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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein qualitatives oder quantitatives Nachweisverfahren für das lokale
Vorliegen von Entzündungs-
und Allergie-Mediatoren, wie Cytokinen, Prostaglandinen und Leukotrienen.
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Sehr viele Frauen leiden an akuten
oder chronischen Vaginalinfektionen, die häufig von Juckreiz und Schmerzen
und gegebenenfalls Ausfluss begleitet sind. Einer der häufigsten
Erreger dieser Infektionen ist Candida albicans, und über 75%
aller Frauen hatten ein oder mehrere Male eine Infektion mit diesem
Erreger.
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C. albicans ist eine pleiomorphe
Hefe, die sowohl in der Hyphen- als auch in der Myzel- (echtes oder
Pseudo-) Form auftritt. Die Hyphenform verursacht, im Gegensatz
zu der Myzelform, keine klinischen Symptome. Der Nachweis von C.
albicans geschieht in Kultur eines Vaginalabstrichs.
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Candida-Infektionen treten in asymptomatischer,
akuter, persistenter, wiederkehrender oder chronisch wiederkehrender
Form auf. Die asymptomatische Form ist nicht immer in einer Kultur
nachweisbar. Die Äthiologie
der chronisch wiederkehrenden Candidiasis nach einem Zeitraum mit
negativer Hefekultur ist nicht eindeutig geklärt. Es wird angenommen, daß es sich
um einen zellulären
Immundefekt handelt, da T-Zellen und Makrophagen in ungenügender Zahl
vorliegen. Möglicherweise
spielt auch eine allergische Reaktion auf das Candida-Allergen eine
Rolle, welche die zelluläre
Immunabwehr unterdrückt.
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Eine weiterer potentieller Erreger
für Vaginalinfektionen
ist Escherichia choli. E. choli ist ein allgegenwärtiges Bakterium,
das natürlich
in der Darmflora vorkommt. Man kann jedoch zahlreiche Serotypen unterscheiden,
von denen einige pathogen sind und beispielsweise eine Kolpitis
und/oder Harnwegsinfektion hervorrufen können. Der Nachweis von E. choli
findet gewöhnlich
ebenfalls in Kultur statt. Dabei ist es jedoch schwierig, zwischen
pathogenen und nicht-pathogenen Stämmen zu unterscheiden.
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Die beiden oben genannten Infektionen
sind lediglich Beispiel für
besonders häufige
Vaginalinfektionen, und der Fachmann weiß, daß es zahlreiche weitere Beispiele
dafür gibt.
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Eine frühzeitige Erkennung und Behandlung von
Vaginalinfektionen ist bei einer bestehenden Schwangerschaft besonders
wichtig, da sie zu einer Frühgeburt
führen
können.
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Es wäre also wünschenswert, über das
klassische Verfahren einer Erreger-Kultur hinaus über ein schnelles
und einfach durchzuführendes
Verfahren zu verfügen,
das Auskunft gibt, ob eine entzündliche und/oder
allergische Reaktion in der Scheide vorliegt. Dies hat sich die
vorliegende Erfindung zur Aufgabe gestellt.
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Demgemäß betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum lokalen qualitativen oder quantitativen
Nachweis von Entzündungs-
und/oder Allergie-Mediatoren mittels PCR (Polymerase Chain Reaction),
LCR (Ligare Chain Reaction) und/oder Enzym- oder Radioimmunoassay
in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probe
ein Vaginalabstrich-, -sekret oder eine Vaginallavage ist.
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Bei den Entzündungs- und/oder Allergie-Mediatoren,
die erfindungsgemäß nachgewiesen
werden, handelt es sich insbesondere um Cytokine, wie Tumornekrosefaktor
(TNF), Interferon-γ (IFN-γ) und die
Interleukine (IL), beispielsweise IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10
and IL-12 und der IL-1-Rezeptorantagonist
(IL-1ra), und um Lipid-Mediatoren, wie die Prostaglandine (z.B.
PGE1, PGE2, PGI2 und PGF2) und Leuktriene
(z.B. LTB4).
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Bei der Probe handelt es sich bevorzugt
um denselben Vaginalabstrich, dasselbe Vaginalsekret oder dieselbe
Vaginallavage, der bzw. das bzw. die für die Zytologie und den Nachweis
von pathogenen Erregern verwendet wird.
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Cytokine können grob in zwei Klassen eingeteilt
werden:
- (1) entzündungsfördernde Cytokine; dazu gehören TNF,
IFN-γ, IL-1,
IL-2 und I1-12; sie stehen mit der T-Zell-vermittelten Immunantwort in Beziehung,
z.B. der Differenzierung von CD4+-Zellen
zu TH1-Zellen und der Aktivierung von Makrophagen und
NK-Zellen, und hemmen die Bildung von TH2-Zellen.
- (2) entzündungshemmende
Cytokine: dazu gehören
IL-4, IL-10 und
IL-1ra, der ein natürlicher
kompetitiver Inhibitor von IL-1 ist, um eine überschießende IL-1-Produktion zu verhindern. IL-4 stimuliert
die Differenzierung von CD4+-Zellen zu TH2-Zellen und wird, zusammen mit IL-10, wiederum
von diesen sekretiert.
IL-4 und IL-10 hemmen die Makrophagen-Aktivierung
und die Differenzierung von CD4+-Zellen
zu TH1-Zellen.
IL-4 ist das Haupt-Cytokin, das die Produktion von IgE und damit
eine allergische Reaktion stimuliert.
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IL-6 nimmt eine Zwischenstellung
zwischen diesen beiden Klassen ein.
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Viren und Bakterien, die intrazellulär leben, stimulieren
eine zelluläre
Immunantwort unter Beteiligung der unter (1) aufgeführten Cytokine.
Gewöhnliche
Bakterien stimulieren meist sowohl die TH1-Zellenbildung
als auch die TH2-Zellenbildung. Es liegen dann
sowohl die unter (1) als auch die unter (2) aufgeführten Cytokine
vor.
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Die herrschende Meinung ist, daß auch für mit C.
albicans infizierter Schleimhaut die zelluläre Immunantwort entscheidend
ist, d.h. die unter (1) aufgeführten
Cytokine werden bei einer derartigen Infektion vorgefunden. Wenn
dies, trotz positiver Kultur, nicht oder nur in geringem Ausmaß der Fall
ist und vor allem die unter (2) angeführten Cytokine nachgewiesen
werden, liegt eine Allergie gegen Candida vor, was zur Folge hat,
daß wegen
der Unterdrückung
der TH1-Zellbildung keine zellvermittelte
Immunantwort zustande kommt. Dies könnte eine der Ursachen für die (ggf.
chronisch) wiederkehrende Infektion sein, wenn bei der Behandlung
nicht alle Keime getötet
worden sind.
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Insbesondere die Anwesenheit der
unter (1) aufgeführten
Cytokine in einer untersuchten Vaginalabstrich-, -sekretoder -lavage-Probe
gestatten den Schluß,
daß ein
pathogener Keim vorhanden ist. Ihr Fehlen und das Vorhandensein
von der unter (2) aufgeführten
Cytokine kann, wenn durch Kultur die Anwesenheit eines solchen Keims
nachgewiesen ist, den Schluß zulassen,
daß ein
Immundefekt und/oder eine allergische Reaktion vorliegt.
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Auch Prostaglandine und Leukotriene
sind bedeutende Entzündungsmediatoren.
Sie weisen eine lokal und zeitlich begrenzte Wirkung an ihrem Wirkort,
z.B. dem Ort der Entzündung,
auf. PGE2 führt zu Vasodilatation und potenziert
die erhöhte vaskuläre Permeabilität, die von
Histamin und Bradykinin erzeugt wird. LTB4 wird
ebenfalls am Ort der Entzündung
gebildet und ruft u.a. eine chemotaktische Reaktion hervor, bei
der Leukozyten zum Ort der höchsten
LZB4-Konzentration wandern. Ihr Nachweis
im Vaginalabstrich deutet ebenfalls auf eine Entzündung hin.
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Der Nachweis der Cytokine, bei den
es sich ja um Peptide handelt, kann mittels PCR oder LCR oder auch
anhand eines ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) vorgenommen
werden.
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Geeignete ELISA-Kits für Cytokine
sind z.B. von der Firma, BioSource International erhältlich.
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Bei der PCR oder LCR wird gewöhnlich zunächst eine
Reverse Transcription (RT) der vorhandenen mRNA in cDNA vorgenommen.
Diese cDNA wird dann unter Verwendung eines Cytokin-spezifischen
Primerpaars mittels PCR oder LCR auf solche Weise amplifiziert,
daß eine
qualitative oder vorzugsweise quantitative Bestimmung möglich ist.
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Bei der PCR geschieht dies z.B. mit
Hilfe einer Sonde, die in geeignetem Abstand für ein Quenchen gemäß dem Förstermechanismus
eine fluoreszierende Markierung und einen deren Fluoreszenz quenchenden
Fluoreszenzquencher aufweist und mit der gesuchten Cytokinsequenz
hybridisiert. Bei der Hybridisierung – und nur dann – spaltet
die Taq-Polymerase
die Sonde zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Fluoreszenzquencher.
Aufgrund des vergrößerten Abstands
zwischen diesen findet dann kein Fluoreszenzquenchen mehr statt.
Die nun auftretenden Fluoreszenz ist, wenn sie geeignet anhand eines
Standards normalisiert wird, ein direktes Maß für die Größe des Signals. Aus diesem
kann bei geeigneter Kalibirierung die anfäng 1iche Zahl der Kopien der
gesuchten Sequenz bestimmt werden.
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Ein geeignetes Kit zur Durchführung einer solchen
PCR für
diverse Interleukine mit den entsprechenden Primerpaaren und Sonden
ist von der Firma BioSource International, Inc. als Real Time PCR® Reagents
auf dem Markt. Diese Reagenzien sind zur Verwendung mit dem Taq-Reagenzkit
ABI TagMan® Universal
PCR Master Mix Reagents optimiert, können aber auch mit anderen
Taq-Reagenzien verwendet werden. Reverse Transcriptions-Reagenzien
sind z.8. von Applied Biosystems (ABI), Stratagene, Clontech erhältlich.
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Prostaglandine und Leukotriene werden
bevorzugt mittels ELISA quantitativ bestimmt. Geeignete Antikörper sind
von einer Vielfalt von Quellen, u.a. BioSource International Inc.
und der Acris GmbH, D-32120 Hiddenhausen, erhältlich, die auch komplette
ELISA-Kits für
die wichtigsten Prostaglandine und für LTB4 liefert.
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Auf Grund der Empfindlichkeit dieser
beiden Techniken ist es möglich,
mit einem sehr geringen Probenvolumen auszukommen. Demgemäß kann ein
einziger Abstrich dazu verwendet werden, eine zytologische Untersuchung,
Nachweise von Keimen und die Nachweise von Entzündungsmediatoren durchzuführen.
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Die folgenden Beispiele erläutern die
Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1
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Bestimmung von Interleukienen
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Zur Entnahme von Vaginalzell- und
-sekretmaterial werden mittels einer sterilen Spritze 2 ml sterile
physiologi sche Kochsalzlösung
in die Scheide eingebracht. Mittels eines Watteträgers wird
eine Vaginallavage vorgenommen. Mit einer sterilen Spritze wird
dann 1 ml der so erhaltenen Lavageflüssigkeit entnommen und sofort
ins Labor gebracht.
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Dort wird die Flüssigkeit 2 min bei 8000 U/min
zentrifugiert, und der Überstand
wird bei -70°C aufbewahrt.
Das Pellet wird für
die zytologische und mikrobielle Untersuchung sowie für gegebenenfalls für eine PCR
verwendet.
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1.1 ELISA von IL-10
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Für
den ELISA wird der Überstand
aufgetaut und bei 4°C
gehalten.
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Der ELISA wird mittels eines kommerziellen Kits
(BioSource International, Katalog-Nr.KHC0101) bei 4°C durchgeführt.
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1.2 RT-PCR mit IL-2
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Gemäß den üblichen Verfahren wurde das Pellet
aus der Zentrifugation lysiert und wurden die Nukleinsäuren gewonnen.
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Mit der so erhaltenen Probe wurde
zunächst eine
Reverse Transcription mit dem RT-Kit TagMan® Reverse
Transcription Reagents (ABI) gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
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Dann wurden unter Verwendung einer
IL-2 FRET-Sonde (ABI), eines humanen IL-2-Primerpaars (ABI), des
ABI TagMan® Universal
Master Mix und der oben erzeugten cDNA sowie einer Blindprobe, einer
positiven Kontrolle und einer RNA-Kontrolle Reaktionsmischungen gemäß den Empfehlungen
des Herstellers für
die PCR hergestellt. Die empfohlenen Mengen (jeweils 50 μ1) wurden
in Röhrchen überführt und
zum Mischen und Entfernen von Luftblasen zentrifugiert. Dann wurde
jede Reaktionsmischung in Vertiefungen einer optischen Reaktionsplatte
mit 96 Vertiefungen gegeben. Diese wurden verschlossen, und die
Platte wurde zentrifugiert, um den Inhalt nach unten zu befördern und
Luftblasen zu entfernen.
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Die Platten wurden dann in ein ABI
PRISM 7700 Sequence Detection System gegeben und wie folgt thermischen
Zyklen unterzogen:
Enzym-Aktivierung: 95°C, 10 min;
Thermozyklen
(40):
Denaturierung: 95°C,
15 s
Hybridisierung, Verlängerung:
60°C, 1
min.
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Nach jedem Zyklus wird das Fluoreszenz-Signal
gemessen, das in einem Amplifikations-Diagramm wiedergegeben wird.
Durch Vergleich mit einer Kalibrierungskurve kann die Zahl der anfänglich vorhandenen
Kopien von IL-2 bestimmt werden.
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Beispiel 2
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Derselbe Überstand wie oben wurde auch zur
Durchführung
eines ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) für die Bestimmung
von LTB4 verwendet.
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Zur Durchführung des Assays wurde das ELISA-Kit
für Leukotrien
B4 (LTB4) der Acris GmbH verwendet, dessen
Nachweisbereich im Bereich von 8 bis 2000 pg/ml liegt. Es wurde
nach den Empfehlungen des Herstellers vorgegangen. Die Anweisungen
des Herstellers können
im Internet unter der Web-Adresse www.acris-antibodies.de, Katalog-Nr. 900-068, eingesehen werden.