotional. The resulting suspensions are placed in a new plate transferred.

Die Proben 1 und 2, die nicht den oben angegebenen Proben entsprechen, weisen nun die in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen 2) auf, Tabelle 2:

wobei OD eine Abkürzung für „optical density" bei 260 nm bzw. 280 nm ist. Bei 260 nm liegt das Absorptionsmaximum der Basen der Nukleinsäuren und bei 280 nm liegt das Absorptionsmaximum der Proteine. OD260/280 steht für das Verhältnis der beiden Messungen.Samples 1 and 2, which do not correspond to the above-mentioned samples, now have the concentrations 2) given in Table 2, Table 2:

where OD is an abbreviation for "optical density" at 260 nm and 280 nm, respectively, at 260 nm the absorption maximum of the bases of the nucleic acids and at 280 nm lies the absorption maximum of the proteins, OD260 / 280 stands for the ratio of the two measurements.

Schritt i) (Konzentrationseinstellung und Fragmentierung):Step i) (Concentration adjustment and fragmentation):

Die Konzentration der gereinigten c-RNA wird auf 0.625 μg/μl eingestellt, da in der nachfolgenden Fragmentierung 15 μg (24 μl) c-RNA eingesetzt werden. Die Fragmentierung erfolgt nach folgender Vorschrift:
15 μg cRNA gelöst in einem Volumen von 24 μl werden mit 6 μl 5× Fragmentierungspuffer versetzt (Gesamtvolumen: 30 μl) und 35 Minuten bei 94°C inkubiert. Die fragmentierte c-RNA wird bis zur Hybridisierung bei –20°C (für längere Zeit bei –80°C) gelagert.The concentration of the purified c-RNA is adjusted to 0.625 μg / μl, since 15 μg (24 μl) of c-RNA are used in the subsequent fragmentation. The fragmentation takes place according to the following rule:
15 μg cRNA dissolved in a volume of 24 μl are mixed with 6 μl 5 × fragmentation buffer (total volume: 30 μl) and incubated at 94 ° C. for 35 minutes. The fragmented c-RNA is stored until hybridization at -20 ° C (for a longer time at -80 ° C).

Claims

A method of providing a microarray-analyzable reaction mixture from mRNA or RNA comprising the steps of: a) synthesizing cDNA, b) binding the cDNA to a membrane filter in the presence of a binding buffer, c) washing, drying and eluting the product adsorbed to the membrane filter in a sample vessel, d) concentration of the eluate from step c), e) synthesis of cRNA starting from the cDNA solution from step d), f) binding the cRNA to a membrane filter in the presence of a binding buffer, g) washing, drying and eluting the product adsorbed to the membrane filter into a sample vessel, h) concentrating the eluate from step g), i) adjusting the cRNA concentration in the solution from step h) and fragmenting the cRNA.

Method according to claim 1, characterized in that binding to a membrane filter in step b) and / or step f) and / or washing, drying and elution in step c) and / or Step g) each with the aid of a to the membrane filter applied negative pressure takes place.

Method according to claim 1 or 2, characterized that step d) is executed is evaporated by solvents becomes.

Method according to claim 1 or 2, characterized that step d) and / or step h) is carried out by the product is concentrated by means of magnetic particles.

Method according to claim 1 or 2, characterized that step d) and / or step h) is carried out by the product concentrated by means of filter plates.

Method according to one the claims 1 to 5, characterized in that the following additional step accomplished becomes: j) applying the product of step i) to a microarray and performing a microarray hybridization experiment.

Method according to claim 6, characterized in that the following additional step is carried out: k) Evaluate the microarray hybridization experiment from the previous one Step.

Method according to one the claims 1 to 7, characterized in that all steps except applying the product of step i) to a microarray are automated.

Method according to one the claims 1 to 7, characterized in that it is without human intervention machined becomes.

Device for fully automated, mechanical execution a method according to a the claims 1 to 7.