DE10306992A1

DE10306992A1 - Method for the quantitative measurement of ligands in the sample of dissolved binding proteins

Info

Publication number: DE10306992A1
Application number: DE10306992A
Authority: DE
Inventors: Christian J. Dr. Strasburger; Martin Dr. Bidlingmaier; Zida Wu
Original assignee: KLINIKUM DER UNI MUENCHEN GROS; Klinikum Der Universitat Muenchen Grosshadern-Innenstadt
Current assignee: KLINIKUM DER UNI MUENCHEN GROS; Klinikum Der Universitat Muenchen Grosshadern-Innenstadt
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2005-08-11
Also published as: WO2004074840A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Ligangen in der Probe gelöster oder suspendierter Bindungsproteine unter Verwendung spezifischer Antikörper, in dem Verfahren verwendbare Antikörper, Arzneimittel, Diagnostika sowie (Diagnostik-)Kits, enthaltend diese Antikörper, die Verwendung dieser Antikörper bei der quantitativen Analyse und in ausgewählten Indikationen sowie Verfahren zu deren Herstellung.The invention relates to a method for the quantitative determination of ligands in the sample of dissolved or suspended binding proteins using specific antibodies, antibodies which can be used in the method, drugs, diagnostic agents and (diagnostic) kits containing these antibodies, the use of these antibodies in the quantitative analysis and in selected indications and methods for their preparation.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Liganden in der Probe gelöster oder suspendierter Bindungsproteine unter Verwendung spezifischer Antikörper, in dem Verfahren verwendbare Antikörper, Arzneimittel, Diagnostika sowie (Diagnostik-)Kits enthaltend diese Antikörper, die Verwendung dieser Antikörper bei der quantitativen Analyse und in ausgewählten Indikationen für therapeutische Zwecke sowie Verfahren zu deren Herstellung.The The invention relates to a method for the quantitative determination of Ligands dissolved in the sample or suspended binding proteins using specific Antibody, antibodies, drugs, diagnostics useful in the method and (diagnostic) kits containing these antibodies, the use of these antibody in quantitative analysis and in selected indications for therapeutic Purposes and methods for their production.

Die quantitative Bestimmung bestimmter chemischer Verbindungen aus einer Probe und insbesondere einer physiologisch in Körperflüssigkeiten – wie z.B. dem Blut – auftretenden Verbindung ist ein wichtiges diagnostisehes Hilfsmittel der Medizin. Viele dieser physiologischen Verbindungen, wie z.B. Hormone und andere Botenstoffe, binden spezifisch an sogenannte Bindungsproteine oder auch Rezeptoren, die vielfach selbst in der Flüssigkeit – wie z.B. dem Blut – gelöst oder suspendiert sind. Damit besteht aber beispielsweise die Gefahr, daß sich vor oder während der Bestimmung ein Komplex aus zu messender Verbindung (Ligand) und Bindungsprotein bildet und somit der Ligand einer Messung entzogen wird oder daß das Bindungsprotein zu Zwecken der Messung zugesetzten markierten Liganden der Messung entzieht. Damit kommt es häufig zu einer deutlichen Interferenz des Bindungsproteins in der quantitativen Messung und damit der Diagnostik. Ein besonders plakatives und wichtiges Beispiel für die Gefahr einer solchen Interferenz des Bindungsproteins ist die quantitative Bestimmung humanem Wachstumshormons.The quantitative determination of certain chemical compounds from a Sample and especially one physiologically in body fluids - e.g. the blood - occurring Compound is an important diagnostic tool in medicine. Many of these physiological compounds, such as e.g. Hormones and other messenger substances bind specifically to so-called binding proteins or also receptors which are often themselves in the fluid - such as e.g. the Blood - dissolved or are suspended. But there is a risk that yourself before or during determination of a complex of compound to be measured (ligand) and binding protein and thus the ligand is removed from a measurement or that Binding protein for the purpose of measuring labeled ligand added removed from the measurement. This often leads to significant interference of the binding protein in the quantitative measurement and thus the Diagnostics. A particularly striking and important example of the danger Such interference of the binding protein is the quantitative Determination of human growth hormone.

Wachstumshormon (human growth hormone, hGH) ist ein Eiweißhormon, das von der Himanhangdrüse sezerniert wird. Neben der Bedeutung, die Wachstumshormon für das Längenwachstum von Kindern und Jugendlichen hat, ist es während des gesamten Lebens für die Regulation einer Vielzahl von Stoffwechselvorgängen essentiell. Bei Kindern und Erwachsenen gibt es Erkrankungen, bei denen die physiologische Regulation der Wachstumshormonsekretion gestört ist. Zu erwähnen sind insbesondere der Wachstumshormonmangel und de Wachstumshormonexzeß. Die Bestimmung der Konzentration von Wachstumshormon in Serumproben ist ein wesentliches diagnostisehes Werkzeug und wird daher in vielen medizinischen Laboratorien durchgeführt.growth hormone (human growth hormone, hGH) is a protein hormone secreted by the hanate gland becomes. In addition to the importance of growth hormone for the longitudinal growth of children and Has teenagers, it is during of the whole life for the regulation of a variety of metabolic processes essential. In children and adults, there are diseases in which the physiological regulation of growth hormone secretion is disturbed. To mention In particular, growth hormone deficiency and growth hormone excess are. The determination The concentration of growth hormone in serum samples is an essential one diagnostic tool and is therefore performed in many medical laboratories.

In der Regel werden für die Analyse der Wachstumshormonkonzentration sogenannte Immunoassays benutzt. Diese beruhen auf dem Prinzip der Interaktion von spezifischen Antikörpern mit einem Analyten. Es werden wahlweise auch kompetitive Assays verwendet (wie der Radioimmunoassay, RIA), bei denen markiertes Wachstumshormon mit dem in der Probe vorhandenen Wachstumshormon um die Bindung an einen Antikörper konkurriert und somit ein zur Konzentration des zu messenden Analyten umgekehrt proportionales Signal entsteht. Am häufigsten jedoch werden inzwischen Sandwich-Immunoassays eingesetzt, bei denen ein immobilisierter spezifischer Antikörper den Analyten bindet („Fangantikörper"), und ein zweiter, gegen ein unterschiedliches Epitop des Analyten gerichteter markierter Antikörper dann den nun immobilisierten Analyten bindet. Hierdurch entsteht ein Signal, das proportional zur Menge des gebundenen Analyten ist. Das bekannteste Beispiel dieser Meßmethode ist der „enryme linked immuno sorbent assay" (ELISA) mit einem kolorimetrischen Endpunkt, da regelmäßig das zur Messung nötige Photometer vorhanden ist. Andere Möglichkeiten der Signalgeneration sind Radioaktivität, Chemilumineszenz oder (zeitaufgelöste) Fluoreszenz.In usually be for the analysis of the growth hormone concentration so-called immunoassays used. These are based on the principle of interaction of specific antibodies with an analyte. There are also optional competitive assays used (as the radioimmunoassay, RIA) in which marked Growth hormone with the growth hormone present in the sample the binding to an antibody competes and thus for the concentration of the analyte to be measured inversely proportional signal arises. Most common, however, are now Sandwich immunoassays are used in which an immobilized specific antibody binds the analyte ("capture antibody"), and a second, labeled against a different epitope of the analyte antibody then binds the now immobilized analyte. This results a signal that is proportional to the amount of bound analyte. The best known example of this measurement method is the "enryme linked immuno sorbent assay "(ELISA) with a colorimetric end point, as regularly the photometer required for the measurement is available. Other options The signal generation is radioactivity, chemiluminescence or (time-resolved) fluorescence.

Allen oben genannten Assaytechniken liegt das Prinzip der hochaffinen, spezifischen Bindung zwischen einem gegen ein bestimmtes Hormon – in diesem Fall Wachstumshormon – gerichteten Antikörper und dem Hormonmolekül in der zu analysierenden Probe zugrunde. Vergleichende Untersuchungen haben nun ergeben, daß bei der Messung von Wachstumshormon einer Probe in verschiedenen Laboratorien mit unterschiedlichen Methoden extrem starke Diskrepanzen für die in dieser Probe ermittelten Konzentrationen auftreten (1, 2, 5). Dies zeigt sich im übrigen auch regelmäßig bei den zentralen Ringversuchen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie.all above-mentioned assay techniques is the principle of high affinity, specific binding between one against a particular hormone - in this Case growth hormone - directed antibody and the hormone molecule in the sample to be analyzed. Comparative studies have now revealed that at the measurement of growth hormone of a sample in different laboratories with different methods extremely strong discrepancies for the in concentrations determined in this sample (1, 2, 5). this shows otherwise also regularly at the central interlaboratory tests of the German Society for Clinical Chemistry.

Zur Diagnose eines Wachstumshormonmangels werden die Ergebnisse verschiedener Stimulationstests herangezogen. Bei diesen Tests wird nach Stimulation der Wachstumshormonsekretion über einen Zeitraum von 1 bis 2 Stunden im Abstand von 15 bis 30 Minuten Blut entnommen und aus den Proben die Wachstumshormonsekretion bestimmt. Steigt die Waehstumshormonkonzentration in zwei unabhängigen Tests nicht über einen arbiträren, aber traditionell – z.B. in der Kinderheilkunde – bei ca. 10 ng/ml definierten „cut-off" -Wert an, gilt die Diagnose „Wachstumshormonmangel" als sehr wahrscheinlich und die Krankenkassen erstatten in der Regel die nachfolgenden Therapiekosten. Diese Kosten einer – potentiell lebenslänglich fortzuführenden – Therapie mit rekombinantem Wachstumshormon sind erheblich.to Diagnosis of growth hormone deficiency will be the results of various Stimulation tests. These tests will after stimulation growth hormone secretion over a period of 1 to 2 hours at intervals of 15 to 30 minutes Taken from the samples and determines the growth hormone secretion. Increases the growth hormone concentration in two independent tests no over an arbitrary, but traditionally - e.g. in paediatrics - at about 10 ng / ml defined "cut-off" value, the applies Diagnosis "growth hormone deficiency" as very likely and the health insurance companies usually reimburse the subsequent treatment costs. These costs one - potentially Life Sentence continuing therapy with recombinant growth hormone are significant.

Durch die extremen Diskrepanzen der Wachstumshormonkonzentration, die bei Verwendung unterschiedlicher Methoden ermittelt wird, wird eine einheitliche, korrekte Diagnosestellung ungewöhnlich erschwert: Das Erreichen des „cut-off" -Wertes in einem Stimulationstest hängt wesentlich von dem Labor ab, in dem die Proben eines bestimmten Patienten gemessen werden bzw. von der dort verwendeten Methode. Dies hat erhebliche ökonomische Auswirkungen, jedoch auch Folgen, die die Patienten direkt betreffen: So können je nach Meßverfahren einzelne Patienten überflüssiger Weise einer Hormonersatztherapie unterzogen werden, während diese anderen – tatsächlich betroffenen Patienten – vorenthalten wird.Due to the extreme discrepancies in growth hormone concentration, which is determined using different methods, a uniform, correct diagnosis is made unusually difficult: The achievement of the "cut-off" value in a stimulation test depends essentially on the laboratory in which the samples of a certain patients or by the method used there. This has considerable economic effects, but also consequences that directly affect the patient: For example, depending on the measurement method, individual patients may be unnecessarily subjected to hormone replacement therapy while these others - in fact affected patients - are withheld.

Zu dieser extremen Diskrepanz der Meßwerte tragen nach bisherigem Wissen verschiedene Faktoren bei, die jedoch alle in spezifischer Weise auf die oben erwähnte Interaktion zwischen Antigen (Wachstumshormon) und Antikörper einwirken: Wachstumshormon, das von der menschlichen Himanhangdrüse produziert wird, ist keine vollkommen homogene Substanz, sondern besteht aus verschiedenen Isoformen. Gerade wegen der hohen Spezifität, insbesondere der monoklonalen Antikörper, für ein genau definierbares Segment (Epitop) auf der Oberfläche des Wachstumshormonmoleküls sind nun Unterschiede in deren Reaktionsvermögen mit den diversen Isoformen des Hormons zu erwarten. Daher werden in den verschiedenen Assays je nach Epitop-Spezifität der verwendeten Antikörper unterschiedliche Anteile dieses Isoformspektrums mitgemessen. Auch aus diesem Grund spielt die Art des verwendeten Kalibrators (Standards) des jeweiligen Assays eine entscheidende Rolle: Die immer noch verwendete „Internationale Referenz-Präparation 80/505" ist eine aus humanen Hypophysen extrahierte Präparation, die ebenfalls aus verschiedenen Isoformen besteht, während die neuere „Intemationale Referenz-Präparation 88/624" rekombinanten Ursprungs ist und in reiner Form aus der 22000 Dalton großen Hauptisoform von Wachstumshormon besteht.To This extreme discrepancy of the measured values is based on the previous one Know several factors, but all in more specific Way to the above Interaction between antigen (growth hormone) and antibodies: Growth hormone that produces from the human brain gland is not a completely homogeneous substance, but consists of different isoforms. Precisely because of the high specificity, in particular the monoclonal antibody, for a exactly definable segment (epitope) on the surface of the Growth hormone molecule are now differences in their reactivity with the various isoforms of the hormone to be expected. Therefore, in the different assays depending on epitope specificity the antibody used mitgemessen different proportions of this isoform spectrum. Also for this reason, the type of calibrator used (standards) of the respective assay: the still used "International Reference preparation 80/505 "is one of human Pituitary extracted preparation, which also consists of different isoforms, while the newer "Intemational Reference Preparation 88/624 "recombinant Origin and is in pure form from the 22,000 dalton major isoform consists of growth hormone.

Der wesentliche Störfaktor für die Messung von Wachstumshormon, auf den sich die hier beschriebene Erfindung bezieht, ist das Vorhandensein eines hochaffnen Wachstumshormon-Bindungsproteins (hGH binding protein, hGHBP) in humanem Serum (2–4). Der Effekt dieses Bindungsproteins auf das Meßergebnis kann je nach verwendetem Assayprinzip (kompetitiver Assay oder Sandwich-Assay) zu falsch hohen oder falsch niedrigen Werten führen. Beim kompetitiven Assay kann einerseits markiertes hGH (als sogenannter „Tracer") durch das Bindungsprotein gebunden und somit dem Assayansatz entzogen werden, was zu falsch hohen Konzentrationsangaben führt. Andererseits kann das Bindungsprotein aber auch sterisch die Interaktion des spezifischen Antikörpers mit den Wachstumshormonmolekülen aus einer Serumprobe behindern und somit ebenfalls zu falsch niedrigen Konzentrationen im kompetitiven Assay führen. Hingegen führt diese sterische Behinderung der Interaktion zwischen Antikörper und Hormon beim Sandwich-Immunoassay in der Flegel zu falsch niedrigen Resultaten, da weniger Hormon oder weniger Detektionsantikörper gebunden wird. Besonders relevant wird der durch diesen Störfaktor entstehende Fehler bei den Meßergebnissen unter bestimmten physiologischen oder pathologischen Bedingungen, die mit einer Veränderung der hGHBP-Konzentration im Blut einhergehen, wie z.B. Schwangerschaften, in deren Verlauf es zu einem Anstieg des hGHBP kommt.Of the significant disruptive factor for the Measurement of growth hormone to which the one described here The invention relates to the presence of a high affinity growth hormone binding protein (hGH binding protein, hGHBP) in human serum (2-4). The effect of this binding protein on the measurement result depending on the assay principle used (competitive assay or sandwich assay) lead to false high or false low values. In the competitive assay On the one hand, labeled hGH (as a so-called "tracer") can be bound by the binding protein and thus be withdrawn from the assay mixture, resulting in incorrectly high concentration data leads. On the other hand, the binding protein can also sterically interact of the specific antibody with the growth hormone molecules a serum sample and thus also to false low Concentrations in the competitive assay. On the other hand, this leads steric hindrance of the interaction between antibodies and Hormone in the sandwich immunoassay in the flail to false low results, because less hormone or less detection antibody is bound. Particularly relevant is the by this disturbing factor resulting errors in the measurement results under certain physiological or pathological conditions, with a change hGHBP concentration in the blood, e.g. pregnancies, during which there is an increase in hGHBP.

In Fachkreisen wird seit Jahren über das Problem der Variabilität der hGH-Messungen und die daraus folgenden Probleme bei der Diagnosestellung diskutiert. Lösungsansätre betreffen einerseits eine Vereinheitlichung des zu verwendenden Kalibrators, andererseits den Versuch, durch die Auswahl von Antikörpern, die hauptsächlich die 22000 Dalton große Hauptisoform von hGH erkennen, wenigstens hinsichtlich der gemessenen hGH-Isoform eine Homogenität der Assays herzustellen. Bislang sind jedoch keine Ansätze zur Lösung des Problems der Interferenz von hGHBP publiziert worden. Bei anderen Hormonen sowie anderen körpereigenen Substanzen werden vor Analyse, beispielsweise in einem Immunoassay, Ex traktionsverfahren angewendet, um die Bindungsproteine zu eliminieren, was jedoch einen erheblichen methodischen Mehraufwand bedeutet und zu erheblichen Meßungenauigkeiten führen kann. Insgesamt gibt es aber im Stand der Technik noch keine befriedigende Lösung der Problematik löslicher Bindungsproteine in zu analysierenden Proben.In Professional circles is over for years the problem of variability hGH measurements and the resulting problems in the diagnosis are discussed. Concern solutions on the one hand a standardization of the calibrator to be used, on the other hand the attempt, by the selection of antibodies, which mainly the 22,000 daltons big Recognize major isoform of hGH, at least in terms of the measured hGH isoform one homogeneity of the assays. So far, however, are no approaches to solution the problem of interference from hGHBP has been published. For others Hormones as well as other body's own Substances are analyzed before analysis, for example in an immunoassay, Ex traction method used to eliminate the binding proteins, which, however, means a considerable additional methodological effort and to considerable measurement inaccuracies can lead. Overall, however, there is still no satisfactory in the prior art solution the problem more soluble Binding proteins in samples to be analyzed.

Es ist daher Aufgabe der im folgenden beschriebenen Erfindung, die Interferenz von in der Probe mitgelöstem oder -suspendiertem Bindungsproteinen in quantitativen Messungen von deren Liganden auf einfache Art auszuschalten. Dieses geschieht durch eine Technik, mit deren Hilfe diese Testsysteme, insbesondere alle derzeit existierenden Assays für Wachstumshormon, unanfälliger für den Störfaktor des in bspw. Serumproben stets vorhandenen Bindungsproteins – wie hGHBP – gemacht werden können.It is therefore an object of the invention described below, the Interference of binding proteins solubilized or -suspended in the sample in quantitative measurements of their ligands in a simple way to turn off. This is done by a technique that helps these test systems, in particular all currently existing growth hormone assays, less susceptible to interference of the binding protein always present in, for example, serum samples, such as hGHBP can be.

Daher ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Liganden eines Bindungsproteins in einer Liganden und Bindungsprotein in gelöster oder suspendierter Form enthaltenden Probe, bei der der zu messenden Probe ein Antikörper A gegen das Bindungsprotein, der gegen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist, zugesetzt wird.Therefore the invention is a method for the quantitative determination a ligand of a binding protein in a ligand and binding protein in dissolved or suspended sample containing the sample to be measured Sample an antibody A against the binding protein that binds to the binding site of the ligand is directed to the binding protein is added.

Dabei zeigte es sich, daß die Bindung des spezisch gegen das Bindungsprotein gerichteten Antikörpers A an das Bindungsprotein exakt dort, wo auch der Ligand bindet, zu einer Verdrängung der Wachstumshormonmoleküle (Ligand) aus ihrer Bindung an hGHBP führt und dabei auch eine erneute Bindung des Liganden verhindert. Diese Verdrängung fällt natürlich umso stärker aus, je größer die Menge zugesetzten Antikörpers A, insbesondere im Verhältnis zum Bindungsprotein, ist, so daß meist ein großer Überschuß an Antikörper günstig ist. Das so "freigesetzte" Wachstumshormon kann nun ohne sterische Hemmung durch das Bindungsprotein quantitativ gemessen werden. Da der „Anti-Bindungsprotein- Antikörper" A selber nicht mit den zur Messung vom Liganden (bspw. hGH) evt. verwendeten „Anti-Liganden-Antikörpern" B interferiert, entfällt auch die Notwendigkeit einer vorgeschalteten Entfernung der Antikörper-A/Bindungsprotein-Komplexe aus der Probe. Vorteilhafterweise kann die Probe, abgesehen vom Zusatz des Antikörpers A und einer evtuellen Vorinkubation, genauso eingesetzt werden, wie für den jeweiligen Assay vom Hersteller beschrieben.It turned out that the binding of the antibody A directed specifically against the binding protein to the binding protein exactly where the ligand binds to a displacement of the growth hormone molecules (ligand) from their bin leads to hGHBP and also prevents re-binding of the ligand. Of course, this displacement is even greater, the greater the amount of added antibody A, in particular in relation to the binding protein, so that usually a large excess of antibody is favorable. The "released" growth hormone can now be quantitatively measured without steric inhibition by the binding protein. Since the "anti-binding protein antibody" A itself does not interfere with the "anti-ligand antibodies" B possibly used for the measurement of the ligand (eg hGH), there is also no need for an upstream removal of the antibody A / binding protein antibodies. Complexes from the sample. Advantageously, the sample, apart from the addition of the antibody A and a possible pre-incubation, be used exactly as described for the respective assay by the manufacturer.

Unter Bindungsprotein im Sinne dieser Erfindung sind alle Proteine zu verstehen, die mit hoher Affinität einen hier zu messenden Liganden binden können. Die hier relevanten Bindungsproteine sind meist löslich bzw. liegen in der Probe als Suspension vor. Beispiele sind bestimmte lösliche Rezeptoren oder beispielsweise im Cytosol oder Blut auftretende Hormonbindungsprotein, wie Wachstumshormonbindungsprotein.Under Binding protein in the context of this invention are all proteins too understand that with high affinity can bind a ligand to be measured here. The binding proteins relevant here are mostly soluble or are present in the sample as a suspension. Examples are specific soluble Receptors or, for example, in the cytosol or blood occurring hormone binding protein, like growth hormone binding protein.

Unter „Ligand" im Sinne dieser Erfindung sind Verbindungen zu verstehen, die mit hoher Affinität an ein Bindungsprotein binden und deren Konzentration in bestimmten Assays gemessen werden kann und beispielsweise für medizinische Zwecke auch gemessen wird. Beispiele sind Botenstoffe, wie Hormone, Transmitter, bspw. Neurotransmitter, extrazelluläre Signalpeptide oder -proteine, Cytokine, Chemokine, Lymphokine etc.Under "ligand" in the sense of this The invention relates to compounds having a high affinity to a Bind binding protein and its concentration in certain assays can be measured and, for example, for medical purposes as well is measured. Examples are messenger substances, such as hormones, transmitters, for example, neurotransmitters, extracellular signal peptides or proteins, Cytokines, chemokines, lymphokines etc.

Unter „Probe" im Sinne dieser Erfindung ist jede Art von zu untersuchender Lösung zu verstehen, insbesondere aber Lösungen medizinisch relevanter Substanzen, wie z.B. Blut, Lymphe, Serum, Urin, Liquor, auch in für die Probenbearbeitung aufbereiteter Form.Under "sample" in the sense of this Invention is to be understood as any kind of solution to be investigated, in particular but solutions medically relevant substances, e.g. Blood, lymph, serum, Urine, cerebrospinal fluid, also in for the sample processing of processed form.

Unter „in gelöster oder suspendierter Form" ist im Sinne dieser Erfindung jede Form von Lösung des Bindungsproteins oder des Liganden im weiteren Sinne im Lösungsmittel zu verstehen. Damit sind auch Situationen umfaßt, in denen beispielsweise das Bindungsprotein am Rand oder jenseits des Ausfallens ist, aber eben doch noch Bestandteil der Lösung ist.Under "in dissolved or suspended form "is in the sense of this invention, any form of solution of the binding protein or of the ligand in a broader sense in the solvent. In order to are also situations in which, for example, the binding protein at the edge or beyond of failure, but it is still part of the solution.

„Antikörper" sind im Sinne dieser Erfindung durch Vertebraten oder künstlich hergestellte Proteine oder evt. andere Strukturen, die mit hoher Affinität an eine bestimmte Oberflächenkonfirmation (Epitop) eines Antigens, also eines anderen Moleküls, binden, vorzugsweise mono- oder polyklonale (Teil)strukturen von Immunglobulinen (bspw. IgG, IgA, IgD, IgE) oder auch polyklonal monospezifische Antikörper. Typischerweise enthalten derartige Antikörper zumindest den variablen Teil von Immunglobulinen, ggf. auch mindestens eine Domäne des konstanten Teils von Immunglobulinen. In diesem Sinne sind bspw. auch F(ab)₂-Fragmente Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung.For the purposes of this invention, "antibodies" are vertebrates or artificially produced proteins or possibly other structures which bind with high affinity to a specific surface confirmation (epitope) of an antigen, ie of another molecule, preferably mono- or polyclonal (part) structures of immunoglobulins (for example IgG, IgA, IgD, IgE) or else polyclonal monospecific antibodies Typically, such antibodies contain at least the variable part of immunoglobulins, optionally also at least one domain of the constant part of immunoglobulins (ab) ₂ fragments Antibodies according to the present invention.

Dabei bedeutet ein Antikörper gegen das Bindungsprotein, der gegen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist, daß der Antikörper als bindendes Epitop spezifisch die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein mit hoher Affinität bindet.there means an antibody against the binding protein that targets the binding site of the ligand is directed on the binding protein that the antibody is specific as a binding epitope the binding site of the ligand on the binding protein with high affinity binds.

Unter „quantitativer Bestimmung" ist generell jede dem Fachmann bekannte Art der Messung der Menge eines gelösten Analyten in einer Probe zu verstehen. Explizit gemeint ist damit z.B. die Quantifizierung über chromatographische Methoden mit einem mitlaufenden Standard und insbesondere die über die hochaffine Wechselwirkung zwischen Antikörper und Ligand (Antigen) erfolgende Quantifizierung durch kompetitive Assays oder Bindungsassays, wie z.B. einen Sandwich-Assay auch im ELISA-Format. Ein besonderer Vorteil dieser Erfindung ist es, daß das vorgestellte Verfahren des Antikörperzusatzes mit praktisch jedem bekannten – insbesondere kommerziell erhältlichen – Testkit bzw. Testsystem zur quantitativen Analyse des jeweiligen Analyten (Liganden) ohne größeren Aufwand kombiniert werden kann.Under "quantitative Determination "is in general, any type of measurement of the amount of a person known to those skilled in the art dissolved To understand analytes in a sample. Explicit is meant with it e.g. the quantification over Chromatographic methods with a tracking standard and especially those about the high-affinity interaction between antibody and ligand (antigen) taking place Quantification by competitive assays or binding assays, e.g. a sandwich assay also in ELISA format. A special advantage This invention is that the presented method of antibody addition with virtually any known - in particular commercially available test kit or test system for the quantitative analysis of the respective analyte (Ligands) without much effort can be combined.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Antikörper A vor oder während, vorzugsweise vor, der quantitativen Bestimmung zugesetzt wird und/oder mit der Probe inkubiert wird.there it is particularly preferred when in the process according to the invention the antibody A before or during, preferably before, the quantitative determination is added and / or is incubated with the sample.

Dabei versteht man unter Inkubation eine Reaktionsbedingung, bei der Reaktionspartner, hier Antikörper A und Bindungsprotein sowie sekundär auch der Ligand, miteinander eine Reaktion eingehen können. Die Inkubation ist meist zeitlich begrenzt, hier beispielsweise 6, 12, 18 oder 24 h. Insbesondere ist hier unter Inkubation die Vorinkubation – beispielsweise über 6, 12, 18 oder 24 h – zu verstehen, die vor Beginn der quantitativen Messung (beispielsweise mit einem kommerziell erhältlichen Testkit) erfolgt.there By incubation is meant a reaction condition in which reactants, here antibodies A and binding protein and secondarily also the ligand, with each other to be able to react. The incubation is usually limited in time, here for example 6, 12, 18 or 24 h. In particular, here under incubation is the Preincubation - for example, via 6, 12, 18 or 24 h - too understand before the start of quantitative measurement (for example with a commercially available Test kit).

Ebenso ist es bevorzugt, wenn die im erfindungsgemäßen Verfahren gemessene Probe Körperflüssigkeit, vorzugsweise humane Körperflüssigkeit, insbesondere Blut bzw. humanes Blut, enthält.As well it is preferred if the sample measured in the method according to the invention Body fluid, preferably human body fluid, especially blood or human blood.

Unter Körperflüssigkeit versteht man jede aus dem Körper eines Vertebraten, insbesondere eines Säugetieres, insbesondere eines Menschen gewonnene Flüssigkeit. Das wäre im Falle des Menschen beispielsweise Blut, Urin oder Lymphe, aber auch cytosolische Präparationen aus menschlichen Zellen.By body fluid one understands each from the body of a Vertebraten, in particular egg a mammal, in particular a human-derived fluid. In the case of humans, for example, this would be blood, urine or lymph, but also cytosolic preparations from human cells.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ligand ein physiologischer Ligand des physiologischen Bindungsproteins.at a further preferred embodiment the method according to the invention the ligand is a physiological ligand of the physiological binding protein.

Die erfindungsgemäße Methode ist auch dann sinnvoll, wenn Ligand und/oder Bindungsprotein von außen (exogen) zugesetzt wurde, z.B. also nach Injektion oder anderweitiger Aufnahme von rekombinantem hGH bei Patienten oder Probanden. Damit besteht die Möglichkeit, ein erfindungsgemäßes Verfahren etwa zur Analyse von Proben bei Verdacht auf Do ping (z.B. im Hochleistungssport) mit hGH oder anderen Hormonen Beispiele für Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung einzusetzen, um nach erfindungsgemäßer Quantifizierung der bspw. hGH-Konzentration in der Probe (ohne verfälschende Einflüsse des/der jeweiligen Bindungsproteins/e) Dopingverdacht ausschließen oder begründen zu können. Auch bei pharmakokinetischen Analysen stören die Bindungsproteine, so daß auch diesbezüglich das künstlich zugeführte hGH gebunden wird, und damit Resultate zur bspw. hGH-Konzentration durch die Anwesenheit von Bindungsprotein verfälscht wird. Eine erfindungsgemäße Vorgehensweise kann auch in diesen Fällen Abhilfe schaffen.The inventive method is also useful if ligand and / or binding protein of Outside (exogenously), e.g. after injection or otherwise Inclusion of recombinant hGH in patients or subjects. In order to it is possible, a method according to the invention eg for the analysis of samples suspected of doping (for example in high performance sport) with hGH or other hormones Examples of ligands within the meaning of the present Use invention to according to the invention quantification of eg. hGH concentration in the sample (without distorting influences of the exclude doping suspicion or justify can. Also in pharmacokinetic analyzes interfere with the binding proteins, so that too in this regard that artificially supplied hGH is bound, and thus results for example. HGH concentration by the presence of binding protein is falsified. An inventive approach can also in these cases Remedy.

Unter einem physiologischen Liganden ist ein Ligand im oben angegebenen Sinne zu verstehen, der ohne von außen zugesetzt zu sein im Körper eines Vertebraten insbesondere in einer Körperflüssigkeit auftritt. Entsprechendes gilt für das physiologische Bindungsprotein, wobei dieses auch der natürliche unter physiologischen Bedingungen auftretende Bindungsprotein des physiologischen Liganden ist.Under a physiological ligand is a ligand in the above To understand the meaning of the senses, without being added from the outside in the body of one Vertebrates occurs especially in a body fluid. The same applies to the physiological binding protein, which is also the natural sub physiological conditions occurring binding protein of the physiological Ligands.

Werter ist es bevorzugt, wenn das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Bindungsprotein löslich, vorzugsweise ein löslicher Rezeptor oder ein Hormonbindungsprotein, insbesondere ein Hormonbindungsprotein, ist.cheaper it is preferred if the binding protein used in the method according to the invention soluble, preferably a soluble one Receptor or a hormone binding protein, in particular a hormone binding protein, is.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ligand eine peptidische Verbindung und/oder ein Hormon, vorzugsweise ein peptidisches Hormon, insbesondere ein Wachstumshormon.at a preferred embodiment the method according to the invention the ligand is a peptidic compound and / or a hormone, preferably a peptidic hormone, in particular a growth hormone.

Dabei versteht man unter peptidisch jede Verbindung, deren Bestandteile überwiegend über eine peptidische Bindung R1-NH-C(O)-R2 miteinander verknüpft sind.there By peptidyl is meant any compound whose constituents are predominantly of one peptide bond R1-NH-C (O) -R2 are linked together.

Unter Hormon versteht man einen chemischen Botenstoff, der in Abstand zu seinem Synthese- und Freisetzungsort wirkt. Dabei werden Hormone vorzugsweise von endokrinen Drüsen, bspw. Hypophyse, Keimdrüsen oder Epiphyse, hergestellt. Beispiele sind Wachstumshormon oder luteinisierendes Hormon LTH, Insulin, Melatonin, Glucagon, Gastrin, Angiotensin, Substanz P, Interleukine, Vasopressin, Endorphine, Enkephaline, Relaxin oder der atrionatriuretische Faktor. Hormonbindungsproteine sind entsprechend Bindungsproteine (s.o.), die affin Hormone binden.Under Hormone is a chemical messenger that is at a distance to its place of synthesis and release. This will be hormones preferably of endocrine glands, eg pituitary, gonads or epiphysis, prepared. Examples are growth hormone or luteinizing hormone LTH, insulin, melatonin, glucagon, gastrin, Angiotensin, substance P, interleukins, vasopressin, endorphins, Enkephaline, relaxin or the atrial -atriuretic factor. Hormone binding proteins are accordingly binding proteins (see above), which bind affin hormones.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ligand humanes Wachstumshormon (human Growth Hormon/hGH) und das Bindungsprotein humanes Wachstumshormon-Bindungsprotein (human Growth hormon binding protein/hGHBP) und der Antikörper A ist gegen die Bindungsstelle des hGH auf dem hGHBP gerichtet.In a particularly preferred embodiment the method according to the invention is the ligand human growth hormone (hGH) and the binding protein human growth hormone binding protein (human growth hormone binding protein / hGHBP) and antibody A is against the binding site of the hGH on the hGHBP.

Besonders bevorzugt ist es auch, wenn der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Antikörper A ein monoklonaler Antikörper bzw. ein single-chain Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn der verwendete Antikörper A ZMC1 ist. ZMC1 ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet ist und wurde im Rahmen der Erfindung zur Lösung der Aufgabe optimiert. Dieser wurde mit Eingang vom 21. Januar 2003 anmelderseitig unter der Nummer DSM ACC2582 (vom Hinterleger zugeteiltes Bezugszeichen: ZMC1) nach Maßgabe des Budapester Vertrags bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in Braunschweig (Deutschland, Maschenroder Weg 1b, 38124 Braunschweig) in lebensfähiger Form hinterlegt.Especially it is also preferred if the antibody A used in the method according to the invention is a monoclonal antibody or a single-chain antibody, preferably a monoclonal antibody. It is special preferred when the antibody A used is ZMC1. ZMC1 is a monoclonal antibody, against the binding site of human growth hormone (hGH) human growth hormone binding protein (hGHBP) and was optimized in the context of the invention to solve the problem. This was with receipt of January 21, 2003 applicant on DSM ACC2582 (Reference assigned by the depositor: ZMC1) as specified the Budapest Treaty at the DSMZ (German Collection of Microorganisms and cell cultures GmbH) in Braunschweig (Germany, Maschenroder Weg 1b, 38124 Braunschweig) in a viable form.

Dabei versteht man unter monoklonal insbesondere das Produkt eines künstlichen Konstrukts, in welchem eine Antikörper-produzierende Zelle (B-Zelle) mit einer immortalisierten Krebszelle fusioniert wird (Hybridom), was zu einer Hybridomzelle führt. Daraus sind spezifische Antikörper zu gewinnen, die alle ausschließlich auf ein Epitop gerichtet sind.there Monoclonal means, in particular, the product of an artificial one Construct in which an antibody-producing cell (B-cell) fused with an immortalized cancer cell (hybridoma), which leads to a hybridoma cell. from that are specific antibodies to win, all exclusively directed to an epitope.

Werter ist es bevorzugt, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die quantitative Bestimmung des Liganden unter Ausnutzung der Bindung des Liganden als Antigen an einen, vorzugsweise monoklonalen, Antikörper B erfolgt. Dabei ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die quantitative Bestimmung über einen kompetitiven Bindungstest, vorzugsweise einen „radio-immuno assay" (RIA), erfolgt. Genauso günstig ist es auch, wenn die quantitative Bestimmung durch Messung eines in Abhängigkeit von der Konzentration des zu messenden Liganden ansteigenden Meßparameters erfolgt, vorzugsweise durch einen enzyme-linked immuno sorbent Assay (ELISA) und/oder durch einen entsprechenden Sandwich-Assay.Werter it is preferred if in the method according to the invention, the quantitative determination of the ligand taking advantage of the binding of the ligand as an antigen to a, preferably monoclonal, antibody B takes place. In one embodiment, it is advantageous if the quantitative determination is carried out by means of a competitive binding test, preferably a radioimmunoassay (RIA) It is equally favorable if the quantitative determination is carried out by measuring a function of the concentration to be measured Ligands increasing measurement parameter is carried out, preferably by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and / or by a corresponding sandwich assay.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor der quantitativen Bestimmung keine Abtrennung des Bindungsproteins aus der zu messenden Probe durchgeführt. Darunter versteht man insbesondere, daß es bei der vorliegenden Erfindung unnötig ist, das Bindungsprotein vor der quantitativen Analyse der Probe aus dieser zu extrahieren, wie dies im Stand der Technik bei anderen Hormonen durchgeführt werden muß. Dabei ist praktisch jede Form von Extraktion denkbar, bei der der zu messende Ligand – wie beispielsweise das Hormon – in der Probe verbleibt, während das Bindungsprotein abgetrennt wird, z.B. durch Fällung und/oder Filtration mit bestimmten Molekülgewichtsausschlußgrenzen, chromatographische Methoden, wie z.B. Affinitätschromatographie oder HPLC, Dialyse bei bestimmten Ligandengrößen etc. Aber genau darauf kann vorzugsweise bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens verzichtet werden, da durch die Wahl des Antikörpers A weder dieser noch der Komplex aus Antikörper A und Bindungsprotein an den zu messenden Liganden bindet und damit die Mes sung nicht mehr behindert oder verfälscht wird, auch wenn das komplexierte Bindungsprotein in der Probe verbleibt. Daran ändert auch der Einsatz hochaffiner Antikörper B zur quantitativen Messung nichts, da diese an den zu messenden Liganden und nicht den Antikörper A, das Bindungsprotein oder den Komplex aus beiden binden.In a further preferred embodiment the method according to the invention will not separate the binding protein prior to quantification performed from the sample to be measured. It is understood as in particular, that it unnecessary in the present invention, the binding protein before extracting the sample from this quantitative analysis, as is done in the prior art with other hormones got to. there Practically every form of extraction is conceivable in which the one to be measured Ligand - like for example, the hormone - in the sample remains while the binding protein is separated, e.g. by precipitation and / or Filtration with certain molecular weight exclusion limits, chromatographic methods, e.g. Affinity chromatography or HPLC, Dialysis at certain ligand sizes, etc. But exactly may preferably when using the method according to the invention be omitted, since by the choice of the antibody A neither this nor the Complex of antibodies A and binding protein binds to the ligand to be measured and thus the measurement is no longer impeded or falsified, even if the complexed Binding protein remains in the sample. This is also changed by the use of high-affinity antibody B for quantitative measurement nothing, since these are to be measured Ligands and not the antibody A, the binding protein or the complex of both bind.

Dieser Vorteil tritt insbesondere bei einem besonders günstigen und bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren auf, bei dem der Antikörper A so zugegeben wird, daß der Antikörper A in der Probe nach Zugabe in einer höheren Konzentration als das Bindungsprotein vorliegt, vorzugsweise in einer mindestens um 50%, insbesondere mindestens um 100%, vorzugsweise mindestens um 200%, insbesondere mindestens um 400% höheren Konzentration.This Advantage occurs in particular in a particularly favorable and preferred method according to the invention on, where the antibody A is added so that the antibody A in the sample after addition at a higher concentration than the binding protein is present, preferably in an at least 50%, in particular at least 100%, preferably at least 200%, in particular at least 400% higher Concentration.

Gerade diese Zugabe des Antikörpers A im Überschuß zum Bindungsprotein ist besonders günstig, da bei ausreichendem Überschuß des Antikörpers A sowohl alle Liganden aus dem Bindungsprotein vollständig verdrängt und somit meßbar werden, als auch das Bindungsprotein quantitativ komplexiert wird und damit bei der Bestimmung nicht mehr interferiert.Just this addition of the antibody A in excess of the binding protein is particularly cheap because with sufficient excess of the antibody A Both all ligands are completely displaced from the binding protein and thus measurable as well as the binding protein is quantitatively complexed and thus no longer interfering with the determination.

Die genaue, richtige und ausreichende Menge an spezifischem Antikörper A, die der Probe zur möglichst interferenzfreien quantitativen Messung des Liganden mindestens und evt. höchstens zugesetzt werden muß bzw. kann, kann vom Fachmann in wenigen einfachen Vorversuchen festgelegt werden. Die optimale Zugabe hängt natürlich von der Menge an Bindungsprotein in der Probe und evt. dem verwendeten quantitativen Testsystem ebenso ab wie möglicherweise von der Menge an zu messendem Liganden.The accurate, correct and sufficient amount of specific antibody A, the sample as possible interference-free quantitative measurement of the ligand at least and possibly at most must be added or can be determined by the expert in a few simple preliminary experiments become. The optimal addition depends Naturally of the amount of binding protein in the sample and possibly the one used quantitative test system as well as possibly from the quantity at the ligand to be measured.

Die besonders bevorzugte Form des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von hGH unter Ausnutzung der affinen Bindung von hGH als Antigen an einen monoklonalen Antikör per B in einer humanes Blut enthaltenden Probe, in der hGH und hGHBP in gelöster oder suspendierter Form enthalten sind, bei der der zu messenden Probe der gegen die Bindungsstelle des hGH auf dem hGHBP gerichtete Antikörper A, vorzugsweise der hinterlegte monoklonale Antikörper ZMC 1, in deutlichem Überschuß gegenüber der Menge an hGHBP vor oder während, vorzugsweise vor, der quantitativen Bestimmung des hGH mittel Antikörper B zugesetzt wird und inkubiert wird.The A particularly preferred form of the process according to the invention is a process for quantitative determination of hGH using the affine Binding of hGH as an antigen to a monoclonal antibody by B in a sample containing human blood in which hGH and hGHBP are dissolved in or suspended form in which the sample to be measured the antibody A directed against the hGH binding site on the hGHBP, preferably the deposited monoclonal antibody ZMC 1, in marked excess over the Amount of hGHBP before or during, preferably before, the quantitative determination of hGH medium antibody B added is and is incubated.

Durch die Erfndung wird die Interferenz des Wachstumshormon-Bindungsproteins dadurch verhindert, daß ein spezifischer, gezielt gegen das Wachstumshormon-Bindungsprotein hergestellter und durch spezifische Experimente charakterisierter, vorzugsweise monoklonaler Antikörper, in hohem Überschuß zu der zu messenden Probe zugesetzt wird. Dieser monoklonale Antikörper (ZMC 1) wurde aufgrund seiner besonders bevorzugten Eigenschaft ausgewählt, daß er auf dem hGHBP-Molekül exakt dort bindet, wo das Wachstumshormonmolekül ebenfalls bindet. Hierdurch kommt es – wenn man den Antikörper im Überschuß zugibt – zu einer Verdrängung der Wachstumshormonmoleküle aus ihrer Bindung an hGHBP. Das so "freigesetzte" Wachstumshormon kann nun ohne sterische Hemmung durch das Bindungsprotein in jedem Immunoassay fur Wachstumshormon gemessen werden. Da der „Anti-Bindungsprotein-Antikörper" selber nicht mit den zur Messung von hGH verwendeten „Ant-Wachstumshormon-Antikörpern" interferiert, entfällt auch die Notwendigkeit einer vorgeschalteten Entfernung der Antikörper hGHBP-Komplexe aus der Probe. Praktisch wird der spezielle anti-hGHBP Antikörper ZMC 1 mit der hGH-verdrängenden Eigenschaft der Probe vor der Analyse zugesetzt und die Probe nach Vorinkubation, wie für den jeweiligen Assay vom Hersteller beschrieben, eingesetzt.By the finding is the interference of the growth hormone binding protein thereby preventing a more specifically, targeted against the growth hormone binding protein prepared and characterized by specific experiments, preferably monoclonal antibody, in high excess to the is added to be measured sample. This monoclonal antibody (ZMC 1) has been selected for its particularly preferred property the hGHBP molecule exactly there binds where the growth hormone molecule also binds. hereby it comes - if one the antibody in excess admits - to one Crowding out Growth hormone molecules from their binding to hGHBP. The "released" growth hormone can now without steric Inhibition by the binding protein in each immunoassay for growth hormone be measured. Since the "anti-binding protein antibody" itself not with interferes with the "anti-growth hormone antibodies" used to measure hGH, also disappears the need for upstream removal of antibody hGHBP complexes from the sample. Practical is the special anti-hGHBP antibody ZMC 1 with the hGH-displacing Property of the sample added before the analysis and the sample after Preincubation, as for the respective assay described by the manufacturer used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper A gegen ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden, wobei der Antikörper A ge gen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist.One Another object of the invention is an antibody A against in body fluids dissolved or suspended physiological binding protein of a physiological one Ligands, wherein the antibody A ge gene the binding site of the ligand on the binding protein is directed.

Besonders bevorzugt ist es, wenn der erfindungsgemäße Antikörper A ein monoklonaler Antikörper und/oder ein single-chain Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist.Especially it is preferred if the antibody A according to the invention is a monoclonal antibody and / or a single-chain antibody, preferably a monoclonal antibody.

Der Begriff "Antikörper" umfaßt im vorliegenden Sinne allerdings sowohl polyklonale, insbesondere polyklonale monospezifische Antikörper (d.h. Antikörper mit verschiedenen variablen Regionen, die jedoch alle ein spezifisches Epitop erkennen), als auch monoklonale, chimärische Antikörper, anti-idiotypische Antikörper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" (bspw. Fluoreszenzmarker, Goldmarker, angekoppelte Enzyme) markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.Of the The term "antibody" as used herein However, both polyclonal, especially polyclonal monospecific antibody (i.e., antibodies with different variable regions, all of which are specific Recognize epitope), as well as monoclonal, chimeric antibodies, anti-idiotypic antibody (directed against antibodies of the invention), which all in bound or soluble Form and if necessary by "label" (eg fluorescence marker, Gold marker, coupled enzymes) may be marked, as well as fragments of aforementioned antibody. In addition to the fragments of antibodies according to the invention in isolation, antibodies of the invention can also in recombinant form as fusion proteins with other (protein) components occur. Fragments as such or fragments of antibodies of the invention as Components of fusion proteins are typically used by the Methods of enzymatic cleavage, protein synthesis or those skilled in the art common Recombination methods produced. As antibodies are according to the present Invention thus polyclonal, monoclonal, human or humanized or recombinant antibodies or fragments thereof, single chain antibodies or even synthetic ones antibody designated.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Anti körpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche oder gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Die verschiedenen Antikörpervarianten mit Monospezifität können den nachfolgend beschriebenen Immunglobulinklassen angehören, es kann sich also um Mischungen von verschiedenen Haupt- oder Subklas- sen handeln, bevorzugt handelt es sich um eine homogene Mischung von IgG-Antikörpern. Diese Homogenität kann durch einen zusätzliche Reinigungsschritt (Immunopräzipitation, Chromatographie, bspw. über gegen IgG gerichtete Antikörper), erreicht werden.at the polyclonal antibodies are heterogeneous mixtures of antibody molecules, the from sera of animals immunized with an antigen have been. A monoclonal antibody contains a substantially homogeneous Population of antibodies, which are specifically directed against antigens, wherein the antibodies in the have substantially the same or the same epitope binding sites. The different antibody variants with monospecificity can belong to the immunoglobulin classes described below, it can therefore be mixtures of different main or subclass act sen, preferably it is a homogeneous mixture of IgG antibodies. This homogeneity can through an additional Purification step (immunoprecipitation, Chromatography, for example. About antibodies directed against IgG), be achieved.

Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US-Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.monoclonal antibody can obtained by the methods known in the art (eg Köhler and Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); U.S. Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow and Lane "Antibodies": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (Eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)). The description contained in the aforementioned references becomes as part of the present invention in the disclosure of included in the present invention.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben, herstellen.Also Genetically engineered antibodies according to the invention can be detected Process, as described in the aforementioned publications produce.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.Antibodies of the invention may be one of belong to the following immunoglobulin classes: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD and possibly a subclass of the aforementioned classes, such as the subclasses of the IgG or mixtures thereof. Preferred are IgG and its subclasses such as IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 or IgGM. Particularly preferred are the IgG subtypes IgG1 / k or IgG2b / k. A hybridoma cell clone, the monoclonal invention antibody can be cultured in vitro or in vivo. The production of big ones Titers of monoclonal antibodies is preferably in vivo or in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen): Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z.B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sei. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion et al., EP A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Har-low und Lane, Antikörper: A Laboratory Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.at the chimeric antibodies of the invention they are molecules, which contain different components, these being different Deduce animal species (eg antibodies, which is a variable region derived from a mouse monoclonal antibody is, and have a constant region of a human immunoglobulin): chimeric antibody are preferably used, on the one hand, the immunogenicity in the Application and on the other hand the yields in production to increase, e.g. murine monoclonal antibodies give higher yields from hybridoma cell lines, to lead but also to a higher one immunogenicity in humans, so that human / murine chimerical antibody preferably used. Chimeric antibodies and Methods for their preparation are known from the prior art (Cabilly et al., Proc. Natl. See, USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al. EP-A-171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) and Har-low and Lane, antibodies: A Laboratory Manual, as cited above. These quotations are called belonging to the revelation included in the present invention.

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein antiidiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z.B. eines Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper), erkennen (U.S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. antianti-idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti-idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren, identifiziert werden.An anti-idiotypic antibody of the invention is an antibody which is a determinant, which is generally associated with the antigen binding site of an antibody of the invention recognizes. An anti-idiotypic antibody can be prepared by immunizing an animal of the same species and the same genetic type (eg, a mouse strain) as a starting point for a monoclonal antibody to which an anti-idiotypic antibody of the present invention is directed. The immunized animal will recognize the idiotypic determinants of the immunizing antibody by the production of an antibody directed against the idiotypic determinants (namely, an anti-idiotypic antibody of the invention) (US 4,699,880). An anti-idiotypic antibody of the invention can also be used as an immunogen to elicit an immune response in another animal and to produce a so-called anti-idiotypic antibody there. The anti-anti-idiotypic antibody may, but need not, be identical in its epitope construction to the original monoclonal antibody which elicited the anti-idiotypic response. In this way, by using antibodies directed against idiotypic determinants of a monoclonal antibody, other clones expressing antibodies of identical specificity can be identified.

Monoklonale Antikörper, die gegen ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti-idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocyanin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigenschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden (s. bevorzugte Beispiele unten). Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.monoclonal Antibody, the against one in body fluids dissolved or suspended physiological binding protein of a physiological ligand are directed be used to detect the binding of anti-idiotypic antibodies in appropriate Animals, such as B. the BALB / c mouse to induce. Cells from the Spleen of such an immunized mouse can be used to produce anti-idiotypic Hybridoma cell lines the anti-idiotypic monoclonal antibodies secrete, produce. Furthermore you can anti-idiotypic monoclonal antibodies are also coupled to a carrier (KLH, "keyhole limpet hemocyanin ") and then used to immunize more BALB / c mice. The sera of these mice then contain anti-anti-idiotypic antibodies that have the binding properties the original one have monoclonal antibodies and specific to a dissolved in body fluids or suspended physiological binding protein of a physiological Ligands (see preferred examples below). The anti-idiotypic monoclonal antibody in this way have their own idiotypic epitopes or "idiotopes" that are structural are similar to the epitope to be examined.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigenkomplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab und F(ab')₂ Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei einem erfindungsgemäßen Verfahren i.S. der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytisehe Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.The term "antibody" is intended to include intact molecules as well as fragments thereof. Fragments which may be mentioned are all truncated or altered antibody fragments having one or two antigen-complementary binding sites, such as antibody parts having a binding site corresponding to the antibody of light and heavy chain, such as Fv, Fab or F (ab ') ₂ fragments or single-stranded fragments. Preference is given to shortened double-stranded fragments such as Fv, Fab or F (ab ') ₂ . Fab and F (ab ') ₂ fragments lack an Fc fragment, such as those present in an intact antibody, so that they can be transported faster in the circulation and have relatively less non-specific tissue binding than intact antibodies. It is emphasized here that Fab and F (ab ') ₂ fragments of antibodies according to the invention can be used in a method according to the invention of the present invention. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage by enzymes such. Papain (for the production of Fab fragments) or pepsin (for the production of F (ab ') ₂ , fragments), or obtained by chemical oxidation or by genetic manipulation of the antibody genes.

Weiterhin kann ein erfindungsgemäßer Antikörper A auch weitere kovalent (oder nicht kovalent) angekoppelte Moleküle oder Gruppen aufweisen, bspw. eine Fluoreszenzmarkierung oder einen Label, bspw. einen Goldlabel, oder spezifische Epitope, die von Drittmolekülen erkannt werden können. Weiterhin kann ein erfindungsgemäßer Antikörper A auch bispezifisch sein, also mit seinen beiden Paratope unterschiedliche Epitope erkennen, vorzugsweise zwei verschiedene Epitope des gleichen Proteins oder Peptids (s.o.), ggf. können aber auch die beiden Paratope ihrer Struktur nach unterschiedlich sein, jedoch dasselbe Epitop oder zumindest überlappende Bereiche binden.Farther An antibody A according to the invention may also be other covalently (or non-covalently) coupled molecules or Have groups, for example a fluorescent label or a label, eg. a gold label, or specific epitopes, recognized by third-party molecules can be. Furthermore, an antibody A according to the invention can also be bispecific be, so with its two paratopes recognize different epitopes, preferably two different epitopes of the same protein or Peptids (s.o.), if necessary but also the two paratopes differ in their structure but bind the same epitope or at least overlapping regions.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Mischungen von erfindungsgemäßen Antikörpern im oben genannten Sinne, bspw. Mischungen monoklonaler Antikörper oder Mischungen von monoklonalen Antikörpern mit Antikörperfragmenten, Mischungen anti-idiotypischer Antikörper etc.object The present invention also mixtures of antibodies according to the invention in above-mentioned meaning, for example. Mixtures of monoclonal antibodies or Mixtures of monoclonal antibodies with antibody fragments, mixtures anti-idiotypic antibody Etc.

Es ist ebenfalls bevorzugt, wenn der o.g. Ligand, an dessen Bindungsstelle der erfindungsgemäße Antikörper A bindet, ein Peptid und/oder Hormon und/oder vorzugsweise humanem Ursprungs ist, ggf. auch gegen Fragmente nativer Poly- oder Oligopeptide gerichtet ist.It is also preferred if the o.g. Ligand, at its binding site the antibody A according to the invention binds, is a peptide and / or hormone and / or preferably of human origin, optionally also directed against fragments of native poly- or oligopeptides is.

In einer bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Antikörpers A ist der Antikörper A gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet.In a preferred form of the antibody A of the invention is the antibody A against the Human growth hormone (hGH) binding site on the human Growth hormone binding protein (hGHBP) directed.

Besonders bevorzugt ist es, wenn der erfindungsgemäße Antikörper A der Antikörper ZMC1 ist, bspw. der bei der DSMZ hinterlegte Antikörper DSM ACC2582.It is particularly preferred if the antibody A according to the invention is the antibody ZMC1, for example the antibody DSM deposited with the DSMZ ACC2582.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemäßen Antikörper A sowie gegebenfalls weitere Wirkstoffe sowie Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.One Another object of the invention is a medicament containing an antibody A of the invention as well as optionally further active ingredients and additives and / or auxiliaries.

Dabei ist dieses Arzneimittel besonders geeignet, zur Behandlung eines Mangelzustandes eines der oben bereits genannten Liganden zu dienen, da durch den Antikörper A der Ligand freigesetzt werden kann oder seine Bindung durch Bindungsprotein verhindert werden kann, so daß beispielsweise der Plasmaspiegel an freiem Liganden ansteigt, bspw. im Falle einer erwnschten Erhöhung des Plasmatiters von hGH.there This medicine is particularly suitable for the treatment of a Defective state of serving one of the ligands already mentioned above, since through the antibody A the ligand can be released or its binding prevented by binding protein can be, so that, for example the plasma level of free ligand increases, for example in the case of a wanted increase of the hGH plasma titer.

Das hGH-bindende Bindungsprotein (hGHBP) entspricht einem extrazellulären Fragment des hGH-Rezeptors. Erfindungsgemäß gegen hGHBP bindende Antikörper, die gegen dessen Bindungsstelle für hGH gerichtet sind, können also auch an den membranständigen hGH-Rezeptor binden und zwar entsprechend in einer solchen Weise, daß der hGH-Rezeptor für die Anlagerung von hGH blockiert ist. Damit können erfindungsgemäße Antikörper A grundsätzlich als Wachstumshormon-Rezeptor Antagonisten therapeutisch eingesetzt werden. Damit kann ein erfindungsgemäßer Antikörper zur Herstellung eines Arzneimittels dienen, das die physiologische Wirkung des humanen Wachstumshormons (hGH) inhibiert. Daher kann ein Arzneimittel, enthaltend einen oder mehr erfindungsgemäße Antikörper A (und ggf. wertere Hilfs- oder Zusatzstoffe), bei all jenen Erkrankungen zum therapeutischen Einsatz gelangen, bei denen die Wirkung von hGH in unphysiologischer, bspw. pathologischer Weise, gesteigert ist. Damit ergibt sich erfindungsgemäß auch die Verwendung entsprechender erfindungsgemäßer Antikörper A zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von all jenen Störungen, Erkrankungen oder Pathophysiologien, für die hGH-Exzeß ätiologisch ist. Bspw. kann ein derartiges Arzneimittel, enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper A, oder ein erfindungsgemäßer Antikörper A zur Behandlung der Akromegalie eingesetzt werden.The hGH-binding binding protein (hGHBP) corresponds to an extracellular fragment of the hGH receptor. According to the invention hGHBP binding Antibody, which are directed against its binding site for hGH, so can also at the membranous bind hGH receptor appropriately in such a way that the hGH receptor for the attachment of hGH is blocked. Thus, antibodies according to the invention can in principle be used as Growth hormone receptor antagonists can be used therapeutically. Thus, an antibody of the invention for Produce a drug that has the physiological effect of human growth hormone (hGH). Therefore, a drug, containing one or more antibodies A according to the invention (and optionally auxiliary auxiliaries) or additives), for all those diseases to the therapeutic In which the effect of hGH in non-physiological, eg pathological way, is increased. This results according to the invention and the Use of corresponding inventive antibody A for the treatment (or for the manufacture of a medicament for the treatment) of all those disorders, Diseases or pathophysiologies, etiological for the hGH-excess is. For example. may be such a medicament containing at least an antibody A according to the invention, or an inventive antibody A for Treatment of acromegaly can be used.

Durch Gabe erfindungsgemäßer Antikörper A oder entsprechender erfindungsgemäßer Arzneimittel können auf diese Art und Weise die Wirkung von pathophysiologisch erhöhten extrazellulären Wachstumshormon-Konzentrationen blockiert werden, ohne dadurch die entsprechenden Serumkonzentrationen zu erniedrigen. Damit können mit einem erfindungsgemäßen Antikörper bspw. die Symptome von Hypophysenadenomen, die für eine gesteigerte Sekretion von Wachstumshormonen verantwortlich sind, behandelt werden.By Administration of inventive antibodies A or corresponding medicaments according to the invention can blocked in this way the effect of pathophysiologically increased extracellular growth hormone concentrations without thereby increasing the corresponding serum concentrations humiliate. With that you can with an antibody according to the invention, for example. the symptoms of pituitary adenomas responsible for increased secretion are responsible for growth hormones.

Gegebenenfalls kann eine Therapie betroffener Patienten mit Hypophysenadenom in Kombination mit solchen Arzneimitteln oder Wirkstoffen durchgeführt werden, die die Sekretion von hGH verringern. Hierbei kann es sich bspw. um eine Behandlung mit Somatostatin-Analoga (bspw. Octreotid) und/oder Dopamin-Agonisten (bspw. Bromocriptin, Cabergolin) handeln. Alternativ können therapeutisch auch konventielle Verfahren, wie etwa neurochirurgische Intervention oder Bestrahlung, im Zusammenhang mit der Gabe von erfindungsgemäßen Arzneimitteln oer Antikörpern eingesetzt werden. Daneben sind auch weitere Antitumor-Substanzen (Chemotherapeutika) in einer derartigen Therapie einsetzbar.Possibly may be a therapy of affected patients with pituitary adenoma in Combination with such medicines or active substances, which reduce the secretion of hGH. This may be, for example. for treatment with somatostatin analogues (eg octreotide) and / or Dopamine agonists (eg bromocriptine, cabergoline) act. alternative can therapeutically also conventional methods, such as neurosurgical Intervention or radiation associated with the administration of Medicaments according to the invention oer antibodies be used. There are also other anti-tumor substances (Chemotherapeutic agents) can be used in such a therapy.

Schließlich kann also ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, enthaltend erfindungsgemäße Antikörper A auch weitere Substanzen, insbesondere Somatostatin-Analoga, Dopamin-Antagonisten und/oder antineoplastische Substanzen, enthalten oder aber separiert bspw. therapeutisch in einem Kit kombiniert, eingesetzt werden.Finally, can that is, a pharmaceutical composition according to the invention, containing antibody A according to the invention also other substances, in particular somatostatin analogues, dopamine antagonists and / or Antineoplastic substances contained or separated eg. used therapeutically in a kit.

Darüber hinaus ist auch eine therapeutische Kombination erfindungsgemäßer Antikörper mit Pegvisomant (Deutsches Ärzteblatt, Jahrgang 98, Heft 9, 2001, A 532) denkbar, ebenso wie ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, enthaltend erfindungsgemäßen Antikörper A und Pegvisomant und ggf. weitere Wirkstoffe (bspw. einen der oben genannten Wirkstoffe). Im Falle einer kombinierten Therapie, in einem Arzneimittel (enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper A und Pegvisomant), könnte die langfristige Wirkung erfindungsgemäßer Antikörper A aufgrund deren längerer Halbwertszeit mit der kurzen Halbwertszeit des Rezeptorantagonisten Pegvisomant kombiniert werden.Furthermore is also a therapeutic combination of antibodies according to the invention Pegvisomant (Deutsches Ärzteblatt, Volume 98, Issue 9, 2001, A 532) conceivable, as well as a pharmaceutical composition according to the invention, containing antibodies A and Pegvisomant and possibly other active substances (for example one of the abovementioned Active ingredients). In case of combined therapy, in a drug (Containing at least one antibody A and pegvisomant according to the invention), the long-term Effect of antibodies A according to the invention its longer Half-life with the short half-life of the receptor antagonist Pegvisomant be combined.

Weitere Erkrankungen, bei denen ein erfindungsgemäßes Arzneimittel oder ein erfindungsgemäßer Antikörper eingesetzt werden können oder zur Herstellung eines Arzneimittels dienen könnten, sind insbesondere Diabetes mellitus (bspw. in Hinblick auf die bei einer Diabetes mellitus auftretenden mittelbar durch hGH vermittelten Retinopathie) oder auch als antitumurigenes Agens bei hGH-abhängigen Tumoren.Further Diseases in which a medicament according to the invention or an antibody according to the invention is used can be or could be used for the preparation of a pharmaceutical are, in particular Diabetes mellitus (eg with regard to diabetes mellitus occurring indirectly by hGH-mediated retinopathy) or as an anti-tumoral agent in hGH-dependent tumors.

Typischerweise wird ein erfindungsgemäßer Antikörper als lyophilisiertes Pulver vorliegen, das zwischen 0,5 mg und 100 mg erfindungsgemäßen Antikörper A, und weitere Zusatzstoffe, bspw. Glycin, Manitol, und/oder Natriumphosphat Monohydrat aufweist. Dieses lyophilisierte Pulver wird in einer geeigneten wässrigen Lösung bereitgestellt und dann, bspw. subkutan ein- oder mehrfach täglich verabreicht.typically, is an inventive antibody as lyophilized powder present between 0.5 mg and 100 mg antibody A according to the invention and other additives, for example glycine, mannitol, and / or sodium phosphate Having monohydrate. This lyophilized powder is in a suitable aqueous solution provided and then, for example, administered subcutaneously once or several times daily.

Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arzneiformen insbesondere in Form von Injektionslösungen verabreicht werden.In principle, the inventive Medicaments are administered as liquid dosage forms, in particular in the form of injection solutions.

Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind z.B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel parenteral, intrvasal, intravenös, intraperitoneal oder intramuskulär appliziert werden soll. Für alle parenteralen Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Suspensionen und Lösungen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen.suitable Additives and / or auxiliaries are e.g. Solvents or diluents, Stabilizers, suspending agents, buffer substances, preservatives, as well as dyes, fillers, and / or Binder. The choice of excipients and the used Quantities of the same depends whether the drug is parenteral, intrvasal, intravenous, intraperitoneal or intramuscularly should be applied. For all parenteral applications are formulations in the form of suspensions and solutions and easily reconstitutable dry preparations.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.One Another object of the invention is a diagnostic containing at least one antibody according to the invention and optionally additives and / or auxiliaries.

Unter einem Diagnostikum versteht man eine Zubereitung oder Hilfsmittel mit deren Hilfe beispielsweise eine bestimmte Krankheit diagnostiziert werden kann.Under A diagnostic means a preparation or auxiliaries with their help, for example, a certain disease can be diagnosed can.

Ein werterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit enthaltend voneinander getrennt mindestens eine erste Zubereitung enthaltend einen erfindungsgemäßen Antikörper und einen auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden, der in diesem Test als Antigen dient.One werterer subject of the invention is a kit containing each other at least one first preparation comprising an antibody according to the invention and an assay based on an antigen / antibody reaction for the quantitative determination of a ligand used in this test serves as an antigen.

Unter einem Kit ist eine gemeinsam auftretende Form verschiedener Bestandteile in einer Verpackungsform zu verstehen. Hier ist es insbesondere ein Diagnostik-Kit, der die veschiedenen notwendigen Bestandteile zur quantitativen Analyse eines Liganden enthält.Under A kit is a co-occurring form of various components to be understood in a packaging form. Here it is in particular one Diagnostic kit containing the various necessary components for contains quantitative analysis of a ligand.

Bevorzugt ist ein Kit, bei dem die erste Zubereitung einen Antikörper, der gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet ist, enthält und/oder neben der ersten Zubereitung und dem auf der Basis einer Antige/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden auch eine Zubereitung zur Kalibrierung enthält.Prefers is a kit in which the first preparation contains an antibody, the against the binding site of the human growth hormone (hGH) on the human Growth hormone binding protein (hGHBP) is directed to, contains and / or in addition to the first preparation and based on an antigen / antibody reaction functioning finished test assay for quantitative determination a ligand also contains a preparation for calibration.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßer Kit, in dem die erste Zubereitung den Antikörper ZMC1 (hinterlegt s.o.) enthält und/oder die Zubereitung zur Kalibrierung „Internationale Referenz-Präparation 88/624" oder „Internationale Referenz-Präparation 80/505", vorzugsweise „Internationale Referenz-Präparation 88/624" enthält und/oder der Antikörper in dem beiliegenden auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden (hGH) ein, vorzugsweise monoklonaler, Antikörper B gegen die 22 kDa große Hauptisoform des hGH ist.A particularly preferred embodiment is a kit according to the invention, in which the first preparation contains the antibody ZMC1 (deposited supra) and / or Preparation for Calibration "International Reference Preparation 88/624 "or" International Reference Preparation 80/505 ", preferably" International Reference Preparation 88/624 "and / or the antibody in the attached based on an antigen / antibody reaction prepare a test assay for the quantitative determination of a ligand (hGH) a, preferably monoclonal, antibody B against the major 22 kDa isoform of the hGH.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Antikörpers zur, vorzugsweise quantitativen, Bestimmung eines physiologischen Liganden eines physiologischen Bindungsproteins.One Another object of the invention is the use of an antibody for, preferably quantitative, determination of a physiological ligand a physiological binding protein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Wachstumsstörungen.One Another object of the invention is the use of an antibody according to the invention Preparation of a medicament for the treatment of growth disorders.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, also eines Antikörpers, der gegen ein Bindungsprotein für einen Liganden gerichtet ist, mit folgenden Schritten: (a) Immunisierung von Tieren mit rekombinant hergestelltem Bindungsprotein, (b) Isolierung von Immunzellen aus dem Tier, (c) Fusion mit Myelom-Zellinien zu Hybridomzellkulturen, (d) Selektion von Klonen mit hoher Spezifität für das Bindungsprotein. Die Immunisierung kann in allen für derartige Zwecke in Betracht kommenden Tieren erfolgen, also . bspw. bei Mäusen, Kaninchen, Schweinen, Pferden etc. Um solche Klone, die Antikörper gegen das Bindungsprotein (z.B. GHBP) produzieren, von erfindungsgemäßen Klonen (die Antikörper produzieren, die spezifisch gegen die Ligandenbindungsstelle des Bindungsproteins gerichtet sind) zu trennen, werden geeignete Medien (z.B. wells von Mikrotiterplatten, Polystyrolbeads, Plastikröhrchen) mit jeweils einem (unselektierten) anti-GHBP-Fangantikörper in einem Verfahrensschritt (e) beschichtet, und in einem Verfahrensschritt (f) werden das Bindungsprotein (z.B. GHBP) und nachfolgend der Ligand (z.B. hGH) hinzugegeben. Hierbei sollte der Ligand markiert sein (bspw. durch Biotinylierung, Label (radiaktiver Laber, Fluoreszenzmarker, Enzymmarker (Meerrettich-Peroxidase) etc.)) oder über einen entsprechenden anti-Ligand-Antikörper detektierbar sein, um die Eigenschaft des Liganden, an das Bindungsprotein in dem mit Fangantikörper beschichteten Behältnis, überprüfen zu können. Alternative Verfahren sind demnach bspw. Radioaktivität, Chemiluminiszenz, kolorimetrische Verfahren oder Enzymreaktion. Nach einem Waschschritt können solche "wells" oder „beads" identifiziert werden, die kein Signal nach Ligandenzugabe aufweisen. In diesem Fall blockiert der Fangantikörper die Ligandenbindungsstelle, die Bindungsstelle steht damit für die Ligandenbindung nicht mehr zur Verfügung, der Fangantikörper interferiert mit dem Liganden.One Another object of the invention is a process for the preparation an antibody according to the invention, ie an antibody, against a binding protein for directed to a ligand, comprising the following steps: (a) immunization of animals with recombinantly produced binding protein, (b) isolation of immune cells from the animal, (c) fusion with myeloma cell lines Hybridoma cell cultures, (d) selection of clones with high specificity for the binding protein. The immunization may be considered in all for such purposes coming animals, so. eg in mice, rabbits, pigs, Horses etc. To such clones, the antibodies against the binding protein (e.g., GHBP), clones of the invention (which produce antibodies, specifically against the ligand binding site of the binding protein are directed), suitable media (e.g., wells of microtiter plates, polystyrene beads, plastic tubes) with one (unselected) anti-GHBP capture antibodies in a process step (e) coated, and in one process step (f) become the binding protein (e.g., GHBP) and subsequently the ligand (e.g., hGH). In this case, the ligand should be marked (eg by biotinylation, label (radiative lab, fluorescence marker, Enzyme marker (horseradish peroxidase) etc.)) or over one corresponding anti-ligand antibody be detectable to the property of the ligand, to the binding protein in the with catching antibody coated container to be able to check. alternative Processes are accordingly, for example, radioactivity, chemiluminescence, colorimetric Method or enzyme reaction. After a washing step, such "wells" or "beads" can be identified which have no signal after ligand addition. Blocked in this case the capture antibody the ligand binding site, the binding site thus stands for ligand binding no longer available, the capture antibody interferes with the ligand.

Schließlich kann ein erfindungsgemäßer Antikörper durch kompetitive Bindungsassays identifiziert werden. Hierzu wird, wie oben beschrieben, beschichtet, allerdings jedes „well" mit einem nicht spezifisch die Ligandenbindungsstelle erkennenden anti-Bindungsprotein-Antikörper. Nach Zugabe von Bindungsprotein wird in jedes „well" jeweils ein potentiell interessanter Antikörper (mit der Eigenschaft, die Ligandenbindungsstelle spezifisch zu erkennen) mit markiertem Liganden hinzugefügt. Mit zu- nehmender Konzentration des ligandenbindungsstellenspezifischen Antikörpers nimmt die Signalintensität des Liganden im „well" ab. Auf diese Weise können erfindungsgemäße Antikörper (bspw. gegen GHBP) selek- tiert werden.Finally, an antibody of the invention can be identified by competitive binding assays. For this purpose, as described above, coated, however, each "well" with a not spe specifically, the ligand binding site recognizing anti-binding protein antibody. After addition of binding protein, a potentially interesting antibody (with the characteristic of specifically recognizing the ligand binding site) with labeled ligand is added to each "well." As the concentration of the ligand-binding site-specific antibody increases, the signal intensity of the ligand in the "well" decreases. In this way, antibodies according to the invention (for example against GHBP) can be selected.

Alternativ zur Herstellung mit Hilfe von Hybridomen können auch die sogenannten „phage display" Verfahren (Morphosys oder Cambridge Antibody Technologies) zum Einsatz kommen, um potentiell erfindungsgemäße Antikörper zu generieren und dann, wie oben beschrieben, zu selektieren.alternative for the production with the help of hybridomas also the so-called "phage display "procedure (Morphosys or Cambridge Antibody Technologies), to potentially antibodies of the invention generate and then select as described above.

Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Ausführungsbeispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.in the The following section will further illustrate the invention by means of embodiments explains without restricting it to it.

Ausführungsbeispiele und Abbildungembodiments and picture

Abbildung:Illustration:

1 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung in Ausführungsbeispiel 2. Die Ergebnisse belegen, daß die Zugabe des erfindungsgemäßen Antikörpers den negativen Störeinfluß, den hGHBP auf die Ergebnisse der hGH-Messung hat (falsch niedrige Werte in den getesteten Sandwichassays), dosisabhängig verrigern bzw. aufheben kann. 1 Figure 4 shows the results of the study in Example 2. The results demonstrate that the addition of the antibody of the invention can dose-dependently correct for the negative interference that hGHBP has on the results of hGH measurement (false low values in the sandwich assays tested).

Ausführungsbeispieleembodiments

Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1

Herstellung von Antikörper A (gegen hGHBP gerichtet)Preparation of antibody A (against hGHBP directed)

Mehr als 20 Balb/c Mäuse wurden mit rekombinant hergestelltem hGHBP wiederholt nach dem allgemein bekannten Verfahren (siehe Beipackzettel Titermax^®) immunisiert. Bei Erreichen eines hohen Titers gegen hGHBP wurde die Milz den Tieren entnommen, und es wurden nach dem von Köhler und Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 1975, Aug. 7; 256 (5517): 495-7) beschriebenen Verfahren durch Fusion mit einer Maus-Myelom-Zelllinie Hybridomzellkulturen hergestellt. Ebenfalls nach allgemein bekannten Verfahren (Limitierende Verdünnung (limited dilution), Sereening der Hybridomzellkultur-Überstände mit markiertem Antigen) wurden solche Klone selektiert, die monoklonale Antikörper hoher Affinität und Spezifität für hGHBP produzierten.More than 20 Balb / c mice were repeatedly immunized with recombinantly produced hGHBP according to the generally known method (see leaflet Titermax ^® ). When a high titer against hGHBP was reached, the spleens were removed from the animals and, according to the method described by Kohler and Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 1975, Aug. 7; 256 (5517): 495-). 7) by fusion with a mouse myeloma cell line hybridoma cell culture. Also according to well-known methods (limiting dilution, screening of hybridoma cell culture supernatants with labeled antigen), those clones were selected which produced monoclonal antibodies of high affinity and specificity for hGHBP.

Die meisten der selektierten Klone waren gegen solche Epitope auf dem hGHBP-Molekül gerichtet, die außerhalb der Bindungsstelle für hGH liegen. Um erfindungsgemäße Antikörper A zu selektieren, die gegen ein Epitop innerhalb der Bindungsstelle gerichtet sind (nur ein solcher mAb ist für die erfindungsgemäße Anwendung anwendbar), wurde zunächst einer der vielen Antikörper, die hGHBP außerhalb der Bindungsstelle binden, eingesetzt. Dieser wurde dadurch identifiziert, daß alle monoklonalen Antikörper gegen GHBP (möglichst viele), z.B. jeweils in getrennte Vertiefungen (wells) einer Mikrotiterplatte (Polystyrolplatten mit hochadsorptiver Oberfläche) als Fangantikörper, aufgebracht wurden (alternativ können auch andere Verfahren, z.B. beschichtete Polystyrolbeads, beschichtete Plastikröhrchen etc., zum Einsatz kommen). Daraufhin wurde rekombinantes GHBP dazugegeben, welches an die Beschichtungsantikörper bindet – in zunächst noch unbekannter Ausrichtung (Bindung je nach Epitop innerhalb oder außerhalb der Hormon-Rezeptor-Interaktionsstelle). Schließlich wurde markiertes (in unserem Fall biotinyliertes) Wachstumshormon hinzugegeben, welches nun ausschließlich an die GHBP-Moleküle binden kann, deren Bindungsstelle frei zugänglich ist (d.h.; bei denen der Beschichtungsantikörper nicht mit der Wachstumshormonbindung interferiert). Die Messung gebundenen Antikörpers erfolgte durch die Zugabe von Streptavidin-Europium, welches an gebundenes biotinyliertes hGH bindet und in einem Fluorometer vermessen werden kann (zeitaufgelöste Fluoreszenz nach Zugabe von Enhancement-Solution). Alternativ kann dieser Schritt auch mit den analogen Methoden (Radioaktivität, Enzymreaktion/kolorimetrisches Verfahren oder Chemilumineszenz) durchgeführt werden.The Most of the selected clones were against such epitopes on the hGHBP molecule directed, outside the binding site for hGH lie. To inventive antibody A to select that is directed against an epitope within the binding site are (only one such mAb is for the application of the invention applicable), was first one of the many antibodies the hGHBP outside bind the binding site used. This was identified by that all monoclonal antibody against GHBP (if possible many), e.g. each in separate wells (wells) of a microtiter plate (Polystyrene plates with highly adsorptive surface) as catching antibody, applied were (alternatively also other methods, e.g. coated polystyrene beads, coated plastic tubes etc., are used). Then recombinant GHBP was added, which binds to the coating antibodies - initially unknown Alignment (binding depending on epitope inside or outside the hormone-receptor interaction site). Finally, marked (in biotinylated) growth hormone added to our case now exclusively to the GHBP molecules whose binding site is freely accessible (i.e. the coating antibody not interfering with growth hormone binding). The measurement bound antibody was carried out by the addition of streptavidin-europium, which bound biotinylated hGH binds and measured in a fluorometer can be (time-resolved Fluorescence after addition of enhancement solution). Alternatively, you can This step also with the analogous methods (radioactivity, enzyme reaction / colorimetric Method or chemiluminescence).

Um nun einen Antikörper aufzufinden, der gegen die Bindungsstelle gerichtet ist, wurde eine Mikrotiterplatte mit einem der nach oben angegebenen Verfahren selektierten Antikörper gegen GHBP, der nicht mit der Bindung von hGH interferiert, beschichtet. Zugabe von GHBP bewirkte, daß die GHBP-Moleküle gerichtet gebunden werden, also mit einer frei zugänglichen Bindungsstelle für hGH. Nunmehr wurde biotinyliertes hGH zugegeben und zugleich alle anderen monoklonalen Antikörper gegen GHBP (natürlich wieder jeder Antikörper in eine eigene Vertiefung der Mikrotiterplatte). Wenn nun ein Antikörper gegen die Bindungsstelle gerichtet wäre, sollte er die Bindung von biotinyliertem hGH konzentrationsabhängig behindern, was an abfallender Signalintesität erkannt werden konnte (Detektionsverfahren in unserem Falle wieder zeitaufgelöste Fluoreszenz (Streptavidin-Europium). Zur Bestätigung wurde im umgekehrten Experiment versucht, biotinylierte Antikörper gegen GHBP durch Zugabe von unmarkiertem hGH zu verdrängen. Dies ist dann möglich, wenn der biotinylierte Antikörper mit dem nicht-markierten hGH um die Bindung an die Rezeptorbindungsstelle konkurriert, also das Epitop des mAbs innerhalb der hGH/hGH-Rezeptorinteraktionsstelle liegt.In order to find an antibody directed against the binding site, a microtiter plate was coated with an antibody to GHBP selected from the above-specified methods which does not interfere with the binding of hGH. Addition of GHBP caused the GHBP molecules to be directionally bound, that is, with a freely accessible hGH binding site. Now biotinylated hGH was added and at the same time all other monoclonal antibodies against GHBP (again, of course, each antibody in its own well of the microtiter plate). If an antibody was then directed against the binding site, it should hinder the binding of biotinylated hGH in a concentration-dependent manner, which could be recognized by decaying signal intensity (detection method in our case again time-resolved fluorescence (streptavidin-europium).) In the reverse experiment, biotinylated was used as confirmation To displace antibodies against GHBP by adding unlabelled hGH, this is possible if the biotinylated antibody concocts with the unlabeled hGH to bind to the receptor binding site that is, the epitope of the mAbs lies within the hGH / hGH receptor interaction site.

Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:

Nachweis der Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen Antikörpers und der damit verbundenen Verbesserung allgemeiner quantitativer Meßmethoden bei störendem BindungsproteinProof of effectiveness an antibody of the invention and the associated improvement of general quantitative measurement methods at disturbing binding protein

Schafserum – das im Gegensatz zu den Seren anderer Spezies kein hochaffnes Wachstumshormon-Bindungsprotein enthält und somit das optimale „Kontrollmedium" abgibt – wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Wachstumshormon versetzt (verwendet wurde die Präparation 80/505, Endkonzentration 0,3/0,6/4 und 9 ng/ml). Danach wurden Aliquots dieser Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem humanem GHBP gemischt und für 24 Stunden bei 4°C inkubiert, um die Interaktion zwischen dem zugesetzten hGH und dem zugesetzten hGHBP zu ermöglichen. Somit wurden Serumproben mit definierten Konzentrationen von hGH und definierten Konzentrationen von hGHBP hergestellt. Diesen Proben wurde nun der erfindungsgemäße und hinterlegte anti-hGHBP-Antikörper ZMC 1 zugesetzt und für weitere 12 Stunden inkubiert und anschließend in 3 verschiedenen Immunoassays für hGH gemessen. Die Ergebnisse (siehe 1) belegen, daß die Zugabe des erfindungsgemäßen Antkörpers den negativen Störeinfluß, den hGHBP auf die Ergebnisse der hGH-Messung hat (falsch niedrige Werte in den getesteten Sandwichassays), dosisabhängig verringern bzw. aufheben kann.Sheep serum - unlike the sera of other species, does not contain high affinity growth hormone binding protein and thus gives the optimal "control medium" - different concentrations of growth hormone were added (preparation 80/505, final concentration 0.3 / 0.6 / 4 and 9 ng / ml) and then aliquots of these sera were mixed with different concentrations of recombinant human GHBP and incubated for 24 hours at 4 ° C to allow interaction between the added hGH and the added hGHBP Concentrations of hGH and defined concentrations of hGHBP were then added to these samples, and the anti-hGHBP antibody ZMC 1 according to the invention and deposited was incubated for a further 12 hours and subsequently measured in 3 different immunoassays for hGH 1 ) demonstrate that the addition of the antibody of the present invention can dose-dependently reduce or reverse the negative interference hGHBP has on the results of hGH measurement (false low levels in the sandwich assays tested).

Das Prinzip der Methode wurde bisher an drei verschiedenen Immunoassays erfolgreich getestet. Dabei konnten an humanen Serumproben die oben gezeigten Ergebnisse bestätigt werden. Je nach Immunoassay müssen die Konzentrationen des anti-hGHBP-Antikörpers angepaßt werden, um die interferenzfreie Messung von hGH zu ermöglichen. Damit ist eine grundsätzlich neue Anwendung von monoklonalen Antkörpern zur Blockade interferierender Bindungsproteine etabliert.The The principle of the method has been used in three different immunoassays successfully tested. It could be on human serum samples the above results confirmed become. Depending on the immunoassay need the concentrations of the anti-hGHBP antibody are adjusted, to enable the interference-free measurement of hGH. This is a fundamentally new Application of monoclonal antibodies established to block interfering binding proteins.

Literatur:Literature:

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Claims

Method for the quantitative determination of a ligand of a binding protein in a ligand and binding protein in dissolved or suspended form containing sample, characterized in that the sample to be measured is an antibody A against the binding protein, which is directed against the binding site of the ligand on the binding protein added ,

Method according to claim 1, characterized in that the antibody A before or during, preferably before, the quantitative determination is added and / or is incubated with the sample.

Method according to one the claims 1 or 2, characterized in that the sample contains body fluid, preferably human body fluid, in particular Blood or human blood contains.

Method according to one the claims 1 to 3, characterized in that the ligand is a physiological Ligand of the physiological binding protein is.

Method according to one the claims 1 to 4, characterized in that the binding protein is soluble, preferably a soluble one Receptor or a hormone binding protein, in particular a hormone binding protein, is.

Method according to one the claims 1 to 5, characterized in that the ligand is a peptidic Compound and / or a hormone, preferably a peptide hormone, especially a growth hormone.

A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the ligand is human growth hormone (hGH) and the binding protein is human growth hormone binding protein (hGHBP) and the antibody directed by A against the binding site of hGH on the hGHBP.

Method according to one the claims 1 to 7, characterized in that the antibody A is a monoclonal antibody or a single-chain antibody, preferably a monoclonal antibody.

Method according to one the claims 1 to 8, characterized in that the antibody A of the monoclonal antibody ZMC 1 is.

Method according to one the claims 1 to 9, characterized in that the quantitative determination of the ligand utilizing the binding of the ligand as antigen to a, preferably monoclonal, antibody B takes place.

Method according to claim 10, characterized in that the quantitative determination of a competitive binding assay, preferably a "radio-immunoassay" (RIA).

Method according to claim 10, characterized in that the quantitative determination by measuring one in dependence from the concentration of the measured ligand to be measured measuring parameter is carried out, preferably by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and / or by a sandwich assay.

Method according to one Claims 1 to 12, characterized in that before the Quantitative determination no separation of the binding protein the sample to be measured takes place.

Method according to one the claims 1 to 13, characterized in that the antibody A is added so that the antibody A in the sample in a higher Concentration is present as the binding protein, preferably in one at least 50%, in particular at least 100%, preferably at least by 200%, in particular at least 400% higher concentration.

antibody A against a dissolved in body fluids or suspended physiological binding protein of a physiological Ligands, characterized in that the antibody A against the binding site of the ligand is directed to the binding protein.

antibody A according to claim 15, characterized in that the antibody A is a monoclonal antibody and / or a single-chain antibody, preferably a monoclonal antibody, is.

antibody A according to one the claims 15 or 16, characterized in that the ligand is a peptide and / or Hormone and / or preferably of human origin.

antibody A according to one the claims 15 to 17, characterized in that the antibody A against the binding site of human growth hormone (hGH) on human growth hormone binding protein (hGHBP).

antibody A according to one the claims 15 to 18, characterized in that the antibody A of the antibody ZMC1 is.

Medicaments containing an antibody A according to a the claims 15 to 19 and optionally other active ingredients and additives and / or auxiliaries.

Use of an antibody after one of the claims 15 to 19 or a medicament according to claim 20 for the treatment of diseases, disorders or pathophysiologies based on hGH excess, for example acromegaly.

Diagnostic agent containing at least one antibody A according to a the claims 15 to 19 and optionally excipients.

Kit containing at least one separate from each other A first preparation comprising an antibody A according to any one of claims 15 to 19 and one based on an antigen / antibody reaction prepare a test assay for the quantitative determination of a ligand, which serves as antigen in this test.

Kit according to claim 23, characterized in that the first preparation of an antibody A according to claim 18 contains and / or next to the first preparation and based on a Antigen / antibody reaction functioning finished test assay for quantitative determination a ligand also contains a preparation for calibration.

Kit according to claim 24, characterized in that the first preparation the antibody ZMC1 contains and / or the preparation for calibration "International Reference Preparation 88/624 "or" International Reference Preparation 80/505 ", preferably" International Reference Preparation 88/624 ° contains and / or the antibody B in the based on an antigen / antibody reaction prepare a test assay for the quantitative determination of a ligand (hGH) a, preferably monoclonal, antibody to the major 22 kDa isoform of the hGH.

Use of an antibody A according to any one of claims 15-19 to, preferably quanti tatives, determination of a physiological ligand of a physiological binding protein.

Use of an antibody A according to claim 18 or 19 for the preparation a drug for the treatment of metabolic disorders.

Process for the preparation of an antibody A according to one the claims 15 to 19 with the following steps: (a) Immunization of animals with recombinantly produced binding protein, (b) isolation immune cells from the animal, (c) fusion with myeloma cell lines to hybridoma cell cultures, (d) Selection of high-clones specificity for the binding protein.