DE10314750A1 - Scanning microscope for biological applications has an objective with a contrast device which enables use of the microscope in a Hoffman-modulation contrast mode - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts, mit einer zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, einem Mikroskopobjektiv, einer Kondensoroptik, einem von der Lichtquelle zum Objekt verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang und einem vom Objekt zu mindestens zwei Detektoren verlaufenden Detektionsstrahlengang, wobei mindestens ein Detektor auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordnet ist.The The present invention relates to a scanning microscope for detection an object with a light source suitable for multi-photon fluorescence excitation, a microscope lens, condenser optics, one from the light source illumination beam path running to the object and one from the object detection beam path running to at least two detectors, wherein at least one detector on the side facing away from the object Condenser optics is arranged.
Unter Rastermikroskopen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind Mikroskope zu verstehen, bei denen das zu detektierende Objekt mit einem Beleuchtungsmuster beleuchtet und abgerastert wird. Das vom Objekt reflektierte Beleuchtungslicht und/oder emittierte Fluoreszenzlicht wird hierbei von den Detektoren detektiert. Dieser Rastervorgang erfolgt bei einem punkt- oder kreisförmigen Beleuchtungsmuster üblicherweise mäanderförmig, so dass das Objekt mit dem Beleuchtungsmuster in ähnlicher Weise abgerastert wird, wie beispielsweise ein Elektronenstrahl auf den Bildschirm einer Braun'schen Röhre gelenkt wird. Eine Objektdetektion mit einem linienförmigen Beleuchtungsmuster ist ebenfalls denkbar, in diesem Fall wird das linienförmige Beleuchtungsmuster entlang der Richtung quer zur Linie relativ zum Objekt bewegt.Under Scanning microscopes in the sense of the present invention are microscopes to understand, in which the object to be detected with an illumination pattern is illuminated and scanned. The illuminating light reflected by the object and / or emitted fluorescence light is detected by the detectors. This rasterization process usually takes place in the case of a point or circular lighting pattern meandering, like this that the object is scanned with the lighting pattern in a similar manner like an electron beam on the screen steered a Braun tube becomes. An object detection with a linear illumination pattern is also conceivable, in this case the linear illumination pattern moved along the direction across the line relative to the object.
Insbesondere bei biomedizinischen Anwendungen werden seit geraumer Zeit ganz besondere Rastermikroskope, nämlich konfokale Rastermikroskope, dann eingesetzt, wenn – verglichen zu konventionellen Auflicht- oder Durchlichtmikroskopen – eine verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse benötigt wird. Bezüglich der Ausgestaltung und Einsatzmöglichkeiten konfokaler Rastermikroskope wird beispielsweise auf die Literaturstelle „Handbook of biological confocal microscopy", Editor: J. Pawley, Plenum Press 1995 verwiesen.In particular in biomedical applications have been whole for quite some time special scanning microscopes, namely confocal scanning microscopes, used when - compared to conventional reflected light or transmitted light microscopes - an improved one resolution along the optical axis becomes. In terms of the design and possible uses confocal scanning microscopes are referred to, for example, the reference “Handbook of biological confocal microscopy ", editor: J. Pawley, Plenum Press 1995 directed.
Bei
der Mehrphotonen-Rastermikroskopie werden Fluoreszenzphotonen detektiert,
die auf einen Mehrphotonenanregungsprozess zurückzuführen sind. Bei Mehrphotonenanregungsprozessen
erfolgt der Übergang
von einem Zustand eines Fluorochroms in den angeregten Zustand durch
die simultane Absorption mehrerer Photonen. Die Wahrscheinlichkeit
eines N-Photonenübergangs
ist von der N-ten Potenz der Anregungslichtleistung des Beleuchtungslichts
abhängig.
Zum Erzielen hoher Lichtleistungen wird üblicherweise das zur Beleuchtung dienende
Anre gungslicht gepulst und in ein kleines Volumen bzw. Beleuchtungsmuster
fokussiert. Lediglich beispielhaft wird auf die
Der Hoffman-Modulations-Kontrast für konventionelle Hellfeld-Mikroskope ist beispielsweise in der Literaturstelle Optimizing Light Microscopy for Biological and Clinical Laboratories, Barbara Foster, ASCLS, Kendall/Hunt Publ. Com., 1997, Seiten 66-68 beschrieben. Hiernach wird das Objekt von der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik mit Licht beleuchtet. Hierbei ist eine Spaltapertur in der rückwärtigen Fokalebene der Kondensoroptik angeordnet, wobei die räumlichen Ausmaße des Spalts nur einen kleinen Teil des dort vorliegenden Strahldurchmessers ausmacht. Dieses Licht durchläuft nach dem Durchgang durch das Objekt das Mikroskopobjektiv. In der rückwärtigen Fokalebene des Mikroskopobjektivs – auf der dem Objekt abgewandten Seite – ist ein Kontrastmittel, ein sogenannter Modulator, entsprechend angeordnet. Dieses Kontrastmittel ist eine Art Filter und umfasst Bereiche mit unterschiedlichen Transmissionseigenschaften für das Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts. Das Kontrastmittel ist derart angeordnet, dass die Bereiche auf das durch das Mikroskopobjektiv verlaufende Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts wirken. Hierdurch ist ein Helligkeitsgradient für dieses Licht erzeugt, der kausal für diese Kontrastierungsart verantwortlich ist. Mit dem Hoffman-Modulations-Kontrast können Gradienteninformationen des Objekts sichtbar gemacht werden, d.h. Brechungsindexunterschiede bzw. Brechungsindexübergänge. Nachteilig bei dieser Anordnung ist, dass eine zusätzliche Lichtquelle notwendig ist. Dies ist teuer und in der Realisierung konstruktiv aufwendig, da diese kondensorseitig einzukoppeln ist. Bereits bestehende Rastermikroskopsysteme ohne Hoffman-Modulations-Kontrast sind nur mit erheblichem Aufwand auf diese Kontrastierungsart nachzurüsten.The Hoffman modulation contrast for conventional bright field microscope is for example in the reference Optimizing Light Microscopy for Biological and Clinical Laboratories, Barbara Foster, ASCLS, Kendall / Hunt Publ. Com., 1997, pages 66-68 described. After that, the object is turned away from the object Side of the condenser optics illuminated with light. Here is one Slit aperture in the back focal plane the condenser optics arranged, the spatial dimensions of the gap only makes up a small part of the beam diameter there. This light runs through the microscope objective when passing through the object. In the back focal plane of the microscope lens - on the side facing away from the object - is a contrast medium, a so-called modulator, arranged accordingly. This contrast medium is a kind of filter and covers areas with different transmission properties for the light of the Hoffman modulation contrast. The contrast agent is like this arranged that the areas on that through the microscope lens running light of the Hoffman modulation contrast. hereby is a brightness gradient for generates this light, which is causal for this type of contrast responsible for. With the Hoffman modulation contrast gradient information can of the object are made visible, i.e. Refractive index differences or refractive index transitions. A disadvantage of this arrangement is that an additional light source is necessary is. This is expensive and structurally complex to implement, since this is to be coupled in on the capacitor side. Existing scanning microscope systems without Hoffman modulation contrast are only with considerable effort retrofit to this type of contrast.
Aus
der
Nun
könnte
der Hoffman-Modulations-Kontrast in Verbindung mit der Mehrphotonen-Rastermikroskopie
angewandt werden, wie das beispielsweise in der
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein bereits bestehendes Rastermikroskop in möglichst einfacher Weise um einen Hoffman-Modulations-Kontrast-Modus nachzurüsten wobei eine kompakte Bauweise angestrebt wird.The The present invention is therefore based on the object, one already existing scanning microscope in as possible simple way around a Hoffman modulation contrast mode retrofit whereby a compact design is sought.
Das erfindungsgemäße Rastermikroskop der gattungsbildenden Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts dadurch gekennzeichnet, dass dem Mikroskopobjektiv ein zum Hoffman-Modulations-Kontrast geeignetes Kontrastmittel zugeordnet ist.The scanning microscope according to the invention Generic species solves the above task by the features of the claim 1. Then is such a scanning microscope for the detection of an object characterized in that the microscope objective to the Hoffman modulation contrast suitable contrast agent is assigned.
Ein Kontrastmittel im Sinn der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein optisches Bauteil, das einen Bereich mit sich ändernder Transmissionseigenschaft für das Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts oder einzelne Bereiche mit unterschiedlichen Transmissionseigenschaften für das Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts aufweist.On Contrast medium in the sense of the present invention is special an optical component that has an area with changing Transmission property for the light of the Hoffman modulation contrast or individual areas with different transmission properties for the light of the Hoffman modulation contrast having.
Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass eine möglichst kompakte Bauweise dann gewährleistet ist, wenn das Kontrastmittel dem Mikroskopobjektiv zugeordnet ist. So könnte das Kontrastmittel zwischen Lichtquelle und Mikroskopobjektiv unmittelbar vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet sein. Dies könnte beispielsweise in einer Aufnahme im Objektivrevolver eines konventionellen Mikroskopstativs erfolgen, an dem die für ein Rastermikroskop spezifischen Baugruppen adaptiert sind. Eine direkte Adaption des Kontrastmittels an das Gehäuse des Mikroskopobjektivs wäre ebenfalls denkbar, beispielsweise mittels eines Schnapp- oder Schraubverschlusses oder dergleichen.According to the invention is initially recognized been that one if possible compact design then guaranteed is when the contrast medium is assigned to the microscope objective. So could the contrast medium between the light source and the microscope objective immediately be arranged in front of the microscope objective. For example in a photograph in the nosepiece of a conventional microscope tripod at which the for a scanning microscope specific modules are adapted. A direct one Adaptation of the contrast medium to the housing of the microscope objective would also be conceivable, for example by means of a snap or screw closure or similar.
Ein Nachrüsten bereits bestehender Rastermikroskope ist in ganz besonders vorteilhafter Weise einfach dadurch möglich, dass ein entsprechendes Mikroskopobjektiv in das Rastermikroskop eingebracht wird, wobei dem Mikroskopobjektiv ein Kontrastmittel – in welcher Form auch immer – zugeordnet ist. Somit muss keine Zwischenabbildung zwischen der Lichtquelle und dem Stativ des Rastermikroskops in den Beleuchtungsstrahlengang allein zur Realisierung eines Hoffman-Modulations-Kontrast-Modus eingefügt werden. Eine aufwändige Justage dieses Teils des Beleuchtungsstrahlengangs ist somit nicht erforderlich. Dementsprechend entspricht der Platzbedarf des in erfindungsgemäßer Weise modifizierten Rastermikroskops dem des bereits bestehenden Rastermikroskops.On upgrade Existing scanning microscopes are particularly advantageous Way simply by that a corresponding microscope objective in the scanning microscope is introduced, with the microscope objective a contrast medium - in which Any form - assigned is. There is therefore no need for an intermediate image between the light source and the tripod of the scanning microscope in the illumination beam path solely for realizing a Hoffman modulation contrast mode added become. An elaborate one Adjustment of this part of the illumination beam path is therefore not possible required. Accordingly, the space requirement of the in modified according to the invention Scanning microscope that of the existing scanning microscope.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kontrastmittel im Wesentlichen in einer Fourierebene des Mikroskopobjektivs angeordnet. Hierbei könnte es sich um eine Fourierebene handeln, die unmittelbar in der Umgebung des Mikroskopobjektivs oder sogar darin liegt.In a preferred embodiment the contrast medium is essentially in a Fourier plane of the Microscope lens arranged. This could be a Fourier plane act directly in the vicinity of the microscope objective or even lies in it.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Kontrastmittel im Mikroskopobjektiv angeordnet. Hierdurch ist in besonders vorteilhafter Weise eine kompakte Bauweise und darüber hinaus auch eine ganz besonders einfache Handhabung möglich. Da mit dem Einschrauben des Mikroskopobjektivs in einen Revolver des Rastermikroskops eine wesentliche Voraussetzung zur Durchführung des Hoffman-Modulations-Kontrasts erfüllt ist, ist lediglich eine Modifikation der restlichen erforderlichen Komponenten – beispielsweise ein entsprechend betreibbarer Detektor – im Rastermikroskop vorzusehen bzw. zu modifizieren.In The contrast agent is a very particularly preferred embodiment arranged in the microscope objective. This is particularly advantageous Wise a compact design and also a very special one easy handling possible. Since screwing the microscope lens into a revolver the scanning microscope is an essential prerequisite for performing the Hoffman modulation contrast is only one Modification of the remaining required components - for example a correspondingly operable detector - to be provided in the scanning microscope or to modify.
Im Konkreten umfasst das Kontrastmittel mehrere Bereiche, die für das Licht der Lichtquelle jeweils einen unterschiedlichen Transmissionskoeffizienten aufweisen. Hierbei nehmen die Bereiche vorzugsweise nur einen geringen Anteil des auf den Beleuchtungsstrahlengang wirkenden Teils des Kontrastmittels in Anspruch. Das Kontrastmittel hat bei einer geeigneten Anordnung im optischen Strahlengang die Wirkung eines Phasenfilters, das einen Phasengradienten erzeugt.in the Specifically, the contrast medium includes several areas that are responsible for the light the light source each have a different transmission coefficient exhibit. Here, the areas preferably take only a small one Proportion of the part of the beam that acts on the illumination beam path Contrast medium in claim. The contrast medium has a suitable one Arrangement in the optical beam path the effect of a phase filter, that creates a phase gradient.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind drei Bereiche vorgesehen, die für das Licht der zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle einen Transmissionskoeffizienten von jeweils im Wesentlichen 0,01, 0,15 und 1,0 aufweisen. Dies entspricht im Wesentlichen dem Aufbau des Kontrastmittels, das beim klassischen Hoftman-Modulations-Kontrast zum Einsatz kommt, wie es letztendlich in der eingangs genannten Literaturstelle zum Hoffman-Modulations-Kontrast beschrieben ist.In a preferred embodiment three areas are provided for the light to be used for multi-photon fluorescence excitation suitable light source has a transmission coefficient of each have essentially 0.01, 0.15 and 1.0. This corresponds to Essentially the structure of the contrast medium that is used in the classic Hoftman modulation contrast is used, as it ultimately is in the literature mentioned at the beginning on the Hoffman modulation contrast is described.
Ein Kontrastmittel mit mehreren Bereichen unterschiedlicher Transmissionskoeffizienten könnte eine beschichtete optische Platte umfassen. Diese könnte mit einer Interferenz- oder Absorptionsbeschichtung versehen sein, wobei eine Interferenzbeschichtung bevorzugt wird. Falls nämlich das Kontrastmittel eine Absorptionsbeschichtung umfasst, würde sich das Kontrastmittel während des Betriebs sehr schnell erwärmen, da die Absorptionsbeschichtung Licht im Infrarot-Bereich der zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle absorbieren würde. Eine mit einer Interferenzbeschichtung versehene optische Platte reflektiert das nicht transmittierte Licht, so dass eben keine Erwärmung des Kontrastmittels auftritt. Üblicherweise dient zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts gepulstes Licht einer Wellenlänge in einem Wellenlängenbereich von 700 bis 1000 nm. Für das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht, insbesondere für Licht im sichtbaren Spektralbereich weist das Kontrastmittel einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 auf.A contrast medium with several areas of different transmission coefficients could comprise a coated optical plate. This could be provided with an interference or absorption coating, with an interference coating being preferred. If the contrast medium comprises an absorption coating, the contrast medium would heat up very quickly during operation, since the absorption coating would absorb light in the infrared range of the light source suitable for multi-photon fluorescence excitation. An optical plate provided with an interference coating reflects the non-transmitted light, so that there is no heating of the contrast medium. Usually, pulsed light of a wavelength in a wavelength range from 700 to 1000 nm is used to excite the multiphoton fluorescent light. For the multiphoton fluorescent light, in particular for light in the visible spectral range, the contrast medium has a transmission coefficient of essentially 1.0.
Die zum Hoffman-Modulations-Kontrast erforderliche Segmentoptik ist in einer konkreten Ausführungsform der Kondensoroptik zugeordnet. So könnte beispielsweise die Segmentoptik in einer Filterposition eines Filterrads eingebracht sein, wobei bei einer Kondensorbaugruppe eines konventionellen Mikroskopstativs üblicherweise ein Filterrad vorgesehen ist. Somit kann diese Anordnung der Segmentoptik ge wählt werden, wenn die für ein Rastermikroskop spezifischen Baugruppen an einem konventionellen Mikroskopstativ adaptiert sind.The segment optics required for the Hoffman modulation contrast in a concrete embodiment assigned to the condenser optics. For example, the segment optics be introduced in a filter position of a filter wheel, with a condenser assembly of a conventional microscope stand usually a filter wheel is provided. This arrangement of the segment optics can thus ge chooses if the for a scanning microscope specific assemblies on a conventional Microscope stand are adapted.
Nun könnte die Segmentoptik auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordnet sein. Dort ist üblicherweise auch das bereits beschriebene Filterrad des Kondensors eines konventionellen Mikroskopstativs wirksam, so dass die Segmentoptik in einer Filterposition des Filterrads eingebracht werden kann.Now could the segment optics on the side of the condenser optics facing away from the object be arranged. There is usually also the filter wheel of the condenser of a conventional one already described Microscope stand effective, so that the segment optics in a filter position of the filter wheel can be introduced.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Segmentoptik im Wesentlichen in einer Fourierebene der Kondensoroptik angeordnet. Insbesondere wenn die Kondensoroptik derart ausgebildet ist, dass eine Fourierebene auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik liegt, könnte die Segmentoptik in dem oben beschriebenen Filterrad angeordnet sein. Hierdurch ist in vorteilhafter Weise eine kompakte Bauweise erzielbar, bei der die einzelnen optischen Komponenten nahezu unmittelbar nacheinander angeordnet sind. Eine einfache Handhabung ist durch eine Einbringung der Segmentoptik in ein Filterrad gewährleistet. Jedenfalls kann der Hoffman-Modulations-Kontrast durch einfaches Drehen des Filterrads aktiviert bzw. deaktiviert werden. Ein Nachrüsten eines bereits bestehenden Rastermikroskops kann bei einer solchen Anordnung nahezu gänzlich ohne Justiervorgänge durchgeführt werden.In a preferred embodiment the segment optics is essentially in a Fourier plane of the condenser optics arranged. In particular if the condenser optics are designed in this way is that a Fourier plane on the side of the Condenser optics, could the segment optics arranged in the filter wheel described above his. This is a compact construction in an advantageous manner achievable in which the individual optical components almost immediately are arranged one after the other. Easy handling is through a Guaranteed insertion of the segment optics in a filter wheel. In any case, the Hoffman modulation contrast can be done by simple Turning the filter wheel can be activated or deactivated. Retrofitting one already existing scanning microscope can with such an arrangement almost entirely without adjustment processes carried out become.
Im Konkreten weist die Segmentoptik für das vom Objekt kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 auf. Eine nahezu verlustfreie Detektion dieses Lichts bei zusätzlichem Hoffman-Modulations-Kontrast ist somit möglich, da zumindest die Segmentoptik einen nahezu maximalen Transmissionskoeffizienten aufweist und das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht hierdurch in seiner Leistung nicht vermindert wird. Die Wellenlängen des vom Objekt kommenden Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts liegen üblicherweise einen Wellenlängenbereich von 400 bis 700 nm.in the The segment optics have specifics for the multi-photon fluorescent light coming from the object has a transmission coefficient of substantially 1.0. A almost lossless detection of this light with additional Hoffman Modulation Contrast is therefore possible since at least the segment optics have an almost maximum transmission coefficient and the multi-photon fluorescent light this does not reduce its performance. The wavelengths of the Multi-photon fluorescent light coming from the object is usually located a wavelength range from 400 to 700 nm.
Die Segmentoptik weist nur in einem geringen Bereich einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 für das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle auf. Im übrigen Bereich der Segmentoptik ist für dieses Licht vorzugsweise ein Transmissionskoeffizient von nahezu 0 vorgesehen. Insoweit wird zur Durchführung des Hoffman-Modulations-Kontrasts mit einem geeignet angeordneten Detektor lediglich das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle detektiert, das die Segmentoptik passiert, mit anderen Worten also durch diesen Bereich hindurchtritt. In diesem Bereich ist der Transmissionskoeffizient für das vom Objekt kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht ebenfalls 1,0, so dass auch dieser Bereich zur Detektion des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts genutzt werden kann. Hierdurch kann in ganz besonders vorteilhafter Weise eine hohe Signalausbeute bei der Detektion des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts erzielt werden, das ohnehin eine geringe Intensität aufweist.The Segment optics have a transmission coefficient only in a small area of essentially 1.0 for the light used to excite the multiphoton fluorescent light Light source on. Furthermore The field of segment optics is for this light preferably has a transmission coefficient of almost 0 provided. To this extent, the Hoffman modulation contrast with a suitably arranged detector only that for excitation of the multi-photon fluorescent light serving light of the light source detects that the segment optics happens, in other words it passes through this area. In this area the transmission coefficient for that of Object-coming multiphoton fluorescent light also 1.0, see above that this area for the detection of the multi-photon fluorescent light can be used. This can be particularly advantageous A high signal yield in the detection of the multi-photon fluorescent light can be achieved, which has a low intensity anyway.
Zum Erzielen eines brauchbaren Hoffman-Modulations-Kontrasts ist die Segmentoptik derart angeordnet, dass der vom Kontrastmittel beeinflusste Teil des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienenden Lichts der Lichtquelle im Wesentlichen den geringen Bereich der Segmentoptik durchläuft. Insoweit sind die beiden Mittel in ihrer relativen Anordnung aufeinander angepasst. Bei geeigneter Strahlführung ist der zur Erzeugung des Hoffman-Modulations-Kontrasts dienende Lichtweg bzw. Teilstrahlengang dem Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang überlagert.To the Achieving a useful Hoffman modulation contrast is Segment optics arranged in such a way that the one influenced by the contrast medium Part of that used to excite the multiphoton fluorescent light Light of the light source essentially the small area of the segment optics passes. In this respect, the two means are relative to one another in their arrangement customized. With suitable beam guidance, this is for generation of the Hoffman modulation contrast serving light path or partial beam path superimposed on the illumination and detection beam path.
Zur Justage bzw. Einstellung des Hoffman-Modulations-Kontrasts ist die Segmentoptik und/oder das Kontrastmittel um eine Drehachse drehbar angeordnet, die vorzugsweise parallel zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs oder des Beleuchtungsstrahlengangs ist. Falls beispielsweise die Segmentoptik in einem der Kondensoroptik zugeordneten Filterrad eingebracht ist, könnte die Segmentoptik hierbei in einer drehbaren Fassung im Filterrad untergebracht sein. Da Filterräder mit diesen Eigenschaften aus dem Stand der Technik bekannt sind, kann hierzu auf Standardkomponenten zurückgegriffen werden und somit eine Einstellmöglichkeit kostengünstig geschaffen werden. Alternativ oder zusätzlich könnte beispielsweise auch das im Mikroskopobjektiv angeordnete Kontrastmittel drehbar angeordnet sein, das beispielsweise über einen drehbar angeordneten Ring am Mikroskopobjektivgehäuse betätigt werden könnte.In order to adjust or adjust the Hoffman modulation contrast, the segment optics and / or the contrast medium are arranged so as to be rotatable about an axis of rotation, which is preferably parallel to the optical axis of the detection beam path or the illumination beam path. If, for example, the segment optics is incorporated in a filter wheel assigned to the condenser optics, the segment optics could be accommodated in a rotatable socket in the filter wheel. Since filter wheels with these properties are known from the prior art, standard components can be used for this be used and thus an adjustment option can be created inexpensively. Alternatively or additionally, for example, the contrast medium arranged in the microscope objective could also be rotatably arranged, which could be actuated, for example, via a rotatably arranged ring on the microscope objective housing.
Grundsätzlich können die zum Hoffman-Modulations-Kontrast erforderlichen Komponenten beispielsweise durch eine Aufnahme in ein Filterrad oder ähnliches in den Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang verbracht werden und/oder justiert werden. Für physiologische Applikationen ist jedoch ein erschütterungsfreies Arbeiten erforderlich, da ein noch lebendes Objekt unter Verwendung von Mikro-Pipetten untersucht wird und eine Erschütterung am Stativ des Rastermikroskops gegebenenfalls das Objekt zerstören kann. Eine Verstellung der für den Hoffman-Modulations-Kontrast erforderlichen Komponenten ist jedoch nach einmaliger Justage üblicherweise nicht erforderlich, so dass solche Untersuchungen in vorteilhafter Weise nach entsprechender Justage durchgeführt werden können.Basically, they can components required for Hoffman modulation contrast, for example by inclusion in a filter wheel or the like in the lighting or detection beam path are brought and / or adjusted. For physiological However, applications require vibration-free work, because a living object is examined using micro pipettes and a shock on Tripod of the scanning microscope can possibly destroy the object. An adjustment for the Hoffman modulation contrast required components is usually after a single adjustment not necessary, so such investigations are more advantageous Way can be carried out after appropriate adjustment.
Das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht könnte beispielsweise mit mindestens einem Detektor detektiert werden, der auf der der Lichtquelle zugewandten Seite des Mikroskopobjektivs angeordnet ist. Insoweit könnte hierzu ein konventioneller Auflicht-Detektionsstrahlengang vorliegen, insbesondere auch dann, falls das Rastermikroskop einen konfokalen Strahlengang aufweist. Ein solcher Detektor detektiert das vom Mikroskopobjektiv aufgesammelte Licht, das vom Objekt kommt.The For example, multi-photon fluorescent light can be detected with at least one detector on which the Light source side of the microscope objective arranged is. To that extent there is a conventional incident light detection beam path for this purpose, especially also if the scanning microscope has a confocal beam path having. Such a detector detects that from the microscope objective collected light that comes from the object.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform detektiert der Detektor vom Objekt kommendes Licht, das zwischen dem Mikroskopobjektiv und einer Rastereinrichtung des Rastermikroskops verläuft. Bei einer solchen Detektionsanordnung handelt es sich um eine sogenannte Non-Descan-Anordnung, da das vom Objekt kommende sich in gleicher Weise wie das zur Objektbeleuchtung dienende Licht bewegt, das von der Rastereinrichtung ausgelenkt wird. Hierdurch ist eine effiziente Detektion des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts möglich, da keine Detektionslochblende erforderlich ist und hierdurch auch keine Lichtverluste beim konfokalen Detektionsstrahlengang auftreten. Eine Detektionslochblende ist bei Mehrphotonen-Anregungsprozessen nicht erforderlich, da das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht lediglich aus dem Fokusbereich des konfokalen Beleuchtungsmusters stammt. Eine konfokale Detektionslochblende würde aufgrund des sich bewegenden Detektionsstrahlengangs an dieser Stelle so gut wie kein Licht durchlassen.In In a particularly preferred embodiment, the detector detects light coming from the object, which is between the microscope lens and a scanning device of the scanning microscope. at such a detection arrangement is a so-called Non-descan arrangement, since the one coming from the object is the same Way the light used for object lighting moves that of the raster device is deflected. This makes it efficient Detection of the multi-photon fluorescent light possible because there is no pinhole is required and therefore no loss of light in confocal Detection beam path occur. A detection pinhole is not necessary for multi-photon excitation processes, since the multi-photon fluorescent light only from the focus area of the confocal lighting pattern comes. A confocal pinhole would be due to the moving Detection beam path hardly let any light through at this point.
Zur Detektion zumindest eines Teils des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienenden Lichts der Lichtquelle ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordneter Detektor vorgesehen. Dieser Detektor detektiert letztendlich das Licht, das zur Erzeu gung des Hoffman-Modulations-Kontrasts erforderlich ist. Insoweit detektiert dieser Detektor einen Teil des vom Objekt kommenden Lichts, das von der Kondensoroptik aufgesammelt wird.to Detection of at least part of the excitation of the multi-photon fluorescent light serving light of the light source is in a preferred embodiment one on the side of the condenser optics facing away from the object Detector provided. This detector ultimately detects that Light required to create the Hoffman modulation contrast is. In this respect, this detector detects a part of that of the object coming light, which is collected by the condenser optics.
Zur Detektion des von der Kondensoroptik aufgesammelten, vom Objekt kommenden Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts ist mindestens ein auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordneter Detektor vorgesehen. Die auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordneten Detektoren detektieren das vom Objekt kommende Licht im Non-Descan-Modus, da das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienende Licht der Lichtquelle aufgrund des Rastervorgangs relativ zum Objekt bewegt wird und dementsprechend auch das vom Objekt kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht ebenfalls keinen ortsfesten Strahlenverlauf aufweist.to Detection of the object collected by the condenser optics upcoming multiphoton fluorescent light is at least one on the side of the condenser optics facing away from the object Detector provided. The side of the Condenser optics arranged detectors detect that coming from the object Light in non-descan mode, since this is used to excite the multi-photon fluorescent light serving light of the light source due to the raster process relative is moved to the object and accordingly that coming from the object Multi-photon fluorescent light also does not have a fixed beam path having.
Grundsätzlich könnte zur separaten Detektion des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienenden Lichts der Lichtquelle und des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienende Licht der Lichtquelle und das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht aufgespalten werden. Hierdurch wäre eine räumliche Trennung des Anregungslichts und des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht erreicht. Dies ermöglicht die separate Messung der entsprechenden Lichtleistungen mit verschiedenen Detektoren.Basically, could separate detection of the excitation of the multi-photon fluorescent light serving light of the light source and the multiphoton fluorescent light the light used to excite the multiphoton fluorescent light Light source and the multi-photon fluorescent light are split. This would be a spatial Separation of the excitation light and the multiphoton fluorescent light reached. this makes possible the separate measurement of the corresponding light outputs with different Detectors.
Im Konkreten könnte zur Aufspaltung mindestens ein Farbstrahlteiler eingesetzt sein. Dabei könnten mehrere Farbstrahlteiler hintereinander angeordnet sein, um eine Abspaltung unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche zu ermöglichen.in the Could be concrete at least one color beam splitter can be used for splitting. Doing so several color beam splitters can be arranged one behind the other Elimination of different wavelengths or wavelength ranges to enable.
Alternativ hierzu könnte zur Aufspaltung mindestens ein teildurchlässiger Spiegel eingesetzt sein. Diesem Spiegel oder diesen Spiegeln könnte ein Band- oder Blockfilter nachgeordnet sein. Auch bei der Verwendung von Spiegeln als Aufspaltungsbauteil könnten mehrere derartige Spiegel hintereinander, gegebenenfalls mit einem nachgeordneten Band- oder Blockfilter, angeordnet sein. Auch hierdurch ist eine Aufspaltung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts in mehrere Spektralbereiche möglich.alternative could do this at least one partially transparent mirror can be used for splitting. this Mirror or these mirrors could a band or block filter can be arranged downstream. Even when using it of mirrors as a splitting component could be several such mirrors one after the other, if necessary with a subordinate tape or Block filter. This also causes a split of the multi-photon fluorescent light possible in several spectral ranges.
Alternativ
zur Verwendung von Farbstrahlteilern oder Spiegeln könnte zur
Aufspaltung ein Multibanddetektor eingesetzt werden, der beispielsweise in
der
In einer bevorzugten Ausführungsform ist zur Beleuchtung des Objekts eine weitere Lichtquelle vorgesehen. Diese Lichtquelle emittiert Weißlicht, also kein monochromatisches Licht, sondern Licht eines größeren Wellenlängenbereichs. Insoweit sei angemerkt, dass das Kontrastmittel grundsätzlich keine Einschränkung auf eine Laserlichtquelle darstellt, die sichtbares Licht emittiert. Bei Verwendung einer Weißlichtquelle sollte der Lichtstrahl vor der Rastereinrichtung eingekoppelt werden, nämlich kondensorseitig über einen Strahlteiler. Eine zusätzliche Kamera bzw. ein Detektor könnte im Detektionsstrahlengang über einen entsprechenden Strahlteiler zum Einsatz kommen.In a preferred embodiment a further light source is provided for illuminating the object. This light source emits white light, so not monochromatic light, but light of a larger wavelength range. In this respect, it should be noted that the contrast agent is basically not restricted represents a laser light source that emits visible light. When using a white light source should the light beam be coupled in front of the grid device, namely on the condenser side a beam splitter. An additional Camera or a detector could in the detection beam path an appropriate beam splitter can be used.
Beispielsweise
könnte
als weitere Lichtquelle eine Lichtquelle eingesetzt werden, wie
sie aus der
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Rastermikroskop einen konfokalen Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang auf. Dies könnte beispielsweise durch das Vorsehen von entsprechend angeordneten Beleuchtungs- bzw. Detektionslochblenden im Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang erfolgen. Aber auch ohne Beleuchtungs- bzw. Detektionslochblenden kann bei der Mehrphotonen-Fluoreszenzmikroskopie ein konfokaler Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang gebildet werden, indem die Strahlfüh rung entsprechend dem eines konfokalen Rastermikroskops ohne Lochblenden ausgebildet ist.In The scanning microscope according to the invention has a very particularly preferred embodiment a confocal illumination and detection beam path. This could for example by providing appropriately arranged lighting or detection pinhole in the illumination or detection beam path respectively. But also without lighting or detection pinhole can be confocal in multiphoton fluorescence microscopy Illumination and detection beam path are formed by the beam guidance corresponding to that of a confocal scanning microscope without pinhole is trained.
Da das Kontrastmittel dem Mikroskopobjektiv zugeordnet ist, könnte in einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ein Mikroskopobjektiv derart ausgestaltet sein, dass es zur Verwendung für ein Rastermikroskop nach einem der Patentansprüche 1 bis 20 geeignet ist. Dies könnte beispielsweise durch eine geringfügige Modifikation erzielt werden, beispielsweise durch Einschrauben eines in einer entsprechenden Fassung vorgesehenen Kontrastmittels am Mikroskopobjektivgehäuse am Mikroskopobjektivwechselbereich eines herkömmlichen Mikroskopobjektivs. Eine Fertigung einer speziell für das erfindungsgemäße Rastermikroskop geeigneten Mikroskopobjektivserie wäre ebenfalls denkbar.There the contrast medium is assigned to the microscope objective, in a very particularly preferred embodiment of a microscope objective be designed to be used for a scanning microscope one of the claims 1 to 20 is suitable. this could can be achieved, for example, by a slight modification, for example by screwing one provided in an appropriate socket Contrast agent on the microscope lens housing at the microscope lens change area a conventional one Microscope objective. A production of a specially for the scanning microscope according to the invention suitable microscope objective series would also be conceivable.
Bei dem Mikroskopobjektiv könnte es sich um ein Immersionsobjektiv der Klasse HCX APO der Anmelderin handeln. Vorzugsweise weist es eine Vergrößerung von 20x und einen relativ großen Arbeitsabstand auf. Hierdurch ist es insbesondere für physiologische bio-medizinische Applikationen geeignet. Es hat eine feste oder eine verstellbare Numerische Apertur von 0,8 bis 1,0 und ist für den Einsatz mit einem Immersionsmedium mit einem Brechungsindexbereich von 1,33 bis 1,45 optimiert bzw. ebenfalls einstellbar. Als Immersionsmedium kann beispielsweise ein Wasser-Dextran-Gemisch verwendet werden, wobei der Brechungsindex der Probe als Vorgabe zur Anpassung und damit für die Wahl des Verhältnisses in dem Gemisch maßgeblich ist. Dadurch wird der optische Fluss vom Mikroskopobjektiv in die Probe ideal angepasst.at the microscope lens could it is an immersion lens of the applicant's class HCX APO act. It preferably has a magnification of 20x and a relative one huge Working distance. This makes it especially for physiological suitable for bio-medical applications. It has a fixed or an adjustable numerical aperture from 0.8 to 1.0 and is for use with an immersion medium with a refractive index range of 1.33 up to 1.45 optimized or also adjustable. As an immersion medium can, for example, a water-dextran mixture can be used, with the refractive index of the sample as a default for adaptation and thus for the choice of the ratio decisive in the mixture is. As a result, the optical flow from the microscope objective into the Ideally adapted sample.
Das Mikroskopobjektiv ist für Licht aus einem Wellenlängenbereich von 350 bis 1100 nm transmittierend ausgeführt. Die Farbkorrektion des Mikroskopobjektivs erfolgt in vergleichbarer Weise wie bei einem HCX APO Mikroskopobjektiv der Anmelderin. Durch den großen Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs ist eine Untersuchung dicker Präparate möglich. Bei Verwendung des Objektivs ist wesentlich, dass ein erschütterungsfreies Arbeiten bei gleichzeitig hoher Penetration in die Probe möglich ist.The Microscope lens is for Light from one wavelength range from 350 to 1100 nm transmitting. The color correction of the Microscope objective is done in a similar way as for one Applicant's HCX APO microscope objective. Due to the large working distance The microscope objective can examine thick specimens. at Using the lens is essential to be vibration free Working with high penetration into the sample is possible.
An dieser Stelle sei angemerkt, dass sowohl das Kontrastmittel als auch die Segmentoptik austauschbar sind.On At this point it should be noted that both the contrast medium and the segment optics are also interchangeable.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigenIt are now different ways to design the teaching of the present invention in an advantageous manner and educate. On the one hand, this is based on the claim 1 subordinate claims and on the other hand to the following explanation of the preferred exemplary embodiments to refer to the invention with reference to the drawing. Combined with the explanation of the preferred embodiments the invention with reference to the drawing are also generally preferred Refinements and developments of teaching explained. In show the drawing
Die
Erfindungsgemäß ist dem
Mikroskopobjektiv
Das
in
In
den
Die
Segmentoptik
In
den
Die
Detektoren
Wie
in den
In
den Ausführungsbeispielen
der
Der
in den
Bei
dem in
Die
in den
Bei
dem Mikroskopobjektiv
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.In conclusion particularly noted that those discussed above embodiments serve only to describe the claimed teaching, this however not on the exemplary embodiments limit.
Claims (22)
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