DE10224140A1 - Production of amperometric biosensor used for determining hydrogen peroxide concentration comprises coating screen printed two electrode system with composition comprising polymer, mediator and enzyme - Google Patents
Production of amperometric biosensor used for determining hydrogen peroxide concentration comprises coating screen printed two electrode system with composition comprising polymer, mediator and enzymeInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft einen preiswerten, einfach und materialsparend zu fertigenden und leicht zu betreibenden amperometrischen Dickschicht-Biosensor zur quantitativen H2O2-Bestimmung von niedrigen Konzentrationen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Sensors. Der erfindungsgemäße Biosensor erlaubt die H2O2-Bestimmung im Konzentrationsbereich von 10 bis 10.000 nM, insbesondere im submikromolaren Bereich. The invention relates to an inexpensive, simple and material-saving to manufacture and easy-to-operate amperometric thick-film biosensor for the quantitative H 2 O 2 determination of low concentrations and a method for producing this sensor. The biosensor according to the invention allows H 2 O 2 determination in the concentration range from 10 to 10,000 nM, in particular in the submicromolar range.
Vor allem im medizinischen und umweltanalytischen Bereich ist es wünschenswert, über preiswerte und einer Massenfertigung leicht zugängliche Biosensoren zur H2O2-Bestimmung im submikromolaren Bereich zu verfügen. Especially in the medical and environmental analytical field, it is desirable to have inexpensive and easily accessible mass production biosensors for determining H 2 O 2 in the submicromolar range.
Amperometrische Biosensoren, mit deren Hilfe die Konzentration von bestimmten Stoffen in Lösungen bestimmt werden kann, funktionieren nach dem Grundprinzip, dass die Reaktion des zu bestimmenden Stoffes mit einer biologischen Komponente, oft einem Enzym, mit dem elektrochemischen Detektionsmechanismus kombiniert wird. Dieser enzymatisch- elektrochemische Detektionsmechanismus ist die Reaktion einer Mediatorsubstanz mit dem Enzym im Endzustand nach seiner Reaktion mit dem zu bestimmenden Stoff in der Weise, dass nach der Reaktion des Enzyms und der Mediatorsubstanz das Enzym wieder in seinem ursprünglichen Zustand vorliegt, während die Mediatorsubstanz in einem oxidierten oder reduzierten Zustand vorliegt und in einer elektrochemischen Reaktion an einer Elektrode wieder in seinen Ausgangszustand überführt werden kann. Der bei dieser elektrochemischen Reaktion durch die Elektrode fließende Strom ist der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes proportional und kann gemessen werden. Mit Hilfe einer Kalibration ist somit die quantitative Bestimmung von unbekannten Konzentrationen der zu bestimmenden Stoffe in Lösungen möglich. Amperometric biosensors, with whose help the Concentration of certain substances in solutions can be determined can work on the basic principle that the reaction of the substance to be determined with a biological Component, often an enzyme, with the electrochemical Detection mechanism is combined. This enzymatic electrochemical detection mechanism is the reaction of one Mediator substance with the enzyme in its final state after its Reaction with the substance to be determined in such a way that after the reaction of the enzyme and the mediator substance Enzyme is back in its original state, while the mediator substance in an oxidized or reduced state and in an electrochemical Reaction on an electrode back to its original state can be transferred. The one in this electrochemical The current flowing through the electrode is the reaction Concentration of the substance to be determined proportional and can be measured. With the help of a calibration is thus the quantitative determination of unknown concentrations of the substances to be determined possible in solutions.
Ein derartiges Sensor-Prinzip wird im Patent US 4,882,013 mit Tetrathiafulvalen (TTF) als Mediatorsubstanz in verschiedenen Ausführungsvarianten beschrieben. Such a sensor principle is described in US Pat. No. 4,882,013 Tetrathiafulvalen (TTF) as a mediator substance in different Design variants described.
Die in US 4,882,013 beschriebene erste Ausführungsvariante des Sensor-Prinzips besteht aus einer Graphitfolien-Scheibe auf einem Substrat, die als Elektrode dient und in ein Glasrohr eingeklebt ist. Ein Draht, welcher mit silberhaltigem Klebstoff an der Rückseite der Graphitfolie befestigt ist, dient der Kontaktierung. Diese Elektrode wird für 2 Stunden in eine TTF-haltige Lösung getaucht und danach 60 Minuten an der Luft getrocknet. Danach wird die Elektrode für 90 Minuten in eine Lösung von 1-Cyclohexyl-3(2- morpholinoethyl) carbodiimidmetho-p-toluensulfonat getaucht, welches als bifunktioneller Ligand für die kovalente Anbindung des Enzyms Glucoseoxidase (GOD) dient. Diese so vorbehandelte Elektrode wird nach Abspülen mit destilliertem Wasser 60 Minuten in eine GOD-Lösung getaucht und ist nach abermaligem Spülen mit einem Phosphat-Puffer einsatzbereit. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 25 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 5 mM Glucose. Die Aufbewahrung erfolgt in einer Phosphat-Puffer-Lösung. The first embodiment variant described in US 4,882,013 The sensor principle consists of a graphite foil disc on a substrate that serves as an electrode and in a Glass tube is glued. A wire that with silver-containing adhesive on the back of the graphite foil attached, is used for contacting. This electrode will immersed in a solution containing TTF for 2 hours and then Air-dried for 60 minutes. Then the electrode for 90 minutes in a solution of 1-cyclohexyl-3 (2- morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate, which acts as a bifunctional ligand for the covalent Connection of the enzyme glucose oxidase (GOD) serves. This way pre-treated electrode is rinsed with distilled Water is immersed in a GOD solution for 60 minutes and is after ready for use again with a phosphate buffer. The glucose biosensor produced in this way delivers in Concentration range up to 25 mM glucose a linear Current signal. The smallest measured with this sensor Concentration is 5 mM glucose. The storage takes place in a phosphate buffer solution.
Die zweite Ausführungsvariante besteht aus der oben beschriebenen TTF-modifizierten Elektrode, auf die eine konzentrierte Glucosedehydrogenase-Lösung appliziert wird, welche durch eine mit einem Gummiring befestigte modifizierte Dialyse - Membran auf der Oberfläche gehalten wird. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 10 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 1 mM Glucose. The second variant consists of the one above described TTF-modified electrode, on the one concentrated glucose dehydrogenase solution is applied, which by a modified with a rubber ring modified Dialysis membrane is held on the surface. The way made glucose biosensor delivers in Concentration range up to 10 mM glucose a linear current signal. The smallest concentration measured with this sensor 1 mM glucose.
Eine weitere Ausführungsvariante mit einer verbesserten Enzymimmobilisierung nutzt die Möglichkeit, GOD über seine Kohlenhydratketten aneinander und an die Elektrodenoberfläche zu binden. Dazu wird die oben beschriebene Elektrode 15 Minuten in eine ethanolische Lösung von Hexadecylamin getaucht und danach getrocknet. Die trockene Elektrode wird dann 1 Stunde in eine TTF-Lösung getaucht und wiederum getrocknet. Nach dieser Prozedur wird die Elektrode für 90 Minuten in eine periodatoxidierte GOD Lösung getaucht und danach umgehend in eine Adipin Dihydrazin-haltige Pufferlösung überführt. Nach 30 weiteren Minuten kann die Elektrode mit Wasser gespült und eingesetzt werden oder man bewahrt sie in einer Phosphat-Puffer-Lösung auf. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 15 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 5 mM Glucose. Another embodiment variant with improved enzyme immobilization uses the possibility of binding GOD to one another and to the electrode surface via its carbohydrate chains. For this purpose, the electrode described above is immersed in an ethanolic solution of hexadecylamine for 15 minutes and then dried. The dry electrode is then immersed in a TTF solution for 1 hour and dried again. After this procedure, the electrode is immersed in a periodate-oxidized GOD solution for 90 minutes and then immediately transferred to a buffer solution containing adipine dihydrazine. After another 30 minutes, the electrode can be rinsed with water and inserted, or it can be stored in a phosphate buffer solution. The glucose biosensor produced in this way delivers a linear current signal in the concentration range up to 15 mM glucose. The smallest concentration measured with this sensor is 5 mM glucose.
Es wird weiterhin erwähnt, dass TTF ein geeigneter Mediator für das Enzym L-Aminosäureoxidase ist. Außerdem wird gezeigt, dass ein signifikanter Elektronentransfer über TTF zu einer unbehandelten Glas-Kohle-Elektrode erfolgt, wenn sowohl TTF, GOD sowie Glucose in Lösung vorliegen. Das Cyclovoltammogramm zeigt in einer ca. 20 mM Glucoselösung einen deutlichen Peak. It is also mentioned that TTF is a suitable mediator for the enzyme is L-amino acid oxidase. It also shows that significant electron transfer over TTF to one untreated glass-carbon electrode occurs when both TTF, GOD and glucose are in solution. The cyclic voltammogram shows a clear peak in an approx. 20 mM glucose solution.
Der in US 4,882,013 vorgeschlagene Aufbau von Sensoren, d. h. von auf Kohlenstoff basierenden Elektroden, auf denen Enzyme und Mediatoren immobilisiert sind, so dass mit ihnen ohne weitere Zusätze Stoffkonzentrationen in Lösungen bestimmt werden können, bringt wesentliche Nachteile mit sich. Der Aufbau ist kompliziert, sehr zeitaufwendig und damit teuer und für eine Massenproduktion ungeeignet. Mit den resultierenden Sensoren können nur Konzentrationen im Bereich von 1-25 mM bestimmt werden. Die fertigen Sensoren müssen in einer Pufferlösung aufbewahrt werden. The construction of sensors proposed in US 4,882,013, i. H. of carbon-based electrodes on which enzymes and mediators are immobilized so that with them without further additives substance concentrations in solutions determined can bring significant disadvantages. The Setup is complicated, very time consuming and therefore expensive and unsuitable for mass production. With the resulting sensors can only detect concentrations in the range of 1-25 mM can be determined. The finished sensors must be in a buffer solution.
Das Patent WO 98/35053 beschreibt einen Sensor für den Nachweis und die Messung eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit. Der Sensor umfasst zwei Enzyme. Eine Ausführungsform des Sensors misst die Wasserstoffperoxid- Konzentration, wobei hierfür eine thermostabile Peroxidase benutzt wird, welche in einem Redox-Hydrogel immobilisiert ist und auf diese Weise eine sensitive Schicht auf einer Arbeitselektrode bildet. Dieser Sensor beinhaltet weiterhin ein zweites, Wasserstoffperoxid generierendes Enzym, das von der Redox-Hydrogelschicht und der Elektrode isoliert ist. Dieses zweite Enzym (z. B. Glucoseoxidase oder Lactatoxidase) generiert Wasserstoffperoxid in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Analyten (z. B. Glucose oder Lactat) oder einer aus dem Analyten gebildeten Verbindung. Das zweite Enzym kann von der Elektrode isoliert werden, indem eine elektrisch isolierende Schicht zwischen sensitive Schicht und zweite Enzymschicht gebracht wird. Alternativ kann das zweite Enzym in einer anorganischen polymeren Matrix immobilisert werden, was vorzugsweise in einem Sol-Gel- Polymerisationsprozess realisiert wird. Eine weitere Stabilisierung des Enzyms kann durch die gemeinsame Immobilisierung mit einem Polyelektrolyt-Polymer in einer Sol-Gel-Matrix erreicht werden. The patent WO 98/35053 describes a sensor for the Detection and measurement of an analyte in a biological Liquid. The sensor comprises two enzymes. A Embodiment of the sensor measures the hydrogen peroxide Concentration, with a thermostable peroxidase is used, which is immobilized in a redox hydrogel and is thus a sensitive layer on one Working electrode forms. This sensor still contains a second, hydrogen peroxide generating enzyme, by the redox hydrogel layer and the electrode is insulated. This second enzyme (e.g. glucose oxidase or lactate oxidase) generates hydrogen peroxide depending on the Presence of an analyte (e.g. glucose or lactate) or a compound formed from the analyte. The second Enzyme can be isolated from the electrode by using a electrically insulating layer between sensitive layer and second enzyme layer is brought. Alternatively, the second Enzyme immobilized in an inorganic polymer matrix what is preferably in a sol-gel Polymerization process is realized. Another Stabilization of the enzyme can be done through the common Immobilization with a polyelectrolyte polymer in one Sol-gel matrix can be achieved.
WO 98/35053 betrifft das Gebiet thermostabiler Enzym-Sensoren für unterschiedliche Analyte. Als Beispiele sind Blut-Glucose und Blut-Lactat angeführt. Bei den beschriebenen Sensoren wurde bei einer Temperatur von 37°C eine Abnahme der Empfindlichkeit von 10% festgestellt. Es wird insbesondere auf das Einsatzfeld der in vivo kontinuierlichen Messungen von Blut-Glucose und Blut-Lactat abgezielt. WO 98/35053 relates to the field of thermostable enzyme sensors for different analytes. Examples are blood glucose and blood lactate. With the sensors described was a decrease in the temperature at 37 ° C Sensitivity of 10% determined. It will in particular to the field of application of in vivo continuous measurements targeted by blood glucose and blood lactate.
Der beschriebene Sensor ist eindeutig nicht für die Detektion von Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich geeignet. Die beschriebenen Anwendungen für den Sensor zielen auf eine Konzentration des Analyten im millimolaren Bereich ab. Im Ausführungsbeispiel 15 wird die Empfindlichkeit des Sensors mit 0,8 nA/mM Glucose angegeben und ist damit um etwa 5 Größenordnungen schlechter als die geforderte Empfindlichkeit. Aufgrund der Anordnung des Mehrschichtsystems und der daraus resultierenden großen Schichtdicke der sensitiven Schicht des Sensors können lediglich Ansprechzeiten im Minuten-Bereich erzielt werden. Als besonders nachteilig ist auch das langwierige Herstellungsverfahren des Sensors einzuschätzen (vgl. Ausführungsbeispiel 1). The sensor described is clearly not for detection of concentrations in the lower nanomolar range. The applications described for the sensor are aimed at one Concentration of the analyte in the millimolar range. in the Embodiment 15 becomes the sensitivity of the sensor with 0.8 nA / mM glucose and is thus around 5 Orders of magnitude worse than the required Sensitivity. Due to the arrangement of the Multilayer system and the resulting large Layer thickness of the sensitive layer of the sensor can only response times in the minutes range can be achieved. The lengthy process is also particularly disadvantageous Assess the manufacturing process of the sensor (cf. Embodiment 1).
Aufgabe der Erfindung war es, einen preiswerten, einfach zu fertigenden und somit massenproduktionstauglichen Sensor für die quantitative H2O2-Konzentrationsbestimmung im submikromolaren Bereich bereitzustellen, der sich durch eine kurze run in-Phase auszeichnet. Der Sensor soll einfach handhabbar, leicht zu betreiben, robust gegenüber mechanischen Einflüssen, haltbar und ohne großen Aufwand lagerfähig sein. Aufgabe der Erfindung war es auch, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors anzugeben. The object of the invention was to provide an inexpensive, easy-to-manufacture and therefore mass-production-compatible sensor for quantitative H 2 O 2 concentration determination in the submicromolar range, which is characterized by a short run-in phase. The sensor should be easy to handle, easy to operate, robust against mechanical influences, durable and easy to store. The object of the invention was also to provide a method for producing such a sensor.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass sich ein solcher H2O2-Sensor gemäß den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 herstellen lässt. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Herstellungsverfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche. Surprisingly, it has been shown that such an H 2 O 2 sensor can be produced in accordance with the characterizing features of claim 1. Advantageous embodiments of the manufacturing method are the subject of the subclaims.
Zur Herstellung des 2-Elektrodensystems wird im Siebdruckverfahren auf ein Substrat, das vorzugsweise ein übliches Keramiksubstrat, z. B. der Firmen Ceramtec, Kyocera oder Coors ist, eine Platin- oder Goldelektrode als Arbeitselektrode aufgebracht. Als Gegenelektrode wird eine Silberelektrode aufgedruckt. Dazu stehen entsprechende kommerziell erhältliche Platin-Pasten, Gold-Pasten und Silber-Pasten z. B. der Firmen Du Pont, Heraeus, ESL oder Acheson zur Verfügung. Die zugehörigen Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkte können z. B. mit einer Silber/Palladium-Paste oder Goldpaste aufgedruckt werden. Auch solche Pasten sind kommerziell erhältlich. To manufacture the 2-electrode system, Screen printing process on a substrate, which is preferably a common one Ceramic substrate, e.g. B. from Ceramtec, Kyocera or Coors is a platinum or gold electrode as the working electrode applied. A silver electrode is used as the counter electrode printed. The corresponding ones are commercially available available platinum pastes, gold pastes and silver pastes e.g. B. from Du Pont, Heraeus, ESL or Acheson. The associated contact paths and contact points can z. B. with a silver / palladium paste or gold paste be printed on. Such pastes are also commercial available.
Wird als Substrat ein polymerer Träger, z. B. auf Polyimidbasis oder auf Basis von epoxidharzgetränkten Glasfasergeweben, z. B. FR-4 verwendet, so werden polymere Druckpasten z. B. von den Firmen Acheson oder DuPont zum Aufbringen der Elektroden eingesetzt. If a polymeric substrate, e.g. B. on Based on polyimide or based on epoxy resin Glass fiber fabrics, e.g. B. FR-4 used, so are polymers Printing pastes e.g. B. from the companies Acheson or DuPont for Application of the electrodes used.
Zum Erreichen der angestrebten Sensitivität ist es erfindungswesentlich, dass die Arbeitselektrode mittels einer Pt- oder Au-Paste hergestellt wird. Im Gegensatz dazu wird üblicherweise aufgrund der großen Oberfläche Kohlepaste als Elektrodenmaterial oder aufgrund seiner elektrochemischen (große elektrochemische Überspannung für die elektrochemische Sauerstoff- und Wasserstoffentwicklung) und chemischen Eigenschaften (Möglichkeit der chemischen Immobilisierung von Enzymen auf der Elektrodenoberfläche) Kohlenstoff als Elektrodenmaterial verwendet. It is to achieve the desired sensitivity essential to the invention that the working electrode by means of a Pt or Au paste is produced. In contrast to that usually due to the large surface area of carbon paste Electrode material or due to its electrochemical (large electrochemical overvoltage for the electrochemical Oxygen and hydrogen evolution) and chemical Properties (possibility of chemical immobilization of Enzymes on the electrode surface) carbon as Electrode material used.
Auf die nicht mit den Elektroden bedruckten Flächen des Substrates und auf die aufgebrachten Kontaktbahnen (aber nicht auf die Kontaktierungspunkte) wird als elektrisch isolierendes Material eine Lackschicht aufgedruckt. Sie dient der Isolation der Leiterbahnen. On the surfaces of the Substrate and on the applied contact tracks (but not on the contact points) is considered electrical insulating material printed on a lacquer layer. she serves the insulation of the conductor tracks.
Das so hergestellte substratbasierte 2-Elektrodensystem aus Arbeits- und Gegenelektrode, den Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkten und der Lackschicht ist auch kommerziell erhältlich und wird gemäß der Erfindung zum hochsensitiven Biosensor zur H2O2-Bestimmung modifiziert. The substrate-based 2-electrode system produced in this way, consisting of the working and counterelectrode, the contact tracks and contacting points and the lacquer layer, is also commercially available and is modified according to the invention into a highly sensitive biosensor for H 2 O 2 determination.
Erfindungsgemäß wird nun die aufgedruckte Silberelektrode vor Aufbringen einer Polymerschicht, die Mediator und Enzym immobilisiert, elektrochemisch modifiziert. Dazu wird in einer chloridhaltigen Lösung ein anodischer Strom durch die Silberelektrode geleitet, wobei sich diese mit einer dünnen Silberchloridschicht überzieht. Dadurch wird erreicht, dass die Referenzelektrode beim Messprozess ein nahezu konstantes Potential behält. Druckt man dagegen, wie es nahe liegt, eine silberchloridhaltige Paste auf, um eine potentialstabile Elektrode zu erzeugen, so wird die gewünschte Sensitivität des Biosensors nicht erreicht. According to the invention, the printed silver electrode is now in front Apply a polymer layer, the mediator and enzyme immobilized, electrochemically modified. This is done in a chloride - containing solution an anodic current through the Silver electrode conducted, this with a thin Silver chloride layer covers. This ensures that the reference electrode is almost constant during the measuring process Keeps potential. If, on the other hand, you print one, as is obvious paste containing silver chloride to make a potential stable Generate electrode, so the desired sensitivity of the biosensor not reached.
Im nächsten Schritt wird die einen Mediator und ein Enzym enthaltende Polymerschicht auf die Elektroden aufgebracht. Die Polymerschicht wird in der Weise hergestellt, dass eine Lösung oder Suspension, die Polymer, Mediator und Enzym enthält, gleichmäßig sowohl auf die Arbeitselektrode als auch auf die Gegenelektrode und den Zwischenraum zwischen den Elektroden oder nur auf die Arbeitselektrode aufgebracht und eintrocknen gelassen wird. Vorzugsweise sollte das Aufbringen und Trocknen bei einer Temperatur von 18-35°C erfolgen, bevorzugt bei 20 bis 25°C. The next step is a mediator and an enzyme containing polymer layer applied to the electrodes. The polymer layer is produced in such a way that a Solution or suspension containing the polymer, mediator and enzyme contains, evenly on both the working electrode as well on the counter electrode and the gap between the Electrodes or only applied to the working electrode and is allowed to dry. Preferably the application should be and drying at a temperature of 18-35 ° C, preferably at 20 to 25 ° C.
Als Mediatoren werden Tetrathiafulvalen (TTF) oder seine Derivate, wie z. B. Mono- und Polycarbonsäurederivate oder Mono- und Polyaminoderivate, Ferrocen, Hexacyanoferrat, N- Methylphenazinium (NMP+), Methylacridinium (NMA) oder 7,7,8,8-Tetracyanparachinodimethan (TCNQ) eingesetzt. Tetrathiafulvalen (TTF) or its derivatives, such as e.g. B. mono- and polycarboxylic acid derivatives or mono- and polyamino derivatives, ferrocene, hexacyanoferrate, N-methylphenazinium (NMP + ), methylacridinium (NMA) or 7,7,8,8-tetracyano-parachinodimethane (TCNQ).
Als Polymer finden erfindungsgemäß bevorzugt Polyurethane, z. B. alipatische Polycarbonatdiolurethane, alipatische Polyesterurethane, alipatische Polyetherurethane, aromatische Polyesterurethane, Mischungen dieser Urethane oder Mischungen dieser Urethane mit Acrylaten wie z. B. mit anionischen Acrylaten, nichtionischen Acrylaten, anionischen Methacrylaten und modifizierten anionoschen Acrylaten Verwendung. Auch Polyacrylate können eingesetzt werden. According to the invention, the preferred polymer is polyurethane, z. B. alipatic polycarbonate diurethanes, alipatic Polyester urethanes, aliphatic polyether urethanes, aromatic Polyester urethanes, mixtures of these urethanes or mixtures these urethanes with acrylates such. B. with anionic Acrylates, nonionic acrylates, anionic Methacrylates and modified anionic acrylates Use. Polyacrylates can also be used.
Als Enzym finden Peroxidasen Verwendung. In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym Meerrettich-Peroxidase oder Sojabohnen-Peroxidase. Es ist nicht erforderlich, dass das Enzym thermostabil ist. Peroxidases are used as the enzyme. In a The preferred embodiment according to the invention is the enzyme Horseradish peroxidase or soybean peroxidase. It is does not require the enzyme to be thermostable.
Je nach eingesetztem Polymer, Mediator und Enzym wird eine Lösung oder eine Suspension hergestellt, welche alle drei Komponenten enthält. Dazu werden zunächst Lösungen des Enzyms und des Mediators hergestellt. Für die Lösung des Enzyms und des Mediators eignen sich, je nach dem, welches Enzym und welcher Mediator verwendet werden, Wasser, Ethanol, Essigsäureethylester, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und Mischungen aus diesen Lösungsmitteln. Diese Lösungen werden mit einer wässrigen Suspension des Polymers vermischt. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, zunächst z. B. eine wässrige Peroxidaselösung mit einer wässrigen aliphatischen Polyurethan-Suspension zu mischen und dieses Gemisch wiederum mit einer essigsäureethylesterhaltigen alkoholischen TTF-Lösung zu vermischen. Bevorzugt werden Enzym-, Mediator- oder Polymerkonzentrationen von 0,5-2% eingesetzt. Für Enzym und Mediator sind Konzentrationen von 1-1,5% besonders bevorzugt. Die Konzentration des Polymers sollte in einer besonders bevorzugten Ausführungsform 1,5-2% betragen. Depending on the polymer, mediator and enzyme used, a Solution or suspension made up all three Contains components. To do this, first use solutions of the enzyme and the mediator. For the solution of the enzyme and of the mediator are suitable, depending on which enzyme and which mediator to use, water, ethanol, Ethyl acetate, dimethyl sulfoxide (DMSO), Dimethylformamide (DMF) and mixtures of these solvents. These solutions are mixed with an aqueous suspension of Polymer mixed. It has proven to be advantageous initially z. B. an aqueous peroxidase solution with a to mix aqueous aliphatic polyurethane suspension and this mixture in turn with a Mix alcoholic TTF solution containing ethyl acetate. Enzyme, mediator or Polymer concentrations of 0.5-2% used. For enzyme and mediator concentrations of 1-1.5% are particularly preferred. The Concentration of the polymer should be in a particular preferred embodiment be 1.5-2%.
Es hat sich gezeigt, dass der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte H2O2-Biosensor eine run-in Zeit von weniger als 30 Minuten hat und sich H2O2-Konzentrationen im nanomolaren Bereich zuverlässig messen lassen. Die Herstellung des Grundsensors auf der Basis des Siebdruckes in Dickschichttechnologie ist ein für eine Massenproduktion geeignetes und preiswertes Verfahren. Die Immobilisierung des Enzyms und des Mediators mit Hilfe eines Polymers erfolgt zeitsparend in einem Schritt und lässt sich ebenfalls automatisieren. Der Sensor ist ohne besondere Hilfsmittel lange haltbar und bei geringer Größe gut lagerbar. It has been shown that the H 2 O 2 biosensor produced according to the method according to the invention has a run-in time of less than 30 minutes and that H 2 O 2 concentrations can be measured reliably in the nanomolar range. The production of the basic sensor on the basis of screen printing in thick-film technology is a suitable and inexpensive method for mass production. The immobilization of the enzyme and the mediator using a polymer saves time in one step and can also be automated. The sensor can be kept for a long time without special aids and can be stored well in a small size.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Biosensor mit den Merkmalen des Anspruchs 8. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Biosensors sind Gegenstand der Unteransprüche. In einer bevorzugten geometrischen Ausgestaltung ist das Substrat (Sensorkörper) 1 planar und der Sensor weist die in den Fig. 1 und 3 dargestellte geometrische Ausgestaltung auf. Die Größe des Substrats 1 beträgt erfindungsgemäß von 2 bis 400 mm2, bevorzugt von 4 bis 40 mm2. The present invention therefore also relates to a biosensor with the features of claim 8. Advantageous embodiments of the biosensor are the subject of the subclaims. In a preferred geometric configuration, the substrate (sensor body) 1 is planar and the sensor has the geometric configuration shown in FIGS. 1 and 3. According to the invention, the size of the substrate 1 is from 2 to 400 mm 2 , preferably from 4 to 40 mm 2 .
Die in Fig. 3 dargestellte geometrische Ausgestaltung ist insbesondere unter dem Aspekt der Materialeinsparung und der kostensparenden Herstellung vorteilhaft. Während in beiden Sensorvarianten der Fig. 1 und 3 Arbeits- und Gegenelektrode 2, 3 gleich angeordnet sind, führen die Kontaktbahnen 6 in der Ausgestaltung gemäß Fig. 3 von der Arbeits- und der Referenzelektrode 2, 3 zu diagonal angeordneten Kontaktpunkten 7, die sich in gegenüberliegenden Ecken des rechteckigen Sensorkörpers 1 befinden. Der erfindungsgemäße Sensor kann zum besseren Handling wahlweise in eine Halterung eingebracht werden. The geometric configuration shown in FIG. 3 is particularly advantageous in terms of material savings and cost-saving production. While are 3 positioned the same in both sensor variants of FIGS. 1 and 3, the working and counter electrode 2, cause the contact paths 6 in the embodiment according to Fig. 3 of the working and the reference electrode 2, 3 to diagonally arranged contact points 7, which are are located in opposite corners of the rectangular sensor body 1 . The sensor according to the invention can optionally be placed in a holder for better handling.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung enthält die Polymerschicht des erfindungsgemäßen Biosensors das Enzym, den Mediator und das Polymer im Verhältnis (w/v) von 0,25-4 : 0,25-4 : 1, vorzugsweise von 0,5-1,3 : 0,5-1,3 : 1. In a further advantageous embodiment, the Polymer layer of the biosensor according to the invention the enzyme, the mediator and the polymer in the ratio (w / v) of 0.25-4: 0.25-4: 1, preferably 0.5-1.3: 0.5-1.3: 1.
Zum Betrieb des Sensors wird dieser bevorzugt in einer Durchflusszelle mit einem Strömungskanal so fixiert, dass der Biosensor eine Wand des Strömungskanals bildet und die mit der sensitiven Polymerschicht bedeckte Arbeitselektrode und ein Teil der Gegenelektrode von der Probe überspült werden. Der Fluss durch die Messzelle wird durch eine möglichst pulsationsarme Pumpe gewährleistet. Mit Hilfe des Potentiostaten wird zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode eine Spannung angelegt und der resultierende Strom gemessen. Die Messsignale des Potentiostaten können mit analogen oder digitalen Aufzeichnungsgeräten, z. B. einem y-t- Schreiber, aufgezeichnet werden. Das Grundsignal des Sensors erhält man, wenn man eine H2O2-freie Lösung durch die Messzelle pumpt. Wird eine H2O2-haltige Lösung durch die Messzelle gepumpt, erhält man ein der Analytkonzentration entsprechendes Sensorsignal. To operate the sensor, it is preferably fixed in a flow cell with a flow channel in such a way that the biosensor forms a wall of the flow channel and the working electrode covered with the sensitive polymer layer and part of the counter electrode are washed over by the sample. The flow through the measuring cell is guaranteed by a pump with as little pulsation as possible. With the help of the potentiostat, a voltage is applied between the working electrode and the counter electrode and the resulting current is measured. The measurement signals of the potentiostat can be used with analog or digital recording devices, e.g. B. a yt recorder, are recorded. The basic signal of the sensor is obtained when an H 2 O 2 -free solution is pumped through the measuring cell. If an H 2 O 2 -containing solution is pumped through the measuring cell, a sensor signal corresponding to the analyte concentration is obtained.
Die mit zehn erfindungsgemäßen Biosensoren ermittelten Messwerte bei H2O2-Konzentrationen von 15 nM bis 2.000 nM gemäß Fig. 2 zeigen, dass die Abhängigkeit des Biosensorsignals in diesem Bereich der H2O2-Konzentration linear ist und damit der Biosensor leicht kalibrierbar ist. The measured values determined with ten biosensors according to the invention at H 2 O 2 concentrations from 15 nM to 2,000 nM according to FIG. 2 show that the dependence of the biosensor signal in this area of the H 2 O 2 concentration is linear and the biosensor can therefore be easily calibrated ,
Untersuchungen zur Haltbarkeit des Sensors haben gezeigt, dass bei einer trockenen Lagerung im Kühlschrank bei 4°C nach 3 Monaten kein signifikanter Empfindlichkeitsverlust auftritt. Studies on the durability of the sensor have shown that after a dry storage in the refrigerator at 4 ° C after 3 months no significant loss of sensitivity occurs.
Fig. 1 und 3 zeigen den erfindungsgemäßen Biosensor in bevorzugten Ausführungsformen. Fig. 1 and 3 show the biosensor according to the invention in preferred embodiments.
Es bedeuten:
1 - Substrat (Sensorkörper)
2 - Platin- oder Goldarbeitselektrode
3 - Ag/AgCl-Referenzelektrode
4 - Lackschicht
5 - Zwischenraum zwischen den Elektroden
6 - Kontaktbahnen der Elektroden
7 - Kontaktpunkte
It means:
1 - substrate (sensor body)
2 - platinum or gold working electrode
3 - Ag / AgCl reference electrode
4 - lacquer layer
5 - gap between the electrodes
6 - contact paths of the electrodes
7 - contact points
Fig. 2 zeigt die durchschnittlichen Messwerte, die mit zehn erfindungsgemäßen Biosensoren (Arbeitselektrode Platin, Gegenelektrode Ag/AgCl, Keramiksubstrat, Enzym Peroxidase, Mediator TTF, Polymer Polyurethan) erhalten wurden. Es wurden Probelösungen unterschiedlicher H2O2-Konzentrationen von 15 nM bis 2.000 nM in 0,033 M chloridhaltigem Phospatpuffer (pH = 7,1) vermessen. Das an die Arbeitselektrode angelegte Potential betrug -100 mV vs. Ag/AgCl. Fig. 2 shows the average measured values of ten inventive biosensors (platinum working electrode, counter electrode, Ag / AgCl, ceramic substrate, enzyme peroxidase mediator TTF, polyurethane polymer) was obtained. Test solutions of different H 2 O 2 concentrations from 15 nM to 2,000 nM in 0.033 M chloride-containing phosphate buffer (pH = 7.1) were measured. The potential applied to the working electrode was -100 mV vs. Ag / AgCl.
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