DE10327937A1

DE10327937A1 - Use of cyclophilin D or creatine kinase for inhibiting apoptosis, useful for treating e.g. cardiac infarct and in drug screening, also use of their inhibitors for treating tumors

Info

Publication number: DE10327937A1
Application number: DE2003127937
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Grimm; Alexis Schubert
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2004-01-08

Abstract

Use of cyclophilin D (I) and/or creatine kinase (II), or their biologically active fragments or derivatives; nucleic acids that encode them, and their activators (collectively (A)), for inhibiting apoptotic processes that are not associated with ANT-1 (adenine nucleotide translocase-1). Independent claims are also included for the following: (1) pharmaceutical composition containing (i) fusion protein of (I) or (II) with a heterologous protein, (ii) a derivative of (I) without chaperone function, (iii) a derivative of (II) without enzymatic activity and (iv) nucleic acid encoding (i)-(iii); (2) use of an inhibitor of (I) or (II) for inhibiting hyperproliferation and/or autoimmune processes; (3) transgenic non-human organism, or eukaryotic cell, that under- or over-expresses (I) and/or (II); and (4) use of an effector molecule directed against the amino acid regions 1-17, 67-107 and/or 151-170 regions of ANT-1 for modulating ANT-1 associated apoptosis. ACTIVITY : Cardiant; Cerebroprotective; Vasotropic; Nootropic; Neuroprotective; Antiparkinsonian; Ophthalmological; Hepatotropic; Antianemic; Anti-AIDS; Cytostatic; Immunosuppressive; Nephrotropic; Virucide. No details of tests for these activities are given. MECHANISM OF ACTION : (A) inhibit apoptotic processes associated with: activation of permeability transition pores; caspase 8, tBid and/or bax; inhibitors of tumor necrosis factor/cycloheximide; UV light and/or diarsenic trioxide; cytostatics or hypoxia. No biological data given.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Cyclophilin D oder/und Creatinkinase, dafür kodierender Nukleinsäuren bzw. Aktivatoren oder Inhibitoren davon zur Modulation, beispielsweise Hemmung oder Stimulation von apoptotischen Prozessen. Weiterhin werden Bereiche des ANT-1 Proteins, die mit apoptiotischen Prozessen assoziiert sind, offenbart.The invention relates to the use of cyclophilin D or / and creatine kinase, nucleic acids coding therefor or Activators or inhibitors thereof for modulation, for example Inhibition or stimulation of apoptotic processes. Farther are areas of the ANT-1 protein that are associated with apoptiotic processes are associated.

Die Verwendung der Adeninnukleotidtranslokase-1 (ANT-1) als Komponente der Permeabilitätstransitionspore (PT-Pore) in Mitochondrien als Target zur Beeinflussung von Apoptose ist aus WO 01/19384 bekannt. Weiterhin wird dort die Verwendung von Cyclophilin D als ANT-1 Antagonist beschrieben.The use of adenine nucleotide translocase-1 (ANT-1) as a component of the permeability transition pore (PT pore) in mitochondria as a target for influencing apoptosis is out WO 01/19384 known. The use of cyclophilin D as an ANT-1 antagonist is also described there.

Im Rahmen der zur vorliegenden Erfindung führenden Experimente wurde gefunden, dass Cyclophilin D auch eine Hemmung von nicht mit ANT-1 assoziierten apoptotischen Prozessen bewirken kann. So konnte ausgeschlossen werden, dass Cyclophilin D den Import von ANT-1 in die Mitochondrien (zum Ort der Apoptose-Induktion) verhindert (Beispiel 4). Die Apoptose-Induktion durch Caspase 8 und tBid kann durch Cyclophilin D reprimiert werden (Beispiele 6 und 7), die Apoptose-Induktion durch Caspase 2 jedoch nicht (Beispiel 10). Es konnte gezeigt werden, dass diese Wirkungen von Cyclophilin D an das Vorhandensein einer aktivierten PT-Pore geknüpft sind, Cyclophilin D also ein spezifischer Repressor der Apoptose bei aktivierter PT-Pore ist.Within the scope of the present invention Experiments have found that cyclophilin D is also an inhibitor of apoptotic processes not associated with ANT-1. It was thus ruled out that Cyclophilin D could not import ANT-1 in the mitochondria (to the site of apoptosis induction) prevented (Example 4). Apoptosis induction by Caspase 8 and tBid can can be repressed by cyclophilin D (Examples 6 and 7), apoptosis induction by Caspase 2, however, not (Example 10). It could be shown, that these effects of cyclophilin D depend on the presence of a activated PT pore are knotted, Cyclophilin D is a specific repressor of apoptosis when activated PT pore is.

Weiterhin wurde gefunden, dass Creatinkinase ein Target zur Beeinflussung apoptotischer Prozesse darstellt, wobei diese Prozesse mit ANT-1 assoziiert oder nicht mit ANT-1 assoziiert sein können. Creatinkinase ist in der Lage, Apoptose zu reprimieren (Beispiel 3). Sowohl Cyclophilin D als auch Creatinkinase sind Bestandteile der PT-Pore.Furthermore, it was found that creatine kinase represents a target for influencing apoptotic processes, whereby these processes are associated with ANT-1 or not associated with ANT-1 could be. creatine is able to repress apoptosis (Example 3). Both cyclophilin D and creatine kinase are components of the PT pore.

Unter apoptotischen Prozessen, die nicht mit ANT-1 assoziiert sind, werden solche Prozesse verstanden, die ohne Beteiligung von ANT-1 ablaufen können. Eine Unterscheidung ließe sich beispielsweise durch einen Nachweis der Expression von ANT-1 per PCR oder Western-Blot durchführen. Das Niveau der normalen endogenen Expression lässt sich so leicht von einer erhöhten, krankhaften ANT-1-Expression unterscheiden.Among apoptotic processes that are not associated with ANT-1, such processes are understood that can take place without the participation of ANT-1. A distinction could be made for example by detecting the expression of ANT-1 per Perform PCR or Western blot. The level of normal endogenous expression can be easily ascertained from one increased, distinguish pathological ANT-1 expression.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit die Verwendung von Cyclophilin D oder/und Creatinkinase, einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon, oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure oder eines Aktivators von Cyclophilin D oder Creatinkinase zur Hemmung von nicht mit ANT-1 assoziierten apoptotischen Prozessen.A first aspect of the present The invention thus relates to the use of cyclophilin D or / and Creatine kinase, a biologically active fragment or derivative thereof, or one for it coding nucleic acid or an activator of cyclophilin D or creatine kinase for inhibition of apoptotic processes not associated with ANT-1.

Cyclophiline katalysieren die cis-trans-Isomerisierung von Prolyl-Peptid-Bindungen in Proteinen. Cyclophiline finden sich in verschiedenen Isoformen in spezifischen subzellulären Komponenten:
Cyclophilin A im Cytosol, Cyclophilin B und C im endoplasmatischen Retikulum. Cyclophilin D, ein 19 kD Protein, ist in der Mitochondrienmatrix lokalisiert. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von humanen Cyclophilin D ist in GenBank Akzessions Nr. NM_005038 und BC 030707 beschrieben.Cyclophilins catalyze the cis-trans isomerization of prolyl peptide bonds in proteins. Cyclophilins are found in various isoforms in specific subcellular components:
Cyclophilin A in the cytosol, Cyclophilin B and C in the endoplasmic reticulum. Cyclophilin D, a 19 kD protein, is localized in the mitochondrial matrix. The nucleotide and amino acid sequence of human cyclophilin D is described in GenBank Accession No. NM_005038 and BC 030707.

Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der humanen Creatinkinase ist in GenBank Akzessions Nr. NM_001825, NM_020990 und BC 029140 beschrieben.The nucleotide and amino acid sequence the human creatine kinase is in GenBank accession no. NM_001825, NM_020990 and BC 029140.

Die Erfindung erfasst neben Cyclophilin oder Creatinkinase auch biologisch aktive Fragmente, vorzugsweise mit einer Länge von mindestens 6, vorzugsweise mindestens 8 und besonders bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren oder Derivate davon, z. B. Cyclophilin D-Derivate ohne Chaperonfunktion bzw. Creatinkinase-Derivate ohne Enzymfunktion. Der Begriff "biologisch aktiv" bedeutet in diesem Zusammenhang die Fähigkeit zur Modulation von apoptotischen Prozessen. Da Cyclophilin D oder Creatinkinase die ANT-1 assoziierte Apoptose als auch die nicht mit ANT-1 assoziierte Apoptose reprimieren können, betrifft die Wirkung der biologisch aktiven Fragmente oder Derivate von Cyclophilin D oder Creatinkinase sowohl die ANT-1 assoziierte Apoptose als auch die nicht mit ANT-1 assoziierte Apoptose.In addition to cyclophilin, the invention also covers or creatine kinase, also biologically active fragments, preferably with a length of at least 6, preferably at least 8 and particularly preferably at least 10 amino acids or derivatives thereof, e.g. B. Cyclophilin D derivatives without chaperone function or creatine kinase derivatives without Enzyme function. The term "biological active "means in this context the ability for the modulation of apoptotic processes. Because cyclophilin D or Creatine kinase the ANT-1 associated apoptosis as well as that Repress apoptosis associated with ANT-1 affects the effect the biologically active fragments or derivatives of cyclophilin D or creatine kinase both ANT-1 associated apoptosis as well apoptosis not associated with ANT-1.

Weiterhin erfasst die Erfindung die Verwendung von für Cyclophilin oder Creatinkinase bzw. Fragmente oder Derivate davon kodierenden Nukleinsäuren. Bevorzugt ist die Verwendung von doppelsträngigen oder einzelsträngigen Nukleinsäuren, umfassend in den obigen Akzessions Nummern offenbarten Sequenzen, dazu komplementären Sequenzen oder damit unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Sequenzen. Eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen liegt vor, wenn ein positives Hybridisierungssignal nach Waschen für 1 h mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C und insbesondere für 1 h in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C beobachtet wird. Eine Nukleinsäuresequenz, die unter den angegebenen Waschbedingungen mit den für Cyclophilin D oder Creatinase kodierenden Sequenzen (siehe GenBank Akzessions Nr.) oder komplementären Sequenzen dazu hybridisiert oder eine im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes einer solchen Sequenz entsprechende Sequenz wird von der vorliegenden Erfindung erfaßt.Furthermore, the invention covers the Use of for Cyclophilin or creatine kinase or fragments or derivatives thereof coding nucleic acids. The use of double-stranded or single-stranded nucleic acids is preferred sequences disclosed in the above accession numbers, sequences complementary thereto or sequences that hybridize under stringent conditions. Hybridization under stringent conditions exists if a positive hybridization signal after washing for 1 h with 1 × SSC and 0.1% SDS at 50 ° C, preferably at 55 ° C, particularly preferred at 62 ° C and most preferably at 68 ° C and especially for 1 h in 0.2 x SSC and 0.1% SDS at 50 ° C, preferably at 55 ° C, particularly preferred at 62 ° C and most preferably at 68 ° C is observed. A nucleic acid sequence, the under the specified washing conditions with those for cyclophilin Sequences encoding D or creatinase (see GenBank accessions No.) or complementary Sequences hybridized to it or one in the context of the degeneration of sequence corresponding to genetic codes of such a sequence covered by the present invention.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Aktivatoren von Cyclophilin D oder Creatinkinase. Solche Aktivatoren können durch ein – wie im folgenden beschriebenes – Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen aufgefunden werden.The invention further relates to the use of activators of cyclophilin D or creatine kinase. Such activators can through a - like process described below to identify active substances.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Hemmung von nicht mit ANT-1 assoziierten apoptotischen Prozessen, die durch eine Aktivierung der Permeabilitätstransitions-(PT)-Pore vermittelt werden. Weiterhin bevorzugt ist die Hemmung von mit Caspase 8 oder/und tBid oder/und Bax assoziiierten apoptotischen Prozessen bzw. die Hemmung von durch Cytostatika oder/und Hypoxiebedingungen oder/und durch exogene Stimuli, wie TNF/Cycloheximid (CHX), UV-Licht oder/und Diarsentrioxid, vermittelten apoptotischen Prozessen.A preferred embodiment of the invention relates to the inhibition of apoptotic processes not associated with ANT-1, which are caused by an Ak activation of the Permeability Transition (PT) pore. Also preferred is the inhibition of apoptotic processes associated with Caspase 8 or / and tBid or / and Bax or the inhibition of by cytostatics or / and hypoxic conditions and / or by exogenous stimuli such as TNF / cycloheximide (CHX), UV light or / and diarsen trioxide, mediated apoptotic processes.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Diagnose oder/und Therapie von mit Apoptose assoziierten Krankheiten, vorzugsweise von Krankheiten hervorgerufen oder begleitet von nicht mit ANT-1 assoziierten apoptotischen Prozessen. Derartige Krankheiten sind beispielsweise ausgewählt aus Herzinfarkt, Schlaganfall, Reperfusionsschäden, neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, cerebralen Degenerationen, Retinitis, amylotropher lateraler Sklerosis, Toxin- oder Virus-induzierten Leberkrankheiten, Gewebsschädigungen durch Ischämie, Myelodisplasie, z. B. aplastischer Anämie, und AIDS.Another preferred aspect of The present invention is the diagnosis and / or therapy of with Apoptosis-associated diseases, preferably diseases evoked or accompanied by non-ANT-1 associated apoptotic Processes. Such diseases are selected from, for example Heart attack, stroke, reperfusion damage, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease, cerebral degeneration, Retinitis, amylotrophic lateral sclerosis, toxin or virus induced Liver disease, tissue damage through ischemia, Myelodisplasia, e.g. B. more aplastic Anemia, and AIDS.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von pharmakologischen Wirkstoffen, das insbesondere als Screeningverfahren durchgeführt wird und die Fähigkeit einer Testsubstanz zur Modulation, z. B. die Hemmung oder Aktivierung von Cyclophilin D oder Creatinkinase, vorzugsweise der Apoptose hemmenden Aktivität von Cyclophilin D oder Creatinkinase umfasst.Another aspect of the invention is a procedure for the identification of pharmacological agents, which is carried out in particular as a screening process and the ability a test substance for modulation, e.g. B. inhibition or activation of cyclophilin D or creatine kinase, preferably the apoptosis inhibitory activity of Cyclophilin D or creatine kinase includes.

Die Identifizierung von Cyclophilin D oder Creatinkinase-Modulatoren kann als Hochdurchsatztest erfolgen, welcher vorzugsweise die parallele Bestimmung von mindestens 24 und besonders bevorzugt mindestens 96 Testverbindungen umfassen. Das Verfahren kann als Zell – basierender Test durchgeführt werden, wobei man ein Testsystem verwendet, das Cyclophilin D oder/und Creatinkinase enthaltende Zellfraktionen oder Cyclophilin D oder/und Creatinkinase enthaltende vollständige Zellen, insbesondere eukaryontische Zellen, gekennzeichnet durch eine Über- oder Unterexpression von Cyclophilin D oder/und Creatinkinase umfasst. Weiterhin kann das Verfahren auch die Verwendung von transgenen nichthumanen Lebewesen gekennzeichnet durch eine Über- oder Unterexpression von Cyclophilin D oder/und Creatinkinase umfassen. Beispiele für transgene nichthumane Lebewesen sind Säuger, z. B. Ratte oder Maus, Fische, z. B. Zebrafisch (D. rerio) und Nematoden, z. B. C. elegans. Alternativ kann das Verfahren auch als molekularer Test durchgeführt werden, umfassend die Verwendung eines im wesentlichen auf gereinigten oder isolierten Cyclophilin D oder/und Creatinkinase-Proteins oder Fragmenten davon.The identification of cyclophilin D or creatine kinase modulators can be used as a high throughput test, which is preferably the parallel determination of at least 24 and particularly preferably comprise at least 96 test compounds. The Process can be cell based test completed are, using a test system, the cyclophilin D or / and Cell fractions containing creatine kinase or cyclophilin D or / and Complete creatine kinase Cells, in particular eukaryotic cells, characterized by an over- or underexpression of cyclophilin D and / or creatine kinase. Furthermore, the method can also use transgenic non-human beings characterized by a super or Under-expression of cyclophilin D and / or creatine kinase include. examples for transgenic non-human beings are mammals, e.g. B. Rat or mouse, fish, e.g. B. Zebrafish (D. rerio) and nematodes, e.g. B. C. elegans. Alternatively, the method can also be carried out as a molecular test, comprising the use of a substantially purified or isolated cyclophilin D or / and creatine kinase protein or fragments thereof.

Cyclophilin D oder Creatinkinase können für die oben genannten Anwendungen gegebenenfalls auch in Form von Fusionsproteinen eingesetzt werden, wobei ein solches Fusionsprotein neben einer homologen Domäne (Cyclophilin D bzw. Creatinkinase oder ein Apoptose hemmendes Fragment davon) eine heterologe Domäne, z. B. eine membrangängige oder/und mitochondriale Signalsequenz oder/und eine Markierungsdomäne oder/und eine Effektordomäne (z. B. ein Toxin) enthält. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Cyclophilin D-Derivate ohne Chaperonfunktion bzw. Creatinkinase-Derivate ohne Enzymfunktion als Apoptoserepressoren wirksam sind.Cyclophilin D or creatine kinase can for the above-mentioned applications optionally also in the form of fusion proteins be used, such a fusion protein in addition to a homologous domain (Cyclophilin D or creatine kinase or an apoptosis-inhibiting fragment thereof) a heterologous domain, z. B. a membrane-permeable and / or mitochondrial Signal sequence or / and a labeling domain and / or an effector domain (e.g. contains a toxin). Surprisingly found that cyclophilin D derivatives have no chaperone function or creatine kinase derivatives without enzyme function as apoptosis repressors are effective.

In einer weiteren Ausführungsform können Cyclophilin D bzw. Creatinkinase auch in Form der dafür kodierenden Nukleinsäuren eingesetzt werden. Hierzu liegen die entsprechenden Nukleinsäuren vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz, beispielsweise als viraler oder nicht viraler Gentransfervektor vor.In another embodiment can cyclophilin D or creatine kinase are also used in the form of the nucleic acids coding therefor become. For this purpose, the corresponding nucleic acids are preferably located in operative connection with an expression control sequence, for example as a viral or non-viral gene transfer vector.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Fusionsprotein von Cyclophilin D oder Creatinkinase mit einer heterologen Proteinsequenz oder eine dafür kodierende Nukleinsäure sowie pharmakologisch akzeptable Träger-, Hilfs- oder/und Verdünnungsmittel.Yet another aspect of the invention is a pharmaceutical composition comprising a fusion protein of cyclophilin D or creatine kinase with a heterologous protein sequence or one for that coding nucleic acid as well as pharmacologically acceptable carriers, auxiliaries and / or diluents.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Cyclophilin D-Derivat ohne Chaperonfunktion oder ein Creatinkinase-Derivat ohne Enzymfunktion oder eine dafür kodierende Nukleinsäure sowie pharmakologisch akzeptable Träger-, Hilfs- oder/und Verdünnungsmittel.Yet another aspect of the invention is a pharmaceutical composition comprising a cyclophilin D derivative without chaperone function or a creatine kinase derivative without Enzyme function or one for it coding nucleic acid as well as pharmacologically acceptable carriers, auxiliaries and / or diluents.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Ergebnisse zeigen, dass Inhibitoren von Cyclophilin D oder Creatinkinase auch als Mittel zur Hemmung von hyperproliferativen oder/und autoimmunreaktiven Prozessen eingesetzt werden können, insbesondere wenn solche Prozesse eine erhöhte Cyclophilin D oder/und Creatinkinase Expression beinhalten. Es konnte z. B. gezeigt werden, dass Inhibitoren wie Antisense-Oligonukleotide gegen Cyclophilin D in der Lage sind, Apoptose durch Aufhebung der Cyclophilin D-Repression zu induzieren (Beispiel 8) und auf diese Weise hyperproliferative oder/und autoimmunreaktive Prozesse hemmen können.The basis of the present invention Results show that inhibitors of cyclophilin D or creatine kinase as a means of inhibiting hyperproliferative or / and autoimmune reactive processes can be used, in particular if such processes an increased cyclophilin D or / and creatine kinase expression include. It could e.g. B. are shown to inhibit such as antisense oligonucleotides Cyclophilin D are capable of apoptosis by lifting cyclophilin To induce D-repression (Example 8) and in this way hyperproliferative or / and inhibit autoimmune reactive processes.

Die Inhibitoren werden vorzugsweise ausgewählt aus Antikörpern, beispielsweise monoklonalen Antikörpern, chimären Antikörpern, humanisierten Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern oder Fragmenten solcher Antikörper mit mindestens einer Antigenbindedomäne, Peptiden, z. B. Teilsequenzen von Cyclophilin D oder Creatinkinase mit einer Länge von vorzugsweise 4 bis 20 Aminosäuren, gegebenenfalls zyklischen Peptidderivaten oder Peptidmimetika, niedermolekularen Wirkstoffen, z. B. organischen Molekülen oder biologisch aktiven Nukleinsäuren wie Antisense-Molekülen, Ribozymen und RNAi Molekülen. Bei den niedermolekularen Wirkstoffen handelt es sich bevorzugt um Substanzen, die die Transkription von Cyclophilin bzw. Creatinkinase hemmen.The inhibitors are preferred selected from antibodies, for example monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, single chain antibodies or fragments of such antibodies with at least one antigen binding domain, peptides, e.g. B. Partial sequences of cyclophilin D or creatine kinase with a length of preferably 4 to 20 amino acids, optionally cyclic peptide derivatives or peptide mimetics, low molecular weight Active ingredients, e.g. B. organic molecules or biologically active nucleic acids like antisense molecules, Ribozymes and RNAi molecules. The low molecular weight active ingredients are preferred substances that inhibit the transcription of cyclophilin or creatine kinase.

Inhibitoren von Cyclophilin D oder Creatinkinase können zur Diagnose oder/und Therapie von Krankheiten eingesetzt werden, insbesondere von solchen Krankheiten, die mit einer verringerten Apoptose in Verbindung stehen, wie etwa Krankheiten, die von hyperproliferativen oder/und autoimmunreaktiven Prozessen hervorgerufen oder begleitet sind. Konkrete Beispiele solcher Krankheiten sind Tumorerkrankungen wie etwa Brust-, Prostata-, Uterus- und Ovarkrebs, Autoimmunerkrankungen, Lupus erythematosus, Glomerulonephritis und vitale Infektionen. Besonders bevorzugt sind die Krankheiten ausgewählt aus Brust-, Uterus- und Ovarialkrebs, insbesondere aus solchen Krebsarten, bei denen eine verstärkte Expression von Cyclophilin oder/und Creatinkinase gefunden wird. Überraschenderweise wurde eine signifikant erhöhte Cyclophilin D-Expression gegenüber gesundem Gewebe in Brust-, Uterus- und Ovarialkrebs gefunden.Inhibitors of Cyclophilin D or Creatinki noses can be used to diagnose and / or treat diseases, in particular those diseases that are associated with reduced apoptosis, such as diseases that are caused or accompanied by hyperproliferative and / or autoimmune-reactive processes. Specific examples of such diseases are tumor diseases such as breast, prostate, uterine and ovarian cancer, autoimmune diseases, lupus erythematosus, glomerulonephritis and vital infections. The diseases are particularly preferably selected from breast, uterine and ovarian cancer, in particular from those types of cancer in which an increased expression of cyclophilin and / or creatine kinase is found. Surprisingly, a significantly increased cyclophilin D expression was found compared to healthy tissue in breast, uterine and ovarian cancer.

Weiterhin können die Inhibitoren auch zur Identifizierung von pharmakologischen Wirkstoffen verwendet werden wie zuvor beschrieben.Furthermore, the inhibitors can also be used for identification of pharmacological agents are used as previously described.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Inhibitor von Cyclophilin D oder Creatinkinase sowie pharmakologisch akzeptable Träger-, Hilfs- oder/und Verdünnungsmittel.Yet another aspect of the invention is a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of cyclophilin D or creatine kinase as well as pharmacologically acceptable Carrier, auxiliary or / and diluents.

Schließlich noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Effektormoleküls gerichtet gegen die Bereiche der Aminosäuren 1–17, 67–107 oder/und 151–170 von ANT-1 zur Modulation von mit ANT-1 assoziierten apoptotischen Prozessen. Inhibitoren dieser Bereiche können beispielsweise zur Hemmung apoptotischer Prozesse und Aktivatoren zur Stimulation apoptotischer Prozesse eingesetzt werden.Finally, another aspect the invention relates to the use of an effector molecule directed against the regions of amino acids 1-17, 67-107 or / and 151-170 of ANT-1 for the modulation of apoptotic processes associated with ANT-1. Inhibitors of these areas can, for example to inhibit apoptotic processes and activators for stimulation apoptotic processes.

Effektormoleküle werden vorzugsweise ausgewählt aus Antikörpern, Peptiden, niedermolekularen Wirkstoffen und biologisch aktiven Nukleinsäuren wie Antisense-Molekülen, Rybozymen und RNAi Molekülen wie zuvor definiert.Effector molecules are preferably selected from antibodies Peptides, low molecular weight active substances and biologically active nucleic acids such as Antisense molecules, Rybozymes and RNAi molecules as previously defined.

Die Effektormoleküle können zur Diagnose oder/und Therapie von Krankheiten, insbesondere von mit ANT-1 assoziierten Krankheiten oder zur Identifizierung von Wirkstoffen verwendet werden.The effector molecules can be used for diagnosis or / and Therapy of diseases, especially those associated with ANT-1 Diseases or used to identify active ingredients.

Schließlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Effektormolekül gerichtet gegen die Bereiche der Aminosäuren 1–17, 67–107 oder/und 151–170 von ANT-1 sowie pharmakologisch akzeptable Träger-, Hilfs- oder/und Verdünnungsmittel.Finally, the invention relates a pharmaceutical composition comprising an effector molecule against the areas of amino acids 1-17, 67-107 or / and 151-170 of ANT-1 and pharmacologically acceptable carriers, auxiliaries and / or diluents.

Weiterhin soll die Erfindung durch die im folgenden beschriebenen Figuren und Beispiele näher erläutert werden.Furthermore, the invention is intended to the figures and examples described below are explained in more detail.

1
Mapping der Apoptose-induzierenden Domänen von ANT-1: Ausgehend vom Wildtyp Ant-1 (Ant-1), wurden vom N-Terminus beginnend die Sequenzen progressiv durch die von Ant-2 (das nicht Apoptose-induzierend wirkt) ersetzt. Die Konstrukte wurden in 293T Zellen exprimiert und der Grad der Apoptose-Induktion anhand der prozentualen DNA-Fragmentierung (über Propidiumjodid-Färbung und Normalisierung) auf die Transfektionseffizienz bestimmt. Die Ergebnisse von je drei unabhängigen Experimenten sind jeweils mit Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass es drei Domänen gibt, die für die Apoptose-Induktion durch Ant-1 verantwortlich sind: der unmittelbare N-Terminus (Ant-1/ex 17) die äußere Schleife (ex 67/ex 107) und die zweite innere Schleife (ex 151/ex 170). 1
Mapping of the apoptosis-inducing domains of ANT-1: Starting from the wild type Ant-1 (Ant-1), starting from the N-terminus, the sequences were progressively replaced by those of Ant-2 (which does not induce apoptosis). The constructs were expressed in 293T cells and the degree of apoptosis induction was determined based on the percentage of DNA fragmentation (via propidium iodide staining and normalization) on the transfection efficiency. The results of three independent experiments are shown with mean and standard deviation. The results show that there are three domains responsible for apoptosis induction by Ant-1: the immediate N-terminus (Ant-1 / ex 17), the outer loop (ex 67 / ex 107) and the second inner one Bow (ex 151 / ex 170).

2
Apoptose-Induktion durch Überexpression von Komponenten der PT-Pore: Die Gene der inneren Mitochondrienmembran (Ant-1 in Kombination mit Luciferase und Ant-2), die der äußeren Mitochondrienmembran (VDAC I ("voltage dependent anion channel"), VDAC II) sowie Benzodiazepin-Rezeptor (BDR), Creatinkinase (CK) und Cyclophilin D (CycD) wurden in 293T Zellen exprimiert und die prozentuale Apoptose-Induktion über Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Die Ergebnisse von je drei unabhängigen Experimenten sind jeweils mit Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Apoptose-Induktion nur durch Ant-1 sowie VDAC I und II erfolgt. 2
Apoptosis induction by overexpression of components of the PT pore: the genes of the inner mitochondrial membrane (Ant-1 in combination with luciferase and Ant-2), those of the outer mitochondrial membrane (VDAC I ("voltage dependent anion channel"), VDAC II) as well as benzodiazepine receptor (BDR), creatine kinase (CK) and cyclophilin D (CycD) were expressed in 293T cells and the percentage induction of apoptosis was determined by propidium iodide staining. The results of three independent experiments are shown with mean and standard deviation. The results show that apoptosis induction only by Ant-1 and VDAC I and II takes place.

3
Repressionsaktivität einzelner Komponenten der PT-Pore bei Ant-1 induzierter Apoptose: Ant-1 wurde jeweils mit einem 3-fachen Überschuß an Luciferase, Ant-2, VDAC I, Creatinkinase, Benzodiazepin-Rezeptor sowie Cyclophilin D in 293T-Zellen transfiziert und exprimiert und die prozentuale Apoptose-Induktion über Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Die Ergebnisse von je drei unabhängigen Experimenten sind jeweils mit Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Die Experimente zeigen, dass nur Creatinkinase und Cyclophilin D in der Lage sind, Ant-1 induzierte Apoptose zu reprimieren. 3
Repression activity of individual components of the PT pore in Ant-1 induced apoptosis: Ant-1 was in each case with a 3-fold excess of luciferase, Ant-2, VDAC I , Creatine kinase, benzodiazepine receptor and cyclophilin D transfected and expressed in 293T cells and the percentage apoptosis induction determined by propidium iodide staining. The results of three independent experiments are shown with mean and standard deviation. The experiments show that only creatine kinase and cyclophilin D are able to repress Ant-1 induced apoptosis.

4
Kontrollexperiment zur Untersuchung der mitochondrialen Extrakte auf die Gegenwart von transfizierten Proteinen: Die mitochondrialen Extrakte von 293T Zellen, die mit Luciferase (Luc) (Kontrolle) sowie Ant-1 mit einem 5-fachen Überschuß an Luciferase bzw. mit Ant-1 und einem 5-fachen Überschuß an Cyclophilin D (CypD) transfiziert wurden, wurden in einem Western Blot untersucht. Der Nachweis von Ant-1 erfolgte durch einen Antikörper gegen das myc-Epitop. Der Nachweis von Cyclophilin D erfolgte durch einen Antikörper gegen Cyclophilin D. Als Kontrolle diente ein Antikörper gegen das mitchondriale Transportprotein Tim23. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Co-Transfektion von Cyclophilin D und Ant-1 der Import von Ant-1 in die Mitochondrien nicht verringert wird. Somit kann ausgeschlossen werden, dass Cyclophilin D den Import von Ant-1 in die Mitochondrien (zum Ort der Apoptose-Induktion) verhindert. 4
Control experiment to investigate the mitochondrial extracts for the presence of transfected proteins: The mitochondrial extracts of 293T cells, those with luciferase (Luc) (control) and Ant-1 with a 5-fold excess of luciferase or with Ant-1 and a 5 -fold excess of cyclophilin D (CypD) were examined in a Western blot. Ant-1 was detected by an antibody against the myc epitope. Cyclophilin D was detected by an antibody against cyclophilin D. An antibody against the mitchondrial transport protein Tim23 served as a control. The results show that the co-transfection of cyclophilin D and Ant-1 does not reduce the import of Ant-1 into the mitochondria. It can therefore be excluded that Cyclophilin D imports Ant-1 into the Mito chondria (to the site of apoptosis induction) prevented.

5
Repression von Ant-1 induzierter Apoptose ist unabhängig von der Chaperon-Aktivität von Cyclophilin D. Ant-1 wurde mit einem 3-fachen Überschuß an Wildtyp Cyclophilin D (Ant+3×CycD) sowie einem 3-fachen Überschuß eines 2-fach mutierten Cyclophilin D (ANT+3×CycD*) in 293T-Zellen exprimiert und die prozentuale Apoptose-Induktion über Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Ein Hefe-Homolog dieser Cyclophilin D Mutante inaktiviert die Chaperon-Aktivität des Cyclophilin D. Die Ergebnisse von je drei unabhängigen Experimenten sind jeweils mit Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass Cyclophilin D auch dann noch Ant-1 induzierte Apoptose reprimiert, wenn die Chaperon-Aktivität des Proteins aufgehoben ist. 5
Repression of Ant-1 induced apoptosis is independent of the chaperone activity of cyclophilin D. Ant-1 was mutated with a 3-fold excess of wild-type cyclophilin D (Ant + 3 × CycD) and a 3-fold excess Cyclophilin D (ANT + 3 × CycD *) expressed in 293T cells and the percentage induction of apoptosis determined by propidium iodide staining. A yeast homologue of this cyclophilin D mutant inactivates the chaperone activity of cyclophilin D. The results of three independent experiments are presented with mean and standard deviation. The results show that cyclophilin D represses Ant-1 induced apoptosis even when the protein's chaperone activity is abolished.

6
Korrelation der Apoptose-Repression mit dem PT-Poren-Hemmstoff Bongkreksäure (BA; Klingenberg et al., 1970). Ein bekannter Apoptose-Induktor Caspase 8 wurde in 293T Zellen jeweils mit einem 5-fachen Überschuß an Luciferase, Bcl-2, Bcl-xl und Cyclophilin D (CypD) transfiziert und exprimiert und die prozentuale Apoptose-Induktion über Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Überexpression von Cyclophilin D die Apoptose reprimiert, wenn die PT-Pore durch BA gehemmt werden kann. Der reprimierende Effekt ist mit der BA gleichzusetzen. 6
Correlation of apoptosis repression with the PT pore inhibitor bongkrekic acid (BA; Klingenberg et al., 1970). A known apoptosis inducer caspase 8 was transfected and expressed in 293T cells each with a 5-fold excess of luciferase, Bcl-2, Bcl-xl and cyclophilin D (CypD) and the percentage induction of apoptosis was determined by propidium iodide staining. The results show that overexpression of cyclophilin D represses apoptosis if the PT pore can be inhibited by BA. The repressing effect is equivalent to the BA.

7
Korrelation der Apoptose-Repression mit dem PT-Poren-Hemmstoff Bongkreksäure (BA). Ein bekannter Apoptose-Induktor tBid (Li et al., 1998) wurde in 293T Zellen jeweils mit einem 5-fachen Überschuß an Luciferase, Bcl-2, Bcl-xl und Cyclophilin D (CypD) transfiziert und exprimiert und die prozentuale Apoptose-Induktion über Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Überexpression von Cyclophilin D immer dann die Apoptose reprimiert, wenn die PT-Pore durch BA gehemmt werden kann. Aus 6 und 7 und 10 (als Negativkontrolle) geht hervor, dass Cyclophilin D ein spezifischer Repressor der Apoptose bei aktivierter PT-Pore ist. 7
Correlation of apoptosis repression with the PT pore inhibitor bongkrekic acid (BA). A known apoptosis inducer tBid (Li et al., 1998) was transfected and expressed in 293T cells with a 5-fold excess of luciferase, Bcl-2, Bcl-xl and cyclophilin D (CypD) and the percentage apoptosis induction determined by propidium iodide staining. The results show that overexpression of cyclophilin D represses apoptosis whenever the PT pore can be inhibited by BA. Out 6 and 7 and 10 (as a negative control) shows that cyclophilin D is a specific repressor of apoptosis when the PT pore is activated.

8
Antisense-Konstrukte zu Cyclophilin D heben die Apoptose-reprimierende Wirkung von Cyclophilin D auf: In HELA-Zellen wurden Oligonukleotide von Proteinkinase C in "sense" (PKCa sense) und "anti-sense" (PKCa a-sense) sowie Cyclophilin D "antisense" (CycD a-sense #3 und #4) transfiziert und die Apoptose-Induktion als prozentuale DNA-Fragmentation über Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Antisense-Konstrukte die Apoptose-Reprimierung von Cyclophilin D aufheben. 8th
Antisense constructs to cyclophilin D abolish the apoptosis-repressing effect of cyclophilin D: In HELA cells, oligonucleotides of protein kinase C were found in "sense" (PKCa sense) and "anti-sense" (PKCa a-sense) as well as cyclophilin D " antisense "(CycD a-sense # 3 and # 4) and the apoptosis induction was determined as percentage DNA fragmentation via propidium iodide staining. The results show that the antisense constructs abolish cyclophilin D apoptosis repression.

9
Erhöhte Cyclophilin D Expression in verschiedenen Tumoren: Radioaktiv markierte Cyclophilin D cDNA auf einem "Cancer Profiling Array" ("Normal vs. Tumor-Profiling Blot"; Clontech, Heidelberg) wurden in folgenden Geweben hybridisiert und die Expression anhand densitometrischer Auswertung über einen Phosphoimager bestimmt: Brust, Uterus, Eierstock, Niere, Dickdarm, Mastdarm, Magen und Lunge. Der Vergleich zwischen gesundem (Normal-) Gewebe und Tumorgewebe zeigt eine signifikante Hochregulation von Cyclophilin D in Karzinom-Geweben von Brust, Uterus und Ovar. 9
Increased Cyclophilin D Expression in Various Tumors: Radioactive labeled cyclophilin D cDNA on a "Cancer Profiling Array"("Normal vs. Tumor Profiling Blot"; Clontech, Heidelberg) were hybridized in the following tissues and the expression was determined using densitometric analysis using a phosphoimager : Breast, uterus, ovary, kidney, colon, rectum, stomach and lungs. The comparison between healthy (normal) tissue and tumor tissue shows a significant upregulation of cyclophilin D in carcinoma tissues of the breast, uterus and ovary.

10
Korrelation der Apoptose-Repression mit dem PT-Poren-Hemmstoff BA. Ein bekannter Apoptose-Induktor Caspase 2 wurde in 293T Zellen jeweils mit einem 5-fachen Überschuß an Luciferase, Bcl-2, Bcl-xl und Cyclophilin D (CypD) transfiziert und exprimiert und die prozentuale Apoptose-Induktion der Propidiumjodid-Färbung bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Überexpression von Cyclophilin D keine Hemmung von Apoptose bewirken kann, wenn die PT-Pore nicht aktiviert ist und keine Hemmung der Apoptose durch BA erfolgt. 10
Correlation of apoptosis repression with the PT pore inhibitor BA. A known apoptosis inducer caspase 2 was transfected and expressed in 293T cells each with a 5-fold excess of luciferase, Bcl-2, Bcl-xl and cyclophilin D (CypD) and the percentage apoptosis induction of the propidium iodide staining was determined. The results show that overexpression of cyclophilin D cannot inhibit apoptosis if the PT pore is not activated and the apoptosis is not inhibited by BA.

11
Cyclophilin D reprimiert Apoptose, die durch exogene Zelltodstimuli in HeLa-Zellen induziert wurde. Als Zelltodstimuli wurden TNF/CHX, Ultraviolettlicht oder As₂O₃ verwendet. 11
Cyclophilin D represses apoptosis induced by exogenous cell death stimuli in HeLa cells. TNF / CHX, ultraviolet light or As ₂ O _{3 were} used as cell death stimuli.

BeispieleExamples

Beispiel 1 example 1

Distinkte Regionen im ANT-1-Protein vermitteln eine Apoptose-Induktion. Distinct regions in the ANT-1 protein mediate apoptosis induction.

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für Luciferase, ANT-1, ANT-2 bzw. verschiedenen Austauschmutanten transfiziert. In allen Transfektionsansätzen wurde zusätzlich 1 μg Expressionsplasmid für EGFP (Clontech, Heidelberg) zugesetzt. Nach 18 h erfolgte die Auswertung durch Propidiumjodid-Färbung der Zellen und quantitative FACS-Analyse in einem FACSCalibur (Becton-Dickinson, Heidelberg). Parallel wurde für jede Probe der Anteil GFP-positiver Zellen per FACS bestimmt und für die Berechnung der spezifischen Apoptose herangezogen. Die gezeigten Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren jeweils drei unabhängige Messungen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.HEK 293T cells in 6-hole plates were each transfected with 1 μg expression plasmid for luciferase, ANT-1, ANT-2 or various exchange mutants. In all transfection batches, an additional 1 μg expression plasmid for EGFP (Clontech, Heidelberg) was added. After 18 h the evaluation was carried out by propidium iodide staining of the cells and quantitative FACS analysis in a FACSCalibur (Becton-Dickinson, Heidelberg). In parallel, the proportion of GFP-positive cells was determined by FACS for each sample and used to calculate the specific apoptosis. The mean values and standard deviations shown each represent three independent measurements. The results are in 1 shown.

Beispiel 2 example 2

Apoptose-Induktion durch PT-Poren-ProteineInduction of apoptosis by PT pore proteins

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden pro Vertiefung mit 5 μg Expressions-Plasmid für ANT-2, VDAC (bzw. 1 μg ANT-1 Expressionsplasmid und 4 μg Luciferase-Expressionsplasmid) etc. sowie 1 μg GFP-Expressionsplasmid transfiziert. Die FACS-Analyse erfolgte nach 18 h Inkubation. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected per well with 5 μg expression plasmid for ANT-2, VDAC (or 1 μg ANT-1 expression plasmid and 4 μg luciferase expression plasmid) etc. and 1 μg GFP expression plasmid , The FACS analysis was carried out after 18 h of incubation. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 2 shown.

Beispiel 3Example 3

Hemmung der ANT-1-induzierten Apoptose durch Kotransfektion von Proteinen der PT-Pore Inhibition of ANT-1-induced Apoptosis by cotransfection of PT pore proteins

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden pro Vertiefung mit 1 μg ANT-1-Expressionsplasmid, 1 μg GFP-Expressionsplasmid und 3 μg Expressionsplasmid für Luciferase, ANT-2 usw. transfiziert. Nach 18 h erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg ANT-1 expression plasmid, 1 μg GFP expression plasmid and 3 μg expression plasmid for luciferase, ANT-2 etc. per well. After 18 hours, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 3 shown.

Beispiel 4Example 4

Der mitochondriale Import von überexprimiertem ANT-1 ist unabhängig von der Koexpression von Cyclophilin D (CypD)Mitochondrial import of overexpressed ANT-1 is independent on the co-expression of cyclophilin D (CypD)

HEK 293T-Zellen in 10 cm-Kulturschalen wurden mit jeweils 2 μg Expressionsplasmid für ANT-1-myc sowie 10 μg Expressionsplasmid für Luciferase bzw. CypD transfiziert. Als Negativ-Kontrolle wurden 12 μg Luc-Expressionsplasmid eingesetzt. Alle Transfektionsansätze enthielten ebenfalls 2 μg Expressionsplasmid für EGFP (enhanced green fluorescent protein). 24 h nach Transfektion wurden mitochondriale Proteinextrakte präpariert und auf einem 15% Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. In einem Immunblot wurden Antikörper gegen das myc-Epitop (Roche, Mannheim), gegen CypD (Dianova, Hamburg) sowie gegen Tim23 (BD Biosciences, Heidelberg) eingesetzt. Die Detektion erfolgte mit HRP (horseradish peroxidasel-gekoppelten Sekundär-Antikörpern und dem ECL (enhanced chemoluminescent)-System. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.HEK 293T cells in 10 cm culture dishes were each transfected with 2 μg expression plasmid for ANT-1-myc and 10 μg expression plasmid for luciferase and CypD. 12 μg Luc expression plasmid was used as negative control. All transfection batches also contained 2 μg expression plasmid for EGFP (enhanced green fluorescent protein). 24 h after transfection, mitochondrial protein extracts were prepared and electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel. Antibodies against the myc epitope (Roche, Mannheim), against CypD (Dianova, Hamburg) and against Tim23 (BD Biosciences, Heidelberg) were used in an immunoblot. The detection was carried out using HRP (horseradish peroxidasel-coupled secondary antibodies and the ECL (enhanced chemiluminescent) system. The results are shown in 4 shown.

Beispiel 5Example 5

Eine enzymatisch inaktive Mutante von CypD inhibiert die ANT-1-induzierte ApoptoseAn enzymatically inactive CypD mutant inhibits ANT-1 induced apoptosis

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden pro Vertiefung mit 1 μg ANT-1-Expressionsplasmid, 1 μg GFP-Expressionsplasmid und 3 μg Expressionsplasmid für Luc, CypD bzw. CypD*R97A/H168Q (eine 2-fach Mutante des Wildtyps, die keine Chaperonaktivität mehr aufweist) transfiziert. Nach 18 h erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were mixed with 1 μg ANT-1 expression plasmid, 1 μg GFP expression plasmid and 3 μg expression plasmid for Luc, CypD and CypD * R97A / H168Q (a 2-fold mutant of the wild type , which no longer exhibits chaperone activity). After 18 hours, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 5 shown.

Beispiel 6Example 6

Die Caspase 8-induzierte Apoptose wird durch CypD-Koexpression und Bongkreksäure (BA) gehemmtThe caspase 8-induced Apoptosis is caused by CypD coexpression and Bongkrek acid (BA) inhibited

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für Caspase 8, 1 μg EGFP-Expressionsplasmid sowie 5 μg Expressionsplasmid für Luciferase, Bcl-2, Bcl-xL sowie CypD transfiziert. Nach 18 h erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 6 (oben) gezeigt. HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für Caspase 8, 1 μg EGFP-Expressionsplasmid sowie 1 μg Epressionsplasmid für Luciferase transfiziert. 5 h nach Transfektion wurde die Hälfte der Ansätze mit Bongkreksäure behandelt (Endkonzentration 65 μM). 16 h später erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 6 (unten) gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg expression plasmid for caspase 8, 1 μg EGFP expression plasmid and 5 μg expression plasmid for luciferase, Bcl-2, Bcl-xL and CypD. After 18 hours, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 6 (above) shown. HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg expression plasmid for caspase 8, 1 μg EGFP expression plasmid and 1 μg expression plasmid for luciferase. 5 h after transfection, half of the batches were treated with bongrekic acid (final concentration 65 μM). 16 hours later, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 6 (shown below).

Beispiel 7Example 7

tBid-induzierte Apoptose wird durch CypD-Koexpression und Bongkreksäure gehemmttBid-induced apoptosis is inhibited by CypD coexpression and Bongkrek acid

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für tBid, 1 μg EGFP-Expressionsplasmid sowie 5 μg Expressionsplasmid für Luciferase, Bcl-2, Bcl-xL sowie CypD transfiziert. Nach 18 h erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 7 (oben) gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg expression plasmid for tBid, 1 μg EGFP expression plasmid and 5 μg expression plasmid for luciferase, Bcl-2, Bcl-xL and CypD. After 18 hours, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 7 (above) shown.

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für tBid, 1 μg EGFP-Expressionsplasmid sowie 1 μg Expressionsplasmid für Luciferase transfiziert. 5 h nach Transfektion wurde die Hälfte der Ansätze mit Bongkreksäure behandelt (Endkonzentration 65 μM). 1 h später erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 7 (unten) gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg expression plasmid for tBid, 1 μg EGFP expression plasmid and 1 μg expression plasmid for luciferase. 5 h after transfection, half of the batches were treated with bongrekic acid (final concentration 65 μM). 1 hour later the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 7 (shown below).

Beispiel 8Example 8

Gegen CypD gerichtete ('Antisense'-)Oligonukleotide induzieren ApoptoseAgainst CypD ('Antisense' -) induce oligonucleotides apoptosis

HeLa-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit je 600 ng Antisense-Oligonukleotid von Proteinkinase C in "sense" (PKCa sense) und "anti-sense" (PKCa a-sense) sowie Cyclophilin D "antisense" (CycD a-sense #3 und #4 transfiziert (Calciumphosphat-Methode) und nach 36 h per FACS analysiert. Da kein GFP kotransfiziert wurde, zeigt die Quantifizierung den Anteil an Zellen mit hypodiploidem DNA-Gehalt ("DNA-Fragmentierung"). Die gezeigten Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren jeweils drei unabhängige Messungen. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.HeLa cells in 6-well plates were each with 600 ng antisense oligonucleotide from protein kinase C in "sense" (PKCa sense) and "anti-sense" (PKCa a-sense) and cyclophilin D "antisense" (CycD a-sense # 3 and # 4 transfected (calcium phosphate method) and analyzed after 36 h by FACS. Since no GFP was co-transfected, the quantification shows the proportion of cells with hypodiploid DNA content ("DNA fragmentation"). The mean values and standard deviations shown each represent three independent measurements. The results are in 8th shown.

Beispiel 9Example 9

Die CypD-mRNA-Level sind in verschiedenen Tumoren signifikant erhöhtThe CypD mRNA levels are significantly increased in various tumors

Die für CypD kodierende cDNA wurde durch Bam HI/Not I-Verdau, Gelelektrophorese und anschließende Elution isoliert. In einer 'random-priming' Markierungsreaktion ("Rediprime-Kit", Pharmacia, Freiburg) wurden 200 ng dsDNA und 50 μCi [³²P]dCTP eingesetzt. Ca. 3×10⁷ cpm markierte DNA wurden in einer Hybridisierungsreaktion mit einem "Normal vs.Tumor-Profiling Blot" (Clontech, Heidelberg) eingesetzt. Nach 6 h Inkubation wurde der Blot mit 2 × SSC, 1 × SSC, 0,5 × SSC (jeweils mit 0,05% SDS) gewaschen und anschliessend für 3 Tage auf einer Phosphoimager-Platte exponiert (Fuji-Films, Heidelberg). Die densitometrische Auswertung erfolgte mit einem BAS 2500-Phosphoimage-Reader (Fuji-Films, Heidelberg) und einer BAS-Image-Reader Software.The cDNA coding for CypD was isolated by Bam HI / Not I digestion, gel electrophoresis and subsequent elution. In a random priming labeling reaction ("Rediprime-Kit", Pharmacia, Freiburg), 200 ng dsDNA and 50 μCi [ ³² P] dCTP were used. Approximately 3 × 10 ⁷ cpm labeled DNA were used in a hybridization reaction with a "normal vs. tumor profiling blot" (Clontech, Heidelberg). After 6 h of incubation, the blot was washed with 2 × SSC, 1 × SSC, 0.5 × SSC (in each case with 0.05% SDS) and then exposed for 3 days on a phosphoimager plate (Fuji-Films, Heidelberg). The densitometric evaluation was carried out with a BAS 2500 phosphoimage reader (Fuji-Films, Heidelberg) and a BAS image reader software.

Für die quantitative Auswertung wurde der Quotient der Beträge von "Normal" und "Tumor" gebildet und der natürliche Logarithmus (In) gegen die Frequenz aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Eine Verstärkung bzw. Abschwächung um den Faktor 1,5 (In 1,5 = 0,4) wurde als spezifisch gewertet (s. graue Flächen).For the quantitative evaluation the quotient of the amounts of "normal" and "tumor" was formed and the natural logarithm (In) was plotted against the frequency. The results are in 9 shown. An increase or decrease by a factor of 1.5 (In 1.5 = 0.4) was rated as specific (see gray areas).

Beispiel 10Example 10

Die Caspase 2-induzierte Apoptose wird durch CypD-Koexpression und Bongkreksäure nicht gehemmtThe caspase 2-induced Apoptosis is not caused by CypD coexpression and bongrek acid inhibited

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für Caspase 2, 1 μg EGFP-Expressionsplasmid sowie 5 μg Expressionsplasmid für Luciferase, Bcl-2, Bcl-xL sowie CypD transfiziert. Nach 18 h erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 10 (oben) gezeigt.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg expression plasmid for caspase 2, 1 μg EGFP expression plasmid and 5 μg expression plasmid for luciferase, Bcl-2, Bcl-xL and CypD. After 18 hours, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 10 (above) shown.

HEK 293T-Zellen in 6-Loch-Platten wurden mit jeweils 1 μg Expressionsplasmid für Caspase 2, 1 μg EGFP- Expressionsplasmid sowie 1 μg Expressionsplasmid für Luciferase transfiziert. 5 h nach Transfektion wurde die Hälfte der Ansätze mit Bongkreksäure behandelt (Endkonzentration 65 μM). 16 h später erfolgte die Analyse der Zellen per FACS. Die angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren drei unabhängige Transfektionen. Die Ergebnisse sind in 10 (unten) gezeigt. Dieses Experiment ist eine Ergänzung zu Beispiel 6 und 7 und dient als Negativkontrolle um zu zeigen, dass eine Reprimierung der Apoptose nur dann erfolgt, wenn auch eine Reprimierung der Apoptose durch Bongkreksäure stattfindet.HEK 293T cells in 6-well plates were transfected with 1 μg expression plasmid for caspase 2, 1 μg EGFP expression plasmid and 1 μg expression plasmid for luciferase. 5 h after transfection, half of the batches were treated with bongrekic acid (final concentration 65 μM). 16 hours later, the cells were analyzed by FACS. The given mean values and standard deviations represent three independent transfections. The results are in 10 (shown below). This experiment is a supplement to Examples 6 and 7 and serves as a negative control to show that apoptosis is only repressed if apoptosis is also repressed by bongkreccic acid.

Beispiel 11Example 11

1,5 μg Plasmid (Luciferase, BCL-xL und Cyclophilin D) wurden zusammen mit 0,5 μg Expressionsplasmid für GFP auf 10 cm Platten in HeLa-Zellen transfiziert. Nach 23 h wurden die Zellen mit UV (25 mJoule), TNF/CHX (15 ng/ml; 0,1 μg/ml) oder 10 μM Diarsentrioxid induziert. Apoptose wurde durch Fax-Analyse nach 18 h quantifiziert. Gezeigt ist der Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten normiert auf die Transfektionseffizienz. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt.1.5 μg plasmid (luciferase, BCL-xL and cyclophilin D) were transfected together with 0.5 μg expression plasmid for GFP on 10 cm plates in HeLa cells. After 23 hours, the cells were induced with UV (25 mJoules), TNF / CHX (15 ng / ml; 0.1 μg / ml) or 10 μM diarsen trioxide. Apoptosis was quantified by fax analysis after 18 hours. The mean and standard deviation of three independent experiments are shown normalized to the transfection efficiency. The results are in 11 shown.

Claims

Use of cyclophilin D and / or creatine kinase, one biologically active fragment or derivative thereof, or a coding thereof nucleic acid or an activator of cyclophilin D or creatine kinase for inhibition of apoptotic processes not associated with ANT-1.

Use according to claim 1 for the inhibition of those not associated with ANT-1 apoptotic processes caused by activation of the PT pore mediated.

Use according to claim 1 or 2 for the inhibition of with caspase 8 or / and tBid or / and bax associated apoptotic processes.

Use according to one of claims 1 to 3 for the inhibition of Apoptotic processes mediated by TNF / CHX, UV light and / or diarsen trioxide.

Use according to any one of claims 1-3 for the inhibition of by cytostatics or / and hypoxic conditions mediated apoptotic processes.

Use according to one of claims 1 or 5 for diagnosis or / and Therapy of diseases.

Use according to claim 6, characterized in that the diseases are selected from heart attack, stroke, reperfusion damage, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease, cerebral degenes rations, retinitis, amylotrophic lateral sclerosis, toxin or virus-induced liver diseases, tissue damage due to ischemia, myelodisplasia, e.g. B. aplastic anemia, and AIDS.

Use according to one of claims 1 to 5 for identification of pharmacological agents.

Use according to one of claims 1 to 8 in the form of a fusion protein.

Use according to claim 9 as a fusion protein with a membrane-permeable signal sequence.

Use according to claim 9 or 10 as a fusion protein with a mitochondrial signal sequence.

Use according to one of claims 1 to 11 as cyclophilin D derivative without chaperone function or as a creatine kinase derivative without enzyme function.

Use according to one of claims 1 to 12 as a nucleic acid in surgery shortcut with an expression control sequence.

Use according to claim 13 as a viral or non-viral gene transfer vector.

A pharmaceutical composition comprising a fusion protein of cyclophilin D or creatine kinase with a heterologous protein sequence or one for that coding nucleic acid as well as pharmacologically acceptable carriers, auxiliaries and / or diluents.

Pharmaceutical composition comprising a cyclophilin D derivative without chaperone function or a creatine kinase derivative without enzyme function or a coding for it nucleic acid as well as pharmacologically acceptable carriers, auxiliaries and / or diluents.

Use of an inhibitor of cyclophilin D or creatine kinase as a means of inhibiting hyperproliferative and / or autoimmune reactive Processes.

Use according to claim 17 for diagnosis and / or therapy of Diseases.

Use according to claim 18, characterized in that the Selected diseases are from tumor diseases such as breast, prostate, uterine and Ovarian cancer, autoimmune diseases, lupus erythematosus, glomerulonephritis and viral infections.

Use according to claim 19, characterized in that the Selected diseases are from breast, uterine and ovarian cancer.

Use according to claim 17 for the identification of pharmacological Agents.

Use according to one of claims 17 to 21, characterized in that that the inhibitor is selected is made from antibodies, Peptides, low molecular weight active substances and biologically active nucleic acids such as Antisense molecules, Ribozymes and RNAi molecules.

Pharmaceutical composition comprising an inhibitor of Cyclophilin D or creatine kinase as well as pharmacologically acceptable Carrier, auxiliary or / and diluents.

Transgenic non-human being, characterized by a super or Under-expression of cyclophilin D and / or creatine kinase.

Transgenic organism according to claim 24 selected from mammals, e.g. B. Rat or mouse, fish, e.g. B. Zebrafish (D. rerio) and nematodes, e.g. B. C. elegans.

Eukaryotic cell, characterized by an over or Under-expression of cyclophilin D and / or creatine kinase.

Use of an effector molecule directed against the areas of amino acids 1-17, 67-107 or / and 151-170 of ANT-1 for modulating apoptotic associated with ANT-1 Processes.

Use according to claim 27 for inhibiting apoptotic processes.

Use according to claim 27 for the stimulation of apoptotic Processes.

Use according to one of claims 27 to 29 for diagnosis or / and therapy of diseases.

Use according to one of claims 27 to 29 for identification of active ingredients.

Use according to one of claims 27 to 29, characterized in that that the effector molecule selected is made from antibodies, Peptides, low molecular weight active substances and biologically active nucleic acids such as Antisense molecules, Ribozymes and RNAi molecules.

Pharmaceutical composition comprising an effector molecule directed against the regions of amino acids 1-17, 67-107 or / and 151-170 of ANT-1 and pharmacologically acceptable table carrier, auxiliary or / and diluent.