DE10311563A1 - Replication assay for the detection of antiviral substances using HTS methods - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein HTS-Testverfahren auf Basis des dem Hepatitis C Virus (HCV) analogen Virus der bovinen viralen Diarrhö (BVDV) in einem in vitro Replikationstest mit infektiösem BVDV auf bovinen Zellen und als Eintopfverfahren. Das Testverfahren eignet sich zur einfachen und schnellen Testung großer Substanzbanken hinsichtlich der Auffindung und Charakterisierung neuer Hemmstoffe für Flaviviren.The present invention relates to an HTS test method based on the hepatitis C virus (HCV) analog virus of bovine viral diarrhea (BVDV) in an in vitro replication test with infectious BVDV on bovine cells and as a one-pot method. The test procedure is suitable for simple and quick testing of large substance banks with regard to the detection and characterization of new inhibitors for flaviviruses.
Description
Die Suche nach neuen, besser wirkenden und besser verträglichen Wirkstoffen, die als Therapeutika zur Behandlung bei viralen Infektionen, insbesondere der Infektion mit Hepatitis C Virus (HCV) verwendet werden können, ist eine drängende Aufgabe der pharmazeutischen Forschung, im Rahmen derer hunderttausende Testverbindungen auf ihre Wirksamkeit hin untersucht werden müssen.The search for new, better looking and better tolerated Active substances that are used as therapeutic agents for the treatment of viral infections, especially the infection with hepatitis C virus (HCV) used can be is an urgent one Abandon pharmaceutical research, among which hundreds of thousands Test compounds must be examined for their effectiveness.
Dazu wird üblicherweise im enzymatischen Test die Wirkung auf virusspezifische Polymerasen, Helikasen oder Proteasen, oder im in vitro Modell die Wirkung der Testsubstanz auf das native, unveränderte Virus und dessen Verhalten an geeigneten Zielzellen untersucht.This is usually done in the enzymatic test the effect on virus-specific polymerases, helicases or proteases, or in the in vitro model the effect of the test substance on the native, unchanged Virus and its behavior on suitable target cells examined.
Die große Zahl der zu testenden Proben bedingt erhebliche logistische Probleme, die nur durch Automatisierung der Testabläufe zu lösen sind.The large number of samples to be tested causes significant logistical problems that are only due to automation of the test procedures to solve are.
Dies ist im Falle der enzymatischen Tests der Stand der Technik, wo große Probenmengen mit sogenannten High-Throughput-Screening Verfahren (HTS-Verfahren) untersucht werden können. Solche Tests können und werden auch im Falle der Enzyme von HCV durchgeführt werden (Journal of Virology (1997) 71,11, 8416 – 8428; V. Lohmann et al.) oder J. Virology (1993) 67, 3835 – 3844, R. L. Bartenschlager et al.).This is the case with the enzymatic State-of-the-art tests, where large amounts of sample with so-called High-throughput screening methods (HTS method) are examined can. Such tests can and will also be done in the case of HCV's enzymes (Journal of Virology (1997) 71, 11, 8416-8428; V. Lohmann et al.) or J. Virology (1993) 67, 3835-3844, R.L. Bartenschlager et al.).
Tests auf Basis von Proteinen und Enzymen eignen sich besonders gut für die Durchführung im HTS, weil für die verfügbaren Read-outs exakte und schnelle Auswertemöglichkeiten, beispielsweise als optische Verfahren durch Messung der Fluoreszenz, gegeben sind. Ein gutes Signal-Rauschverhältnis lässt sich durch Auswahl geeigneter Farbindikatoren erzielen. Allerdings ist der enzymatische Test prinzipiell mit dem Nachteil behaftet, dass er nur einen kleinen Teil aller am Replikationszyklus beteiligten viralen und oder zellulären Systeme erfasst und die optimalen Bedingun gen (Kofaktoren, Ionen-bedingungen, pH Wert usw.) im natürlichen Milieu der Wirtszelle unzureichend abbildet.Tests based on proteins and Enzymes are particularly suitable for use in HTS, because for the available Read-outs precise and quick evaluation options, for example are given as optical methods by measuring the fluorescence. A good signal-to-noise ratio can be by choosing suitable color indicators. However the basic disadvantage of the enzymatic test is that he only a small part of all involved in the replication cycle viral and or cellular Systems and the optimal conditions (cofactors, ion conditions, pH value etc.) in natural Environment of the host cell is insufficient.
Demgegenüber erlaubt die Untersuchung der Replikation von Viren in der Zellkultur die simultane Überprüfung aller an der Virusvermehrung beteiligten Schritte unter weitestgehend natürlichen Bedingungen (Replikationsassay).In contrast, the investigation of the Replication of viruses in cell culture the simultaneous review of all steps involved in virus replication as far as possible natural Conditions (replication assay).
Replikationsassays sind deshalb besonders geeignet, die bekannten enzymatischen Prozesse unter physiologischen Bedingungen abzubilden und bekannte und unbekannte, viruskodierte bzw. wirtsspezifische aber für die Replikation essentielle Prozesse mit zu erfassen, die im enzymatischen Test prinzipiell nicht nachstellbar sind.Replication assays are therefore particularly suitable the known enzymatic processes under physiological conditions map and known and unknown, virus-coded or host-specific but for the replication to capture essential processes involved in the enzymatic In principle, the test cannot be adjusted.
Betreffend HCV sind dies zum Beispiel das Attachment an und das Eindringen in die zu infizierende Zelle sowie die Wirkung virusspezifischer regulativer Mechanismen oder Prozesse, bei denen virus- und zelleigene Faktoren zusammenwirken oder aber die nicht im Replikonsystem (s.u.) abgebildeten HCV spezifischen Prozess Schritte innerhalb der Virusreplikation.For example, regarding HCV the attachment to and penetration into the cell to be infected and the effect of virus-specific regulatory mechanisms or Processes in which virus and cell-specific factors interact or the HCV-specific ones not shown in the replicon system (see below) Process steps within virus replication.
Generell sind die viruseigenen Schritte, die in vitro – wenn überhaupt – nur unter Zusatz außerordentlich komplexer Reaktionsadditive verlaufen, im Replikationsassay in geeigneten Wirtszellen abgebildet und funktionieren z.B. innerhalb des Replikationsprozesses optimal – einem Zell-Virus-Replikationssystem kommt nach einem relevanten experimentellen Infektionssystem die höchste Relevanz für ein Infektionsgeschehen zu.Generally, the virus-specific steps the in vitro - if at all - only under Extraordinary addition complex reaction additives run, in the replication assay in suitable Mapped host cells and work e.g. within the replication process optimal - one Cell virus replication system comes after a relevant experimental one Infection system the highest Relevance for a Infection events too.
Ein Replikationsassay liefert nicht nur Hinweise auf antivirale Wirkungen von Testverbindungen sondern zusätzlich auch Hinweise zur Zytotoxizität/Zellverträglichkeit (Selektivitätsindex) der Testverbindungen und damit ein erstes Maß für die Einschätzung des Potentials der Wirkverbindung. Darüber hinaus werden nur solche Wirkverbindungen als antiviral auffallen, die zugleich zellgängig sind.A replication assay does not deliver only indications of antiviral effects of test compounds but additionally also information on cytotoxicity / cell tolerance (Selectivity index) of the test connections and thus a first measure for the assessment of the Potential of the active connection. In addition, only such Active compounds that are cell-bound are striking as antiviral.
Der Replikationstest eignet sich vor diesem Hintergrund besonders, neue, wirksamere und besser verträgliche Hemmstoffe des HCV aufzufinden.The replication test is suitable Against this background, special, new, more effective and better tolerated inhibitors of the HCV.
Für HCV gibt es kein in vitro Replikationstestverfahren, das der natürlichen Infektion vergleichbar wäre; infektiöse HCV Viren lassen sich in vitro nicht so propagieren, dass derartige Systeme zu Testzwecken einsetzbar wären.For HCV has no in vitro replication test method that is natural Infection would be comparable; infectious HCV viruses cannot be propagated in vitro in such a way that such Systems could be used for test purposes.
Es gelang jedoch, ein sogenanntes Replikonsystem zu generieren, bei dem subgenomische RNA Elemente des HCV verwendet werden, und die in humanen Hepatomazellen unter Selektionsdruck vermehrt werden können (Journal of Virology (2001) 75,3, 1252 – 1264; T. Pietschmann et al. oder Science (1999) 285, 110 – 113; V. Lohmann et al. oder Science (2000) 290, 1972 – 1974; K.J. Blight et al.). Diese Technologie auf Basis des HCV Replikonsystems lässt sich als Screening für die Auffindung und Evaluierung von Hemmstoffen des HCV einsetzen.However, a so-called Generate replicon system using subgenomic RNA elements of the HCV and used in human hepatoma cells Selection pressure can be increased (Journal of Virology (2001) 75,3, 1252-1264; T. Pietschmann et al. or Science (1999) 285, 110-113; V. Lohmann et al. or Science (2000) 290, 1972-1974; K. J. Blight et al.). This Technology based on the HCV replicon system can be used as a screening for the discovery and evaluation of HCV inhibitors.
Das Replikonsystem kann zum Screening für Hemmstoffe des HCV verwendet werden. Es ist jedoch wie erwähnt artifiziell und bildet nicht die natürliche Infektion des HCV ab (z.B. werden keine infektiösen Viren gebildet, die für eine serielle Weiterinfektion nutzbar sind). Insbesondere ist der Einsatz bei Verwendung des kompletten Genoms des HCV mittels Replikonsystem sehr ineffizient und damit praktisch nicht für ein HTS zu verwenden.The replicon system can be used for screening for inhibitors of the HCV can be used. However, as mentioned, it is artificial and forms not the natural one Infection of the HCV (e.g. no infectious viruses are formed, which are responsible for a serial Further infection can be used). In particular, the use is in use the complete genome of the HCV using the replicon system is very inefficient and therefore practically not for to use an HTS.
Viren, die dem HCV verwandt sind und zur Familie der Flaviviren gehören lassen sich wegen ihrer Eigenschaften zur in vitro Vermehrung alternativ und effizient für ein HTS einsetzen. Dies wurde prinzipiell in der Arbeit von S.G. Scott et al. am Beispiel des Virus der bovinen viralen Diarrhö (BVDV) gezeigt (Proc. of the Nat. Acad. of Sciences (2000) 97,14, 7981 – 7986). BVDV wird den Pestiviren innerhalb der Flavivirus Familie zugeordnet. Es gibt zwei Isolate für die in vitro Kultivierung, die prinzipiell für eine Testung auf Hemmstoffe des HCV einsetzbar sind; hier steht der BVDV Stamm NADL, der cytopathische Eigenschaften auf Madi Darby bovine kidney Zellen (MDBK) induziert im Vordergrund. Überraschend wurde gefunden, dass sich BVDV auf MDBK Zellen für ein HTS im Eintopfverfahren eignet.Viruses related to HCV and belonging to the family of flaviviruses can be used alternatively and efficiently for HTS due to their properties for in vitro reproduction. This was principally confirmed in the work of SG Scott et al. shown using the example of the virus of bovine viral diarrhea (BVDV) (Proc. of the Nat. Acad. of Sciences (2000) 97, 14, 7981-7986). BVDV is assigned to the pestiviruses within the flavivirus family. There are two isolates for in vitro cultivation, which can in principle be used for testing for HCV inhibitors; here the BVDV strain NADL is in the foreground, which induces cytopathic properties on Madi Darby bovine kidney cells (MDBK). It was surprisingly found that BVDV on MDBK cells is suitable for HTS in a one-pot process.
Der Replikationsassay ist mit dem prinzipiellen Nachteil belegt, dass der Endpunkt, nämlich die Beurteilung des Verhaltens der dem Virus ausgesetzten Zellen, bisher noch nicht im HTS-Verfahren bestimmt werden kann. Zwar ist es bekannt, gentechnisch veränderte und mit geeigneten Indikatorsystemen wie beispielsweise dem Luciferase-Gen versehene HCV-Varianten einzusetzen, doch verhalten sich solche durch das Einklonieren von Reporter-Genen veränderte Varianten des HCV nicht notwendig so wie unveränderten Stämme des HCV.The replication assay is with the fundamental disadvantage proves that the end point, namely the assessment the behavior of the cells exposed to the virus, not yet can be determined in the HTS procedure. Although it is known, genetically changed and with suitable indicator systems such as the luciferase gene use provided HCV variants, but such behave HCV variants not changed by cloning reporter genes necessary as unchanged strains of the HCV.
Testverfahren, die in vitro auf Basis des HCV Replikonsystems eingesetzt werden, sind Zeit- und Ressourcen – intensiv und nicht automatisierbar wie es für die Untersuchung einer großen Anzahl von Prüfsubstanzen erforderlich wäre, sie sind also in der bisher bekannten Form nicht für die Testung großer Substanzbibliotheken geeignet.Test procedures based in vitro of the HCV replicon system are time and resource intensive and not automatable as it is for the investigation of a large number of test substances would be required So they are not in the form known so far for testing large substance libraries suitable.
Dies ist vor allem aus dem Verhalten der HCV Replikons in vitro begründet. Die Replikons induzieren auf den Zielzellen, bevorzugt auf Leberzellen, keinen charakteristischen zytopathischen Effekt.This is mostly from behavior of the HCV replicons established in vitro. The replicons induce on the target cells, preferably on liver cells, no characteristic cytopathic effect.
Als Verfahren zur Auswertung HCV-spezifischer Veränderungen an Replikon-transfizierten Zellen sind sogenannte Sekundärtests, wie die Messung Virus-spezifischer RNA (z.B. über PCR) oder Farbreaktionen, die über eine gekoppelte Testkaskade mittels Indikatorgen sichtbar gemacht werden können.As a procedure for evaluating HCV-specific changes on replicon-transfected cells are so-called secondary tests, such as the measurement of virus-specific RNA (e.g. via PCR) or color reactions, the above a coupled test cascade made visible using indicator genes can be.
All diese Verfahren sind jedoch außerordentlich ressourcenintensiv und daher für die Testung großer Substanzbanken nur unzureichend geeignet.However, all of these methods are exceptional resource intensive and therefore for testing great Substance banks are insufficiently suitable.
Es stellt sich daher die Aufgabe, einen für das High-Throughput-Screening (HTS) geeigneten Replikationsassay zu etablieren, der unter Verwendung von infektiösen Viren und geeigneten Wirtszellen, als Primärtest unter Verwendung eines optischen Read-outs bei gutem Signal/Rauschverhältnis durchgeführt werden kann.It is therefore the task one for that High-Throughput-Screening (HTS) suitable replication assay establish that using infectious viruses and suitable host cells, as a primary test using an optical read-out with good signal / noise ratio can.
Unter geeigneten Replikationsassays sind erfindungsgemäß solche Assays zu verstehen, die unter Einsatz von Wirtszellen als Ein-Topf Assay ohne weitere Aufarbeitungsschritte durchgeführt werden können.Under suitable replication assays are such according to the invention Understand assays using host cells as a one-pot Assay can be carried out without further workup steps can.
Im Rahmen der Erfindung wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass BVDV und insbesondere das NADL-Isolat von BVDV sich auch in Anwesenheit wesentlich geringerer als im Stand der Technik bisher gebräuchlicher Serumkonzentrationen vermehrt. Bisher gängige Wachstumsbedingungen für Wirtszellen des BVDV waren Wachstumsmedien, die mindestens 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthalten.In the context of the invention has now surprisingly found that BVDV and especially the NADL isolate from BVDV itself even in the presence of much less than in the prior art more common so far Serum concentrations increased. Current growth conditions for host cells of the BVDV were growth media containing at least 10% fetal calf serum (FCS) included.
Dies ist deshalb von besonderer Bedeutung, da hohe Serumkonzentrationen in Zellkulturmedien von viralen Replikationssystemen an Suspensionszellen für optische Detektionsverfahren auf Basis von Fluoreszenz oder Absorptionsmessverfahren ungeeignet sind, was bedingt wird durch das Vorkommen von störenden Proteinen im fötalen Kälberserum (FCS) und der von ihnen ausgehenden enzymatischen Aktivität. Die Anwendung optischer Detektionsverfahren blieb daher bisher auf Zellkultursysteme mit adhärierenden Zellen beschränkt, bei denen sich die im Überstand der Kultur befindlichen, den optischen Test störende Proteine, leicht abpipettieren lassen.This is of particular importance because high serum concentrations in cell culture media from viral replication systems on suspension cells for optical detection methods based on fluorescence or absorption measurement methods are unsuitable, which is caused by the presence of disruptive proteins in the fetal Calf Serum (FCS) and the enzymatic activity emanating from them. The application Optical detection methods have therefore so far remained on cell culture systems with adherent Cells limited where they are in the supernatant Let the proteins in the culture that interfere with the optical test be pipetted off lightly.
Die vorliegenden Untersuchungen haben nun gezeigt, dass auch deutlich geringere Serumkonzentrationen ausreichen, um das BVDV und insbesondere das NADL-Isolat von BVDV, zu propagieren. Es wurde jetzt nämlich überraschend gefunden, dass BVDV sich auch bei bisher nicht etablierten geringen FCS Serumkonzentrationen wie zum Beispiel 0,2 bis 2 %, in Suspensionszellen vermehrt, einer Konzentration, bei der die im FCS enthaltenen Störproteine mit einigen optischen Detektionsverfahren nicht länger interferieren.The present studies have now shown that significantly lower serum concentrations are sufficient, to promote the BVDV and in particular the NADL isolate from BVDV. It was surprising now found that BVDV can also be found in previously unexplored minor FCS serum concentrations such as 0.2 to 2%, in suspension cells increased, a concentration at which the interference proteins contained in the FCS no longer interfere with some optical detection techniques.
Basierend auf dieser Beobachtung wird mit der jetzt vorliegenden Erfindung ein (HTS) Screening Verfahren zur schnellen, kostengünstigen und infektionsrelevanten Prüfung von großen Substanzbanken mit mehr als 500 000 Testverbindungen oder noch größeren Substanzbibliotheken mit mehr als 1 Mio. Prüfverbindungen mit dem Ziel der Auffindung neuer Hemmstoffe des BVDV als Analogmodell für Hemmstoffe des HCV vorgestellt, das darauf beruht, dass der Literatur-bekannte Replikationstest zur in vitro Vermehrung des BVDV, der bisher nur in kleinem Maßstab auch zur Prüfung von Wirkverbindungen gegen das BVDV einsetzbar war, nach gezielten Veränderungen in den Testbedingungen nun auch als HTS durchführbar ist.Based on this observation becomes an (HTS) screening method with the present invention for fast, inexpensive and infection-relevant testing of great Substance banks with more than 500,000 test compounds or even larger substance libraries with more than 1 million test connections with the aim of finding new BVDV inhibitors as an analog model for inhibitors of the HCV, which is based on the literature-known Replication test for the in vitro multiplication of BVDV, which so far only on a small scale also for testing of active connections against the BVDV could be used after targeted changes can now also be carried out as HTS in the test conditions.
Ein in Verbindung mit niedrigen FCS-Konzentrationen erfindungsgemäß zu verwendendes Isolat ist beispielsweise das NADL Isolat des BVDV, das MDBK Zellen derart verändert, dass Virusinfektionen über veränderte biochemische Prozesse im optischen Test mittels Farbreagenzien sichtbar gemacht werden können, da die Infektion von MDBK Zellen mit dem NADL-Isolat in Anwesenheit von geringen FCS-Konzentrationen dazu führt, dass die infizierten Zellen in einen physiologischen Zustand versetzt werden, der die Diskriminierung geschützter von viruszerstörten Zellen unter Verwendung von Farbreagentien ermöglicht.One in conjunction with low FCS concentrations Isolate to be used according to the invention is for example the NADL isolate of the BVDV, the MDBK cells changed that viral infections over changed biochemical processes visible in the optical test using color reagents can be made since the infection of MDBK cells with the NADL isolate is present of low FCS concentrations causes the infected cells be placed in a physiological state of discrimination protected by virus destroyed Allows cells to be used using color reagents.
Als für unter diesen Bedingungen zum Nachweis geeignete Farbreagentien wurden überraschenderweise XTT, MTT, Neutralrot und insbesondere alamar-Blue (alamar-BlueTM, Laboserv GmbH, Giessen, Germany; USP 5501959) oder Fluoreszensfarbstoffe wie z.B. Fluordiazetat aufgefunden.Surprisingly, XTT, MTT, neutral red and in particular alamar-Blue (alamar-Blue ™ , Laboserv GmbH, Giessen, Germany; USP 5501959) or fluorescent dyes such as fluorodiacetate were found as color reagents suitable for detection under these conditions.
Voraussetzung für diese Art des Nachweises ist der überraschende Befund, dass sich einige infektionsrelevante Stämme des BVDV, wie beispielsweise das NADL-Isolat, auch in Zellen vermehren, in deren Kulturmedium nur geringe Mengen an fötalem Kälberserum (FCS) als essentieller Wachstumsfaktor enthalten ist. Dieser Befund ist wesentliche Voraussetzung für die erfindungsgemäßen Verfahren, da die bisher für essentiell gehaltenen höheren Konzentrationen an FCS die Verwendung von Farbreagenzien stören und deshalb ausschließen.Prerequisite for this type of proof is the surprising finding that some infection-relevant strains of BVDV, such as the NADL isolate, also multiply in cells whose culture medium contains only small amounts of fetal calf serum (FCS) as an essential growth factor. This finding is an essential prerequisite for the methods according to the invention, since the higher concentrations of FCS which were previously considered essential disrupt the use of color reagents and therefore preclude them.
Die durch das NADL-Isolat induzierten zytopathischen und zytotoxischen Effekte lassen sich wie überraschend gefunden wurde, durch Zusatz von Trypsin (in Konzentrationen von 0,5 bis 2μg/ml, bevorzugt 2μg/ml) unter den erfindungsgemäßen FCS-Konzentrationen in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Farbreagenzien deutlich verstärken, und erleichtern dadurch ein HTS zur Auffindung von Wirkstoffen gegen das BVDV/HCV.The induced by the NADL isolate Cytopathic and cytotoxic effects can be surprising was found by adding trypsin (in concentrations of 0.5 to 2μg / ml, preferably 2μg / ml) below the FCS concentrations according to the invention clearly in connection with the color reagents according to the invention amplify, and thereby facilitate a HTS to find active substances against the BVDV / HCV.
Es wurde weiter gefunden, dass als Farbstoffe erfindungsgemäß alamar-Blue und Fluoreszensfarbstoffe wie z.B. Fluordiazetat eingesetzt werden können, die mit Hilfe optischer Verfahren unter Einsatz der HTS-Technik gemessen werden können.It was further found that as Dyes according to the invention alamar blue and fluorescent dyes such as Fluorodiacetate can be used measured using optical methods using HTS technology can be.
Es wurde weiter gefunden, dass die erfindungsgemäße Kombination bestehend aus natürlichem BVDV-Isolat, Zellkulturmedium mit erfindungsgemäß niedriger FCS-Konzentration, in Gegenwart von 2μg/ml Trypsin, erfindungsgemäßem Detektionsfarbstoff und MDBK Zellen in einem HTS als Ein-Schritt-Verfahren so konfigurierbar ist, das dieses in 384-well oder auch 1536-well Platten durchgeführt werden kann.It was further found that the combination according to the invention consisting of natural BVDV isolate, cell culture medium with a low FCS concentration according to the invention, in Presence of 2μg / ml Trypsin, detection dye according to the invention and MDBK cells can be configured in a HTS as a one-step procedure is that this is done in 384-well or 1536-well plates can.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Testverfahren jedoch zur Testung großer Substanzbibliotheken und damit zur Auffindung neuer Stoffklassen mit Wirkung gegen das BVDV bevorzugt für HCV einsetzbar. Diese neuen Stoffklassen sind auch für andere dem HCV analoge Virusinfektionen einsetzbar, insbesondere Infektionen verursacht durch das West Nile Virus, Infektionen verursacht durch das Frühsommer Meningoenzephalitis Virus (FSME), Infektionen verursacht durch Dengue Viren, Infektionen verursacht durch das Virus der Japanischen Enzephalitis und Infektionen bedingt durch das Gelbfieber Virus.The test method according to the invention is preferred however for testing large Substance libraries and thus to find new substance classes with Effect against the BVDV preferably used for HCV. These new ones Substance classes are also for other virus infections analogous to HCV can be used, in particular Infections caused by the West Nile Virus, infections caused through early summer Meningoencephalitis Virus (TBE), infections caused by dengue Viruses, infections caused by the Japanese encephalitis virus and infections caused by the yellow fever virus.
Unter den erfindungsgemäßen Testverfahren werden insbesondere solche Testverfahren verstanden, in denen gegenüber nativen Viren, insbesondere BVDV-Viren empfindliche Zielzellen, insbesondere MDCK Zellen in einem Zellkulturmedium, beispielsweise Earle's MEM, unter Zusatz von nur geringen Mengen an fötalem Kälberserum und von Trypsin in Multi-well Platten zusammen mit besagten Viren und einer Test- bzw. Referenzsubstanz für einen Zeitraum von 2 – 20 Tagen; vorzugsweise 5 – 10 Tagen, bei der für die jeweilige Temperatur sich ergebenden Sättigungsfeuchte kultiviert werden, anschließend als Read-out ein Färbemittel, vorzugsweise alamar-Blue oder Fluoresceindiazetat zugegeben, dann erneut inkubiert und nachfolgend im HTS Verfahren optisch vermessen werden.Among the test methods according to the invention are understood in particular those test methods in which compared to native Viruses, especially BVDV viruses, sensitive target cells, in particular MDCK cells in a cell culture medium, for example Earle's MEM, with addition of only small amounts of fetal calf serum and of trypsin in multi-well plates together with said viruses and a test or reference substance for a period of 2 to 20 days; preferably 5 - 10 days, at the for cultivated the respective temperature resulting saturation moisture be, then a dye as a read-out, preferably added alamar blue or fluorescein diacetate, then incubated again and then optically measured using the HTS method become.
Es wurde weiter gefunden, dass die erfindungsgemäße Kombination bestehend aus natürlichem BVDV-Isolat, Zellkulturmedium mit erfindungsgemäß niedriger FCS-Konzentration 2μg/ml Trypsin, erfindungsgemäßem Detektionsfarbstoff und MDBK Zellen in einem HTS als Ein-Schritt-Verfahren so konfigurierbar ist, dass dieses zur schnellen, und kostengünstigen Auffindung von neuen Wirkstoffen gegen HCV verwendet werden kann.It was further found that the combination according to the invention consisting of natural BVDV isolate, cell culture medium with a low FCS concentration according to the invention 2μg / ml trypsin, detection dye according to the invention and MDBK cells can be configured in a HTS as a one-step procedure is that this is for the quick, and inexpensive discovery of new ones Active substances against HCV can be used.
Neue Wirkstoffe im Sinne der Erfindung sind bevorzugt kleinmolekulare Wirkstoffe, die in die Replikation des BVDV/HCV-Virus eingreifen und dessen Vermehrung spezifisch hemmen, wobei unter kleinmolekular im Rahmen der Erfindung Verbindungen mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 bis 500 oder 100 bis 1000 und darüber hinaus verstanden werden.New active substances in the sense of the invention are preferably small-molecule active ingredients involved in replication of the BVDV / HCV virus intervene and specifically inhibit its multiplication, where under small molecular compounds in the context of the invention a molecular weight in the range of about 100 to 500 or 100 up to 1000 and above be understood beyond.
Als potentielle Hemmstoffe können aber auch hochmolekulare Verbindungen, wie z. B. Antikörper, die in großer Anzahl in Bibliotheken hergestellt werden können, in Frage kommen.But also as potential inhibitors high molecular weight compounds such as B. Antibodies in large numbers can be produced in libraries.
Weiterhin eignet sich der Test, die darin identifizierten Hemmstoffe als Inhibitor des BVDV in dem Indikationsgebiet virale bovine Diarrhö einzusetzen.The test is also suitable inhibitors identified therein as inhibitors of BVDV in the indication area use viral bovine diarrhea.
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Auffindung von Hemmstoffen der viralen Replikation (Replikationsassay), insbesondere von Hemmstoffen des HCV, dadurch gekennzeichnet dass ein Analog Virus Isolat zusammen mit empfindlichen Zielzellen in einem Zellkulturmedium inkubiert wird (Inkubationszeit vorzugsweise 2 – 20 Tage), welches fötales Kälberserum in einer Konzentration von weniger als 5 % enthält, sowie ein Detektionsfarbstoff hinzugegeben wird und nach anschließender Inkubation optisch vermessen wird.The invention relates to methods to find inhibitors of viral replication (replication assay), in particular of HCV inhibitors, characterized in that an analog virus isolate along with sensitive target cells is incubated in a cell culture medium (preferably incubation time 2 - 20 Days), which is fetal calf serum contains in a concentration of less than 5%, as well as a detection dye is added and optically measured after subsequent incubation becomes.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Verfahren gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, wobei das Medium zusätzlich Trypsin in einer Konzentration von 2 μg/ml enthält.A method according to the invention is a method according to the above described method, wherein the medium additionally trypsin in a concentration of 2 μg / ml contains.
Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei ein Zellkulturmedium enthaltend fötales Kälberserum in einer Konzentration von 1 – 2 Vol % eingesetzt wird.A is also according to the invention Method as described above, comprising a cell culture medium fetal calf serum in a concentration of 1 - 2 Vol% is used.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren gemäß der vorangehend beschriebenen Verfahren, wobei als natürliches Virus-Isolat ein Isolat von BVDV, sowie als empfindliche Zielzellen MDBK Zellen verwendet werden.The invention relates to a Method according to the preceding described method, being an isolate as a natural virus isolate from BVDV, as well as MDBK cells used as sensitive target cells become.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren gemäß der vorangehend beschriebenen Verfahren, wobei das Analog Virus-Isolat das NADL-Isolat von BVDV ist, sowie als Zellkulturmedium ein Medium, welches fötales Kälberserum in einer Konzentration von 0,1 – 5 Vol %, vorzugsweise 1 – 2 Vol % enthält.The invention also relates to a method according to the preceding described method, wherein the analog virus isolate the NADL isolate from BVDV, and as a cell culture medium, a medium which contains fetal calf serum in a concentration of 0.1 - 5 Vol%, preferably 1-2 Vol% contains.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren gemäß der vorangehend beschriebenen Verfahren, wobei als Detektionsfarbstoff alamar-Blue oder Fluoresceindiazetat eingesetzt wird.The invention also relates to a method according to the method described above, alamar blue being the detection dye or fluorescein diacetate is used.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren gemäß der vorangehend beschriebenen Verfahren, wobei das BVDV Isolat, insbesondere das NADL-Isolat von BVDV als Analogvirus für HCV eingesetzt wird.The invention relates to a Method according to the preceding described method, the BVDV isolate, in particular the NADL isolate from BVDV is used as an analog virus for HCV.
Eine erfindungsgemäße Verwendung ist die Verwendung von den hier beschriebenen Replikationsassays zur Auffindung antiviral wirksamer Hemmstoffe, insbesondere von Hemmstoffen des BVDV als Analogmodell für HCV in High Throughput Assay Systemen.An inventive use is the use of the replication assays described here for the detection of antivirally active inhibitors, in particular of BVDV inhibitors as an analog model for HCV in high throughput assay systems.
Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung ist die Verwendung von Hemmstoffen der viralen Replikation, die mit einem der hier beschriebenen Replikationsassays aufgefunden werden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen.Another use according to the invention is the use of viral replication inhibitors that found using one of the replication assays described here for the manufacture of a medicine for prevention and treatment of infections.
Insbesondere erfindungsgemäß ist die Verwendung von Hemmstoffen der viralen Replikation von BVDV/HCV, besonders bevorzugt dem NADL Isolat von BVDV, die mit einem der hier beschriebenen Verfahren aufgefunden wurden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen durch HCV.According to the invention, in particular Use of inhibitors of viral replication of BVDV / HCV, particularly preferred the NADL isolate from BVDV, which with one of the Processes described here have been found to produce a Medicines used to prevent and treat infections caused by HCV.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Hemmstoffen der viralen Replikation von BVDV/HCV, insbesondere dem NADL Isolat von BVDV, die mit einem der oben beschriebenen Verfahren aufgefunden wurden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen verursacht durch das West Nile Virus, Infektionen verursacht durch das Frühsommer Meningoenzephalitis Virus (FSME), Infektionen verursacht durch Dengue Viren, Infektionen verursacht durch das Virus der Japanischen Enzephalitis und Infektionen bedingt durch das Gelbfieber Virus.The invention also relates to the use of inhibitors of viral replication of BVDV / HCV, especially the NADL isolate from BVDV, which uses one of the above Processes have been found to manufacture a drug for the prevention and treatment of infections caused by the West Nile Virus, infections caused by early summer Meningoencephalitis Virus (TBE), infections caused by dengue Viruses, infections caused by the Japanese encephalitis virus and infections caused by the yellow fever virus.
Erfindungsgemäß ist ebenfalls ein Verfahren zur Inhibition der Replikation von HCV durch Wirkstoffe, welche durch eines der hier beschriebenen Verfahren aufgefunden werden.According to the invention is also a method for Inhibition of replication of HCV by active substances caused by one of the methods described here can be found.
Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel, welche unter Verwendung der mit den hier beschriebenen Verfahren aufgefundenen Wirkstoffen hergestellt werden.The invention also provides Medicinal products using those described herein Processes found active ingredients are produced.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, welche unter Verwendung der mit den hier beschriebenen Verfahren aufgefundenen Wirkstoffen, vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren pharmakologisch unbedenklichen Hilfs- oder Trägerstoffen hergestellt werden, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.Another subject of the present Invention are pharmaceuticals, which using the with the Active ingredients found here, preferably together with one or more pharmacologically acceptable auxiliary or carriers are produced, and their use for the aforementioned Purposes.
Der Wirkstoff kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann er auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat.The active ingredient can be systemic and / or act locally. For this purpose, it can be applied in a suitable manner such as oral, parenteral, pulmonary, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otic or as an implant.
Für diese Applikationswege kann der Wirkstoff in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.For the active substance can administer these administration routes in suitable administration forms be administered.
Für die orale Applikation eignen sich bekannte, den Wirkstoff schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, wie z.B. Tabletten (nicht überzogene sowie überzogene Tabletten, z.B. mit magensaftresistenten Überzüge versehene Tabletten oder Filmtabletten), Kapseln, Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Lösungen und Aerosole.For oral application are known, the active ingredient quickly and / or modified delivery forms of application, such as tablets (not coated as well as coated Tablets, e.g. tablets coated with enteric coatings or Film-coated tablets), capsules, dragees, granules, pellets, powders, emulsions, Suspensions, solutions and aerosols.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan, oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten und sterilen Pulvern.Parenteral administration can bypassing a resorption step (intravenous, intraarterial, intracardial, intraspinal or intralumbal) or with activation absorption (intramuscular, subcutaneous, intracutaneous, percutaneous, or intraperitoneal). For the parenteral Application are suitable as application forms, among others. injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions, emulsions, Lyophilisates and sterile powders.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen / -lösungen, Sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- und Augen-präparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttel mixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, Milch, Pasten, Streupuder oder Implantate.For the other application routes are e.g. Inhalation dosage forms (e.g. powder inhalers, nebulizers), nose drops / solutions, sprays; Tablets to be applied lingually, sublingually or buccally or capsules, suppositories, ear and eye preparations, vaginal capsules, aqueous Suspensions (lotions, shaking mixtures), lipophilic suspensions, ointments, creams, milk, pastes, powder or implants.
Die Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies geschieht unter Verwendung inerter nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Hilfsstoffe. Hierzu zählen u.a. Trägerstoffe (z.B. mikrokristalline Cellulose), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren (z.B. Natriumdodecylsulfat), Dispergiermittel (z.B. Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Biopolymere (z.B. Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie Eisenoxide) oder Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.The active ingredients can be in a manner known per se in the listed Application forms are transferred. This is done using inert non-toxic, pharmaceutical suitable auxiliaries. Which includes et al excipients (e.g. microcrystalline cellulose), solvents (e.g. liquid polyethylene glycols), Emulsifiers (e.g. sodium dodecyl sulfate), dispersants (e.g. Polyvinylpyrrolidone), synthetic and natural biopolymers (e.g. albumin), Stabilizers (e.g. antioxidants such as ascorbic acid), dyes (e.g. inorganic pigments such as iron oxides) or taste and / or odor corrections.
Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 10 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 0.01 bis 25 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht.In general, it has proven to be beneficial proven in parenteral application amounts from about 0.001 to 10 mg / kg, preferably about 0.01 to 5 mg / kg body weight to achieve more effective Deliver results. In the case of oral application, the amount is about 0.01 to 25 mg / kg, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.Nevertheless, it may be necessary to deviate from the amounts mentioned, depending on body weight, route of administration, individual behavior towards the active ingredient, type of preparation and time or interval at which the application is carried out. In some cases it may be sufficient to make do with less than the aforementioned minimum quantity, while in other cases the above upper limit must be exceeded. In the case of application of larger quantities, it may be advisable to mix these in several single doses throughout the day divide.
Jeweils 1,4 × 103 mit BVDV infizierte MDBK-Zellen werden pro well einer 384-well Mikrotiterplatte in Anwesenheit von 0,5 bis 10 % FCS (bevorzugt 2 %) und 0,5 bis 10 μg/ml Trypsin (bevorzugt 2 μg/ml) eingesät, wobei die wells geeignete Verdünnungen der Testsubstanzen bzw. Referenzsubstanz enthalten.In each case 1.4 × 10 3 MDBK cells infected with BVDV are per well of a 384-well microtiter plate in the presence of 0.5 to 10% FCS (preferably 2%) and 0.5 to 10 μg / ml trypsin (preferably 2 μg / ml) sown, the wells containing suitable dilutions of the test substances or reference substance.
Unter geeigneter Verdünnung im Sinne der Erfindung werden Testsubstanzkonzentrationen zwischen 0,1 bis 50 μM verwendet, bevorzugt werden Testsubstanzkonzentrationen von 1 bis 20 μM verwendet.With a suitable dilution in For the purposes of the invention, test substance concentrations between 0.1 to 50 µM test substance concentrations from 1 to are used 20 μM used.
Die Testplatten werden nachfolgend über 7 Tage bei 37°C unter 5 % CO2 und Sättigungsfeuchte im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird zur Bestimmung der antiviralen Effekte bzw. der Zellverträglichkeit der Testsubstanzen als Detektionsfarbstoff Alarmar Blue (Biosource International) (oder Fluoresceindiazetat (200 ug/ml in PBS) in einer Menge von 1/10 Volumenteil des Well-Inhaltes hinzugegeben. Anschließend wird im Falle von alamar-Blue für weitere 5 – 7 Stunden bei o.g. Bedingungen inkubiert. Dann erfolgt die photometrische Auswertung durch Messung von Absorption bzw. Emission. Im Falle von Fluoresceindiazetat wird die Fluoreszenz-Emission bereits nach 20 – 60 Min. Inkubation gemessen.The test plates are subsequently incubated for 7 days at 37 ° C. under 5% CO 2 and saturated moisture in the incubator. Subsequently, to determine the antiviral effects or the cell tolerance of the test substances as detection dye Alarmar Blue (Biosource International) (or fluorescein diacetate (200 µg / ml in PBS) in an amount of 1/10 volume part of the well content is added incubated by alamar-Blue for a further 5 - 7 hours under the above-mentioned conditions, then the photometric evaluation is carried out by measuring absorption or emission In the case of fluorescein diacetate, the fluorescence emission is measured after just 20-60 min.
Unter den Testbedingungen 2 % FCS sowie 2 μg/ml Trypsin im Kulturmedium wurde für die Zellkontrolle eine optische Dichte von 1,9 Extinktionseinheiten gemessen, während die Viruskontrolle eine optische Dichte von 0,02 Extinktionseinheiten aufwies. Dieses erstaunlich günstige Signal/Rauschverhältnis von etwa 1:100 ist eine optimale Voraussetzung zur Durchführung eines HTS Assays mit BVDV im Sinne der gestellten Aufgabe.Under the test conditions 2% FCS and 2 μg / ml Trypsin in the culture medium was used for the cell control has an optical density of 1.9 extinction units measured while the virus control has an optical density of 0.02 absorbance units had. This amazingly affordable Signal / noise ratio of about 1: 100 is an optimal prerequisite for carrying out a HTS assays with BVDV in the sense of the task.
Demgegenüber findet man bei Verwendung der in dieser Technologie bisher gebräuchlichen hohen FCS-Konzentrationen in der BVDV infizierten Zellkultur (10 Vol % FCS) Extinktionswerte für die Zellkontrolle in Höhe von 1,5 Extinktionseinheiten und in der Viruskontrolle 0,4 Extinktionseinheiten.In contrast, when using the high FCS concentrations previously used in this technology in the BVDV infected cell culture (10 vol% FCS) absorbance values for cell control in height of 1.5 absorbance units and in virus control 0.4 absorbance units.
Dieses geringe Signal/Rauschverhältnis von etwa 1:4 ist nicht ausreichend für die Durchführung eines sensitiven HTS.This low signal / noise ratio of about 1: 4 is not enough for the implementation of a sensitive HTS.
Literaturliterature
- 1) Journal of Virology (1997) 71,11, 8416 – 8428, V. Lohmann et al.1) Journal of Virology (1997) 71, 11, 8416-8428, V. Lohmann et al.
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