DE10334811B4

DE10334811B4 - Cold-inducible expression system

Info

Publication number: DE10334811B4
Application number: DE2003134811
Authority: DE
Inventors: Thomas Priv.-Doz. Dr. Schweder; Georg Dr. Homuth
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2003-07-30
Filing date: 2003-07-30
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2023-07-31
Also published as: DE10334811A1

Abstract

Verwendung eines Genexpressionssystems, umfassend einen Desaturase(des)-Promotor zur temperaturregulierten Expression eines heterologen Gens, das für ein kritisches, schwierig zu faltendes oder kälteangepasstes, thermolabiles Protein kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpression in zumindest teilweise Desaturase-defizienten Gram-positiven Bakterien bei einer Temperatur von 22 °C oder niedriger durchgeführt wird.use a gene expression system comprising a desaturase (des) promoter for the temperature-regulated expression of a heterologous gene, the for a critical, difficult-to-fold or cold-adapted, thermolabile Protein encoded, characterized in that the gene expression in at least partially desaturase-deficient Gram-positive bacteria at a temperature of 22 ° C or lower becomes.

Description

Die Erfindung betrifft Systeme zur temperaturregulierten Genexpression, insbesondere zur Überexpression von kritischen, schwierig zu faltenden oder kälteangepassten, thermolabilen Proteinen.The This invention relates to temperature-regulated gene expression systems, especially for overexpression critical, difficult-to-fold or cold-adapted, thermolabile Proteins.

Viele heterologe Proteine führen während der Überproduktion in einem mikrobiologischen Expressionssystem zu einer Überforderung des Faltungsapparates der Zellen. Vielfach werden diese neu synthetisierten fremden Proteine nicht korrekt gefaltet und liegen zumindest partiell denaturiert in den Zellen vor. Durch hydrophobe Wechselwirkungen der Peptidstränge können unlösliche Proteinaggregate, so genannte Inclusion bodies entstehen. Die Auflösung dieser Proteinaggregate sowie eine korrekte Rückfaltung der Proteine in ihre native funktionelle Struktur ist technisch sehr aufwendig und kann einen Proteinproduktionsprozess ökonomisch in Frage stellen.Lots heterologous proteins while overproduction in a microbiological expression system to an excessive demand the folding apparatus of the cells. In many cases, these are newly synthesized foreign proteins are not folded correctly and are at least partially denatured in the cells. By hydrophobic interactions the peptide strands can insoluble Protein aggregates, so-called inclusion bodies arise. The resolution of this Protein aggregates as well as a correct refolding of the proteins into their native functional structure is technically very complicated and can be a Protein production process economical question.

Ein weiteres Problem stellen kälteangepasste Proteine von so genannten psychrophilen Organismen dar. Enzyme dieser Organismen zeichnen sich durch eine hohe katalytische Aktivität bei sehr niedrigen Temperaturen, z.B. 4 °C aus. Diese Eigenschaft wird durch eine im Vergleich zu Enzymen von mesophilen bzw. wärmeliebenden Organismen flexiblere Proteinstruktur realisiert. Diese größere Thermoflexibilität hat zur Folge, dass übliche großtechnische Produktionsverfahren, die bei 37 °C arbeiten, zum Entstehen von zumindest partiell denaturierten Produkten führen, die ebenfalls als Proteinaggregate in den Zellen akkumulieren, und – sofern überhaupt – nur mit geringer Ausbeute renaturiert werden können. Feller et al. (Appl. Environ. Mikrobiol. 64 (1998), 1163-1165) beschreiben die Überexpression einer kälteangepassten Amylase aus einem antarktischen Bakterium in dem mesophilen Expressionswirt Escherichia coli. Nach Expression bei 37 °C konnte keine Amylaseaktivität gemessen werden. Nur durch eine Temperaturerniedrigung auf 25 °C über Nacht konnte ein Teil der überproduzierten Amylase renaturiert werden.One another problem is cold-adapted Proteins of so-called psychrophilic organisms. Enzymes of this Organisms are characterized by a high catalytic activity at very low temperatures, e.g. 4 ° C out. This property is characterized by a compared to enzymes of mesophilic or heat-loving Organisms more flexible protein structure realized. This greater thermo-flexibility has to Follow that usual large-scale Production process, which at 37 ° C work, to the emergence of at least partially denatured products to lead, which also accumulate as protein aggregates in the cells, and - if at all - only with can be renatured low yield. Feller et al. (Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998), 1163-1165) describe overexpression a cold-adapted Amylase from an Antarctic bacterium in the mesophilic expression host Escherichia coli. After expression at 37 ° C no amylase activity could be measured become. Only by lowering the temperature to 25 ° C overnight could be part of the overproduced Amylase be renatured.

Eine Temperaturerniedrigung führt zu einer Verlangsamung der Proteinsynthese. Dadurch kann eine Überlastung der Proteinsynthese- sowie Faltungsmaschinerie der Zellen vermieden werden. Die Chaperone und Faltungshelferproteine der Zellen erhalten mehr Zeit für die korrekte Faltung der Proteine. Für eine verbesserte Expression fremder Gene unter Niedrigtemperaturbedingungen sind Expressionssysteme von Interesse, die über eine hohe Aktivität bei 18-22 °C verfügen. WO96/03521 beschreibt ein kälte-induzierbares Expressionssystem für den Gram-negativen mesophilen Wirt Escherichia coli. Dieses System basiert auf den regulatorischen Sequenzen des Hauptkälteschockproteins von E. coli, Csp. Weiterhin wird ein Kälte-induzierbares Expressionssystem beschrieben, bei dem ein mutierter Promotor des E. coli-Phagen λ (pL) verwendet wird. Dieser Promotor wird durch niedrige Temperaturen von weniger als 20 °C aktiv und erlaubt somit eine selektive Expression rekombinanter Gene unter diesen Bedingungen. Die beschriebenen Expressionssysteme sollen eine korrekte Faltung rekombinanter Proteine bei Temperaturen unter 20 °C ermöglichen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die Beschränkung auf das Gram-negative Bakterium E. coli, welches bei geringen Temperaturen nur ein sehr schlechtes Wachstum zeigt.A Temperature reduction leads to a slowing of protein synthesis. This can cause an overload the protein synthesis as well Folding machinery of the cells are avoided. The chaperones and Folding helper proteins of the cells get more time for the correct one Folding of the proteins. For an improved expression of foreign genes under low temperature conditions are expression systems of interest, which have a high activity at 18-22 ° C. WO96 / 03521 describes a cold-inducible Expression system for the Gram-negative mesophilic host Escherichia coli. This system based on the regulatory sequences of the main cold shock protein of E. coli, Csp. Furthermore, a cold-inducible expression system in which a mutant promoter of E. coli phage λ (pL) is used becomes. This promoter is made by low temperatures of less as 20 ° C active and thus allows selective expression of recombinant Genes under these conditions. The described expression systems should be a correct folding of recombinant proteins at temperatures below 20 ° C enable. A disadvantage of this method is the limitation to the Gram-negative Bacterium E. coli, which at low temperatures only a very shows poor growth.

Das wirtschaftliche Potential von technischen oder pharmazeutisch relevanten Proteinen ist sehr hoch einzuschätzen. Geeignete mikrobiologische Wirts-Vektor-Systeme zur Überproduktion kritischer Proteine sind bisher vor allem auf E. coli beschränkt. Es besteht daher ein Bedarf nach neuen alternativen Expressionssystemen für industriell gut bekannte Mikroorganismen, wie z.B. Bacillus subtilis. Diese Systeme sollten eine kostenkünstige und großtechnische Produktion kritischer bzw. thermolabiler Proteine ermöglichen. B. subtilis ist ein seit langer Zeit genutzter industrieller Wirt, der aufgrund seines GRAS-Status (GRAS = Generally Regaded As Safe) sowie seiner effizienten Sekretion von Proteinen in das extrazelluläre Medium eine besondere Stellung inne hat. Das Gram-positive Boden-Bakterium B. subtilis ist besser als E. coli an niedrige Temperaturen angepasst. Dieser Mikroorganismus zeigt bei 20 °C noch eine relativ gute Wachstumsaktivität.The economic potential of technical or pharmaceutically relevant Proteins are very high. Suitable microbiological host vector systems for overproduction Critical proteins are so far mainly limited to E. coli. It There is therefore a need for new alternative expression systems for industrial well known microorganisms, e.g. Bacillus subtilis. These Systems should be a cost-effective and large-scale Production of critical or thermolabile proteins allow. B. subtilis is a long-standing industrial host, due to his GRAS status (GRAS = Generally Regarded As Safe) and its efficient secretion of proteins into the extracellular medium holds a special position. The Gram-positive soil bacteria B. subtilis is better adapted to low temperatures than E. coli. This microorganism shows at 20 ° C still a relatively good growth activity.

Eine Vielzahl an Fremdproteinen kann für ausgewählte mikrobielle Wirte toxisch sein. Für die Expression dieser Proteine ist Voraussetzung, dass ein Expressionssystem zur Verfügung steht, welches ein sehr niedriges Basalniveau unter normalen Wachstumbedingungen zeigt. In der Regel wird zur Proteinüberproduktion ein zweistufiger Fed-Batch Fermentationsprozess durchgeführt. Zunächst werden die Zellen bis zu einer entsprechenden hohen Zelldichte. kultiviert. In dieser ersten Fermentationsphase ist das Expressionssystem abgeschaltet. Sobald die gewünschte Zelldichte erreicht ist, wird das Expressionssysten induziert. In dieser zweiten Phase der Fermentation wird das Fremdprotein überproduziert. In PCT WO 01/31040 wurde ein solches zweistufiges Verfahren auch für ein Kälte-induzierbares Expressionssystem vorgeschlagen. Dieses temperaturregulierbare Expressionssystem basiert bevorzugt auf der Expressionskontrollsequenz des cspB-Gens aus B. subtilis und wird durch einen Antisense-RNA-Mechanismus so reguliert, dass es bevorzugt bei niedrigen Temperaturen von z.B. 18 °C aktiv ist und bei 37 °C möglichst keine oder nur verminderte Aktivität zeigt. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass der starke cspB-Promotor bereits bei 37 °C hohe Aktivität zeigt. Diese Aktivität muss daher bei 37 °C über ein aufwändiges Kontrollsystem niedrig gehalten werden. Die dazu benötigten Sequenzen können zu einer unnötigen Belastung der Zellphysiologie führen. Dies könnte Strukturinstabilitäten in den entsprechenden regulativen Sequenzen hervorrufen und somit zu einer nur ineffizienten Expression des entsprechenden Systems führen. Weiterhin ist aufgrund der hohen Basalaktivität des cspB-Promotors von B. subtilis das in PCT WO 01/31040 vorgeschlagene System nicht ohne Weiteres für die Überexpression potentiell toxischer Genprodukte einsetzbar.A variety of foreign proteins may be toxic to selected microbial hosts. For the expression of these proteins, it is a prerequisite that an expression system is available which shows a very low basal level under normal growth conditions. As a rule, a two-stage fed-batch fermentation process is carried out for protein overproduction. First, the cells are up to a corresponding high cell density. cultured. In this first fermentation phase, the expression system is switched off. Once the desired cell density is achieved, the expression system is induced. In this second phase of the fermentation, the foreign protein is overproduced. In PCT WO 01/31040, such a two-stage process has also been proposed for a cold-inducible expression system. This temperature-regulatable expression system is preferably based on the expression control sequence of the cspB gene from B. subtilis and is regulated by an antisense RNA mechanism so that it is preferably active at low temperatures of, for example, 18 ° C and at 37 ° C shows as little or no activity as possible. A disadvantage of this system is that the strong cspB promoter shows high activity even at 37 ° C. This activity must therefore be kept low at 37 ° C via a complex control system. The required sequences can lead to an unnecessary burden on cell physiology. This could cause structural instabilities in the corresponding regulatory sequences and thus result in inefficient expression of the corresponding system. Furthermore, due to the high basal activity of the cspB promoter of B. subtilis, the system proposed in PCT WO 01/31040 can not readily be used for the overexpression of potentially toxic gene products.

Eine der vorliegenden Erfindungen zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, ein System zur temperaturregulierten Genexpression bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise ausgeräumt sind.A The object underlying the present inventions was therefore to provide a system for temperature-regulated gene expression, in which the disadvantages of the prior art at least partially cleared are.

Die Erfindung schlägt die Verwendung der Promotoren von zellulären Kälte-induzierbaren Desaturasen für den Einsatz in Niedrigtemperatur-Expressionssystemen zur heterologen Genexpression vor.The Invention proposes the use of the promoters of cellular cold-inducible desaturases for use in low temperature expression systems for heterologous gene expression.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung eines Genexpressionssystems, umfassend einen Desaturase-Promotor zur temperaturregulierten Expression eines heterologen Gens, das für ein kritisches, schwierig zu faltendes oder kälteangepasstes, thermolabiles Protein kodiert, in Mikroorganismen.One The invention thus relates to the use of a gene expression system, comprising a desaturase promoter for temperature-regulated expression a heterologous gene coding for a critical, difficult-to-fold or cold-adapted, thermolabile Protein encoded in microorganisms.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Systems zur Niedrigtemperatur-Genexpression in zumindest teilweise Desaturase-defizienten Gram-positiven Bakterien, umfassend

(a) eine Genexpressionseinheit enthaltend eine Expressionskontrollsequenz mit einem Desaturase(des)-Promotor in operativer Verknüpfung mit einem heterologen Gen, das für ein kritisches, schwierig zu faltendes oder kälteangepasstes, thermolabiles Protein kodiert und
(b) eine Regulationseinheit, welche die Transkription der Expressionskontrollsequenz (a) in Abhängigkeit von der Temperatur reguliert.

Another object of the invention is the use of a system for low-temperature gene expression in at least partially desaturase-deficient Gram-positive bacteria, comprising

(a) a gene expression unit comprising an expression control sequence having a desaturase (des) promoter operably linked to a heterologous gene encoding a critical, difficult-to-fold or cold-adapted, thermolabile protein, and
(b) a regulatory unit which regulates the transcription of the expression control sequence (a) as a function of the temperature.

Bevorzugt wird hierbei ein des-Promotor aus Gram-positiven Bakterien, vorzugsweise aus Bacilli, besonders bevorzugt aus B. subtilis (1A sowie Aguilar et al., 1998, J Bacteriol. 180:2194-2200) verwendet, der spezifisch durch eine Temperaturerniedrigung von 37 °C auf z.B. 22 °C, 20 °C oder 18 °C angeschaltet wird. Der des-Promotor ist der auf Transkriptionsebene am stärksten induzierbare Promotor von B. subtilis nach einem Kälteschock (Kaan et al., 2002, Microbiol. 148:3441-3455). Der erfindungsgemäße des-Promotor enthält eine funktionelle regulatorische Sequenz, z.B. eine DesR-Bindungsstelle, und eine funktionelle ribosomale Bindungsstelle. Weiterhin enthält er vorzugsweise die Nukleotide gemäß 1A (SEQ ID NO. 1) oder eine damit mindestens 90 % identische Nukleotidsequenz.Preference is given here to a des promoter from Gram-positive bacteria, preferably from Bacilli, particularly preferably from B. subtilis ( 1A and Aguilar et al., 1998, J Bacteriol. 180: 2194-2200) which is specifically turned on by a temperature decrease of 37 ° C to, for example, 22 ° C, 20 ° C or 18 ° C. The des promoter is the transcriptional-level most inducible promoter of B. subtilis after a cold shock (Kaan et al., 2002, Microbiol. 148: 3441-3455). The des promoter of the invention contains a functional regulatory sequence, eg a DesR binding site, and a functional ribosome binding site. Furthermore, it preferably contains the nucleotides according to 1A (SEQ ID NO. 1) or at least 90% identical nucleotide sequence.

Die Regulation der Genexpression des des-Promotors erfolgt vorzugsweise über eine Regulationseinheit, umfassend eine Nukleinsäure, die die Transkription des des-Promotors in Abhängigkeit von der Temperatur reguliert. Besonders bevorzugt erfolgt die Regulation über ein Zweikomponentensystem, welches sich aus DesK, einer Sensorkinase, und dem Response-Regulator DesR zusammensetzt (1B sowie Aguilar et al., 2001, EMBO J. 20:1681-1691). Es wird vermutet, dass sich, bedingt durch die Temperaturerniedrigung, die Fluidität der Membran vermindert und folglich die Autokinaseaktivität von DesK, einem bifunktionalen Enzym mit Kinase- und Phosphataseaktivität, induziert wird. Dies führt zu einer Phosphorylierung eines Histidins in der Transmitterdomäne von DesK. Die Phosphatgruppe wird anschließend auf den Response-Regulator DesR übertragen, welcher wiederum die Transkription des Desaturasegens anschaltet. Die Δ5-Desaturase führt spezifisch Doppelbindungen in die Fettsäureketten der Membranlipide ein. Die ungesättigten Fettsäuren bedingen eine Aufrechterhaltung der Fluidität und folglich Funktionalität der Membran von B. subtilis bei niedrigen Temperaturen. Gleichzeitig fungiert der hohe Spiegel an ungesättigten Fettsäuren in der Membran als negatives Signal für die des-Transkription. Vermutlich aktivieren die UFAs (unsaturated fatty acids) eine Dephosphorylierung von DesR durch DesK bzw. die UFAs interagieren mit einem DNA-bindenden-Protein, welches DesR von seiner Promotorbindungsstelle verdrängt. Dadurch ist die Expression der Desaturase in B. subtilis nur transient aktiv. Etwa zwei Stunden nach dem Kälteshift wird der des-Promotor wieder abgeschaltet.The regulation of gene expression of the des promoter is preferably carried out via a regulatory unit comprising a nucleic acid which regulates the transcription of the des promoter as a function of the temperature. Particularly preferably, the regulation takes place via a two-component system, which is composed of DesK, a sensor kinase, and the response regulator DesR ( 1B and Aguilar et al., 2001, EMBO J. 20: 1681-1691). It is believed that, due to the lowering of the temperature, the fluidity of the membrane is reduced and thus the autokinase activity of DesK, a bifunctional enzyme with kinase and phosphatase activity, is induced. This leads to phosphorylation of a histidine in the transmitter domain of DesK. The phosphate group is then transferred to the response regulator DesR, which in turn turns on the transcription of the desaturase gene. The Δ5-desaturase specifically introduces double bonds into the fatty acid chains of the membrane lipids. The unsaturated fatty acids cause maintenance of the fluidity and thus functionality of the B. subtilis membrane at low temperatures. At the same time, the high level of unsaturated fatty acids in the membrane acts as a negative signal for des-transcription. Presumably, the UFAs (unsaturated fatty acids) activate a dephosphorylation of DesR by DesK or UFAs interact with a DNA-binding protein, which displaces DesR from its promoter binding site. As a result, the expression of the desaturase in B. subtilis is only transiently active. About two hours after the cold shift, the des promoter is switched off again.

Vorzugsweise wird die Genexpression in einem Desaturase-defizienten Mikroorganismus durchgeführt. Durch eine Inaktivierung des des-Strukturgens wird die Desaturase nicht mehr oder nicht mehr in funktionaler Form gebildet. Damit wird die Membranfluidität nicht an die Niedrigtemperaturbedingungen durch die Einführung ungesättigter Fettsäuren angepasst, die Sensorkinase wird nicht inaktiviert und der des-Promotor ist bei niedrigen Temperaturen, z.B. 22 °C oder tiefer, nahezu konstitutiv bzw. lang anhaltender aktiv (2). Der des-Promotor kann demnach für eine lang anhaltende Expression eines Fremdgens bei niedrigen Temperaturen in einer des-Mutante genutzt werden. Die Membranfluidität in der des-Mutante bei niedrigen Temperaturen durch die Synthese von verzweigtkettigen Fettsäuren kann z.B. durch die Zugabe von Isoleucin zum Kulturmedium gewährleistet werden.Preferably, gene expression is performed in a desaturase-deficient microorganism. By inactivating the des-structural gene, the desaturase is no longer or no longer formed in functional form. Thus, the membrane fluidity is not affected by the low temperature conditions Adjustment of unsaturated fatty acids adjusted, the sensor kinase is not inactivated and the des promoter is at low temperatures, eg 22 ° C or lower, almost constitutive or long-lasting active ( 2 ). The des promoter can thus be used for long-term expression of a foreign gene at low temperatures in a des mutant. Membrane fluidity in the des-mutant at low temperatures through the synthesis of branched-chain fatty acids can be ensured, for example, by the addition of isoleucine to the culture medium.

Das System ermöglicht eine Kälte-induzierbare Überexpression in einer Vielzahl von Mikroorganismen, z.B. eukaryontischen Zellen wie Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris u.a., und Pilzen, z.B. Aspergillus niger u.a., oder prokaryontischen Zellen, z.B. Escherichia coli, Lactobacillus lactis, Staphylococcus carnosis, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis u.a., insbesondere in Gram-positiven Bakterien, z.B. in Baccili wie Bacillus subtilis, aber auch in Gram-negativen Bakterien.The System allows a cold-induced overexpression in a variety of microorganisms, e.g. eukaryotic cells such as yeasts, e.g. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, etc., and fungi, e.g. Aspergillus niger et al., Or prokaryotic cells, e.g. Escherichia coli, Lactobacillus lactis, Staphylococcus carnosis, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, etc., especially in Gram-positive Bacteria, e.g. in bacilli such as Bacillus subtilis, but also in Gram-negative Bacteria.

Die erfindungsgemäße Verwendung des Genexpressionssystems ist vorzugsweise zur Expression thermolabiler Proteine geeignet, d.h. es ermöglicht bei Temperaturen von ≤ 25 °C, besonders bevorzugt bei ≤ 20 °C, eine effiziente Transkription und Translation. Neben dem des-Promotor umfasst die Expressionskontrollsequenz günstigerweise die ribosomale Bindungsstelle eines Kälteschockgens, z.B. die ribosomale Bindungsstelle des des-Promotors oder eine heterologe ribosomale Bindungsstelle, wie etwa die des cspB-Gens von B. subtilis.The use according to the invention of the gene expression system is preferably more thermolabile for expression Proteins are suitable, i. allows at temperatures of ≤ 25 ° C, especially preferably at ≤ 20 ° C, an efficient Transcription and translation. In addition to the des-promoter includes the Expression control sequence conveniently the ribosomal binding site of a cold shock gene, e.g. the ribosomal Binding site of the des promoter or a heterologous ribosomal Binding site, such as the cspB gene of B. subtilis.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Erkenntnis, dass ausgewählte mRNAs Kälte-induzierbarer Gene von B. subtilis nach einem Kälteschock im Vergleich zur Gesamt-RNA eine deutlich verstärkte Stabilität aufweisen (Tab. 1). Insbesondere die polycistronischen mRNAs der Gene bkdB und mntA zeigen ausgeprägte Sekundärstrukturen am 3'-Ende (3). Die erhöhte Stabilität dieser mRNAs unter Niedrigtemperaturbedingungen scheint mit der Stärke der entsprechenden Sekundärstrukturen im Zusammenhang zu stehen. Die thermodynamische Stabilität Δ G der 3'-terminalen Sekundärstruktur ist vorzugsweise mindestens –20 kcal/mol. Besonders bevorzugt sind die in 3 gezeigten Sekundärstrukturen oder damit mindestens 80 % und insbesondere mindestens 90 % identische Nukleotidsequenzen. Eine Verknüpfung dieser Sekundärstrukturen mit den kodierenden Sequenzen rekombinanter Gene, kann zu einer erhöhten Stabilisierung der entsprechenden fremden mRNAs beitragen. Damit kann ein erhöhtes Expressionsniveau von Fremdgenen in der mikrobiellen Wirtszelle bei niedrigen Temperaturen erreicht werden, Aufgrund dieser Charakteristika wird durch das erfindungsgemäße Expressionssystem ein effektiverer Fermentationsprozess bei niedrigen Temperaturen durch eine effizientere Produktion und Faltung kritischer Fremdproteine ermöglicht.Another object of this invention is the finding that selected mRNAs of cold-inducible genes of B. subtilis after a cold shock in comparison to the total RNA have a significantly increased stability (Table 1). In particular, the polycistronic mRNAs of the genes bkdB and mntA show pronounced secondary structures at the 3'-end ( 3 ). The increased stability of these mRNAs under low temperature conditions appears to be related to the strength of the corresponding secondary structures. The thermodynamic stability .DELTA.G of the 3'-terminal secondary structure is preferably at least -20 kcal / mol. Particularly preferred are those in 3 shown secondary structures or at least 80% and in particular at least 90% identical nucleotide sequences. Linking these secondary structures with the coding sequences of recombinant genes can contribute to increased stabilization of the corresponding foreign mRNAs. Thus, an increased level of expression of foreign genes in the microbial host cell can be achieved at low temperatures. Because of these characteristics, the expression system of the present invention enables a more efficient low temperature fermentation process through more efficient production and folding of critical foreign proteins.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein System zur Niedrigtemperatur-Genexpression umfassend

(a) eine Genexpressionseinheit enthaltend eine Expressionskontrollsequenz mit einem Kälte-induzierbaren Promotor und einer Sequenz, die bei Transkription eine Sekundärstruktur im 3'-untranslatierten Bereich des Transkripts ergibt, in operativer Verknüpfung mit einem heterologen Gen oder einer Klonierungsstelle zur Einführung eines heterologen Gens und
(b) eine Regulationseinheit, welche die Transkription der Expressionskontrollsequenz (a) in Abhängigkeit von der Temperatur reguliert.

Another object of the present invention is thus a system for low-temperature gene expression comprising

(a) a gene expression unit containing an expression control sequence with a cold-inducible promoter and a sequence which upon transcription yields a secondary structure in the 3'-untranslated region of the transcript, operably linked to a heterologous gene or a cloning site for introduction of a heterologous gene and
(b) a regulatory unit which regulates the transcription of the expression control sequence (a) as a function of the temperature.

Das erfindungsgemäße System zur Niedrigtemperatur-Genexpression ist dadurch gekennzeichnet, dass die 3'-terminale Sekundärstruktur eine thermodynamische Stabilität von mindestens –20 kcal/mol aufweist. Bei diesem Aspekt der Erfindung kann die Expressionskontrollsequenz (a) einen beliebigen Kälte-induzierbaren Promotor umfassen, z.B. den cspB-Promotor, wie in WO 01/0301040 offenbart. Vorzugsweise handelt es sich jedoch um den zuvor beschriebenen des-Promotor, insbesondere den des-Promotor von B. subtilis.The inventive system for low-temperature gene expression is characterized in that the 3'-terminals secondary structure a thermodynamic stability of at least -20 kcal / mol. In this aspect of the invention, the expression control sequence (a) any cold-inducible Promoter, e.g. the cspB promoter, as in WO 01/0301040 disclosed. Preferably, however, it is the one described above the promoter, in particular the B. subtilis des promoter.

Die 3'-terminale Sekundärstruktur sorgt für eine verbesserte Stabilität der Fremd-mRNA bei niedrigen Temperaturen und damit für eine verbesserte Translation der entsprechenden mRNAs. Auf diese Weise wird ein Fermentationsprozess ermöglicht, bei dem in einer ersten Phase, der so genannten Wachstumsphase bei höheren Temperaturen, ein schnelles Wachstum der Wirtszellen erfolgt, während bei diesen Bedingungen keine oder nur sehr schwache Expression des gewünschten Proteins stattfindet. Sobald eine genügend hohe Zelldichte erreicht ist, kann dann die zweite Phase der Fermentation, die so genannte Produktionsphase beginnen. In dieser Phase wird das Expressionssystem durch Temperaturverringerung induziert und das kritische Protein überproduziert.The 3'-terminal secondary structure takes care of an improved stability the foreign mRNA at low temperatures and thus for improved Translation of the corresponding mRNAs. In this way, a fermentation process allows in the first phase, the so-called growth phase at higher temperatures, A rapid growth of host cells occurs while at these conditions no or only very weak expression of the desired Protein takes place. Once a sufficiently high cell density is reached is, then can the second phase of fermentation, the so-called Start production phase. At this stage, the expression system becomes induced by temperature reduction and overproducing the critical protein.

Neben einem Promotor enthält die Expressionskontrollsequenz (a) vorzugsweise eine ribosomale Bindungsstelle, besonders bevorzugt von einem kälteaktiven Gen, z.B. von des oder cspB von B. subtilis. Zusätzlich kann stromabwärts der ribosomalen Bindungsstelle eine translatierbare Nukleotidsequenz, insbesondere eine effizient bei niedrigen Temperaturen translatierbare Nukleotidsequenz, enthalten sein, die zur Verbesserung der Translationseffizienz der gewünschten Proteine dient. Diese translatierbare Nukleotidsequenz kann z.B. für den N-Terminus von Kälteschockproteinen kodieren, z.B. für die ersten 10 bis 20 Aminosäuren von CspB. Am Ende der translatierbaren Nukleotidsequenz kann ein Stopcodon lokalisiert sein, so dass die Translation in Form eines Cistrons mit zwei separaten kodierenden Bereichen (translationsverbesserndes Peptid bzw. Polypeptid und gewünschtes rekombinantes Protein) erfolgt. Alternativ kann das gewünschte rekombinante Protein auch als Fusionsprotein mit dem translationsverbessernden Peptid bzw. Polypeptid exprimiert werden, wobei in diesem Fall eine Spaltstelle, z.B. eine proteolytische Spaltstelle, zwischen den beiden genannten Domänen des Fusionsproteins eingebaut werden kann.In addition to a promoter, the expression control sequence (a) preferably contains a ribosomal Bin site, particularly preferably of a cold-reactive gene, for example of the or cspB of B. subtilis. In addition, downstream of the ribosomal binding site, a translatable nucleotide sequence, in particular a nucleotide sequence which can be efficiently translated at low temperatures, may be present, which serves to improve the translational efficiency of the desired proteins. For example, this translatable nucleotide sequence may encode the N-terminus of cold-shock proteins, eg, for the first 10 to 20 amino acids of CspB. At the end of the translatable nucleotide sequence, a stop codon may be located so that the translation takes place in the form of a cistron with two separate coding regions (translation-enhancing peptide or polypeptide and desired recombinant protein). Alternatively, the desired recombinant protein can also be expressed as a fusion protein with the translation-enhancing peptide or polypeptide, in which case a cleavage site, eg a proteolytic cleavage site, can be inserted between the two mentioned domains of the fusion protein.

Die Genexpressionseinheit kann weiterhin eine Klonierungsstelle in operativer Verknüpfung mit der Expressionskontrollsequenz (a) enthalten, um die Einklonierung eines gewünschten Zielgens zu ermöglichen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Genexpressionseinheit bereits ein Strukturgen, welches vorzugsweise für ein thermolabiles oder schwer zu faltendes, hydrophobes Protein kodiert, in operativer Verknüpfung mit der Expressionskontrollsequenz enthalten.The Gene expression unit may also have a cloning site in operative shortcut with the expression control sequence (a) to the Einklonierung a desired one To enable target gene. In another embodiment invention, the gene expression unit may already be a structural gene, which preferably for a thermolabile or difficult to fold hydrophobic protein encoded, in operative linkage containing the expression control sequence.

Die erfindungsgemäßen Genexpressionssysteme können auf einem oder zwei Vektoren oder auch auf dem Chromosom einer Wirtszelle lokalisiert sein. Die Vektoren sind vorzugsweise prokaryontische Vektoren, d.h. Vektoren, die zur Propagierung in einer prokaryontischen Wirtszelle fähig sind. Beispiele für derartige Vektoren sind Plasmidvektoren, Bakteriophagen, Cosmide, etc. Bevorzugt werden Vektoren verwendet, die für eine Propagierung in Gram-positiven prokaryontischen Wirtszellen, insbesondere B. subtilis, geeignet sind. Die Vektoren weisen einen für die jeweilige Wirtszelle geeigneten Replikationsursprung sowie vorzugsweise ein Antibiotikumresistenzgen auf, um eine Selektion zu ermöglichen.The Gene expression systems according to the invention can on one or two vectors or on the chromosome of a host cell be localized. The vectors are preferably prokaryotic Vectors, i. Vectors used for propagation in a prokaryotic Host cell capable are. examples for such vectors are plasmid vectors, bacteriophages, cosmids, etc. Preferably, vectors are used which are suitable for propagation in Gram-positive prokaryotic host cells, especially B. subtilis are. The vectors have one for the respective host cell suitable replication origin, and preferably an antibiotic resistance gene to enable a selection.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle, die ein erfindungsgemäßes Expressionssystem enthält. Vorzugsweise ist die Zelle eine Gram-positive Zelle, insbesondere eine B. subtilis Zelle.The The invention further relates to a cell comprising an expression system according to the invention contains. Preferably, the cell is a Gram-positive cell, in particular a B. subtilis cell.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem und die erfindungsgemäße Zelle können in einem Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Polypeptiden, insbesondere von thermolabilen Polypeptiden, in Prokaryonten verwendet werden.The Expression system according to the invention and the cell of the invention can in a process for the genetic engineering of polypeptides, in particular thermolabile polypeptides used in prokaryotes become.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Polypeptiden in einer prokaryontischen Zelle, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man

(i) eine Zelle bereitstellt, die ein erfindungsgemäßes Expressionssystem enthält,
(ii) die Zelle aus (i) in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen kultiviert, die zu einer Expression des gewünschten Polypeptids führen, und
(iii) das Polypeptid aus der Zelle oder aus dem Medium isoliert.

The invention thus also relates to a process for the genetic engineering of polypeptides in a prokaryotic cell, which is characterized in that

(i) providing a cell containing an expression system according to the invention,
(ii) the cell of (i) is cultured in a suitable medium and under suitable conditions which result in expression of the desired polypeptide, and
(iii) the polypeptide isolated from the cell or from the medium.

Die Kultivierung der Zelle in Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise auf solche Weise durchgeführt, dass bis zum Erreichen einer vorbestimmten Zelldichte die Expression des für das gewünschte Polypeptid kodierenden Gens weitgehend reprimiert ist. Nach Erreichen einer vorbestimmten Zelldichte wird durch Temperaturänderung, insbesondere Temperaturverringerung auf Temperaturen um 20 °C, die Expression des gewünschten Polypeptids induziert.The Culturing the cell in step (ii) of the method according to the invention is preferably carried out in such a way that until reaching a predetermined cell density, the expression of the desired polypeptide coding gene is largely repressed. After reaching a predetermined cell density is due to temperature change, especially temperature reduction to temperatures around 20 ° C, the Expression of the desired Induced polypeptide.

Die Erfindung wird weiterhin durch nachfolgende Tabellen bzw. Figuren und Beispiele erläutert. Es zeigen: The Invention is further characterized by the following tables or figures and examples are explained. Show it:

Tabelle 1 Stabilität der Gesamt mRNA im Vergleich zu ausgewählten mRNAs Kälte-induzierbarer Gene von B. subtilis bei 37 °C und 18 °Ctable 1 stability of total mRNA compared to selected mRNAs of cold-inducible genes B. subtilis at 37 ° C and 18 ° C

1(A) die regulatorische Sequenz des Kälte-induzierbaren Gens des von B. subtilis bis zum Startcodon ATG (SEQ ID No. 1) (+ 1 der des mRNA: fett markiert und unterstrichen, Startcodon: fett markiert, potentielle DesR-Bindestelle: eingerahmt, Ribosomale Bindungssequenz (RBS): unterstrichen),
(B) die Sequenz des Zweikomponentensystems des RK (SEQ ID No. 2) (RBS: fett markiert, Terminator: unterstrichen), 1 (A) the regulatory sequence of the cold-inducible gene of B. subtilis to the start codon ATG (SEQ ID No. 1) (+ 1 of the mRNA: bold and underlined, start codon: bold, potential DesR binding site: framed, ribosomal binding sequence (RBS): underlined),
(B) the sequence of the two-component system of the RK (SEQ ID No. 2) (RBS: marked in bold, terminator: underlined),

2 Expression einer des-IacZ-Fusion nach einer Temperaturverringerung von 37 °C auf 20 °C im Wildtyp sowie in einer des-Mutante, 2 Expression of a desacyl-fusion after a temperature reduction of 37 ° C to 20 ° C in the wild type and in a des mutant,

3 die schematische Darstellung der 3'-terminalen Sekundärstrukturen der polycistronischen mRNAs der Kälte-induzierten Gene bkdB und mntA 3 the schematic representation of the 3'-terminal secondary structures of the polycistronic mRNAs of the cold-induced genes bkdB and mntA

1. Material und Methoden1. Material and methods

Für die in der Tabelle 1 sowie in den 1-3 dargestellten Experimente und Ergebnisse wurde der B. subtilis Stamm 168 (trpC2) verwendet (Aganostopoulos, C., and 1. Spizizen. J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746). B, subtilis wurde in einem Minimalmedium, wie bei Stülke et al. (1993) (J. Gen. Microbiol. 139: 2041-2045) beschrieben, kultiviert. Der Kälteschock wurde durch eine Temperaturverringerung von 37 °C auf 18 °C bei einer optischen Dichte der Kultur von 0.5 ausgelöst.For those in Table 1 and in the 1 - 3 The experiments and results presented have used B. subtilis strain 168 (trpC2) (Aganostopoulos, C., and 1. Spizizen, J. Bacteriol 81 (1961) 741-746). B, subtilis was in a minimal medium, as in Stülke et al. (1993) (J. Gen. Microbiol 139: 2041-2045). The cold shock was triggered by a temperature reduction from 37 ° C to 18 ° C at a culture optical density of 0.5.

Die Isolation von Gesamt-RNA sowie Northern-blot Experimente zur Bestimmung der mRNA-Stabilitäten wurden so durchgeführt, wie bei Homuth et al. beschrieben (J. Bacteriol. 179 (1997) 1153-1164). Die Mengen der einzelnen mRNAs in den Stabilitätsversuchen wurden mit Hilfe Digoxigenin-markierter spezifischer RNA Sonden bestimmt. Dazu wurden die Sonden in vitro mit Hilfe der T7 RNA Polymerase und Gen-spezifischen PCR Produkten als Matrize transkribiert. Die Synthese der PCR-Matrizen wurde mit Hilfe der folgenden Oligonukleotide durchgeführt: für die apt Sonde, APT-5' (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCCGGGTAA-3') (SEQ ID No. 3) und APT-3' (5'-GGATTACCCGAAAGA-3') (SEQ ID No. 4); für bkdB, BKDB-5' (5'-TGAAC AAATGACGATGCCGC-3') (SEQ ID No. 5) und BKDB-3' (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTTTATCACCGGC TGCAGA-3') (SEQ ID No. 6); (für bkdR, BKDB-5' (5'-ATAGTAGGTGCC GGCAAAAG-3') (SEQ ID No. 7) und BKDR-3' (5'-CTAATACGACTCACTA TAGG GAGAAATGATCGCCTAACAGCTGC-3') (SEQ ID No. 8); für lpdV, LPDV-5' (5'-ATGACGT AGTCATTCTGGGC-3') (SEQ ID No. 9) und LPDV-3'(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTCAGTCGGCAATATG CGA-3') (SEQ ID No. 10); für mntA, MNTA-5' (5'-TTGCGACC TTTGCTTTAACG-3') (SEQ ID No. 11) und MNTA-3' (5'-CTAATACGACTC ACTATAGGGAGATCTTTTGTGCCCTTTTCACC-3') (SEQ ID No. 12); für ptb, PTB-5' (5'-ATGAAGCTGAAAG ATTTAAT-3') (SEQ ID No. 13) und PTB-3' (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGGCCCCTTTTGTACAT TT-3') (SEQ ID No. 14); für purA, PURA-5' (5'-CTAATACGACTCTCAC TATAGGGAGATTCGCACGGTACACA-3') (SEQ ID No. 15) und PURA-3' (5'-CAGTAGTTGT AGTAG-3') (SEQ ID No. 16); für yvfG, YVFG-5' (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGAC TCCACGTTTGACTT-3') (SEQ ID No. 17) und YVFG-3' (5'-CCGTCCCTTATTTTA-3') (SEQ ID No. 18). Die unterstrichene Sequenz entspricht der T7-Promotorregion.The Isolation of total RNA as well as Northern blot experiments for determination the mRNA stabilities were done that way, as in Homuth et al. (J. Bacteriol 179 (1997) 1153-1164). The amounts of the individual mRNAs in the stability experiments were determined with the aid of Digoxigenin-labeled specific RNA probes determined. In addition were the probes in vitro using the T7 RNA polymerase and gene-specific Transcribed PCR products as a template. The synthesis of PCR templates was performed using the following oligonucleotides: for the apt Probe, APT-5 '(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCCGGGTAA-3') (SEQ ID No. 3) and APT-3 '(5'-GGATTACCCGAAAGA-3') (SEQ ID No. 4); for bkdB, BKDB-5 '(5'-TGAAC AAATGACGATGCCGC-3') (SEQ ID No. 5) and BKDB-3 '(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTTTATCACCGGC TGCAGA-3 ') (SEQ ID No. 6); (For bkdR, BKDB-5 '(5'-ATAGTAGGTGCC GGCAAAAG-3') (SEQ ID No. 7) and BKDR-3 '(5'-CTAATACGACTCACTA TAGG GAGAAATGATCGCCTAACAGCTGC-3 ') (SEQ ID No. 8); For lpdV, LPDV-5 '(5'-ATGACGT AGTCATTCTGGGC-3') (SEQ ID No. 9) and LPDV-3 '(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTCAGTCGGCAATATG CGA-3 ') (SEQ ID No. 10); For mntA, MNTA-5 '(5'-TTGCGACC TTTGCTTTAACG-3') (SEQ ID No. 11) and MNTA-3 '(5'-CTAATACGACTC ACTATAGGGAGATCTTTTGTGCCCTTTTCACC-3') (SEQ ID NO 12); for ptb, PTB-5 '(5'-ATGAAGCTGAAAG ATTTAAT-3') (SEQ ID No. 13) and PTB-3 '(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGGCCCCTTTTGTACAT TT-3') (SEQ ID NO 14); for purA, PURA-5 '(5'-CTAATACGACTCTCAC TATAGGGAGATTCGCACGGTACACA-3 ') (SEQ ID No. 15) and PURA-3 '(5'-CAGTAGTTGT AGTAG-3') (SEQ ID No. 16); for yvfG, YVFG-5 '(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGAC TCCACGTTTGACTT-3 ') (SEQ ID No. 17) and YVFG-3 '(5'-CCGTCCCTTATTTTA-3') (SEQ ID No. 18). The underlined sequence corresponds to the T7 promoter region.

Zur Bestimmung der Gesamt-RNA-Stabilität wurde die B. subtilis Kultur bei 37 °C bzw. 18 °C bis zu einer OD von 0.5 kultiviert und anschließend 1,5 ml Kultur in ein Röhrchen mit 30 μl radioaktiven Uridin vermischt ([5,6-³H]-Uridin, Amersham Biosciences, Freiburg, BRD), 1 mCi/ml, 740 GBq/mmol) und bei der entsprechenden Temperatur für 2 min inkubiert. Anschließend wurde 22,5 μl einer 1:2 Mixtur (vol/vol) von Rifampicin (5 mg/ml, Sigma, Taufkirchen, BRD) und nicht-radioaktives Uridin (2 mg/ml, Sigma, Taufkirchen, BRD) zugegeben. Nach verschiedenen Zeiten (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.5, 10, 12.5, 15, 20 und 25 min bei 37 ° C und 0, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 min bei 18 ° C) wurden jeweils 50 μl Probe entnommen und auf Filterpapierscheiben aufgetragen. Die Filterscheiben wurden sofort in gekühlte 10 % Trichloressigsäure (TCA, Roth) gegeben und 30 min bei 4 ° C inkubiert. Nach dem Waschen der Filterscheiben wurden diese getrocknet und in Scintillationslösung in einem Scintillationsmessgerät analysiert (Tricarb 2900TR, Packard).To determine total RNA stability, the B.subtilis culture was cultured at 37 ° C. or 18 ° C. to an OD of 0.5 and then 1.5 ml of culture were mixed into a tube containing 30 μl of radioactive uridine ([5, 6- ³ H] uridine, Amersham Biosciences, Freiburg, Germany), 1 mCi / ml, 740 GBq / mmol) and incubated at the appropriate temperature for 2 min. Subsequently, 22.5 μl of a 1: 2 mixture (vol / vol) of rifampicin (5 mg / ml, Sigma, Taufkirchen, Germany) and non-radioactive uridine (2 mg / ml, Sigma, Taufkirchen, Germany) were added. After different times (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.5, 10, 12.5, 15, 20 and 25 min at 37 ° C and 0, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10 , 20, 40, 60, 80, 100 and 120 min at 18 ° C) were each 50 ul sample taken and applied to filter paper discs. The filter discs were immediately placed in chilled 10% trichloroacetic acid (TCA, Roth) and incubated at 4 ° C for 30 min. After washing the filter discs, they were dried and analyzed in scintillation solution in a scintillation meter (Tricarb 2900TR, Packard).

Die transkriptionelle Promotorfusion des des-Promoters mit dem Reportergen lacZ wurde, wie bei Kaan et al. (1999) (Mol Gen Genet. 262:351-354) beschrieben, konstruiert. Der β-Galaktosidase-Enzym-Assay wurde nach Miller (1972) (Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) durchgeführt. Die B. subtilis des-Mutante wurde, wie bei Aguilar et al. (2001) beschrieben, konstruiert (EMBO J. 20: 1681-1691).The transcriptional promoter fusion of the des promoter with the reporter gene lacZ, as described in Kaan et al. (1999) (Mol Gen Genet 262: 351-354) described, constructed. The β-galactosidase enzyme assay was after Miller (1972) (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.). The B. subtilis des mutant, as in Aguilar et al. (2001) (EMBO J. 20: 1681-1691).

2. Ergebnisse2 results

Die Halbwertszeit der Gesamt-mRNA wurde mit 2,68 min bei 37 °C bestimmt, wobei ein 6,5-facher Anstieg auf 17,47 min bei 18 °C beobachtet werden konnte (Tab. 1). Für die Bestimmung der Halbwertszeit der spezifischen mRNAs bei 37 °C und 18 °C wurden die Zellen bei 37 °C und 18 ° C kultiviert und Proben zur RNA-Isolation zu den unter Material und Methoden angegebenen verschiedenen Zeitpunkten nach der Inhibition der Transkriptionsinitiation durch die Zugabe von Rifampicin genommen. Die Ergebnisse der mRNA-Stabilitätsversuche für die Gene cspB, apt, lpdV, mntA, purA und yvfG sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Durch diese Experimente konnte eine signifikant stärkere Stabilisierung dieser spezifischen mRNAs im Vergleich zur Gesamt-RNA nachgewiesen werden. Sekundärstrukturen 3'-stromabwärts der kodierenden Sequenz der mRNAs von lpdV (bkdB) sowie von mntA (mntD) bei 18 °C sowie deren ΔG Werte wurden nach Zuker (2003) (Nucleic Acids Res. 31: 3406-3415) bestimmt (3). Das Gen lpdV liegt im bkd-Operon von B. subtilis. Das Gen mntA liegt im mnt-Operon von B. subtilis zusammen mit dem Gen mntD.The half-life of the total mRNA was determined to be 2.68 minutes at 37 ° C, with a 6.5-fold increase to 17.47 minutes at 18 ° C (Table 1). For the determination of the half-life of the specific mRNAs at 37 ° C and 18 ° C, the cells were cultured at 37 ° C and 18 ° C and samples for RNA isolation at the different times indicated under material and methods after inhibition of Transkriptionsinitiation by the Addition of rifampicin taken. The results of the mRNA stability experiments for the genes cspB, apt, lpdV, mntA, purA and yvfG are summarized in Table 1. By these experiments, a significantly stronger stabilization of these specific mRNAs compared to the total RNA could be detected. Secondary structures 3 'downstream of the coding sequence of mRNAs of lpdV (bkdB) and of mntA (mntD) at 18 ° C. and their ΔG values were determined according to Zuker (2003) (Nucleic Acids Res. 31: 3406-3415) ( 3 ). The gene lpdV is in the bkd operon of B. subtilis. The gene mntA is in the mnt operon of B. subtilis together with the gene mntD.

Wachstumsexperimente mit einer transkriptionellen des-lacZ-Fusion zeigten im B. subtilis Wildtyp eine vorübergehende Induktion der β-Galaktosidaseaktivität nach einer Temperaturverringerung von 37 °C auf 22 °C (2A). In einer B. subtilis des-Mutante konnte jedoch eine länger anhaltende Erhöhung der β-Galaktosidaseaktivität bestimmt werden ( 2B). SEQUENCE LISTING

Growth experiments with a transcriptional des-lacZ fusion showed a transient induction of β-galactosidase activity in the B. subtilis wild type after a temperature reduction from 37 ° C. to 22 ° C. ( 2A ). In a B. subtilis des mutant, however, a prolonged increase in β-galactosidase activity could be determined ( 2 B ). SEQUENCE LISTING

Claims

Use of a gene expression system comprising a desaturase (des) promoter for temperature-regulated expression of a heterologous gene encoding a critical, difficult-to-fold or cold-adapted, thermolabile protein, characterized in that gene expression in at least partially desaturase-deficient Gram-positive bacteria at a temperature of 22 ° C or lower.

Use according to claim 1, characterized a B. subtilis des promoter is used.

Use according to claim 1 or 2, characterized in that the des promoter the nucleotides according to 1A or contains at least 90% identical nucleotide sequence.

Use according to any one of claims 1 to 3 in a cold-inducible gene expression system.

Use according to one of Claims 1 to 4, characterized that the gene expression system continues to be the ribosomal binding site a cold shock gene includes.

Use according to claim 5, characterized that the gene expression system continues to be one at low temperatures contains translatable nucleotide sequence.

Use according to one of claims 1 to 6, characterized that the gene expression system continues to be a regulatory unit which involves the transcription of the des promoter in dependence regulated by the temperature.

Use according to claim 7, characterized that the regulatory unit contains a sensor kinase and a response regulator, wherein the response regulator is activated by a cold-induced kinase reaction becomes.

Use according to one of claims 1 to 8, characterized that gene expression is carried out in B. subtilis.

Use of a system for low temperature gene expression in at least partially desaturase-deficient Gram-positive bacteria, full (a) a gene expression unit containing an expression control sequence with a desaturase (des) promoter in operative association with a heterologous gene responsible for a critical, difficult-to-fold or cold-adapted thermolabile Protein encoded, and (b) a regulatory unit comprising the Transcription of the expression control sequence (a) depending on regulated by the temperature.

A system for low temperature gene expression, comprising (a) a gene expression unit comprising a first expression control sequence with a cold-inducible promoter and a sequence which upon transcription yields a secondary structure in the 3 'untranslated region of the transcript, operably linked to a heterologous gene or cloning site to induce a heterologous gene and (B) a regulatory unit which regulates the transcription of the first expression control sequence (a) as a function of the temperature, characterized in that the 3'-terminal secondary structure has a thermodynamic stability of at least -20 kcal / mol.

System according to claim 11, characterized in that that the 3'-terminal secondary structure from the bkdB or mntA gene from B. subtilis.

A cell containing a system for low temperature gene expression according to one of the claims 1 1 or 12.

Cell according to claim 13, characterized that she is a B. subtilis cell.