DE10312659A1 - New 5-aminolevulinic acid derivatives useful for photodynamic tumor therapy and/or diagnosis - Google Patents

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Abstract

5-Aminolevulinic acid derivatives (I) are new. 5-Aminolevulinic acid derivatives of formula (I) and their salts are new; H2N-CH2-CO-(CH2)2-COR1> (I) R1>OR2>, SR3> or OCH2Ar; R2>1-20C fluoroalkyl; R3>alkyl, substituted alkyl, alkoxy, aryloxy, alkoxycarbonyl, amino or aryl, all optionally interrupted by O, N, S or P; Ar : phenyl substituted with 0-4 of R4> and 1-5 of R5>; R4>H, halo, alkyl, substituted alkyl, NH2, OR3>, SR3>, OH, SH, COOH; and R5>5-aminolevulinoyloxymethyl. ACTIVITY : Cytostatic. MECHANISM OF ACTION : Photodynamic therapy.

Description

Die Erfindung betrifft neue 5-Aminolävulinsäurederivate mit spezifischen Resten, Arzneimittel enthaltend derartige Lävulinsäurederivate und die Verwendung dieser 5-Aminolävulinsäurederivate für die photodynamische Tumortherapie und -diagnostik.The invention relates to new 5-aminolevulinic acid derivatives with specific residues, drugs containing such levulinic acid derivatives and the use of these 5-aminolevulinic acid derivatives for the photodynamic Tumor therapy and diagnosis.

In der WO 91/01727 ist die photodynamische Tumortherapie und -diagnostik mit 5-Aminolävulinsäure (ALA) beschrieben. ALA ist ein körpereigener Stoff, der im Zuge der Hämin-Biosynthese in den Zellen aus Glycin und Succinyl-Coenzym A gebildet wird. Im weiteren Verlauf entsteht Protoporphyrin IX (PPIX), aus dem durch Eiseneinlagerung Hämin gebildet wird. Aufgrund eines strengen Kontrollmechanismus (Feedback-Kontrolle) wird die Konzentration von freiem Hämin geregelt und die intrazelluläre ALA-Synthese limitiert. Durch exogene ALA-Applikation kann dieser Kontrollmechanismus umgangen werden, was zu einer Akku mulation von PPIX im Zielgewebe (Tumor) führt. PPIX stellt einen idealen Photosensibilisator dar, der nach Anregung mit Licht entsprechender Wellenlänge einerseits zur Photodynamischen Tumordiagnostik (PDD) und andererseits zur Photodynamischen Tumortherapie (PDT) herangezogen werden kann.In WO 91/01727 is the photodynamic Tumor therapy and diagnosis with 5-aminolevulinic acid (ALA) described. ALA is a body's own Substance used in the course of hemin biosynthesis is formed in the cells from glycine and succinyl-coenzyme A. in the Protoporphyrin IX (PPIX) develops from which the Iron storage Hämin is formed. Due to a strict control mechanism (feedback control) the Concentration of free hemin regulated and the intracellular Limited ALA synthesis. This can be achieved through exogenous ALA application Control mechanism are bypassed, resulting in accumulation of PPIX leads in the target tissue (tumor). PPIX is an ideal photosensitizer that can be used with Light of the appropriate wavelength on the one hand for photodynamic tumor diagnosis (PDD) and on the other hand can be used for photodynamic tumor therapy (PDT).

Bei der PDD nutzt man die selektive Anreicherung von PPIX in entartetem Gewebe. Unter Blaulichtbestrahlung können mittels der charakteristischen Rotfluoreszenz von PPIX Präkanzerosen und Frühkarzinome lokalisiert und von gesundem Gewebe abgegrenzt werden. Damit kommt der Fluoreszenz-Endoskopie mit ALA große Bedeutung bei der Krebsfrüherkennung zu.The PDD uses the selective one Enrichment of PPIX in degenerate tissue. Under blue light can using the characteristic red fluorescence of PPIX precancerosis and early cancer localized and delineated from healthy tissue. With that comes fluorescence endoscopy with ALA is of great importance in early cancer detection to.

Bei der PDT wird nach ALA-Applikation und tumorselektiver PPIX-Akkumulation mit Rotlicht bestrahlt. Die Anregungsenergie wird vom Photosensibilisator entweder direkt an Zielmoleküle abgegeben (Photoreaktionen I) oder zur Bildung von Singulett-Sauerstoff herangezogen (Photoreaktionen II). Beide Mechanismen führen zur Zerstörung lebenswichtiger Zellbestandteile. Die Tumorzelle stirbt ab.The PDT is based on ALA application and tumor selective PPIX accumulation irradiated with red light. The Excitation energy is either directly applied by the photosensitizer targets emitted (photoreactions I) or to form singlet oxygen used (photoreactions II). Both mechanisms lead to destruction vital cell components. The tumor cell dies.

Heutiger Standard der PDT ist die systemische Applikation von Photofrin. Dieser Photosensibilisator reichert sich nur wenig selektiv in Tumoren an, kann nicht topisch appliziert werden und führt zu einer generalisierten Sensibilisierung der Patienten gegenüber Sonnenlicht für mehrere Wochen. ALA-induziertes PPIX weist neben einer sehr hohen Tumorselektivität keinerlei Dunkeltoxizität auf. Aufgrund rascher Eliminierung aus dem Körper (24 Stunden) kommt es zu einer sehr geringen Photosensibilisierung. Somit stellt die ALA-PDT eine sehr schonende und effektive Methode zur Tumortherapie dar.Today's standard of the PDT is systemic application of Photofrin. This photosensitizer enriches is not very selective in tumors and cannot be applied topically be and leads generalized patient awareness of sunlight for many Weeks. In addition to a very high tumor selectivity, ALA-induced PPIX does not have any dark toxicity on. It happens due to rapid elimination from the body (24 hours) to a very low photosensitization. Thus, the ALA-PDT is a very gentle and effective method for tumor therapy.

Aufgrund der geringen Lipophilie von ALA ist die Aufnahme durch die Zellmembran und die damit verbundene intrazelluläre PPIX-Akkumulation limitiert. Eine Möglichkeit, die Lipophilie von ALA zu steigern ist in der WO 02/10120 beschrieben. Danach wird hierzu die Synthese von ALA-Estern vorgeschlagen. Als besonders interessant haben sich hierbei für die PDT und PDD der Haut der ALA-Methylester für die PDD im Gastrointestinaltrakt der ALA-Benzylester und ALA-Hexylester und für die PDT und PDD in der Harnblase der ALA-Hexylester erwiesen.Because of the low lipophilicity of ALA is the uptake by the cell membrane and the associated intracellular PPIX accumulation limited. One way to prevent lipophilia Increasing ALA is described in WO 02/10120. After that the synthesis of ALA esters is proposed. As special have been interesting for the PDT and PDD of the skin the ALA methyl ester for the PDD in the gastrointestinal tract the ALA-benzyl ester and ALA-hexyl ester and for PDT and PDD in the bladder the ALA hexyl ester proved.

Nachteilig bei den vorstehend beschriebenen ALA-Estern ist jedoch, dass diese im Bezug auf die Tumorselektivität noch unbefriedigende Eigenschaften aufweisen. Auch ist eine Steigerung der PPIX-Akkumulation wünschenswert, da diese bei den vorstehend beschriebenen Estern noch nicht befriedigend ist.A disadvantage of those described above ALA esters, however, that these properties are still unsatisfactory in terms of tumor selectivity exhibit. An increase in PPIX accumulation is also desirable, since this is not yet satisfactory with the esters described above is.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue 5-Aminolävulinsäurederivate vorzuschlagen, die insbesondere in Bezug auf die Tumorselektivität und die Möglichkeit der Steigerung der PPIX-Akkumulation gegenüber den bekannten Estern Vorteile aufweisen.Based on this, it is the task the present invention to propose new 5-aminolevulinic acid derivatives, which in particular with regard to tumor selectivity and the possibility advantages of increasing the PPIX accumulation compared to the known esters exhibit.

Die Aufgabe wird durch die 5-Aminolävulinsäurederivate nach Patentanspruch 1 gelöst. Die Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen in Bezug auf die Säurederivate auf.The task is solved by the 5-aminolevulinic acid derivatives solved according to claim 1. The subclaims show advantageous developments in relation to the acid derivatives on.

Die erfindungsgemäßen neuartigen 5-Aminolävulinsäurederivate bzw. deren Salze sind durch die allgemeine Formel (I) definiert. HN2-CH2-CO-(CH2)2-COR1 (I) The novel 5-aminolevulinic acid derivatives or their salts according to the invention are defined by the general formula (I). HN 2 -CH 2 -CO- (CH 2 ) 2 -COR 1 (I)

Die neuartigen 5-Aminolävulinsäurederivate umfassen drei spezifische Varianten in Bezug auf den Rest R1.The novel 5-aminolevulinic acid derivatives comprise three specific variants with respect to the radical R 1 .

Die erste Gruppe betrifft 5-Aminolävulinsäurederivate, bei denen der Rest R1 ein Estersubstient ist, der eine spezifische Fluorierung in der Kette aufweist. Bevorzugt ist dabei R1 = -OR2 wobei R2 wie nachfolgend definiert ist: R2 = – (CR62 )mCnR7 The first group relates to 5-aminolevulinic acid derivatives in which the radical R 1 is an ester substituent which has a specific fluorination in the chain. R 1 = -OR 2 is preferred, wherein R 2 is defined as follows: R 2 = - (CR 6 2 ) m C n R 7

Bei den 5-Aminolävulinsäurederivaten nach der vorstehenden Variante ist dabei der Rest CnR7 geradkettig oder verzweigt. Der Rest R6 kann dabei Wasserstoff und/oder Fluor sein. Der Rest R7 ist F2n+1 oder HF2n oder H2nF. Bei den vorstehend beschriebenen 5-Aminolävulinsäurederivaten ist m = 0–10 und n = 1–10 wobei CnR7 geradkettig oder verzweigt ist. Bevorzugte Verbindung sind diejenigen, bei denen m = 1 oder und n = 3–5 ist. Weitere bevorzugte Varianten zeichnen sich dadurch aus, dass der Rest R6 Wasserstoff und/oder Fluor ist.In the 5-aminolevulinic acid derivatives according to the above variant, the radical C n R 7 is straight-chain or branched. The radical R 6 can be hydrogen and / or fluorine. The radical R 7 is F 2n + 1 or HF 2n or H 2n F. In the 5-aminolevulinic acid derivatives described above, m = 0-10 and n = 1-10 where C n R 7 is straight-chain or branched. Preferred compounds are those in which m = 1 or and n = 3-5. Further preferred variants are characterized in that the radical R 6 is hydrogen and / or fluorine.

Konkrete Beispiele für 5-Aminolävulinsäurederivate der vorstehend beschriebenen Varianten sind:
5-Aminolävulinsäure-1H,1H-heptafluorbutylesterhydrochlorid,
5-Aminolävulinsäure-1H,1H,2H,2H-nonafluorhexylesterhydrochlorid,
5-Aminolävulinsäure-1H,1H-tridecafluorheptylesterhydrochlorid,
5-Aminolävulinsäure-1H,1H,5H-octafluorpentylester hydrochlorid.Specific examples of 5-aminolevulinic acid derivatives of the variants described above are:
5-aminolevulinic acid-1H, 1H-heptafluorbutylesterhydrochlorid,
5-aminolevulinic acid-1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorhexylesterhydrochlorid,
5-aminolevulinic acid-1H, 1H-tridecafluorheptylesterhydrochlorid,
5-aminolevulinic acid 1H, 1H, 5H-octafluoropentyl ester hydrochloride.

Die erfindungsgemäßen 5-Aminolävulinsäurederivate bzw. deren Salze der zweiten Alternative sind dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R1 ein Rest der Gruppe -SR3 ist. R3 ist dabei ausgewählt aus Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkoxy, Acyloxy, Alkoxycarbonyl, Amino, Aryl oder Halogen wobei die Reste durch Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphoratome unterbrochen sein können.The 5-aminolevulinic acid derivatives according to the invention or their salts of the second alternative are characterized in that the radical R 1 is a radical of the group -SR 3 . R 3 is selected from alkyl, substituted alkyl, alkoxy, acyloxy, alkoxycarbonyl, amino, aryl or halogen, where the radicals can be interrupted by oxygen, nitrogen, sulfur or phosphorus atoms.

Ein bevorzugtes Beispiel eines derartigen Thioesters ist 5-Aminolävulinsäurethiohexylester-hydrochlorid.A preferred example of such Thioesters is 5-aminolevulinic acid thiohexyl ester hydrochloride.

Die dritte Alternative der neuen erfindungsgemäßen 5-Aminolävulinsäurederivate ist dadurch charakterisiert, dass der Rest R1 ein spezieller Benzylester

Figure 00050001
wobei R4 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogen, Alkyl, substituiertes Alkyl, NH2, OR3, SR3 wobei R3 wie vorstehend definiert ist, OH, SH, COOH und R5 = -CH2-COO-(CH2)2-COCH2-NH2,
bzw. dessen Salz ist und wobei R 4 / 15 gleich oder verschieden sein kann. Bevorzugt ist es hierbei, wenn Di-, Tri-, Tetra-, Penta- oder Hexaester vorliegen.The third alternative of the new 5-aminolevulinic acid derivatives according to the invention is characterized in that the radical R 1 is a special benzyl ester
Figure 00050001
where R 4 is selected from hydrogen, halogen, alkyl, substituted alkyl, NH 2 , OR 3 , SR 3 where R 3 is as defined above, OH, SH, COOH and R 5 = -CH 2 -COO- (CH 2 ) 2 -COCH 2 -NH 2 ,
or its salt and where R 4/15 may be the same or different. It is preferred here if di-, tri-, tetra-, penta- or hexa esters are present.

Eine bevorzugte Verbindung ist Bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiesterdihydrochlorid.A preferred compound is bis-5-aminolevulinic acid 1,4-dibenzyldiester dihydrochloride.

Es hat sich gezeigt, dass die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen 5-Aminolävulinsäurederivate zu einer Steigerung der PPIX-Akkumulation im Vergleich zu dem aus dem Stand der Technik bekannten Hexylester um bis zu 62% ermöglichen.It has been shown that the above 5-aminolevulinic acid derivatives according to the invention described to an increase in PPIX accumulation compared to that enable the known prior art hexyl esters by up to 62%.

Weiter ist hervorzuheben, dass die neuen Verbindungen keine Dunkeltoxizität zeigen, was eine Bedingung für die klinische Anwendung ist.It should also be emphasized that the new compounds do not show dark toxicity, which is a condition for the is clinical application.

Die erfindungsgemäßen Derivate zeichnen sich weiterhin dadurch aus, dass die Tumorselektivität im Vergleich zum Hexylester im Kolon (HT29/CCD18) um bis zu 47% und im Urothel (J82/Urotsa) um bis zu 17% gesteigert ist.The derivatives according to the invention stand out further characterized by the fact that the tumor selectivity compared to the hexyl ester in the colon (HT29 / CCD18) by up to 47% and in the urothelium (J82 / Urotsa) is increased by up to 17%.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen 5-Aminolävulinsäurederivate führte zudem bei Phototoxizitätstests zu einer Erniedrigung des LD50-Verhältnisses im Vergleich zum Hexylester um bis zu 68% im Kolon (HT29/CCD18) und bis zu 15% im Urothel (J82/Urotsa).The use of the 5-aminolevulinic acid derivatives according to the invention also led to a reduction in the LD 50 ratio in phototoxicity tests compared to the hexyl ester by up to 68% in the colon (HT29 / CCD18) and up to 15% in the urothelium (J82 / Urotsa).

Die vorstehend detailliert beschriebenen 5-Aminolävulinsäurederivate sind deshalb ausgezeichnet für die photodynamische Tumortherapie und -diagnostik geeignet und zeigen sich überlegen gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen bisher bekannten Verbindungen.The ones described in detail above 5-Aminolävulinsäurederivate are therefore excellent for suitable and show photodynamic tumor therapy and diagnosis to consider across from the previously known compounds described in the prior art.

Die Erfindung wird nachstehend detailliert anhand von verschiedenen Beispielen näher beschrieben.The invention is detailed below described in more detail using various examples.

A) Beispiele für 5-Aminolävulinsäurederivate der allgemeinen Formel (I) mit dem Rest R1 = -OR2 A) Examples of 5-aminolevulinic acid derivatives of the general formula (I) with the radical R 1 = -OR 2

1) Allgemeine Summenformeln1) General empirical formulas

  • R2 = (CH2)mCnF2n+1; m = 0–x, n = 1–y, wobei CnF2n+1 geradkettig oder verzweigt sein kann;R 2 = (CH 2 ) m C n F 2n + 1 ; m = 0-x, n = 1-y, where C n F 2n + 1 can be straight-chain or branched;

Synthetisierte VerbindungenSynthesized compounds

Verbindung 1:Connection 1:

  • m = 1, n = 3: 5-Aminolävulinsäure-1H,1H-heptafluorbutylester-hydrochloridm = 1, n = 3: 5-aminolevulinic acid 1H, 1H-heptafluorobutyl ester hydrochloride

Verbindung 2:Connection 2:

  • m = 2, n = 4: 5-Aminolävulinsäure-1H,1H,2H,2H-nonafluorhexylester-hydrochloridm = 2, n = 4: 5-aminolevulinic acid-1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl ester hydrochloride

Verbindung 3:Connection 3:

  • m = 1, n = 6: 5-Aminolävulinsäure-1H,1H-tridecafluorheptylester-hydrochloridm = 1, n = 6: 5-aminolevulinic acid 1H, 1H-tridecafluoroheptyl ester hydrochloride
  • R2 = (CH2)m(CF2)nCHF2; m = 0–x, n = 0–yR 2 = (CH 2 ) m (CF 2 ) n CHF 2 ; m = 0-x, n = 0-y

Synthetisierte VerbindungSynthesized compound

Verbindung 4:Connection 4:

  • m = 1, n = 4 : 5-Aminolävulinsäure-1H,1H,5H-octafluorpentylester-hydrochlorid R2 = (CHF)mCnF2n+1; m = 0–x, n = 1–y R2 = (CHF)mCnHF2n; m = 0–x, n = 1–y R2 = (CH2)mCnHF2n; m = 0–x, n = 1–y R2 =(CFz)mCnHznFi m = 0–x, n = 1–ym = 1, n = 4: 5-aminolevulinic acid 1H, 1H, 5H-octafluoropentyl ester hydrochloride R 2 = (CHF) m C n F 2n + 1 ; m = 0-x, n = 1-y R 2 = (CHF) m C n HF 2n ; m = 0-x, n = 1-y R 2 = (CH 2 ) m C n HF 2n ; m = 0-x, n = 1-y R 2 = (CFz) mCnHznFi m = 0-x, n = 1-y

2. Synthese der Beispiele 1–42. Synthesis of the examples 1-4

Allgemeines:General:

BOC-5-Aminolävulinsäure wurde mit fluorierten Alkoholen, 1-Ethyl-3-[3-(dimethyl-amino)propyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC) und Dimethylaminopyridin (DMAP) in CH2Cl2 zu BOC-Beschützen ALA-Fluoralkylestern umgesetzt. Entfernung der BOC-Schutzgruppe mit HCl-gesättigter Essigesterlösung lieferte die 5-Aminolävulinsäurefluoralkylester-hydrochloride in guten Ausbeuten. Im Folgenden sind die Synthese von BOC-ALA sowie nach Verbindungen geordnet die Synthese der BOC-geschützten ALA-Ester und der ALA-Esterhydrochloride 1–4 beschrieben.BOC-5-aminolevulinic acid was reacted with fluorinated alcohols, 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and dimethylaminopyridine (DMAP) in CH 2 Cl 2 to BOC-protect ALA fluoroalkyl esters. Removal of the BOC protecting group with HCl-saturated ethyl acetate solution gave the 5-aminolevulinic acid fluoroalkyl ester hydrochloride in good yields. The synthesis of BOC-ALA and the synthesis of the BOC-protected ALA esters and the ALA ester hydrochlorides 1–4 are described below according to compounds.

BOC-5-AminolävulinsäureBOC-5-aminolevulinic acid

Zur Synthese von BOC-ALA wurde der pH-Wert einer Lösung von 0,42 mg (2,5 mmol) 5-Aminolävulinsäure in 5 ml H2O mit 0,1 N NaOH auf 8,5 eingestellt. Nach Zugabe von 1,16 g (5,3 mmol) Di-tert-butyldicarbonat in 5 ml 1,4-Dioxan wurde die Lösung 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige BOC-Anhydrid wurde durch zweifaches Ausschütteln mit 50 ml Diethylether entfernt. Nach Zugabe von 50 ml Essigsäureethylester wurde die wässrige Phase mit 1 N HCl angesäuert und die organische Phase abgetrennt. Nach zweimaligem Ausschütteln der wässrigen Phase mit je 25 ml Essigsäureethylester wurden die organischen Phasen vereint und das LM abgezogen. BOC-ALA wurde als farbloses Öl isoliert.
C10H17NO5 (231,3)
Ausbeute: 419 mg (1,8 mmol; 72,5%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 249,2, [M+NH4] (47, 28); 193,1, [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC),
2,72 (m, 4H, 2CH2), 4,08 (m, 2H, CH2), 5,25 (breites s, 1H, NH).To synthesize BOC-ALA, the pH of a solution of 0.42 mg (2.5 mmol) of 5-aminolevulinic acid in 5 ml of H 2 O was adjusted to 8.5 with 0.1 N NaOH. After adding 1.16 g (5.3 mmol) of di-tert-butyl dicarbonate in 5 ml of 1,4-dioxane, the solution was stirred at room temperature for 18 h. The excess BOC anhydride was removed by shaking twice with 50 ml of diethyl ether. After adding 50 ml of ethyl acetate, the aqueous phase was acidified with 1N HCl and the organic phase was separated off. After shaking the aqueous phase twice with 25 ml of ethyl acetate, the organic phases were combined and the LM was removed. BOC-ALA was isolated as a colorless oil.
C 10 H 17 NO 5 (231.3)
Yield: 419 mg (1.8 mmol; 72.5%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 249.2, [M + NH 4 ] (47, 28); 193.1, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC),
2.72 (m, 4H, 2CH 2 ), 4.08 (m, 2H, CH 2 ), 5.25 (broad s, 1H, NH).

Verbindung 1Connection 1

BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H-heptafluorbutylesterBOC-5-aminolevulinic acid-1H, 1H-heptafluorbutylester

Zu einer Lösung von 300 mg (1,3 mmol) N-BOC-5-Aminolävulinsäure, 120 mg (1,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 300 mg (1,5 mmol)1H,1H-Heptafluorbutanol in 15 mol trockenem CH2Cl2 wurden unter Eiskühlung 257,4 mg (1,6 mmol) EDC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 0°C und anschließend 2 h bei RT gerührt. Nach Abziehen des LM wurde der Rückstand in einer Mischung aus 100 ml Essigester und 20 ml H2O aufgenommen. Zum Entfernen des wasserlöslichen Kupplungsreagens wurde die organische Phase je zweimal mit 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 20 ml H2O extrahiert. Nach Trocknung über Na2SO4 und Abziehen des LM wurde das Produkt säulenchromatographisch (SiO2, MeOH/CH2Cl2:40/1) gereinigt und als farbloser Feststoff isoliert.
C14H18F7NO5 (413,3)
Ausbeute: 362 mg (0,88 mmol; 67,7%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 431,3, [M+NH4] (51,8); 375,2 [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, 24°C, TMS):
δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC), 2,70-2,80 (AA'BB'-System,
4H, 2CH2), 4,10 (m, 2H, CH2), 4,59 (t, 3J(H-F) = 13,5 Hz, 2H, CH2), 5,18 (breites s, 1H, NH).To a solution of 300 mg (1.3 mmol) of N-BOC-5-aminolevulinic acid, 120 mg (1.0 mmol) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 300 mg (1.5 mmol) of 1H, 1H-heptafluorobutanol in 15 mol of dry CH 2 Cl 2 257.4 mg (1.6 mmol) EDC were added with ice cooling. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 2 h and then at RT for 2 h. After the LM had been stripped off, the residue was taken up in a mixture of 100 ml of ethyl acetate and 20 ml of H 2 O. To remove the water-soluble coupling reagent, the organic phase was extracted twice with 30 ml of saturated NaHCO 3 solution and 20 ml of H 2 O. After drying over Na 2 SO 4 and stripping off the LM, the product was purified by column chromatography (SiO 2 , MeOH / CH 2 Cl 2 : 40/1) and isolated as a colorless solid.
C 14 H 18 F 7 NO 5 (413.3)
Yield: 362 mg (0.88 mmol; 67.7%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 431.3, [M + NH 4 ] (51.8); 375.2 [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS):
δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC), 2.70-2.80 (AA'BB 'system,
4H, 2CH 2 ), 4.10 (m, 2H, CH 2 ), 4.59 (t, 3 J (HF) = 13.5 Hz, 2H, CH 2 ), 5.18 (broad s, 1H, NH).

5-Aminolävulinsäure-1H,1H-heptafluorbutylesterhydrochlorid 15-aminolevulinic acid-1H, 1H-heptafluorbutylesterhydrochlorid 1

119,3 mg (0,25 mmol) BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H-heptafluorbutylester wurden unter Eiskühlung in 5 ml getrocknetem Essigsäureethylester gelöst und mit 5 ml HCl-gesättigtem Essigsäureethylester versetzt. Nach 30 min wurde das Eisbad entfernt und 5 h bei RT weitergerührt. Nach vollständiger Entschützung (DC-Kontrolle, Ninhydrinlösung) wurde die Lösung eingeengt, was zur Fällung des in Essigester schwerlöslichen Hydrochlorids führte. Der farblose Niederschlag wurde unter N2 abfiltriert.
C10H12ClF8NO3 (349, 6)
Ausbeute: 72 mg (0,21 mmol); 84%)
PI-DCIMS (NH3): m/z (%) = 314,2, [MH-HCl] (100).
1H-NMR (300 MHz, D2O, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 2,73/2, 85 (AA'BB'-System, 4H, 2CH2), 4,10 (s, 2H, CH2), 4,57-4,68 (m, 2H, CH2).119.3 mg (0.25 mmol) of BOC-5-aminolevulinic acid 1H, 1H-heptafluorobutyl ester were dissolved in 5 ml of dried ethyl acetate with ice-cooling and 5 ml of HCl-saturated ethyl acetate were added. After 30 min the ice bath was removed and stirring was continued at RT for 5 h. After complete deprotection (TLC control, ninhydrin solution), the solution was concentrated, which led to the precipitation of the hydrochloride, which was sparingly soluble in ethyl acetate. The colorless precipitate was filtered off under N 2 .
C 10 H 12 ClF 8 NO 3 (349, 6)
Yield: 72 mg (0.21 mmol); 84%)
PI-DCIMS (NH 3 ): m / z (%) = 314.2, [MH-HCl] (100).
1 H-NMR (300 MHz, D 2 O, 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 2.73 / 2.85 (AA'BB 'system, 4H, 2CH 2 ), 4.10 (s, 2H, CH 2 ), 4.57-4.68 (m, 2H, CH 2 ).

Verbindung 2Connection 2

BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H,2H,2H-nonafluorhexylesterBOC-5-aminolevulinic acid-1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorhexylester

Zu einer Lösung von 300 mg (1,3 mmol) BOC-5-Aminolävulinsäure, 120 mg (1,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 369,2 mg (1,5 mmol) 1H,1H,2H,2H-Nonafluorhexanol in 15 ml trockenem CH2Cl2 wurden unter Eiskühlung 257,4 mg (1,6 mmol) EDC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 0°C und anschließend 2 d bei RT gerührt. Nach Abziehen des LM wurde der Rückstand in einer Mischung aus 100 ml Essigester und 20 ml H2O aufgenommen. Zum Entfernen des wasserlöslichen Kupplungsreagens wurde die organische Phase je zweimal mit 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 20 ml H2O extrahiert. Nach Trocknung über Na2SO4 und Abziehen des LM wurde das Produkt säulenchromatographisch (SiO2, MeOH/CH2Cl2: 40/1) gereinigt und als farbloser Feststoff isoliert.
C16H20F9NO5 (477, 3)
Ausbeute: 352 mg (0,74 mmol; 56,7%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 495, 3, [M+NH4] (59,7); 439,3, [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC), 2,35-2,60 (tt, 3J(H-H) = 6,5 Hz, 3J H-F) = 18,3 Hz, 2H, CH2), 2,70-2,80 (AA'BB'-System, 4H, 2CH2), 4,10 (m, 2H, CH2), 4,38 (t, 3J (H-H) = 6,5 Hz, 2H, CH2), 5,17 (breits s, 1H, NH).To a solution of 300 mg (1.3 mmol) BOC-5-aminolevulinic acid, 120 mg (1.0 mmol) 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 369.2 mg (1.5 mmol) 1H, 1H, 2H, 2H -Nonafluorohexanol in 15 ml dry CH 2 Cl 2 257.4 mg (1.6 mmol) EDC were added with ice cooling. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 2 h and then at RT for 2 d. After the LM had been stripped off, the residue was taken up in a mixture of 100 ml of ethyl acetate and 20 ml of H 2 O. To remove the water-soluble coupling reagent, the organic phase was extracted twice with 30 ml of saturated NaHCO 3 solution and 20 ml of H 2 O. After drying over Na 2 SO 4 and stripping off the LM, the product was purified by column chromatography (SiO 2 , MeOH / CH 2 Cl 2 : 40/1) and isolated as a colorless solid.
C 16 H 20 F 9 NO 5 (477, 3)
Yield: 352 mg (0.74 mmol; 56.7%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 495.3, [M + NH 4 ] (59.7); 439.3, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC), 2.35-2.60 (tt, 3 J (HH) = 6.5 Hz, 3 J HF) = 18.3 Hz, 2H, CH 2 ), 2.70-2.80 (AA'BB 'system, 4H, 2CH 2 ), 4.10 (m, 2H, CH 2 ), 4.38 (t, 3 J (HH) = 6, 5 Hz, 2H, CH 2 ), 5.17 (broad s, 1H, NH).

ALA-1H,1H,2H,2H-nonafluorhexylester-hydrochlorid 2 119,3 mg (0,25 mmol) BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H, 2H,2H-nonafluorhexylester wurden unter Eiskühlung in 5 ml getrocknetem Essigsäureethylester gelöst und mit 5 ml HCl-gesättigtem Essigsäureethylester versetzt. Nach 30 min wurde das Eisbad entfernt und 5 h bei RT weitergerührt. Nach vollständiger Entschützung (DC-Kontrolle, Ninhydrinlösung) wurde die Lösung eingeengt, was zur Fällung des in Essigester schwerlöslichen Hydrochlorids führte. Der Niederschlag wurde unter N2 abfiltriert und nach Umkristallisation (Essigester/PE) wurde der farblose Feststoff im ÖV getrocknet.
C11H13ClF9NO3 (413,7)
Ausbeute: 84 mg (0,2 mmol; 81,2%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 378,3, [MH-HCl] (100).
1H-NMR (250 MHz, D2O, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 2,40-2,57(tt, 3J(H-H) = 6,1 Hz, 3J(H-F) = 19,4 Hz, 2H, CH2), 2,62/2,79 (AA'BB'-System, 4H, 2CH2), 4,00 (s, 2H, CH2), 4,34 (t, 3J (H-H) = 6.1 Hz, 2H, CH2).ALA-1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl ester hydrochloride 2 119.3 mg (0.25 mmol) BOC-5-aminolevulinic acid 1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl ester were dissolved in 5 ml of dried ethyl acetate and cooled with 5 ml of HCl-saturated ethyl acetate were added. After 30 min the ice bath was removed and stirring was continued at RT for 5 h. After complete deprotection (TLC control, ninhydrin solution), the solution was concentrated, which led to the precipitation of the hydrochloride, which was sparingly soluble in ethyl acetate. The precipitate was filtered off under N 2 and after recrystallization (ethyl acetate / PE) the colorless solid was dried in a public transport.
C 11 H 13 ClF 9 NO 3 (413.7)
Yield: 84 mg (0.2 mmol; 81.2%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 378.3, [MH-HCl] (100).
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 2.40-2.57 (tt, 3 J (HH) = 6.1 Hz, 3 J (HF) = 19.4 Hz, 2H, CH 2 ), 2.62 / 2.79 (AA'BB 'system, 4H, 2CH 2 ), 4.00 (s, 2H, CH 2 ), 4.34 (t, 3 J (HH) = 6.1 Hz, 2H, CH 2 ).

Verbindung 3Connection 3

BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H-tridecafluorheptylester Zu einer Lösung von 300 mg (1,3 mmol) N-BOC-Aminolävulinsäure, 120 mg (1,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 525 mg (1,5 mmol) 1H,1H-Tridecafluorheptanol in 15 ml trockenem CH2Cl2 wurden unter Eiskühlung 257,4 mg (1,6 mmol) EDC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 0°C und anschließend 2 d bei RT gerührt. Nach Abziehen des LM wurde der Rückstand in einer Mischung aus 100 ml Essigester und 20 ml H2O aufgenommen. Zum Entfernen des wasserlöslichen Kupplungsreagens wurde die organische Phase je zweimal mit 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 20 ml H2O extrahiert. Nach Trocknung über Na2SO4 und Abziehen des LM wurde das Produkt säulenchromatographisch (SiO2, MeOH/CH2Cl2: 40/1) gereinigt und als farbloser Feststoff isoliert.
C17H18F13NO5 (563,3)
Ausbeute: 406 mg (0,72 mmol; 55%)
PI-DCIMS (NH3): m/z (%) = 581,4, [M+NH4] (42,9); 525,3, [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS) δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC), 2,77 (m, 4H, 2CH2), 4,06 (m, 2H, CH2), 4,58 (t, 3J (H-F) = 13,7 Hz, 2H, CH2), 5,17 (breites s, 1H, NH).BOC-5-aminolevulinic acid 1H, 1H-tridecafluorheptyl ester To a solution of 300 mg (1.3 mmol) of N-BOC-aminolevulinic acid, 120 mg (1.0 mmol) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 525 mg (1.5 mmol) of 1H, 1H-tridecafluoroheptanol in 15 ml of dry CH 2 Cl 2 , 257.4 mg (1.6 mmol) of EDC were added with ice cooling. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 2 h and then at RT for 2 d. After the LM had been stripped off, the residue was taken up in a mixture of 100 ml of ethyl acetate and 20 ml of H 2 O. To remove the water-soluble coupling reagent, the organic phase was extracted twice with 30 ml of saturated NaHCO 3 solution and 20 ml of H 2 O. After drying over Na 2 SO 4 and stripping off the LM, the product was purified by column chromatography (SiO 2 , MeOH / CH 2 Cl 2 : 40/1) and isolated as a colorless solid.
C 17 H 18 F 13 NO 5 (563.3)
Yield: 406 mg (0.72 mmol; 55%)
PI-DCIMS (NH 3 ): m / z (%) = 581.4, [M + NH 4 ] (42.9); 525.3, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS) δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC), 2.77 (m, 4H, 2CH 2 ), 4.06 (m , 2H, CH 2 ), 4.58 (t, 3 J (HF) = 13.7 Hz, 2H, CH 2 ), 5.17 (broad s, 1H, NH).

5-Aminolävulinsäure-1H,1H-tridecafluorheptylesterhydrochlorid 35-aminolevulinic acid-1H, 1H-tridecafluorheptylesterhydrochlorid 3

119,3 mg (0,25 mmol)BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H-nonafluorhexylester wurden unter Eiskühlung in 5 ml getrocknetem Essigsäureethylester gelöst und mit 5 ml HCl-gesättigtem Essigsäureethylester versetzt. Nach 30 min wurde das Eisbad entfernt und 5 h bei RT weitergerührt. Nach vollständiger Entschützung (DC-Kontrolle, Ninhydrinlösung) wurde die Lösung eingeengt, was zur Fällung des in Essigester schwerlöslichen Hydrochlorids führte. Der Niederschlag wurde unter N2 abfiltriert. Nach Umkristallisation (Essigester/PE) wurde der farblose Feststoff im ÖV getrocknet.
C12H11ClF19NO3 (499,3)
Ausbeute: 99 mg (0,20 mmol; 80%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 464, 2, [MH+-HCl] (100).
1H-NMR (250 MHz, D2O, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 2,71/2, 84 (AA'BB'-System, 4H, 2CH2), 4,00 (s, 2H, CH2), 4,76 (m, 2H, CH2).119.3 mg (0.25 mmol) of BOC-5-aminolevulinic acid 1H, 1H-nonafluorohexyl ester were dissolved in 5 ml of dried ethyl acetate while cooling with ice, and 5 ml of HCl-saturated ethyl acetate were added. After 30 min the ice bath was removed and stirring was continued at RT for 5 h. After complete deprotection (TLC control, ninhydrin solution), the solution was concentrated, which led to the precipitation of the hydrochloride, which was sparingly soluble in ethyl acetate. The precipitate was filtered off under N 2 . After recrystallization (ethyl acetate / PE) the colorless solid was dried in a public transport.
C 12 H 11 ClF 19 NO 3 (499.3)
Yield: 99 mg (0.20 mmol; 80%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 464, 2, [MH + -HCl] (100).
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 2.71 / 2.84 (AA'BB 'system, 4H, 2CH 2 ), 4.00 (s, 2H, CH 2 ), 4.76 (m, 2H, CH 2 ).

Verbindung 4Connection 4

BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H,5H-octafluorpentylesterBOC-5-aminolevulinic acid-1H, 1H, 5H-octafluorpentylester

Zu einer Lösung von 300 mg (1,3 mmol) N-BOC-5-Aminolävulinsäure, 120 mg (1,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 348,1 mg (1,5 mmol) 1H,1H,5H-Octafluorpentanol in 15 ml trockenem CH2Cl2 wurden unter Eiskühlung 257,4 mg (1,6 mmol) EDC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 0°C und anschließend 2 d bei RT gerührt. Nach Abziehen des LM wurde der Rückstand in einer Mischung aus 100 ml Essigester und 20 ml H2O aufgenommen. Zum Entfernen des wasserlöslichen Kupplungsreagens wurde die organische Phase je zweimal mit 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 20 ml H2O extrahiert. Nach Trocknung über Na2SO4 und Abziehen des LM wurde das Produkt säulenchromatographisch (SiO2, MeOH/CH2Cl2: 40/1) gereinigt und als farbloser Feststoff isoliert.
C15H19F8NO5 (445,3)
Ausbeute: 346 mg (0,78 mmol; 59,8%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 463,3, [M+NH4] (48,8); 407,3, [M+NH4-C4H8] (100)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC), 2,77 (4H, 2CH2), 4,10 (m, 2H, CH2), 4,57-4,68 (t, 3J (H-F) = 13, 7 Hz, 2H, CH2), 5,16 (breites s, 1H, NH), 5.76-6,30 (tt, 2J (H-F) = 51,9 Hz, 3J (H-F) = 5,4 Hz, 1H, CH).To a solution of 300 mg (1.3 mmol) of N-BOC-5-aminolevulinic acid, 120 mg (1.0 mmol) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 348.1 mg (1.5 mmol) of 1H, 1H, 5H -Octafluoropentanol in 15 ml dry CH 2 Cl 2 257.4 mg (1.6 mmol) EDC were added with ice cooling. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 2 h and then at RT for 2 d. After the LM had been stripped off, the residue was taken up in a mixture of 100 ml of ethyl acetate and 20 ml of H 2 O. To remove the water-soluble coupling reagent, the organic phase was extracted twice with 30 ml of saturated NaHCO 3 solution and 20 ml of H 2 O. After drying over Na 2 SO 4 and stripping off the LM, the product was purified by column chromatography (SiO 2 , MeOH / CH 2 Cl 2 : 40/1) and isolated as a colorless solid.
C 15 H 19 F 8 NO 5 (445.3)
Yield: 346 mg (0.78 mmol; 59.8%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 463.3, [M + NH 4 ] (48.8); 407.3, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100)
1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC), 2.77 (4H, 2CH 2 ), 4.10 (m, 2H, CH 2 ), 4.57-4.68 (t, 3 J) (HF) = 13.7 Hz, 2H, CH 2 ), 5.16 (broad s, 1H, NH), 5.76-6.30 (tt, 2 J (HF) = 51.9 Hz, 3 J (HF ) = 5.4 Hz, 1H, CH).

5-Aminolävulinsäure-1H,1H,5H-octafluorpentylesterhydrochlorid 45-aminolevulinic acid-1H, 1H, 5H-octafluorpentylesterhydrochlorid 4

111,3 mg (0.25 mmol) BOC-5-Aminolävulinsäure-1H,1H,5H-octafluorpentylester wurden unter Eiskühlung in 5 ml getrocknetem Essigsäureethylester gelöst und mit 5 ml HCl-gesättigtem Essigsäureethylester versetzt. Nach 30 min wurde das Eisbad entfernt und 4 h bei RT weitergerührt, wobei eine Trübung der Lösung auftrat. Der farblose Niederschlag wurde unter N2 abfiltriert und nach Umkristallisation (Essigester/PE) im ÖV ge trocknet.
C10H12ClF8NO3 (381,7)
Ausbeute: 72 mg (0,19 mmol, 75,5%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 346,3, [MH-HCI] (100).
1H-NMR (250 MHz, D2O, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 2,85/2,90 (AA'BB'-System, 4H, 2CH2), 4,10 (s, 2H, CH2), 4,57-4,68 (t, 3J (H-F) = 13,7 Hz, 2H, CH2), 6,13-6,67 (tt, 2J (H-F) = 51,1 Hz, 3J (H-F) = 5,5 Hz, 1H, CH).111.3 mg (0.25 mmol) of BOC-5-aminolevulinic acid 1H, 1H, 5H-octafluorpentylester were dissolved in 5 ml of dried ethyl acetate with ice cooling and 5 ml of HCl-saturated ethyl acetate were added. After 30 min the ice bath was removed and stirring was continued for 4 h at RT, the solution becoming cloudy. The colorless precipitate was filtered off under N 2 and, after recrystallization (ethyl acetate / PE), dried in a public transport.
C 10 H 12 ClF 8 NO 3 (381.7)
Yield: 72 mg (0.19 mmol, 75.5%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 346.3, [MH-HCl] (100).
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 2.85 / 2.90 (AA'BB 'system, 4H, 2CH 2 ), 4.10 (s, 2H, CH 2 ), 4.57-4.68 (t, 3 J (HF) = 13.7 Hz, 2H, CH 2 ), 6.13-6.67 (tt, 2 J (HF) = 51.1 Hz, 3 J (HF) = 5.5 Hz, 1H, CH ).

Die Synthese und die Strukturen der Verbindungen 1 bis 4 sind in 1 wiedergegeben.The synthesis and structures of compounds 1 to 4 are shown in 1 played.

3. Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen3. Results of in vitro studies

Als Vergleichssubstanz für die in vitro-Testungen der neuen Verbindungen diente ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl), das bei PDD und PDT der Harnblase und des Gastronintestinaltrakts Stand der Technik ist.As a reference substance for the in ALA hexyl ester hydrochloride was used for vitro testing of the new compounds (Hexyl), which is used in PDD and PDT of the bladder and gastrointestinal tract State of the art is.

3.1 Verwendete Zelllinien3.1 Cell lines used

  • Kolonmodell: Adenokarzinom-Zelllinie HT29 (Krebszellen) und Kolonfibroblasten-Zelllinie CCD18 (Vertreter des gesunden Darmbindegewebes)Colon model: HT29 adenocarcinoma cell line (cancer cells) and colon fibroblast cell line CCD18 (representative of healthy intestinal connective tissue)
  • Urothelmodell: Urothelkarzinom-Zelllinie J82 (Krebszellen) und Urothel-Zelllinie UROTSA (Vertreter des gesunden Harnblasengewebes)Urothelial model: Urothelial carcinoma cell line J82 (cancer cells) and Urothel cell line UROTSA (representative of healthy bladder tissue)

3.2 PP2X-Akkumulation3.2 PP2X accumulation

  • →Inkubation (3 h, 0,12 mmol/l) von HT29 und J82 mit ALA-Ester-hydrochloriden 1–4 und ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl)→ incubation (3 h, 0.12 mmol / l) of HT29 and J82 with ALA ester hydrochlorides 1–4 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Deutliche Steigerung der PPIX-Akkumulation durch die neuen fluorierten ALA-Esterhydrochloride 2, 3 und 4 im Vergleich zu ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl) in J82 und HT29 (2).→ Significant increase in PPIX accumulation with the new fluorinated ALA ester hydrochlorides 2, 3 and 4 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in J82 and HT29 ( 2 ).

3.3 PPIX-Akkumulationsverhältnis3.3 PPIX accumulation ratio

  • →Inkubation (3 h, 0,12 mmol/l) von HT29 und CCD18 sowie J82 und UROTSA mit ALA-Ester-hydrochlorid 2 und ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl)→ incubation (3 h, 0.12 mmol / l) of HT29 and CCD18 as well as J82 and UROTSA with ALA ester hydrochloride 2 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Berechnung der Akkumulationsverhältnisse HT29/CCD18 und J82/UROTSA→ calculation the accumulation ratios HT29 / CCD18 and J82 / UROTSA
  • →Deutliche Steigerung des Akkumulationsverhältnisses durch ALA-Nonafluorhexylesterhydrochlorid 2 im Vergleich zu ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl) in HT29/CCD18 sowie in J82/UROTSA (3).→ Significant increase in the accumulation ratio due to ALA nonafluorohexyl ester hydrochloride 2 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in HT29 / CCD18 and in J82 / UROTSA ( 3 ).

3.4 PPIX-Bildungskinetik3.4 PPIX educational kinetics

  • →Inkubation (5 min, 30 min, 180 min; 0,12 mmol/l; Gesamtmetabolisierung 3 h) von HT29 und J82 mit ALA-Ester-hydrochloriden 2, 4 und ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl)→ incubation (5 min, 30 min, 180 min; 0.12 mmol / l; total metabolism 3 h) of HT29 and J82 with ALA ester hydrochlorides 2, 4 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Darstellung der PPIX-Kinetiken als Michaelis-Menten-Kurven (4, 5) und als Balkendiagramme (6, 7)→ Representation of the PPIX kinetics as Michaelis-Menten curves ( 4 . 5 ) and as bar graphs ( 6 . 7 )
  • →Deutliche Steigerung der PPIX-Akkumulation nach Kurzzeitinkubation mit ALA-Nonafluorhexylesterhydrochlorid 2 im Vergleich zu ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl) in HT29 sowie in J82.→ Significant Increase in PPIX accumulation after short-term incubation with ALA nonafluorohexyl ester hydrochloride 2 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in HT29 as well in J82.

3.5 Phototoxizität3.5 Phototoxicity

  • →Inkubation (0,12 mmol/l; 3 h) von HT29 und CCD18 mit ALA-Ester-hydrochlorid 2 und ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl); Bestrahlung der Zellen mit unterschiedlichen Energiedosen (λ = 590–700 nm, 0–30 J/cm2, 40 mal/cm2); Klonogenitätstests, Bestimmung der Zellvitalität in Abhängigkeit der applizierten Strahlungsdosis; Ermittlung des LD50-Verhältnisses in HT29/CCD18→ Incubation (0.12 mmol / l; 3 h) of HT29 and CCD18 with ALA ester hydrochloride 2 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl); Irradiation of the cells with different energy doses (λ = 590-700 nm, 0-30 J / cm 2 , 40 times / cm 2 ); Clonogenicity tests, determination of cell vitality depending on the applied radiation dose; Determination of the LD 50 ratio in HT29 / CCD18
  • →Deutliche Verringerung des LD50-Verhältnisses in HT29/CCD18 durch 5-Aminolävulinsäure-1H,1H,2H,2H-nonafluorhexylester-hydrochlorid 2 im Vergleich zu ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl) (8)→ Significant reduction in the LD 50 ratio in HT29 / CCD18 by 5-aminolevulinic acid 1H, 1H, 2H, 2H-nonafluorohexyl ester hydrochloride 2 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) ( 8th )

B) Beispiele für 5-Aminolävulinsäurederivate der allgemeinen Formel (I) mit dem Rest R1 = -SR3 B) Examples of 5-aminolevulinic acid derivatives of the general formula (I) with the radical R 1 = -SR 3

1) Allgemeine Summenformel1) General empirical formula

  • H2NCH2CO(CH2)2COSR1 H 2 NCH 2 CO (CH 2 ) 2 COSR 1

Verbindung 1: 5-AminolävulinsäurethiohexylesterhydrochloridCompound 1: 5-aminolevulinic acid thiohexyl ester hydrochloride

  • H2NCH2CO(CH2)2COS(CH2)5CH3xHClH 2 NCH 2 CO (CH 2 ) 2 COS (CH 2 ) 5 CH 3 xHCl

2. Synthese2. Synthesis

Allgemeines:General:

BOC-5-Aminolävulinsäure wurde mit Hexanthiol, 1-Ethyl-3[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimid-hydrochlorid (EDC) und Dimethylaminopyridin (DMAP) in CH2Cl2 zu BOC-5-Aminolävulinsäurethiohexylester umgesetzt. Entfernung der BOC-Schutzgruppen mit HCl-gesättigter Essigesterlösung lieferte 5-Aminolävulinsäurethiohexylesterhydrochlorid in guter Ausbeute. Im Folgenden sind die Synthese von BOC-ALA und die Synthese des BOC-geschützten ALA-Esters sowie des ALA-Thiohexylesterhydrochlorids beschrieben.BOC-5-aminolevulinic acid was reacted with hexanethiol, 1-ethyl-3 [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and dimethylaminopyridine (DMAP) in CH 2 Cl 2 to give BOC-5-aminolevulinic acid thiohexyl ester. Removal of the BOC protecting groups with HCl-saturated ethyl acetate solution gave 5-aminolevulinic acid rethiohexyl ester hydrochloride in good yield. The synthesis of BOC-ALA and the synthesis of the BOC-protected ALA ester and of the ALA thiohexyl ester hydrochloride are described below.

BOC-5-AminolävulinsäureBOC-5-aminolevulinic acid

Zur Synthese von BOC-ALA wurde der pH-Wert einer Lö sung von 420 mg 5-Aminolävulinsäure (2,5 mmol) in 5 ml H2O mit 0,1 N NaOH auf 8,5 eingestellt. Nach Zugabe von 1,16 g Di-tert-butyldicarbonat (5,3 mmol) in 5 ml 1,4-Dioxan wurde die Lösung 18 h bei RT gerührt. Das überschüssige BOC-Anhydrid wurde durch zweifaches Ausschütteln mit 50 ml Diethylether entfernt. Nach Zugabe von 50 ml Essigsäureethylester wurde die wässrige Phase mit 1 N HCl angesäuert und die organische Phase abgetrennt. Nach zweimaligem Ausschütteln der wässrigen Phase mit je 25 ml Essigsäureethylester wurden die organischen Phasen vereint und das LM abgezogen. BOC-ALA wurde als farbloses Öl isoliert.
C10H17NO5 (231,3)
Ausbeute: 419 mg (1,8 mmol; 72,5%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 249,2, [M+NH4] (47, 28); 193,1, [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC), 2,72 (m, 4H, 2CH2), 4,08 (m, 2H, CH2), 5,25 (breites s, 1H, NH).To synthesize BOC-ALA, the pH of a solution of 420 mg of 5-aminolevulinic acid (2.5 mmol) in 5 ml of H 2 O was adjusted to 8.5 with 0.1 N NaOH. After adding 1.16 g of di-tert-butyl dicarbonate (5.3 mmol) in 5 ml of 1,4-dioxane, the solution was stirred at RT for 18 h. The excess BOC anhydride was removed by shaking twice with 50 ml of diethyl ether. After adding 50 ml of ethyl acetate, the aqueous phase was acidified with 1N HCl and the organic phase was separated off. After shaking the aqueous phase twice with 25 ml of ethyl acetate, the organic phases were combined and the LM was removed. BOC-ALA was isolated as a colorless oil.
C 10 H 17 NO 5 (231.3)
Yield: 419 mg (1.8 mmol; 72.5%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 249.2, [M + NH 4 ] (47, 28); 193.1, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC), 2.72 (m, 4H, 2CH 2 ), 4.08 (m, 2H, CH 2 ), 5.25 (broad s, 1H, NH ).

BOC-5-AminolävulinsäurethiohexylesterBOC-5-Aminolävulinsäurethiohexylester

Zu einer Lösung von 300 mg (1,3 mmol) N-BOC-5-Aminolävulinsäure, 120 mg (1,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 177 mg Hexanthiol (1,5 mmol) in 15 ml trockenem CH2Cl2 wurden unter Eiskühlung 257,4 mg (1,6 mmol) EDC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde erst 2 h bei 0°C und anschließend 2 h bei RT gerührt. Nach Abziehen des LM wurde der Rückstand in einer Mischung aus 100 ml Essigester und 20 ml H2O aufgenommen. Zum Entfernen des wasserlöslichen Kupplungsreagens wurde die organische Phase je zweimal mit 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 20 ml H2O extrahiert. Nach Trocknung der organischen Phase über Na2SO4 und Abziehen des LM wurde das Produkt säulenchroma tographisch (SiO2, MeOH/CH2Cl2: 40/1) gereinigt und BOC-5-Aminolävulinsäurethiohexylester als gelbliches Öl isoliert.
C16H29NO4S (331,5)
Ausbeute: 302 mg (0,91 mmol; 69,7%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 349,2, [M+NH4] (16,5); 293,2, [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS):
δ[ppm] = 0, 88 (t, 3J (H-H) = 6,8 Hz, 3H, CH3), 1,20-1,40 (m, 6H, 3CH2), 1,45 (s, 9H, BOC), 1,57 (m, 2H, CH2), 2,70-3,0 (m, 6H, 3CH2), 4,06 (m, 2H, CH2), 5,18 (breites s, 1H, NH).To a solution of 300 mg (1.3 mmol) of N-BOC-5-aminolevulinic acid, 120 mg (1.0 mmol) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 177 mg of hexanethiol (1.5 mmol) in 15 ml of dry CH 2 Cl 2 , 257.4 mg (1.6 mmol) EDC were added with ice cooling. The reaction mixture was first stirred at 0 ° C. for 2 h and then at RT for 2 h. After the LM had been stripped off, the residue was taken up in a mixture of 100 ml of ethyl acetate and 20 ml of H 2 O. To remove the water-soluble coupling reagent, the organic phase was extracted twice with 30 ml of saturated NaHCO 3 solution and 20 ml of H 2 O. After drying the organic phase over Na 2 SO 4 and removing the LM, the product was purified by column chromatography (SiO 2 , MeOH / CH 2 Cl 2 : 40/1) and BOC-5-aminolevulinic acid thiohexyl ester was isolated as a yellowish oil.
C 16 H 29 NO 4 S (331.5)
Yield: 302 mg (0.91 mmol; 69.7%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 349.2, [M + NH 4 ] (16.5); 293.2, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS):
δ [ppm] = 0.88 (t, 3 J (HH) = 6.8 Hz, 3H, CH 3 ), 1.20-1.40 (m, 6H, 3CH 2 ), 1.45 (s, 9H, BOC), 1.57 (m, 2H, CH 2 ), 2.70-3.0 (m, 6H, 3CH 2 ), 4.06 (m, 2H, CH 2 ), 5.18 (broad s, 1H, NH).

5-Aminolävulinsäurethiohexylester-hydrochlorid 15-Aminolävulinsäurethiohexylester hydrochloride 1

82,9 mg (0,25 mmol) BOC-5-Aminolävulinsäurethiohexylester wurden unter Eiskühlung in 5 ml getrocknetem Essigsäureethylester gelöst und mit 5 ml HCl-gesättigtem Essigsäureethylester versetzt. Nach 30 min wurde das Eisbad entfernt und 5 h bei RT weitergerührt. Nach vollständiger Entschützung (DC-Kontrolle, Ninhydrinlösung) wurde die Lösung eingeengt, was zur Fällung des in Essigester schwerlöslichen Hydrochlorids führte. Der farblose hygroskopische Feststoff wurde im ÖV getrocknet.
C11H22ClNO2S (267,8)
Ausbeute: 58 mg (0,21 mmol, 86,6%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 232,2, [MH-HCl] (100).
1H-NMR (250 MHz, D2O, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 0,88 (t, 3J (H-H) = 6,8 Hz, 3H, CH3), 1,20-1,40 (m, 6H, 3CH2), 1,55 (m, 2H, CH2), 2,79-3,14 (m, 6H, 3CH2), 4,27 (s, 2H, CH2), 8,17 (breites s, 3H, NH3).82.9 mg (0.25 mmol) of BOC-5-aminolevulinic acid thiohexyl ester were dissolved in 5 ml of dried ethyl acetate while cooling with ice, and 5 ml of HCl-saturated ethyl acetate were added. After 30 min the ice bath was removed and stirring was continued at RT for 5 h. After complete deprotection (TLC control, ninhydrin solution), the solution was concentrated, which led to the precipitation of the hydrochloride, which was sparingly soluble in ethyl acetate. The colorless hygroscopic solid was dried in public transport.
C 11 H 22 ClNO 2 S (267.8)
Yield: 58 mg (0.21 mmol, 86.6%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 232.2, [MH-HCl] (100).
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 0.88 (t, 3 J (HH) = 6.8 Hz, 3H, CH 3 ), 1.20-1.40 (m, 6H, 3CH 2 ), 1.55 (m, 2H, CH 2 ), 2.79-3.14 (m, 6H, 3CH 2 ), 4.27 (s, 2H, CH 2 ), 8.17 (broad s, 3H, NH 3 ).

Der Syntheseweg und die Struktur der synthetisierten Verbindung ist in 9 wiedergegeben.The synthetic route and the structure of the synthesized compound is in 9 played.

3. Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen3. Results of in vitro studies

Als Vergleichssubstanz für die in vitro-Testungen der neuen Verbindung diente ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl), das bei PDD und PDT der Harnblase und des Gastronintestinaltrakts Stand der Technik ist.As a reference substance for the in Vitro testing of the new compound served ALA hexyl ester hydrochloride (Hexyl), which is used in PDD and PDT of the bladder and gastrointestinal tract State of the art is.

3.1 Verwendete Zelllinien3.1 Cell lines used

  • Kolonmodell: Adenokarzinom-Zelllinie HT29 (Krebszellen) und Kolonfibroblasten-Zelllinie CCD18 (Vertreter des gesunden Darmbindegewebes)Colon model: HT29 adenocarcinoma cell line (cancer cells) and colon fibroblast cell line CCD18 (representative of healthy intestinal connective tissue)
  • Urothelmodell: Urothelkarzinom-Zelllinie J82 (Krebszellen) und Urothel-Zelllinie UROTSA (Vertreter des gesunden Harnblasengewebes)Urothelial model: Urothelial carcinoma cell line J82 (cancer cells) and Urothel cell line UROTSA (representative of healthy bladder tissue)

3.2 PPIX-Akkumulation3.2 PPIX accumulation

  • →Inkubation (3 h, 0,12 mmol/l) von HT29 und J82 mit ALA-Thiohexylester-hydrochlorid 1 und ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl)→ incubation (3 h, 0.12 mmol / l) of HT29 and J82 with ALA thiohexyl ester hydrochloride 1 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Deutliche Steigerung der PPIX-Akkumulation durch das neue ALA-Thiohexylesterhydrochlorid 1 im Vergleich zu ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl) in J82 und HT29 (10).→ Significant increase in PPIX accumulation through the new ALA thiohexyl ester hydrochloride 1 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in J82 and HT29 ( 10 ).

3.3 PPIX-Akkumulationsverhältnis3.3 PPIX accumulation ratio

  • →Inkubation (3 h, 0,12 mmol/l) von HT29 und CCD18 sowie J82 und UROTSA mit ALA-Thiohexylesterhydrochlorid 1 und ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl)→ incubation (3 h, 0.12 mmol / l) of HT29 and CCD18 as well as J82 and UROTSA with ALA thiohexyl ester hydrochloride 1 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Berechnung der Akkumulationsverhältnisse HT29/CCD18 und J82/UROTSA→ calculation the accumulation ratios HT29 / CCD18 and J82 / UROTSA
  • →Deutliche Steigerung des Akkumulationsverhältnisses durch ALA-Thiohexylesterhydrochlorid 1 im Vergleich zu ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl) in HT29/CCI18 sowie in J82/UROTSA (10).→ Significant increase in the accumulation ratio due to ALA thiohexyl ester hydrochloride 1 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in HT29 / CCI18 and in J82 / UROTSA ( 10 ).

3.4 Phototoxizität3.4 Phototoxicity

  • →Inkubation (0,12 mmol/l; 3 h) von HT29 und CCD18 sowie J82 und UROTSA mit ALA-Thiohexylesterhydrochlorid 1 und ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl); Bestrahlung der Zellen mit unterschiedlichen Energiedosen (λ = 590–700 nm, 0–30 J/cm2, 40 mW/cm2); Klonogenitätstests, Bestimmung der Zellvitalität in Abhängigkeit der applizierten Strahlungsdosis; Ermittlung des LD50-Verhältnisses in HT29/CCD18 und J82/UROTSA.→ Incubation (0.12 mmol / l; 3 h) of HT29 and CCD18 as well as J82 and UROTSA with ALA thiohexyl ester hydrochloride 1 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl); Irradiation of the cells with different energy doses (λ = 590-700 nm, 0-30 J / cm 2 , 40 mW / cm 2 ); Clonogenicity tests, determination of cell vitality depending on the applied radiation dose; Determination of the LD 50 ratio in HT29 / CCD18 and J82 / UROTSA.
  • →Deutliche Verringerung des LD50-Verhältnisses in HT29/CCD18 und J82/UROTSA durch ALA-Thiohexylesterhydrochlorid 1 im Vergleich zu ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl) (11).→ Significant reduction in the LD 50 ratio in HT29 / CCD18 and J82 / UROTSA by ALA-thiohexyl ester hydrochloride 1 compared to ALA-hexyl ester hydrochloride (hexyl) ( 11 ).

c) Beispiele für 5-Aminolävulinsäurederivate der allgemeinen Formel (I) mit dem Rest

Figure 00200001
c) Examples of 5-aminolevulinic acid derivatives of the general formula (I) with the rest
Figure 00200001

1. Allgemeine Summenformel1. General empirical formula

[H2NCH2CO(CH2)2COOCH2]mC6X6–m m = 2–6; X = H, F, Cl, Br, I, subst. Alkylreste, subst. Arylreste, NR2, OR, SR, OH, SH, COOH, COOR, COR; R = H, Alkylreste, subst. Alkylreste, Arylreste, subst. Arylreste, [H 2 NCH 2 CO (CH 2 ) 2 COOCH 2 ] m C 6 X 6-m m = 2-6; X = H, F, Cl, Br, I, subst. Alkyl residues, subst. Aryl residues, NR 2 , OR, SR, OH, SH, COOH, COOR, COR; R = H, alkyl radicals, subst. Alkyl residues, aryl residues, subst. aryl radicals,

Je nach Anzahl der über Benzylesterbindungen gebundenen ALA-Einheiten ergeben sich verschiedene Substitutionsmuster. In Klammern ist die mögliche Orientierung der Benzylgruppen am aromatischen Ring in Abhängigkeit von m angegeben.
Diester: m = 2; (1,2; 1,3; 1,4)
Triester: m = 3; (1,2,3; 1,2,4; 1,3,5)
Tetraester: m = 4; (1,2,3,4; 1,2,3,5; 1,2,4,5)
Pentaester: m = 5; (1,2,3,4,5)
Hexaester: m = 6; (1,2,3,4,5,6)Different substitution patterns result depending on the number of ALA units bound via benzyl ester bonds. The possible orientation of the benzyl groups on the aromatic ring as a function of m is given in brackets.
Diester: m = 2; (1.2, 1.3, 1.4)
Trieste: m = 3; (1,2,3; 1,2,4; 1,3,5)
Tetraester: m = 4; (1,2,3,4; 1,2,3,5; 1,2,4,5)
Pentaester: m = 5; (1,2,3,4,5)
Hexaester: m = 6; (1,2,3,4,5,6)

Synthetisierte VerbindungSynthesized compound

  • Verbindung 1: m = 2; X = H; [HClxH2NCH2CO(CH2)2COOCH2]2C6H4 Bis-5-aminolävulinsäure-l,4-dibenzyldiesterdihydrochloridCompound 1: m = 2; X = H; [HClxH 2 NCH 2 CO (CH 2 ) 2 COOCH 2 ] 2 C 6 H 4 bis-5-aminolevulinic acid-l, 4-dibenzyldiester dihydrochloride

2. Synthese2. Synthesis

Allgemeines:General:

BOC-5-Aminolävulinsäure wurde mit 1,4-Dibenzylalkohol, 1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC) und Dimethylaminopyridin (DMAP) in CH2Cl2 zu Di-BOC-bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiester umgesetzt. Entfernung der BOC-Schutzgruppen mit HCl-gesättigter Essigesterlösung lieferte Bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzylester-dihydrochlorid in guter Ausbeute. Im Folgenden sind die Synthese von BOC-ALA und die Synthese des BOC-geschützten ALA-Esters sowie des ALA-Diesterdihydrochlorids beschrieben.BOC-5-aminolevulinic acid was converted to di-BOC-bis-5- with 1,4-dibenzyl alcohol, 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and dimethylaminopyridine (DMAP) in CH 2 Cl 2 . aminolevulinic acid 1,4-dibenzyl diester implemented. Removal of the BOC protective groups with HCl-saturated ethyl acetate solution gave bis-5-aminolevulinic acid 1,4-dibenzyl ester dihydrochloride in good yield. The synthesis of BOC-ALA and the synthesis of the BOC-protected ALA ester and the ALA diester dihydrochloride are described below.

BOC-5-AminolävulinsäureBOC-5-aminolevulinic acid

Zur Synthese von BOC-ALA wurde der pH-Wert einer Lösung von 420 mg 5-Aminolävulinsäure (2,5 mmol) in 5 ml H2O mit 0,1 N NaOH auf 8,5 eingestellt. Nach Zugabe von 1,16 g Di-tert-butyldicarbonat (5,3 mmol) in 5 ml 1,4-Dioxan wurde die Lösung 18 h bei RT gerührt. Das überschüssige BOC-Anhydrid wurde durch zweifaches Ausschütteln mit 50 ml Diethylether entfernt. Nach Zugabe von 50 ml Essigsäureethylester wurde die wässrige Phase mit 1 N HCl angesäuert und die organische Phase abgetrennt. Nach zweimaligem Ausschütteln der wässrigen Phase mit je 25 ml Essigsäureethylester wurden die organischen Phasen vereint und das LM abgezogen. BOC-ALA wurde als farbloses Öl isoliert.
C10H17NO5 (231,3)
Ausbeute: 419 mg (1,8 mmol; 72,5%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 249,2, [M+NH4] (47,28); 193,1, [M+NH4-C4H8] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 1,45 (s, 9H, BOC), 2,72 (m, 4H, 2CH2), 4,08 (m, 2H, CH2), 5,25 (breites s, 1H, NH).To synthesize BOC-ALA, the pH of a solution of 420 mg of 5-aminolevulinic acid (2.5 mmol) in 5 ml of H 2 O was adjusted to 8.5 with 0.1 N NaOH. After adding 1.16 g of di-tert-butyl dicarbonate (5.3 mmol) in 5 ml of 1,4-dioxane, the solution was stirred at RT for 18 h. The excess BOC anhydride was removed by shaking twice with 50 ml of diethyl ether. After adding 50 ml of ethyl acetate, the aqueous phase was acidified with 1N HCl and the organic phase was separated off. After shaking the aqueous phase twice with 25 ml of ethyl acetate, the organic phases were combined and the LM was removed. BOC-ALA was isolated as a colorless oil.
C 10 H 17 NO 5 (231.3)
Yield: 419 mg (1.8 mmol; 72.5%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 249.2, [M + NH 4 ] (47.28); 193.1, [M + NH 4 -C 4 H 8 ] (100).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 1.45 (s, 9H, BOC), 2.72 (m, 4H, 2CH 2 ), 4.08 (m, 2H, CH 2 ), 5.25 (broad s, 1H, NH ).

Di-BOC-bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiester Zu einer Lösung von 600 mg (2,6 mmol) BOC-5-Aminolävulinsäure, 240 mg (2,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 180 mg (1,3 mmol) 1,4-Dibenzylalkohol in 30 ml trockenem CH2Cl2 wurden unter Eiskühlung 514,8 mg (3,2 mmol) EDC zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 0°C und anschließend 2 d lang bei RT gerührt. Nach Abziehen des LM wurde der Rückstand in einer Mischung aus 100 ml Essigester und 20 ml H2O aufgenommen. Zum Entfernen des wasserlöslichen Kupplungsreagens wurde die organische Phase je zweimal mit 30 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 20 ml H2O extrahiert. Nach Trocknung über Na2SO4 und Abziehen des LM wurde das Produkt säulenchromatographisch (SiO2, MeOH/CH2Cl2: 40/1) gereinigt und als farbloser Feststoff isoliert.
C28H40N2O10 (564,6)
Ausbeute: 376,3 mg (0,67 mmol; 51.3%)
PI-DCIMS (NH3):
m/z (%) = 582, 6, [M+NH4+] (100).
1H-NMR (250 MHz, CDCl3, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 1,45 (s, 18H, BOC), 2,64-2,79 (m, 8H, 4CH2), 4,07 (m, 4H, 2CH2), 5,11 (s, 4H, 2CH2), 5,19 (breites s, 2H, 2NH), 7,33 (s, 4H, 4CH, aromatisch).Di-BOC-bis-5-aminolevulinic acid 1,4-dibenzyl diester To a solution of 600 mg (2.6 mmol) BOC-5-aminolevulinic acid, 240 mg (2.0 mmol) 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 180 mg (1.3 mmol) 1,4-dibenzyl alcohol in 30 ml dry CH 2 Cl 2 , 514.8 mg (3.2 mmol) EDC were added with ice cooling. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 2 h and then at RT for 2 d. After the LM had been stripped off, the residue was taken up in a mixture of 100 ml of ethyl acetate and 20 ml of H 2 O. To remove the water-soluble coupling reagent, the organic phase was extracted twice with 30 ml of saturated NaHCO 3 solution and 20 ml of H 2 O. After drying over Na 2 SO 4 and stripping off the LM, the product was purified by column chromatography (SiO 2 , MeOH / CH 2 Cl 2 : 40/1) and isolated as a colorless solid.
C 28 H 40 N 2 O 10 (564.6)
Yield: 376.3 mg (0.67 mmol; 51.3%)
PI-DCIMS (NH 3 ):
m / z (%) = 582.6, [M + NH 4 +] (100).
1 H-NMR (250 MHz, CDCl 3 , 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 1.45 (s, 18H, BOC), 2.64-2.79 (m, 8H, 4CH 2 ), 4.07 (m, 4H, 2CH 2 ), 5.11 (s, 4H, 2CH 2 ), 5.19 (broad s, 2H, 2NH), 7.33 (s, 4H, 4CH, aromatic).

Bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiesterdihydrochlorid 1Bis-5-aminolevulinic acid-1,4-dibenzyldiesterdihydrochlorid 1

141,2 mg (0,25 mmol) Di-BOC-bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzylester wurden unter Eiskühlung in 5 ml getrocknetem Essigsäureethylester gelöst und mit 5 ml HCl-gesättigtem Essigsäureethylester versetzt. Nach 30 min wurde das Eisbad entfernt und 3 h bei RT weitergerührt. Das in Essigester schwerlösliche Dihydrochlorid fiel in Form eines farblosen hygroskopischen Pulvers aus, wurde unter N2 abfiltriert und im ÖV getrocknet.
C18H26Cl2N2O6 (437,1)
Ausbeute: 95 mg (0,22 mmol; 87,2%)
ESI (CH3OH, 1% HAC): m/z (%) = 365,0, [MH-2HCl] (100).
1H-NMR (250 MHz, D2O, 24°C, TMS)
δ[ppm] = 2,64/2,81 (AA'BB'-System, 8H, 4CH2), 3,98 (s, 4H, 2CH2), 5,05 (s, 4H, 2CH2), 7,32 (s, 4H, 4CH, aromatisch).141.2 mg (0.25 mmol) of 1,4-dibenzyl di-BOC-bis-5-aminolevulinate were dissolved in 5 ml of dried ethyl acetate while cooling with ice, and 5 ml of ethyl acetate saturated with HCl were added. After 30 min the ice bath was removed and stirring was continued for 3 h at RT. The dihydrochloride, which was sparingly soluble in ethyl acetate, precipitated out in the form of a colorless hygroscopic powder, was filtered off under N 2 and dried in a public transport.
C 18 H 26 Cl 2 N 2 O 6 (437.1)
Yield: 95 mg (0.22 mmol; 87.2%)
ESI (CH 3 OH, 1% HAC): m / z (%) = 365.0, [MH-2HCl] (100).
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 24 ° C, TMS)
δ [ppm] = 2.64 / 2.81 (AA'BB 'system, 8H, 4CH 2 ), 3.98 (s, 4H, 2CH 2 ), 5.05 (s, 4H, 2CH 2 ), 7.32 (s, 4H, 4CH, aromatic).

Die Synthese und Struktur der Verbindungen ist in der 12 dargestellt.The synthesis and structure of the compounds is in the 12 shown.

3. Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen3. Results of in vitro studies

Als Vergleichssubstanz für die in vitro-Testungen der neuen Verbindung diente ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl), das bei PDD und PDT der Harnblase und des Gastronintestinaltrakts Stand der Technik ist.ALA-Hexylester-hydro served as the reference substance for the in vitro tests of the new compound chloride (hexyl), which is state of the art in PDD and PDT of the bladder and gastrointestinal tract.

3.1 Verwendete Zelllinien3.1 Cell lines used

  • Kolonmodell: Adenokarzinom-Zelllinie HT29 (Krebszellen) und Kolonfibroblasten-Zelllinie CCD18 (Vertreter des gesunden Darmbindegewebes)Colon model: HT29 adenocarcinoma cell line (cancer cells) and colon fibroblast cell line CCD18 (representative of healthy intestinal connective tissue)
  • Urothelmodell: Urothelkarzinom-Zelllinie J82 (Krebszellen) und Urothel-Zelllinie UROTSA (Vertreter des gesunden Harnblasengewebes)Urothelial model: Urothelial carcinoma cell line J82 (cancer cells) and Urothel cell line UROTSA (representative of healthy bladder tissue)

3.2 PPIX-Akkumulation3.2 PPIX accumulation

  • →Inkubation (3 h, 0,12 mmo1/l) von HT29 und J82 mit ALA-Ester-hydrochlorid 1 und ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl)→ incubation (3 h, 0.12 mmo1 / l) of HT29 and J82 with ALA ester hydrochloride 1 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Deutliche Steigerung der PPIX-Akkumulation durch Bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiesterdihydrochlorid 1 im Vergleich zum ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl) in J82 und HT29 (13).→ Significant increase in PPIX accumulation due to bis-5-aminolevulinic acid 1,4-dibenzyldiester dihydrochloride 1 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in J82 and HT29 ( 13 ).

3.3 PPIX-Akkumulationsverhältnis3.3 PPIX accumulation ratio

  • →Inkubation (3 h, 0,12 mmol/l) von HT29 und CCD18 sowie J82 und UROTSA mit ALA-Ester-hydrochlorid 1 und ALA-Hexylester-hydrochlorid (Hexyl)→ incubation (3 h, 0.12 mmol / l) of HT29 and CCD18 as well as J82 and UROTSA with ALA ester hydrochloride 1 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Durchflusszytometrische Bestimmung der PPIX-Akkumulation→ Flow cytometric Determination of the PPIX accumulation
  • →Berechnung der Akkumulationsverhältnisse HT29/CCD18 und J82/UROTSA→ calculation the accumulation ratios HT29 / CCD18 and J82 / UROTSA
  • →Deutliche Steigerung des Akkumulationsverhältnisses durch Bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiesterdihydrochlorid 1 im Vergleich zu ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl) in HT29/CCD18 sowie in J82/UROTSA (14).→ Significant increase in the accumulation ratio due to bis-5-aminolevulinic acid 1,4-dibenzyldiester dihydrochloride 1 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) in HT29 / CCD18 and in J82 / UROTSA ( 14 ).

3.4 Phototoxizität3.4 Phototoxicity

  • →Inkubation (0,12 mmol/l; 3 h) von HT29 und CCD18 mit ALA-Ester-hydrochlorid 1 und ALA-Hexylester hydrochlorid (Hexyl)→ incubation (0.12 mmol / l; 3 h) of HT29 and CCD18 with ALA ester hydrochloride 1 and ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl)
  • →Bestrahlung der Zellen mit unterschiedlichen Energiedosen (λ = 590–700 nm, 0–30 J/cm2, 40 mW/cm2).→ Irradiation of the cells with different energy doses (λ = 590–700 nm, 0–30 J / cm 2 , 40 mW / cm 2 ).
  • →Klonogenitätstests, Bestimmung der Zellvitalität in Abhängigkeit der applizierten Strahlungsdosis.→ Klonogenitätstests, Determination of cell vitality dependent on the applied radiation dose.
  • →Ermittlung des LD50-Verhältnisses in HT29/CCD18→ Determination of the LD 50 ratio in HT29 / CCD18
  • →Deutliche Verringerung des LD50-Verhältnisses in HT29/CCD18 durch Bis-5-aminolävulinsäure-1,4-dibenzyldiester-dihydrochlorid 1 im Vergleich zu ALA-Hexylesterhydrochlorid (Hexyl) (15).→ Significant reduction in the LD 50 ratio in HT29 / CCD18 by bis-5-aminolevulinic acid 1,4-dibenzyl diester dihydrochloride 1 compared to ALA hexyl ester hydrochloride (hexyl) ( 15 ).

Claims (7)

5-Aminolävulinsäurederivate oder deren Salze der allgemeinen Formel (I) HN2-CH2-CO-(CH2)2-COR1 (I)mit R1 = -OR2 wobei R2 = -(CR 6 / 2)m CnR7 ist mit R 6 / 2 = H und/oder F R7 = F2n+1, HF2n oder H2nF m = 0 – 10 und n = 1 – 10 ist und CnR7 geradkettig oder verzweigt ist oder R1 = -SR3 wobei R3 = Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryloxy, Alkoxycarbonyl, Amino oder Aryl ist, wobei die Reste durch Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor unterbrochen sein können oder
Figure 00260001
wobei R4 = H, Halogen, Alkyl, substituiertes Alkyl, NH2, OR3, SR3 wobei R3 wie vorstehend definiert ist, OH, SH, CO2H und R5 = -CH2-COO-(CH2)2-COCH2-NH2 dabei kann R 4 / 40 gleich oder verschieden sein.5-aminolevulinic acid derivatives or their salts of the general formula (I) HN 2 -CH 2 -CO- (CH 2 ) 2 -COR 1 (I) with R 1 = -OR 2 where R 2 = - (CR 6/2) m C n R 7 with R 6/2 = H and / or FR 7 = F 2n + 1 , HF 2n or H 2n F m = 0-10 and n = 1-10 and C n R 7 is straight-chain or branched or R 1 = -SR 3 where R 3 = alkyl, substituted alkyl, alkoxy, aryloxy, alkoxycarbonyl, amino or aryl, the radicals being represented by Oxygen, nitrogen, sulfur or phosphorus can be interrupted or
Figure 00260001
where R 4 = H, halogen, alkyl, substituted alkyl, NH 2 , OR 3 , SR 3 where R 3 is as defined above, OH, SH, CO 2 H and R 5 = -CH 2 -COO- (CH 2 ) 2 -COCH 2 -NH 2 , R 4/40 may be the same or different. 5-Aminolävulinsäurederivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 = -OR2 ist, wobei R2 wie vorstehend definiert ist, mit der Maßgabe dass m = 1 oder 2 und n = 3–6 ist.5-aminolevulinic acid derivatives according to claim 1, characterized in that R 1 = -OR 2 , wherein R 2 is as defined above, with the proviso that m = 1 or 2 and n = 3-6. 5-Aminolävulinsäurederivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
Figure 00270001
mit der Maßgabe dass R 1 / 5 = -CH2-COO-(CH2)2-COCH2-NH2 und R 4 / 4 = H ist.5-aminolevulinic acid derivatives according to claim 1, characterized in that
Figure 00270001
with the proviso that R 1/5 = -CH 2 -COO- (CH 2 ) 2 -COCH 2 -NH 2 and R 4/4 = H. 5-Aminolävulinsäurederivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 = -SR3 ist mit der Maßgabe dass R3 ein Alkyl mit C3-C10 ist.5-aminolevulinic acid derivatives according to claim 1, characterized in that R 1 = -SR 3 with the proviso that R 3 is an alkyl having C 3 -C 10 . 5-Aminolävulinsäurederivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R3 = (CH2)5CH3 ist.5-aminolevulinic acid derivatives according to claim 4, characterized in that R 3 = (CH 2 ) 5 CH 3 . Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 oder ein Salz hiervon zusammen mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen.Pharmaceutical composition containing a compound according to at least one of the preceding claims 1 to 5 or a salt thereof along with usual Carrier- and / or auxiliary substances. Verwendung einer Verbindung nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 zur Her stellung eines Arzneimittels für die photodynamische Tumortherapie und/oder -diagnostik.Use a connection after at least one of the preceding claims 1 to 5 for the manufacture of a medicament for photodynamic tumor therapy and / or diagnostics.
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