DE10251373A1

DE10251373A1 - Process for verifying the correct spatial structure of molecules using multi-dimensional NMR spectroscopy comprises establishing a standardized chemical composition of a reference and test substance, and further processing

Info

Publication number: DE10251373A1
Application number: DE2002151373
Authority: DE
Inventors: Hans-Robert Kalbitzer
Original assignee: Kalbitzer Hans-Robert Prof Dr Dr
Current assignee: Kalbitzer Hans-Robert Prof Dr Dr
Priority date: 2002-06-27
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2004-01-15

Abstract

Process for verifying the correct spatial structure of molecules using multi-dimensional NMR spectroscopy comprises establishing a standardized chemical composition of a reference and test substance and establishing standardized measuring parameters for a reference and a test spectrum, automatically verifying the selected chemical composition of the reference substance, automatically verifying the measuring parameters when the reference spectrum is received, automatically evaluating and storing data obtained from the reference spectrum, automatically verifying the chemical composition of the test substance, automatically verifying the measuring parameter when the test spectrum is received, automatically evaluating and storing data obtained from the test spectrum, automatically comparing the test spectrum with the reference spectrum, automatically acquiring the each amount of the test substance whose spatial structure agrees with the reference substance, and repeating the process from the step of automatically verifying the chemical composition of the test substance. Independent claims are also included for the following: (1) Computer for carrying out the process; (2) Digital storage medium having electronically readable control signals which interact with the computer, and (3) Computer program for implementing in the computer.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der zwei- oder mehrdimensionalen Struktur von Molekülen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The present invention relates to a method for determining the two- or multi-dimensional structure of molecules according to the preamble of claim 1.

Die Strukturbestimmung von Molekülen mit Hilfe der mehrdimensionalen NMR-Spektroskopie ist bekannt. Die NMR-Spektroskopie wird insbesondere zur Bestimmung der chemischen (kovalenten) Struktur kleiner Moleküle routinemäßig verwendet, um die postulierte Struktur von Naturstoffen oder Syntheseprodukten zu verifizieren, neue Stoffe zu identifizieren oder die intakte chemische Struktur nachzuweisen.The structure determination of molecules with Using multidimensional NMR spectroscopy is known. NMR spectroscopy is used in particular for determination routinely uses the chemical (covalent) structure of small molecules, to the postulated structure of natural products or synthetic products verify new substances or identify the intact chemical Evidence of structure.

In der pharmazeutischen Industrie stellt sich ein neues Problem dann, wenn die intakte räumliche Struktur (Faltung) von Molekülen, insbesondere Makromolekülen wie Proteinen, wesentlich für die pharmakologische Wirksamkeit ist. Bei der Produktion von Pharmazeutika ist eine strikte Qualitätskontrolle notwendig, um sicherzustellen, dass das Medikament in gleichbleibend hoher Wirksamkeit zur Verfügung steht und keine Nebenwirkungen verursacht. Insbesondere bei Makromolekülen ist die Wirksamkeit nicht nur von der intakten chemischen Struktur abhängig, sondern auch mit der Einhaltung der korrekten Raumstruktur verknüpft. Die Überprüfung der Raumstruktur von Molekülen und Makromolekülen zur Qualitätskontrolle in der industriellen Produktion ist immer noch ein ungelöstes Problem.In the pharmaceutical industry A new problem arises when the intact spatial structure (Folding) of molecules, especially macromolecules like proteins, essential for the pharmacological effectiveness is. In the production of pharmaceuticals is a strict quality control necessary to ensure that the drug is consistent high effectiveness stands and causes no side effects. Especially with macromolecules the effectiveness depends not only on the intact chemical structure, but also linked to compliance with the correct spatial structure. The review of the Spatial structure of molecules and macromolecules for quality control in industrial production is still an unsolved problem.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die korrekte räumliche Struktur (dreidimensionale Struktur) von Molekülen insbesondere in der industriellen Produktion schnell und kostengünstig quantitativ beurteilt werden kann.The object of the present invention is therefore to provide a method by which the correct spatial Structure (three-dimensional structure) of molecules, especially in industrial production fast and inexpensive can be assessed quantitatively.

Die Lösung besteht in einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1. Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, dass mittels eines oder mehrerer NMR-Spektren festgestellt wird, ob die dreidimensionale Struktur eines Testmoleküls mit derjenigen eines zuvor definierten Referenzmoleküls übereinstimmt. Um äußere Einflüsse auf die Spektren und die räumliche Struktur zu minimieren, müssen alle Schritte von der Probenherstellen bis zum Spektrenvergleich standardisiert werden. Die Standards werden in einem Protokoll definiert. Die Abarbeitung des Protokolls führt zu einer standardisierten Identifikation der NMR-Signale des Moleküls.The solution is a process with the features of claim 1. According to the invention provided that determined using one or more NMR spectra is whether the three-dimensional structure of a test molecule matches that of a previously defined reference molecule. To external influences the spectra and the spatial Need to minimize structure all steps from sample preparation to spectra comparison be standardized. The standards are defined in a protocol. The processing of the protocol leads for a standardized identification of the NMR signals of the molecule.

Damit ist es erstmals möglich, eine quantitative Aussage zu treffen, wie groß der Anteil der Moleküle mit korrekter dreidimensionaler Struktur in einer Probe ist. Je höher dieser Anteil ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass das Molekül, beispielsweise im pharmazeutischen Bereich, die gewünschte Wirkung aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, automatisch diese Prüfung vorzunehmen und beispielsweise Proben, bei denen der Anteil eine Substanz mit korrekter dreidimensionaler Struktur einen vorher definierten Schwellenwert unterschreitet, sofort zu verwerfen. Da ein NMR-Spektrum direkt mit der Struktur der gemessenen Probe korreliert ist, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch, die Qualität der Probe dahingehend zu differenzieren, ob gegebenenfalls vorhandene Unterschiede in der Struktur einen Bereich des Moleküls betreffen, der für die gewünschte Wirkung unerlässlich oder, im Gegensatz hierzu, vernachlässigbar ist. Im ersten Fall wird die Probe verworfen; im zweiten Fall wird die Probe beibehalten.It is now possible for the first time to make quantitative statements about how large the proportion of molecules with correct three-dimensional structure in a sample. The higher this Proportion is the larger the probability that the molecule, for example in pharmaceutical Area that you want Has effect. The method according to the invention allows automatic this exam and, for example, samples in which the proportion is one Substance with a correct three-dimensional structure, a previously defined one Falls below threshold, to be discarded immediately. Because an NMR spectrum correlates directly with the structure of the measured sample, this enables inventive method also, the quality to differentiate the sample in terms of whether there are any Differences in structure affect a region of the molecule the for the desired Impact essential or, in contrast, is negligible. In the first case the sample is discarded; in the second case the sample is retained.

Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen. Zur NMR-Messung kommen alle Messsysteme (Messmethoden) in Frage, die Strukturinformationen registrieren und wiedergeben und ausreichend empfindlich auf Änderungen in der Struktur reagieren. Da die chemische Verschiebung sehr empfindlich auf Änderungen der Struktur reagiert, sind hier auch alle Messsysteme geeignet, die chemische Verschiebungen einzelner Atome oder Gruppen mit hoher Auflösung abbilden.Advantageous further developments result itself from the subclaims. All measuring systems (measuring methods) can be used for NMR measurement, register and display the structural information and sufficient sensitive to changes react in the structure. Because the chemical shift is very sensitive to changes structure responds, all measuring systems are also suitable here, the chemical shifts of individual atoms or groups with high resolution depict.

Das oder die Testspektren können entweder mit einem einzelnen Original-Referenzspektrum oder einem Satz von Original-Referenzspektren verglichen werden, die von einer oder mehreren Proben der Testsubstanz im Sollzustand (Referenzsubstanz) aufgenommen wurden. Der Vergleich kann dann also mit dem Originaldatensatz erfolgen. Als Alternative können das oder die Testspektren mit aus den Originalspektren erzeugten synthetischen Spektren oder Datensätzen verglichen werden. Im letzteren Fall können optimale Ergebnisse erzielt werden, wenn eine vollkommene Beschreibung aller Spinsysteme und der dazugehörigen dreidimensionalen Struktur vorliegt. In diesem Fall lassen sich die Spektren mit großer Präzision zurückrechnen. Synthetische Referenzspektren sind immer dann notwendig, wenn die Testspektren nicht unter identischen Bedingungen wie die Referenzspektren aufgenommen werden können. In diesem Fall können nur durch die Rückrechnung der Spektren die Unterschiede in den Messbedingungen ausgeglichen werden. Hierbei können insbesondere NOESY-artige Spektren mit dem vollständigen Relaxationsmatrixformalismus perfekt simuliert werden (vgl. Adrian Görler et al., „Relax, a flexible program for the backcalculation of NOESY spectra based on the complete-relaxation-matrix-formalism", Journal of Magnetic Resonance, 124, 177–188 (1997); Adrian Görler et al., „Computer assisted assignment of ¹³C or ¹⁵N edited 3D-NOESY-HSQC-spectra using back calculated and experimental spectra", Journal of Magnetic Resonance 137, 39–45 (1999)). Ein weiterer Spektrentyp, der gut simulierbar und daher für die Rückrechnung besonders geeignet ist, bildet die residualen dipolaren Kopplungen in partiell orientierten Proben ab.That or the test spectra can either with a single original reference spectrum or a set of Original reference spectra are compared by one or several samples of the test substance in the target state (reference substance) were recorded. The comparison can then be made with the original data record respectively. As an alternative you can the test spectra or spectra generated from the original spectra synthetic spectra or data sets are compared. in the the latter case can optimal results can be achieved if a complete description all spin systems and the associated three-dimensional structure is present. In this case, the spectra can be calculated back with great precision. Synthetic reference spectra are always necessary when the Test spectra not under identical conditions as the reference spectra can be included. In this case, you can only by retroactive accounting the spectra compensated for the differences in the measurement conditions become. Here you can especially NOESY-like spectra with the complete relaxation matrix formalism can be perfectly simulated (cf. Adrian Görler et al., “Relax, a flexible program for the backcalculation of NOESY spectra based on the complete relaxation matrix formalism ", Journal of Magnetic Resonance, 124, 177-188 (1997); Adrian Görler et al., "Computer assisted assignment of¹³C or¹⁵N edited 3D-NOESY-HSQC-spectra using back calculated and experimental spectra ", Journal of Magnetic Resonance 137, 39-45 (1999)). Another type of spectra, which is easy to simulate and therefore for the retroactive accounting is particularly suitable, forms the residual dipolar couplings in partially oriented samples.

Von den zu untersuchenden Molekülen können, je nach Struktur, gegebenem chemischen Aufbau und möglicher Auflösung entweder homonukleare oder heteronukleare Spektren, d.h. solche Spektren, bei denen auch andere Kerne als 'H nachgewiesen werden, aufgenommen werden. Die heteronuklearen Spektren können entweder an Substanzen aufgenommen werden, die die gewünschten Isotopen in natürlicher Häufigkeit enthalten oder künstlich mit diesen angereichert wurden. Es ist ferner sinnvoll, vor dem eigentlichen Vergleich der Spektren eventuell vorhandene Artefakte zu selektieren bzw. Unterschiede im Signal- zu Rauschverhältnis zwischen Referenzspektrum und Testspektrum zu quantifizieren und bei dem Vergleich zu berücksichtigen. Signal-, Artefakt- und Rauscherkennung kann bevorzugt automatisch z. B. durch eine Bayessche Analyse durchgeführt werden, so dass nur die echten Signalanteile in den Vergleich einbezogen werden müssen (vgl. Christof Antz et al., „A general Bayesian method for an automated signal class recognition in 2D NMR spectra combined with a multivariate discriminant analysis", J. Biomol. NMR 5, 287–296 (1995); Anja Carina Schulte et al., „Use of global symmetries in automated signal class recognition by a Bayesian method", Journal of Magnetic Resonance 129, 165-172 (1997)).Depending on the structure, given chemical structure and possible resolution, either homonuclear or heteronuclear spectra, ie those spectra, of the molecules to be investigated cores other than 'H can also be detected. The heteronuclear spectra can either be recorded on substances that contain the desired isotopes in natural frequency or have been artificially enriched with them. It is also useful to select any existing artifacts before the actual comparison of the spectra or to quantify differences in the signal-to-noise ratio between the reference spectrum and the test spectrum and to take them into account in the comparison. Signal, artifact and noise detection can preferably automatically z. B. be carried out by a Bayesian analysis, so that only the real signal components need to be included in the comparison (cf. Christof Antz et al., “A general Bayesian method for an automated signal class recognition in 2D NMR spectra combined with a multivariate discriminant analysis ", J. Biomol. NMR 5, 287-296 (1995); Anja Carina Schulte et al.," Use of global symmetries in automated signal class recognition by a Bayesian method ", Journal of Magnetic Resonance 129, 165-172 ( 1997)).

Der eigentliche Vergleich der Spektren findet dann dadurch statt, dass alle Signale einzeln miteinander verglichen werden. Dies kann entweder direkt auf der Ebene der Originaldaten selbst geschehen oder aber mit Hilfe von Parametern, die vorher aus den experimentellen NMR-Daten in der Frequenz- oder Zeitdomäne extrahiert wurden. Diese Parameter wären typischerweise die Signalkoordinaten (chemischen Verschiebungen), die Signalintensität, die Signalwahrscheinlichkeit und das Kopplungsmuster. Quantifiziert werden kann die Übereinstimmung zum Beispiel durch die Berechnung von R-Werten (vgl. Wolfram Gronwald et al., „RFAC, a program for automated NMR-R-factor estimation", J. Biomol. NMR 17, 137–151 (2000)).The actual comparison of the spectra then takes place in that all signals are compared individually become. This can be done directly at the level of the original data happen yourself or with the help of parameters previously extracted from the experimental NMR data in the frequency or time domain were. These parameters would be typically the signal coordinates (chemical shifts) that Signal intensity, the signal probability and the coupling pattern. quantified can be the match for example by calculating R values (cf. Wolfram Gronwald et al., "RFAC, a program for automated NMR-R-factor estimation ", J. Biomol. NMR 17, 137-151 (2000)).

Die Identifikation des Moleküls in der geforderten Struktur kann dann durch eine auf Eins normierte Wahrscheinlichkeit ausgedrückt werden. Die Wahrscheinlichkeitsaussage kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass als Referenzspektrum nicht nur Referenzsubstanzen Substanzen mit der Soll-Struktur S aufgenommen werden, sondern auch Referenzsubstanzen vermessen werden, die gegenüber der Soll-Struktur eine abweichende, unerwünschte Struktur S' haben, also beispielsweise teilweise oder vollständig denaturiert sind, oder die zwar eine von der Soll-Struktur abweichende Struktur aufweisen, obwohl diese Änderung die Wirksamkeit nicht beeinträchtigt. Durch die Korrelation der zu den verschiedenen Referenzsubstanzen gehörigen R-Werte, die die Referenzsubstanzen mit den Testsubstanzen vergleichen, kann beim automatischen Vermessen der Testsubstanzen gegebenenfalls jedes Signal einer bestimmten Struktur zugeordnet und der jeweilige Anteil quantifiziert werden. Alternativ kann im Computer die räumliche Struktur variiert und eine Rückrechnung der Spektren dazu benutzt werden, um die Wahrscheinlichkeit zu ermitteln, dass das gegebene Spektrum der intakten Struktur entspricht.Identification of the molecule in the required structure can then by a probability normalized to one expressed become. The probability statement can, for example, thereby achieved that not only reference substances as a reference spectrum Substances with the target structure S are included, but also Reference substances are measured, which are compared to the target structure deviating, undesirable Have structure S ', are partially or completely denatured, for example, or which have a structure that deviates from the target structure, although this change the Effectiveness not affected. Through the correlation of the different reference substances related R values that compare the reference substances with the test substances, can, if necessary, in the automatic measurement of the test substances each signal is assigned to a certain structure and the respective one Proportion can be quantified. Alternatively, the spatial Structure varies and a back calculation the spectra are used to determine the probability that the given spectrum corresponds to the intact structure.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Hard- und Software zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere ein entsprechend eingerichteter Computer bzw. eine hierfür programmierte Software, die mit dem Computer zusammenwirkt .Object of the present invention is also a hardware and software for carrying out the method according to the invention, in particular a correspondingly set up computer or a therefor programmed software that works with the computer.

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden im folgenden näher erläutert.Embodiments of the present Invention will become more apparent below explained.

Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich alle Arten von Molekülen. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Strukturverifizierung von Proteinen, vor allem für den Fall, dass diese Proteine als Wirkstoffe in Medikamenten eingesetzt werden sollen; was eine zuverlässige Qualitätskontrolle notwendig macht. Wenn die Wirksamkeit der Moleküle mit ihrer Struktur korreliert ist, kann über eine quantitative Erfassung der Strukturqualität auf die Wirkstoffqualität rückgeschlossen werden. In der Regel sollten die Moleküle unter den Bedingungen untersucht werden, unter denen sie später eingesetzt werden sollen., Daher sollten sie im Normalfall nicht mit Isotopen angereichert werden, obwohl dies, falls zum Beispiel aus Empfindlichkeitsgründen erforderlich, natürlich vorgenommen werden kann.For application of the method according to the invention all types of molecules are suitable. The method according to the invention is particularly suitable for structure verification of proteins, especially for the case that these proteins are used as active ingredients in medicines should be; what a reliable quality control makes necessary. When the effectiveness of the molecules correlates with their structure is can about a quantitative recording of the structure quality based on the active ingredient quality become. As a rule, the molecules should be examined under the conditions under which they will later should be used., Therefore, they should not normally can be enriched with isotopes, although this if, for example, from sensitivity reasons required, of course can be made.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein automatisierter Spektrenvergleich zwischen dem Referenzspektrum oder den Referenzspektren und einem Testspektrum vorgenommen. Damit wird geklärt, inwieweit die Struktur des Testmoleküls mit der des Referenzmoleküls übereinstimmt. Um äußere Einflüsse zu minimieren, welche die Spektren unzulässig verändern könnten, werden alle Schritte von der Probenherstellung bis hin zum Spektrenvergleich in einem Protokoll definiert. Die Abarbeitung des Protokolls führt zu einer standardisierten Identifikation des Moleküls und der Bestimmung des Anteils, der in der korrekten räumlichen Struktur vorliegt. Die positive Identifikation wird in Wahrscheinlichkeiten ausgedrückt, mögliche Fehlidentifikationen durch Irrtumswahrscheinlichkeiten definiert.In the method according to the invention becomes an automated spectrum comparison between the reference spectrum or the reference spectra and a test spectrum. In order to it will be clarified, to what extent the structure of the test molecule matches that of the reference molecule. In order to minimize external influences, which the spectra inadmissible change could are all steps from sample preparation to spectra comparison defined in a protocol. The processing of the protocol leads to a standardized identification of the molecule and determination of the proportion, of the correct spatial structure is present. The positive identification becomes probabilities expressed possible Misidentification defined by error probabilities.

Das Protokoll besteht im Ausführungsbeispiel aus sechs Teilen, in welche entsprechende Einträge vorgenommen werden. Die Einträge werden grundsätzlich mittels der Software vorgenommen, d.h. entweder automatisch von der Software generiert oder per Dialog mit dem Anwender. Die Protokolldatei sollte einem normalen Editor nicht zugänglich sein.The protocol is in the embodiment from six parts, in which corresponding entries are made. The Posts are basically carried out by means of the software, i.e. either automatically from generated by the software or by dialog with the user. The log file should not be accessible to a normal editor.

Jedes Teil des Protokolls enthält durch Schlüsselworte gekennzeichnete Einträge, die verschiedene Werte annehmen können. Grundsätzlich können Einträge in das Protokoll nur mittels der Software, beispielsweise über eine Eingabemaske, vorgenommen werden.Each part of the log contains through Keywords marked entries, that can take different values. Basically, entries in the Protocol only using the software, for example via a Input mask.

Folgende Protokollteile werden im Ausführungsbeispiel erstellt. The following protocol parts are in embodiment created.

1. Probenherstellung, Vorbereitung für die Aufnahme des NMR-Spektrums1. sample preparation, preparation for the recording of the NMR spectrum

In diesem Protokollteil werden die äußeren Messparameter wie pH-Wert, Messtemperatur, Reinheit der Probe, Nummer der Charge, verwendetes Lösungsmittel, Puffer etc. festgehalten. Die chemische Zusammensetzung der Probe und die kovalente Struktur des Moleküls wurden vorher beispielsweise mittels Massenspektrometrie und/oder chromatographischen Verfahren verifiziert. Wenn eine Referenz- oder eine Testprobe in die Messapparatur gegeben wird, überprüft die Software automatisch die Einhaltung dieser Rahmenbedingungen bzw. führt Konsistenzprüfungen vor, d.h. sie prüft, ob die Messwerte mit den vorgegebenen Rahmenbedingungen konsistent sind oder zu ihnen in Widerspruch stehen. Im letzteren Fall erfolgt eine Fehlermeldung. Die Software kann auch gleichzeitig den Arbeitsaufwand minimieren, in dem bestimmte Werte automatisch extrahiert werden. Bei der Aufnahme eines Spektrums sind z. B. sämtliche Prozessierungsparameter bekannt und werden von der Software für die Protokollerstellung bzw. Auswertung herangezogen. Die Software kann auch registrieren, welcher Benutzer für welche Zeit welche Messungen vorgenommen hat.In this part of the protocol, the outer measurement parameters such as pH value, measuring temperature, sample purity, batch number, solvent used, Buffer etc. held. The chemical composition of the sample and the covalent structure of the molecule have previously been exemplified by means of mass spectrometry and / or chromatographic methods Verified. If a reference or test sample is in the measuring equipment is given, the software checks automatically adhering to these framework conditions or performing consistency checks, i.e. she checks whether the measured values are consistent with the given framework are or contradict them. In the latter case an error message. The software can also reduce the workload minimize by automatically extracting certain values. When recording a spectrum z. B. all processing parameters known and are from the software for protocol creation or Evaluation used. The software can also register which one Users for which time took which measurements.

2. Aufnahme des NMR-Spektrums2. Recording of the NMR spectrum

In diesem Teil werden vorgegebene Rahmenbedingungen der eigentlichen Messung, wie beispielsweise Pulssequenz, Feldstärke, Messparameter etc. festgehalten und von der Software automatisch bei jeder Messung eingestellt bzw. verifiziert. Sie sollten so genau wie möglich denen bei der Aufnahme entsprechen.In this part are given Framework conditions of the actual measurement, such as pulse sequence, Field strength Measurement parameters etc. recorded and automatically by the software set or verified for each measurement. You should be so precise as possible correspond to those when recording.

3. Datenprozessierung3. Data processing

In diesem Teil des Protokolls werden die eigentlichen Messdaten verarbeitet. Hierzu werden beispielsweise Parameter wie die benutzten Filterfunktionen, die benutzten Basislinienkorrekturen, die Größe des zu transformierenden Datensatzes und die Größe nach der Transformation abgespeichert. Die Datenprozessierung ist bspw. erläutert in Cavanagh et al. „Protein NMR spectroscopy, principles and practice", Academic Press, 1996; K. H. Hausser & H. R. Kalbitzer, „NMR in medicine and biology", Springer Verlag, 1989.This part of the protocol will be processed the actual measurement data. For this, for example Parameters such as the filter functions used, the baseline corrections used, the size of the to be transformed Record and size by saved the transformation. The data processing is e.g. explained in Cavanagh et al. "Protein NMR spectroscopy, principles and practice ", Academic Press, 1996; K. H. Hausser & H. R. Kalbitzer," NMR in medicine and biology ", Springer Verlag, 1989.

4. Postprozessierung4. Post processing

In diesem Teil werden die Daten für den anstehenden Vergleich aufbereitet. Hierzu gehören beispielsweise die Definition von Rausch-, Signal- und Artefaktgebieten, die für die Signalklassifizierung notwendig sind (siehe oben).In this part the data for the upcoming Prepared comparison. This includes, for example, the definition of noise, signal and artifact areas used for signal classification are necessary (see above).

5. Spektrenvergleich und Identifikation5. Spectra comparison and identification

In diesem Teil sind die eigentlichen Algorithmen bzw. die Programmplattform für den vorzunehmenden Spektrenvergleich abgelegt.In this part are the real ones Algorithms or the program platform for the spectrum comparison to be carried out stored.

6. Ausgabe des Protokolls, Archivierung6th edition of the protocol, archiving

In diesem Teil wird festgelegt, in welcher Form die Software automatisch die Messergebnisse und die Vergleichsergebnisse speichert, beispielsweise auf Festplatte oder CD-Rom, und in welcher Form die Ergebnisse ausgegeben werden, beispielsweise als Text oder als graphische Darstellung.This part specifies in which form the software automatically takes the measurement results and the comparison results stores, for example on hard disk or CD-Rom, and in which Form the results are output, for example as text or as a graphic representation.

Anschließend sollte idealer Weise eine Wahrscheinlichkeitsaussage dahingehend gemacht werden können, in welcher Menge das Molekül in seiner korrekten Struktur in der Probe vorhanden ist. Diese Aussage kann auf zweierlei Weise formuliert werden:

a) Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von < a % sind > x % des Moleküls in der korrekten räumlichen Struktur vorhanden.
b) Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit < a % ist > y % des Moleküls in seiner korrekten räumlichen Struktur.

Subsequently, it should ideally be possible to make a probability statement regarding the amount of the molecule in its correct structure in the sample. This statement can be formulated in two ways:

a) With an error probability of <a%,> x% of the molecule is present in the correct spatial structure.
b) With an error probability <a% is> y% of the molecule in its correct spatial structure.

Da nicht alle denaturierte Moleküle im NMR-Spektrum sichtbar sind, weil beispielsweise denaturierte Moleküle miteinander aggregieren können, muss eine Absoluteichung auf einen internen Standard durchgeführt werden. Diese Absoluteichung umfasst die Quantifizierung der Intensitäten der Peaks und sollte am besten bei der Messung des Referenzspektrums vorgenommen werden.Because not all denatured molecules in the NMR spectrum are visible because, for example, denatured molecules together can aggregate, an absolute calibration to an internal standard must be carried out. This absolute calibration includes the quantification of the intensities of the Peaks and should be best when measuring the reference spectrum be made.

Der einzelne Spektrenvergleich kann beispielsweise durch kommerzielle Software vorgenommen werden, wie sie auch für die rein qualitative Strukturanalyse, d.h. die einfache Ja/Nein-Identifikation eines Moleküls gängig sind. Ein Beispiel für eine solche Software ist die sog. Software „AMIX" der Firma Bruka.The individual spectra comparison can for example, be made through commercial software, such as them for too the purely qualitative structural analysis, i.e. easy yes / no identification of a molecule are common. An example for one such software is the so-called "AMIX" software from Bruka.

Eine Reihe von Spektrenvergleichsmethoden ist in AMIX bereits implementiert und wird in verschiedenen Anwendungen zum Einsatz gebracht. Es ist zu untersuchen, inwieweit diese Methoden einzeln oder in Kombinationen, eventuell mit entsprechenden Erweiterungen für die Proteinidentifikation eingesetzt werden können. Eine Identifikation kann nicht stattfinden, wenn das Testspektrum sich vom Referenzspektrum unterscheidet, wobei zu definieren ist, welcher Art die Unterschiede sind (Peak Shifts, fehlende Peaks, zu viele Peaks, Linienformänderungen, Integraländerungen, etc.) und wo die Toleranzgrenze liegt. Der ideale Algorithmus sollte daher nicht nur einen nominierten Ähnlichkeitswert liefern können, sondern bei Bedarf auch eine Ja/Nein Aussage treffen können. Grundsätzlich können bei der Berechnung die beiden Spektren vertauscht werden, so dass sich einige Faktoren, z. B. ro viele Peaks oder zu wenig Peaks, zusammenfassen lassen.A number of spectral comparison methods are already implemented in AMIX and are used in various applications. The extent to which these methods are used individually or in Combinations, possibly with corresponding extensions for protein identification can be used. Identification cannot take place if the test spectrum differs from the reference spectrum, whereby it is necessary to define what the differences are (peak shifts, missing peaks, too many peaks, line shape changes, integral changes, etc.) and where the tolerance limit lies. The ideal algorithm should therefore not only be able to provide a nominated similarity value, but should also be able to make a yes / no statement if necessary. Basically, the two spectra can be interchanged during the calculation, so that some factors, e.g. B. ro summarize many peaks or too few peaks.

Im Folgenden sollen drei verschiedene Ausführungsbeispiele a, b, c erläutert werden, die sich im wesentlichen dadurch unterscheiden, dass im Fall a die Resonanzen des Referenzspektrums nicht zugeordnet sind, in Fall b die Resonanzen des Referenzspektrums weitgehend zugeordnet sind und im Fall c zusätzlich zu b die dreidimensionale Struktur (z. Bsp. aus der Röntgenstrukturanalyse,NMR-Strukturbestimmung oder Strukturvorhersage) bekannt ist. Die spezifische Methode, die in Fall b und c zur Zuordnung der Resonanzlinien genutzt wird, ist für das beschriebene Verfahren nicht relevant, effektive Zuordnungsstrategien sind bekannt und publiziert (vgl. bspw. Cavanagh et al. „Protein NMR spectroscopy, principles and practice", Academic Press, 1996).Below are three different ones embodiments a, b, c explained which differ essentially in that in Case a the resonances of the reference spectrum are not assigned, in case b the resonances of the reference spectrum are largely assigned are and in case c in addition to b the three-dimensional structure (e.g. from X-ray structure analysis, NMR structure determination or structure prediction) is known. The specific method that in cases b and c is used to assign the resonance lines for the described methods not relevant, effective allocation strategies are known and published (see, for example, Cavanagh et al. “Protein NMR spectroscopy, principles and practice ", Academic Press, 1996).

Für die Erstellung des Referenzspektrums oder der Referenzspektren sind nur die Teile 1–4 relevant. Durch Vermessung des Moleküls unter verschiedenen Bedingungen und in verschiedenen strukturellen Zuständen kann eine ganze Bibliothek von Referenzspektren angelegt werden. Hierzu werden zunächst die Spektren selbst aufgenommen und gemäß einer definierten Vorschrift optimal prozessiert . Dann wird jedem Peak im Spektrum einem Strukturelement zugeordnet und in digitaler Form abgespeichert. Das Spektrum selbst setzt sich aus verschiedenen Klassen von Signalen zusammen, der Klasse C₁ der Signale von dem oder den Molekülen mit richtiger Struktur, der Klasse C₂ der Signale von gewünschten anderen Komponenten in der Referenzprobe (z. Bsp. Puffer), der Klasse C₃ der Signale des oder der Moleküle in unerwünschter Form, der Klasse C₄ der Signale anderer Substanzen (Verunreinigungen), die unerwünscht sind, der Klasse C₅ der Artefaktsignale (Mess- oder Prozessierungsartefakte) und der Klasse C₆ der Rauschsignale. Klasse C₇ ist die Klasse der Signale eines Standards (z. Bsp. DSS), die den Referenzproben in fester Absolutkonzentration zugesetzt wurde. Dieser Standard dient zur Referenzierung der Frequenzskala und zur Absoluteichung der Signalintensitäten. Nur die Signale der Klassen C₁ und C₃ sind für die Beurteilung der Probenqualität relevant, die Kenntnis und Abspeicherung der Klassen C₂ und C₄ kann hilfreich sein, während die von Messung zu Messung variablen Signale der Klassen C₅ und C₆ im allgemeinen eliminiert werden. Für die Eliminierung der Signale der Klassen C₅ und C₆ eignet sich z. Bsp. eine Bayessche Analyse.For are the creation of the reference spectrum or the reference spectra only parts 1–4 relevant. By measuring the molecule under different conditions and in different structural states an entire library can of reference spectra. First, the spectra self recorded and according to a optimally processed defined rule. Then every peak assigned to a structural element in the spectrum and in digital form stored. The spectrum itself is made up of different ones Classes of signals together, class C₁ the Signals from the molecule or molecules with the right structure, class C₂ the Signals from desired other components in the reference sample (e.g. buffer), the class C₃ the signals of the molecule or molecules in unwanted Form, class C₄ the signals of others Class C substances (impurities) that are undesirable₅ the artifact signals (measurement or processing artifacts) and class C₆ of the noise signals. great C₇ is the class the signals of a standard (e.g. DSS) that correspond to the reference samples was added in a fixed absolute concentration. This standard is used for referencing the frequency scale and for absolute calibration the signal intensities. Class C signals only₁ and C₃ are for the assessment of the sample quality relevant, the knowledge and storage of classes C₂ and C₄ can be helpful during the from measurement to measurement variable signals of class C₅ and C₆ generally eliminated. For elimination Class C signals₅ and C₆ is suitable for. For example, a Bayesian analysis.

Signale der Klasse C₁ (und bei Vorliegen einer entsprechenden Zuordnung) der Klassen C₂ bis C₄ können in Fall b nach Ausschluss der Klassen C₅ und C₆ direkt auf Grund ihrer chemischen Verschiebung identifiziert werden (vgl. bspw. Wolfram Gronwald et al., „RFAC, a program for automated NMR-R-factor estimation", J. Biomol. NMR 17, 137-151 (2000)), im Fall c auch durch Rückrechnung strukturabhängiger NMR Spektren. Im Fall a können die Signale der Klasse C, prinzipiell durch Ausschluss der anderen Signalklassen (z. Bsp. Aufnahme von Referenzspektren unter Variation der Konzentrationen der Komponenten, die die Signale der Klassen C₂ bis C₄ erzeugen).Signals of class C ₁ (and if there is a corresponding assignment) of classes C ₂ to C ₄ can be identified in case b after the exclusion of classes C ₅ and C ₆ directly on the basis of their chemical shift (see, for example, Wolfram Gronwald et al ., "RFAC, a program for automated NMR-R-factor estimation", J. Biomol. NMR 17, 137-151 (2000)), in case c also by recalculating structure-dependent NMR spectra. In case a, the signals of the class can C, in principle by excluding the other signal classes (e.g. recording reference spectra while varying the concentrations of the components that generate the signals of classes C ₂ to C ₄ ).

Die Signale der Klassen C₁ bis C₄ werden separat gespeichert. Falls eine Variation der Messbedingungen in der späteren Auswertung zugelassen werden soll, auch in der Abhängigkeit von den Messbedingungen. Die Signale können entweder direkt pixel- (voxel-)weise abgespeichert werden, oder spezifische Merkmale wie Position (chemische Verschiebung), Volumen, Amplitude, Multiplettstruktur und Linienbreite können extrahiert und abgespeichert werden. Für die direkte Abspeicherung ist unter anderem eine iterative Segmentierung geeignet (Nei- dig, K.-P. & Kalbitzer, N. R. „Improved representation of 2D NMR spectra by local rescaling", J. Magn. Reson. 88, 155–160 (1990); Geyer, M., Neidig, K.-P. & Kalbitzer, H. R. „Automated peak integration in multidimensional NMR spectra by an optimized iterative segmentation procedure", J. Magn. Reson. B 109, 31–38 (1995)). Im Fall c können alternativ alle zur Spektrensimulation wesentlichen Parameter abgespeichert werden, aus denen sich dann das/die Spektren rückrechnen lassen.Class C ₁ to C ₄ signals are stored separately. If a variation of the measurement conditions is to be permitted in the later evaluation, also depending on the measurement conditions. The signals can either be saved directly pixel-by-pixel (voxel-wise), or specific features such as position (chemical shift), volume, amplitude, multiplet structure and line width can be extracted and saved. Iterative segmentation is suitable for direct storage, among others (Neigig, K.-P. & Kalbitzer, NR "Improved representation of 2D NMR spectra by local rescaling", J. Magn. Reson. 88, 155-160 (1990 ); Geyer, M., Neidig, K.-P. & Kalbitzer, HR "Automated peak integration in multidimensional NMR spectra by an optimized iterative segmentation procedure", J. Magn. Reson. B 109, 31-38 (1995)) , In case c, all parameters essential for spectra simulation can alternatively be stored, from which the spectra can then be recalculated.

Zugleich mit diesen Daten muss die Detektionsgrenze der benutzten Referenzspektren (außer in Fall c) bestimmt werden, die im einfachsten Fall durch das globale Signal-zu-Rausch-Verhältnis vorgegeben ist.At the same time as this data, the Detection limit of the reference spectra used (except in case c) are determined, which in the simplest case are predetermined by the global signal-to-noise ratio is.

Vergleich der Testspektren mit den Referenzspektrencomparison of Test spectra with the reference spectra

Die Testspektren werden unter den selben Bedingungen aufgenommen und prozessiert wie die Referenzspektren. Im nächsten Schritt wird das Integral des Referenzsignals bestimmt, z. Bsp. mit der automatischen iterativen Segmentierungsroutine (vgl. Geyer, M., Neidig, K.-P. & Kalbitzer, H. R. „Automated peak integration in multidimensional NMR spectra by an optimized iterative segmentation procedure", J. Magn. Reson. B 109, 31–38 (1995)), wie sie im Programm AURELIA implementiert ist. Mit. diesem Integral wird das Signal-zu-Rausch-Verhältnis bestimmt, und gleichzeitig werden alle Signalintensitäten normiert. Im Testspektrum werden mit bekannten Peakpickingroutinen (vgl. bspw. Neidig, P., Bodenmüller, H. & Kalbitzer, H. R. „Computer aided evaluation of two-dimensional NMR spectra of proteins", Biochem. Biophys. Res. Comm. 125, 1143–1150 (1984)) Signale gesucht und mit der Bayesschen Analyse Signale als zugehörig zu den verschiedenen Signalklassen bewertet.The test spectra are recorded and processed under the same conditions as the reference spectra. In the next step, the integral of the reference signal is determined, e.g. For example, with the automatic iterative segmentation routine (cf. Geyer, M., Neidig, K.-P. & Kalbitzer, HR "Automated peak integration in multidimensional NMR spectra by an optimized iterative segmentation procedure", J. Magn. Reson. B 109 , 31-38 (1995)), as implemented in the AURELIA program. With this integral, the signal-to-noise ratio is determined, and at the same time all signal intensities are normalized. In the test spectrum, known peak-picking routines (cf. Neidig, P., Bodenmüller, H. & Kalbitzer, HR “Computer aided evaluation of two-dimensional NMR spectra of proteins ", Biochem. Biophys. Res. Comm. 125, 1143-1150 (1984)) sought signals and evaluated signals as belonging to the different signal classes with the Bayesian analysis.

Die Signale R_i(C_j) der verschiedenen Signalklassen C₁ bis C₄ des/der Referenzspektren werden im Testspektrum iterativ dadurch identifiziert, dass im ersten Schritt nach Signalen (Peakmaxima oder Peakminima) an den Stellen im Testspektrum gesucht wird, an denen in den Referenzspektren Signale zu finden sind. Ein N-dimensionaler Vektor r_s,i (mit N gleich der Anzahl der Dimensionen des NMR-Spektrums) wird definiert, in dem ein oder mehrere Testsignale S_Tj potentiell einem gegebenen Referenzsignal S_R,i zugehören können. Der Komponenten r_s,i ^k des Suchvektors r_s,i sind definiert als

mit D^k der digitalen Auflösung in der k-ten Dimension und d_i ^k der experimentell bestimmten oder abgeschätzten Unsicherheit der Position des Testsignals S_i in der k-ten Dimension. Im allgemeinen wird mehr als ein Testsignal einem Referenzsignal zu zuordnen sein und vice versa. Die wahrscheinlichste Lösung kann durch Maximierung der zugehörigen Wahrscheinlichkeiten gefunden werden, wobei die wahrscheinlichste Lösung in einfachen Fällen durch die Permutation aller wechselseitigen Zuordnungen oder in komplizierteren Fällen durch geeignete bekannte Suchalgorithmen (z. B. simulated anealing , threshold accepting, genetische Algorithmen, neuronale Netze) gefunden werden. Diese Wahrscheinlichkeiten können entweder nichtnormiert, semiquantitativ ermittelt werden (score values) oder aus einem statistischen Ansatz gewonnen werden.The signals R _i (C _j ) of the different signal classes C ₁ to C ₄ of the reference spectra are identified iteratively in the test spectrum by first searching for signals (peak maxima or peak minima) at the points in the test spectrum where the Reference spectra signals can be found. An N-dimensional vector r _{s, i} (with N equal to the number of dimensions of the NMR spectrum) is defined in which one or more test signals S _{Tj can} potentially belong to a given reference signal S _{R, i} . The components r _{s, i} ^{k of} the search vector r _{s, i} are defined as

with D ^k the digital resolution in the k th dimension and d _i ^k the experimentally determined or estimated uncertainty of the position of the test signal S _i in the k th dimension. In general, more than one test signal will have to be assigned to a reference signal and vice versa. The most probable solution can be found by maximizing the associated probabilities, the most probable solution in simple cases by permutation of all mutual assignments or in more complicated cases by suitable known search algorithms (e.g. simulated anealing, threshold accepting, genetic algorithms, neural networks) being found. These probabilities can either be non-standardized, determined semi-quantitatively (score values) or obtained from a statistical approach.

Allgemein ausgedrückt werden Eigenschaften der Referenzsignale zusammengefasst in einem Eigenschaftsvektor E_R _,i mit den Eigenschaften der Testsignale zusammengefasst in einem Eigenschaftvektor E_Tj verglichen und bewertet. Geeignete Eigenschaften sind unter anderen der Abstand zwischen Referenz und Testsignal, die Volumina, die Signalform. Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen p(E_R,i) können entweder experimentell aus Testspektren gewonnen werden oder mit einem geeigneten Modell abgeschätzt werden.In general terms, properties of the reference signals combined in a property _vector E _R _{, i are} compared and evaluated with the properties of the test signals combined in a property _vector E _Tj . Suitable properties include the distance between the reference and the test signal, the volumes and the signal shape. The probability distributions p (E _{R, i} ) can either be obtained experimentally from test spectra or can be estimated using a suitable model.

Berechnung von QualitätskriterienCalculation of quality criteria

a) Relativer Anteil an gefaltetem Proteina) Relative share of folded protein

Der relative Anteil wohlgefalteten Proteins kann durch Vergleich der normierten Signalintensitäten der Signalklasse C, erhalten werden. Hierzu werden ein oder mehrere Spektrentypen verglichen mit dem Ziel, die Intensitäten für mehrdimensionale Signale (cross peaks) von möglichst allen den Protein zugehörigen NMR-nachweisbaren Kernen zu erhalten. Der wahrscheinliche Wert sf kann analog zu dem Verfahren, das zur Berechnung von NMR-Faktoren entwickelt wurde, berechnet werden (vgl. Gronwald, W., Kirchhöfer, R. Görler, A., Kremer, W., Ganslmeier, B., Neidig, K.-P. & Kalbitzer, H. R. „RFAC, a program for automated NMR-R-factor estimation", J. Biomol. NMR 17, 137-151(2000)).The relative proportion of well-folded Proteins can be obtained by comparing the normalized signal intensities of the signal class C, can be obtained. For this, one or more types of spectra compared with the goal of intensities for multidimensional signals (cross peaks) of possible all NMR-detectable belonging to the protein To get cores. The probable value sf can be analogous to that Method developed for the calculation of NMR factors (see Gronwald, W., Kirchhöfer, R. Görler, A., Kremer, W., Ganslmeier, B., Neidig, K.-P. & Kalbitzer, H. R. "RFAC, a program for automated NMR-R-factor estimation ", J. Biomol. NMR 17, 137-151 (2000)).

Hierbei sind I_ref,i die Volumina der Signale i der Klasse C₁ der Referenzspektren und I_test,i die Volumina der zugehörigen Signale im Testspektrum. Da einzelne Signale des Referenz- oder Testspektrums mit Signalen der Klasse C₂ bis C₆ überlagert sein können, die die Signalintensität verfälschen, wird sf iterativ optimiert. Zunächst wird die Standardabweichung σ für das gegebene sf berechnet als

und die Signale werden entfernt, für die gilt

Die Schritte 1 bis drei werden iterativ wiederholt bis die Bedingung gemäß Gleichung (3) für alle Signale erfüllt ist.I _{ref, i are} the volumes of the signals i of class C _{1 of} the reference spectra and I _{test, i} the volumes of the associated signals in the test spectrum. Since individual signals of the reference or test spectrum can be superimposed with signals of classes C ₂ to C ₆ , which falsify the signal intensity, sf iterative optimization. First, the standard deviation σ for the given sf is calculated as

and the signals for which applies are removed

Steps 1 to 3 are repeated iteratively until the condition according to equation (3) is fulfilled for all signals.

Der Anteil des gefalteten Proteins c_P kann dann berechnet werden als

mit I_ref,stan und I_test,stan den Intensitäten des Stanardsignals in Referenz- und Testprobe. Der Fehler Δc_P wird abgeschätzt als

mit t(N,p) als dem Korrekturwert aus der t-Verteilung für die Stichprobe der Größe N und mit p als der vorgegebenen Wahrscheinlichkeit.The proportion of the folded protein c _P can then be calculated as

with I _{ref, stan} and I _{test, stan} the intensities of the standard signal in the reference and test sample. The error Δc _P is estimated as

with t (N, p) as the correction value from the t distribution for the sample of size N and with p as the given probability.

Als Endergebnis ergibt sich, dass der Anteil des gefalteten Proteins mit der Wahrscheinlichkeit p ≥ c_p – Δc_p ist.The end result is that the proportion of the folded protein with the probability p ≥ c _p - Δc _p .

b) Maximaler Anteil an nicht vollständig richtig gefalteten Proteinb) Maximum proportion of not completely properly folded protein

Aus der Analyse der Referenzspektren wird ein Subset S von sicheren Proteinsignalen identifiziert, die ungestört beobachtbar sind und die native Konformation vollständig beschreiben. In Fall a kann dies durch eine Bayessche Analyse erfolgen, die nur Proteinsignale mit hoher Wahrscheinlichkeit beibehält. Spektren mit teildenaturiertem Protein werden aufgenommen und die Signale identifiziert, die signifikant ihre Intensität ändert. In Fall b und c liegen die Zuordnungen vor und damit ist bekannt, ob ein Signal zum nativen Protein gehört. Für die einzelnen Signale des Referenzspektrums wird die Abweichung ΔAi; berechnet mit

From the analysis of the reference spectra, a subset S of safe protein signals is identified, which can be observed undisturbed and completely describes the native conformation. In case a, this can be done using a Bayesian analysis that only maintains protein signals with a high probability. Spectra with partially denatured protein are recorded and the signals identified that significantly change their intensity. In cases b and c the assignments are available and it is therefore known whether a signal belongs to the native protein. For the individual signals of the reference spectrum, the deviation ΔAi; calculated with

Der minimale Anteil c_N an vollständig richtig gefalteten Protein ergibt sich dann aus

The minimum proportion c _N of completely correctly folded protein then results from

Claims

Procedure for verifying the correct spatial Structure of molecules by means of multidimensional NMR spectroscopy, using a reference substance at least one reference spectrum and the test substance to be examined at least one test spectrum is recorded and the one or more reference spectra are compared to the test spectra, characterized by following process steps: a. Definition of a standardized chemical composition of reference and test substance and specification of standardized measurement parameters for reference and test spectrum; b. Automatic verification of the selected chemical composition the reference substance; c. Automatic verification of the measurement parameters when recording the at least one reference spectrum; d. Automatic evaluation and storage of the at least one Available data; e. Automatic verification of the chemical composition of the test substance; f. Automatic verification of the measurement parameters when recording the at least one test spectrum; G. Automatic evaluation and storage of those available from the at least one test spectrum Data; H. Automatic comparison of test spectrum and reference spectrum; i. Automatic determination of the proportion of the test substance its spatial Structure corresponds to that of the reference substance; being the Steps e. to i. can be repeated any number of times.

A method according to claim 1, characterized in that the at least one test spectrum with at least one original reference spectrum is compared.

A method according to claim 1, characterized in that the at least one test spectrum with a simulated reference spectrum is compared.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that homonuclear spectra are recorded.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that heteronuclear spectra be included.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that two or more different types of spectra be included.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that in step h. before the actual comparison any existing artifacts are selected in the spectra.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that in step i. to determine the proportion converted the result of the comparison of the spectra into a probability statement becomes.

A method according to claim 8, characterized in that for Creation of the probability statement as reference spectra in steps a. to d. at least one spectrum of the reference substance with an unwanted one Structure added and the respective structures with the respective R values are correlated.

A method according to claim 8, characterized in that for Creation of the probability statement as reference spectra in steps a. to d. at least one simulated spectrum as Reference substance with an unwanted structure created and the respective structures correlated with the respective R values become.

Computer, programmed to implement the Method according to one of the claims 1 to 10.

Digital storage medium with electronically readable control signals, that can work with a programmed computer in such a way that a method according to one of claims 1 to 10 is carried out.

Computer program product for performing the method according to a of claims 1 to 10 after implementation in a computer according to claim 11.

The computer program product of claim 14 stored on a disk, in particular a hard disk, a floppy disk, a CD-ROM or a storage tape.