DE10223281A1 - Hydrolytically stable polyaza-polyacid chelating agent active esters, useful as reagents for labeling peptides, antibodies or other biomolecules with radioactive or paramagnetic nuclides - Google Patents

Hydrolytically stable polyaza-polyacid chelating agent active esters, useful as reagents for labeling peptides, antibodies or other biomolecules with radioactive or paramagnetic nuclides

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DE10223281A1 DE2002123281 DE10223281A DE10223281A1 DE 10223281 A1 DE10223281 A1 DE 10223281A1 DE 2002123281 DE2002123281 DE 2002123281 DE 10223281 A DE10223281 A DE 10223281A DE 10223281 A1 DE10223281 A1 DE 10223281A1
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Abstract

Polyaza-polyacid chelating agent active esters (I) and their complexes with nuclides are new. Polyaza-polyacid chelating agent active esters of formula Chel(-T)m (I) and their complexes with nuclides are new. Chel = chelating agent of formula Y-Q-N(-Q-Y)-Q-(N(-Q-Y)) n-Q-N(-Q-Y)-Q-Y (a), (b) or Y-Q-X-Q-R(-Q-X-Q-Y)-Q-X-Q-Y (c); Each Q = 1-6C alkylene (in which one or more non-adjacent C-atoms are optionally replaced by O, NH, S, N-(1-3C alkyl), PO2H, OPO2H or OPO2OH); R = CH or N; X = O, S, PH, P-(1-3C alkyl), NH or N-(1-3C alkyl); Y = reactive acid group (e.g. carboxylate, phosphate, phosphate monoester, sulfate or sulfate monoester) or the corresponding acid, where m of the Y groups form ester bonds with T; m = 1-4 in (a) or (b) or 1-3 in (c) (m preferably being 1); T = optionally substituted phenoxy, phenylthio, naphthoxy, naphthylthio or other aromatic or heteroaromatic 5-25C aryloxy or arylthio group; An Independent claim is also included for the preparation of (I).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese von Aktivestern von Chelatoren, welche für die Bindung radioaktiver und paramagnetischer Nuklide eingesetzt werden können, sowie deren Komplexierung und Konjugation mit Zielmolekülen wie Proteinen und Peptiden. The present invention relates to the synthesis of active esters of Chelators, which are used for binding radioactive and paramagnetic Nuclides can be used, as well as their complexation and Conjugation with target molecules such as proteins and peptides.

Bifunktionelle Chelatoren sind potente Liganden für die Markierung von Molekülen wie Peptiden und Antikörpern mit paramagnetischen oder radioaktiven Nukliden. Daher besteht grosses Interesse an der Entwicklung dieser Agentien z. B. für den Einsatz radioaktiver Metalle zur zielgericheten Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen. Folglich sind bereits eine Vielzahl bifunktioneller Chelatoren entwickelt worden (S. Liu et al. Bioconjug. Chem. Vol. 12, 2001, Seite 7ff). Bifunctional chelators are potent ligands for the labeling of Molecules such as peptides and antibodies with paramagnetic or radioactive nuclides. Therefore there is great interest in the development these agents z. B. for the use of radioactive metals for targeted Diagnosis and therapy of cancer. Hence are already one Numerous bifunctional chelators have been developed (S. Liu et al. Bioconjug. Chem. Vol. 12, 2001, page 7ff).

Ein Beispiel eines Chelators stellt DOTA dar. DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure) bindet bekanntermaßen eine Vielzahl von Hauptgruppen- und Übergangsmetallen mit sehr hohen Stabilitätskonstanten. DOTA bildet starke 8-fach koordinierte Komplexe, wie am Beispiel von Y3+ Komplexen eines Modellpeptids (DOTA-D-Phe- NH2) (A. Heppeler et al., Chem. Eur. J. Vol. 5, 1999, Seite 1974ff) gezeigt wurde. Aufgrund ihrer hohen Stabilität in vivo sowie der einfach durchzuführenden Markierung mit Radionukliden, bieten DOTA-Konjugate Vorteile gegenüber anderen Konjugaten bifunktioneller Chelatoren wie DTPA. DOTA is an example of a chelator. DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) is known to bind a large number of main group and transition metals with very high stability constants. DOTA forms strong 8-fold coordinated complexes, such as the example of Y 3+ complexes of a model peptide (DOTA-D-Phe-NH 2 ) (A. Heppeler et al., Chem. Eur. J. Vol. 5, 1999, page 1974ff) was shown. Due to their high stability in vivo and the easy to carry out labeling with radionuclides, DOTA conjugates offer advantages over other conjugates of bifunctional chelators such as DTPA.

Beispiele für mögliche Klassen von Zielmolekülen, die mit Chelatoren konjugiert werden können, sind Peptide, Nukleinsäuren, Proteine, Saccharide und Polymere (z. B.: D. L. Ladd et al. Bioconjugate Chem., Vol. 10, 1999, Seite 361-370), bevorzugt Antikörper (z. B. M. Li et al. Cancer Res. (Suppl.), Vol. 55, 1995, Seite 5726s-5728s), Peptide (z. B. B. Stolz et al., Eur J Nucl Med, Vol. 25, 1998; Seite 668-674) und kleine Proteine. Examples of possible classes of target molecules with chelators can be conjugated are peptides, nucleic acids, proteins, Saccharides and polymers (e.g .: D.L. Ladd et al. Bioconjugate Chem., Vol. 10, 1999, pages 361-370), preferably antibodies (e.g. M. Li et al. Cancer Res. (Suppl.), Vol. 55, 1995, pages 5726s-5728s), peptides (e.g., Stolz et al., Eur J Nucl Med, Vol. 25, 1998; Page 668-674) and small proteins.

Dennoch besteht noch immer ein grosser Bedarf an einfachen Protokollen für die Herstellung von Konjugaten aus Chelatoren und Zielmolekülen. Diese Konjugationsprotokolle werden sowohl für diagnostische und therapeutische Anwendungen, als auch zum Screening von Peptiden zum Einsatz in der Nuklearmedizin benötigt. Nevertheless, there is still a great need for simple protocols for the production of conjugates from chelators and target molecules. These conjugation protocols are used for both diagnostic and therapeutic applications, as well as for screening peptides for Use in nuclear medicine required.

Derzeit werden Konjugate von DOTA und anderen Chelatoren wir z. B. DTPA bevorzugt durch in situ Aktivierung des Chelators mit NHS (N- Hydroxysuccinimid) und anschließender Reaktion mit dem Zielmolekül hergestellt. Currently conjugates from DOTA and other chelators such as e.g. B. DTPA preferred by in situ activation of the chelator with NHS (N- Hydroxysuccinimide) and subsequent reaction with the target molecule manufactured.

Die in situ Aktivierung des Chelators führt zu einer Mischung von einfach und mehrfach aktivierten Chelatoren. Die mehrfach aktivierten Chelatoren können mit mehr als einem Zielmolekül reagieren. Folglich wird das gewünschte Konjugat mit zweifach und höher substituierten Konjugaten verunreinigt, was die Bildung eines definierten pharmazeutischen Produktes erschwert. The in situ activation of the chelator leads to a mixture of simple and multiple activated chelators. The multiple activated chelators can react with more than one target molecule. Consequently, that will desired conjugate with conjugates substituted twice or more contaminates what is the formation of a defined pharmaceutical Product difficult.

Zudem führt die Reaktion von mehr als einer Carbonsäurefunktion des Chelators zu einer Verringerung der Komplexstabilität. Um die in situ Aktivierung zu optimieren, muß ein großer Überschuß des Chelators (typischerweise ein 10-facher Überschuß) eingesetzt werden. Dieser Überschuß an Chelator kann unspezifisch mit den Zielmolekülen aggregieren. Diese Aggregate können wiederum sehr schwer abgetrennt werden und so während des in vivo Einsatzes freigesetzt werden und zu einer undefinierten Bioverteilung führen. In addition, the reaction of more than one carboxylic acid function of the Chelators reduce complex stability. To the in situ To optimize activation must have a large excess of the chelator (typically a 10-fold excess) can be used. This Excess chelator can be unspecific with the target molecules aggregate. These aggregates can in turn be separated with great difficulty are and so are released during in vivo use and to lead to an undefined biodistribution.

Eine weitere Möglichkeit zur Konjugation von Chelatoren mit zielmolekülen ist die Erzeugung Spacer-modifizierter Chelatoren, die aktive Gruppen wie Isothiocyanate für die Konjugation mit den Zielmolekülen tragen. Dieser Ansatz benötigt aufwendige Synthesen der Vorläufermoleküle. Zudem besteht die Möglichkeit der Beeinflussung der Eigenschaften des Chelators durch die Spacer. Another way to conjugate chelators with target molecules is the generation of spacer-modified chelators that like active groups Wear isothiocyanates for conjugation with the target molecules. This Approach requires complex syntheses of the precursor molecules. moreover there is the possibility of influencing the properties of the chelator through the spacers.

Die einzige bekannte Methode zur direkten Herstellung definierter Produkte aus Chelatoren und Zielmolekülen besteht in der selektiven Blockade aller funktionellen Gruppen des Chelators, die nicht für die (A. Heppeler et al., Chem. Eur. J., Vol. 5 (1999), Seite 1974ff). Die verbleibende freie funktionelle Gruppe kann für die Konjugation mit dem Zielmolekül eingesetzt werden. Diese Methode führt zu definierten Konjugaten. Allerdings ist die Synthese des partiell geschützten Vorläufermoleküls in der Regel sehr aufwendig und bedingt einen Entschützungsschritt im Anschluß an die Konjugation. Handelt es sich bei den Zielmolekülen um Proteine oder Antikörper, führt dieser Entschützungsschritt häufig zur Denaturierung der Biomoleküle. The only known method for the direct production of defined products Chelators and target molecules consist in the selective blockade of all functional groups of the chelator that are not suitable for the (A. Heppeler et al., Chem. Eur. J., Vol. 5 (1999), page 1974ff). The remaining free functional group can be used for conjugation with the target molecule be used. This method leads to defined conjugates. However, the synthesis of the partially protected precursor molecule is in the Usually very complex and requires a deprotection step afterwards to the conjugation. If the target molecules are proteins or antibodies, this deprotection step often leads to denaturation of the biomolecules.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer effizienten und einfachen Methode zur Herstellung von definierten Konjugaten bestehend aus Chelator und Zielmolekül. The object of the present invention is therefore to provide a efficient and simple method of producing defined Conjugates consisting of chelator and target molecule.

Es wurde gefunden, dass beim Einsatz modifizierter Phenylester für die Aktivierung von Chelatoren die Isolierung der aktivierten Chelatoren gelingt und dass diese aufgereinigt und anschließend mit den Zielmolekülen umgesetzt werden können. It was found that when using modified phenyl esters for the Activation of chelators The activation of the activated chelators succeeds and that this cleaned up and then with the target molecules can be implemented.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher aktiverte Ester von Chelatoren entsprechend Formel I

Chel(-Ph)m I

wobei Chel ein Chelator entsprechend einer der allgemeinen Formeln A, B oder C ist,


wobei
die gebogenen Bindungen eine C1-C6-Alkylkette sind, in der ein oder mehrere nicht benachbarte C-Atome unabhängig voneinander durch O, NH, S, N-C1-C3-alkyl, PO2H, OPO2H oder OPO2HO ersetzt sein können,
R C oder N ist,
X O, S, PH, P-C1-C3-alkyl, NH oder N-C1-C3-alkyl ist,
Y eine reaktive Säuregruppe, wie z. B. Carboxylat, Phosphat, Phosphat monoester, Sulfat oder Sulfat monoester oder die entsprechende Säure ist, wobei eine Anzahl von m Y-Gruppen Esterbindungen mit Ph bilden,
m 1 bis 4 ist für die Chelatoren nach Formel A und B und 1 bis 3 ist für die Chelatoren nach Formel C (bevorzugt ist m = 1),
Ph eine substituierte oder unsubstituierte Phenoxy-, Thiophenoxy-, Naphthoxy-, Thionaphthoxy-Gruppe oder andere aromatische oder heteroaromatische C5-C25 Aryloxy oder Thioaryloxy-Gruppe ist. The present invention therefore relates to activated esters of chelators corresponding to formula I.

Chel (-Ph) m I

where Chel is a chelator according to one of the general formulas A, B or C,


in which
the bent bonds are a C 1 -C 6 alkyl chain in which one or more non-adjacent C atoms independently of one another by O, NH, S, NC 1 -C 3 alkyl, PO 2 H, OPO 2 H or OPO 2 HO can be replaced
Is RC or N,
XO, S, PH, PC 1 -C 3 alkyl, NH or NC 1 -C 3 alkyl,
Y is a reactive acid group, such as. B. carboxylate, phosphate, phosphate monoester, sulfate or sulfate monoester or the corresponding acid, a number of m Y groups forming ester bonds with Ph,
m is 1 to 4 for the chelators according to formula A and B and 1 to 3 is for the chelators according to formula C (preferably m = 1),
Ph is a substituted or unsubstituted phenoxy, thiophenoxy, naphthoxy, thionaphthoxy group or other aromatic or heteroaromatic C 5 -C 25 aryloxy or thioaryloxy group.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist Ph eine Phenoxy- oder Thiphenoxy-Gruppe der Formel II


wobei
R, R', R", R''' und R"" unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, OH, NO2, O-alkyl, O-aryl, SH, S-alkyl, S-aryl, SO3H, NH2, alkyl, aryl, H2PO4, NH-alkyl, NH-aryl, N(alkyl)2, N(aryl)2 oder N(alkyl)(aryl) sind,
mit
alkyl = eine lineare, verzweigte oder cyklische C1-C12 Gruppe, wobei ein oder mehrere C-Atome durch ein oder mehrere O, NH or S substituiert sein können,
Aryl = eine aromatische oder heteroaromatische C5-C15 Gruppe,
Z = O oder S ist. In a preferred embodiment, Ph is a phenoxy or thiphenoxy group of the formula II


in which
R, R ', R ", R""andR""independently of one another H, F, Cl, Br, I, OH, NO 2 , O-alkyl, O-aryl, SH, S-alkyl, S-aryl , SO 3 H, NH 2 , alkyl, aryl, H 2 PO 4 , NH-alkyl, NH-aryl, N (alkyl) 2 , N (aryl) 2 or N (alkyl) (aryl),
With
alkyl = a linear, branched or cyclic C 1 -C 12 group, where one or more C atoms can be substituted by one or more O, NH or S,
Aryl = an aromatic or heteroaromatic C 5 -C 15 group,
Z = O or S.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist Ph eine 4-Nitrophenoxy, 2-Nitrophenoxy, 2,6-Difluorophenoxy, 2,3,5-Trifluorophenoxy oder eine 2,3,5,6-Tetrafluorophenoxy Gruppe. In a particularly preferred embodiment, Ph is a 4-nitrophenoxy, 2-nitrophenoxy, 2,6-difluorophenoxy, 2,3,5-trifluorophenoxy or a 2,3,5,6-tetrafluorophenoxy group.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist Chel ausgewählt aus einer der folgenden Gruppen:


die gestrichelte Linie in den Formeln zeigt die Stelle der Anbindung an das Zielmolekül an. In a preferred embodiment, Chel is selected from one of the following groups:


the dashed line in the formulas indicates the point of attachment to the target molecule.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der aktiverte Ester mit einem Nuklid komplexiert. In a preferred embodiment, the activated ester is with a Nuclide complexed.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von aktivierten Estern von Chelatoren entsprechend der allgemeinen Formel I durch

  • - Bereitstellung eines Chelators, welcher mindestens eine reaktive Säuregruppe und eine phenolische Komponente enthält;
  • - Mischen des Chelators und der phenolischen Komponente mit einem Kondensationsmittel in einem geeigneten Lösungsmittel;
  • - Isolierung des aktivierten Chelators aus dem Reaktionsgemisch
The present invention furthermore relates to a process for the preparation of activated esters of chelators in accordance with the general formula I by
  • Provision of a chelator which contains at least one reactive acid group and a phenolic component;
  • Mixing the chelator and the phenolic component with a condensing agent in a suitable solvent;
  • - Isolation of the activated chelator from the reaction mixture

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Chelator um DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), DOTA (1,4,7,10- Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure), NOTA (1,4,7- Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure) oder TETA (1,4,8,11- Tetraazacyclotetradecan-1,4,8,11-tetraessigsäure). In a preferred embodiment, the chelator is DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), DOTA (1,4,7,10- Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), NOTA (1,4,7- Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid) or TETA (1,4,8,11- Tetraazacy--1,4,8,11-tetra-acetic acid).

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der phenolischen Komponente um 4-Nitrophenol, 2-Nitrophenol, 2,6-Difluorphenol, 2,3,5- Trifluorphenol oder 2,3,5,6-Tetrafluorphenol. In a preferred embodiment, the phenolic is Component around 4-nitrophenol, 2-nitrophenol, 2,6-difluorophenol, 2,3,5- Trifluorophenol or 2,3,5,6-tetrafluorophenol.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kondensationsmittel ein Carbodiimid. In a preferred embodiment, the condensing agent is a Carbodiimide.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der aktivierte Chelator mittels flüssigchromatographischer Methoden aus dem Reaktionsgemisch isoliert. In a preferred embodiment, the activated chelator is by means of liquid chromatographic methods isolated from the reaction mixture.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der isolierte aktivierte Chelator mit einem Nuklid komplexiert. In a preferred embodiment, the isolated activated chelator is complexed with a nuclide.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten von Chelatoren durch Reaktion von zumindest einem aktivierten Chelator mit zumindest einem Zielmolekül. The present invention further relates to a method of manufacture of conjugates of chelators by reacting at least one activated chelator with at least one target molecule.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Zielmolekül um einen Antikörper oder ein Peptid. In a preferred embodiment, the target molecule an antibody or a peptide.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind zudem Konjugate bestehend aus einem Chelator, der direkt mit einem Zielmolekül verknüpft ist. The present invention also relates to conjugates from a chelator that is directly linked to a target molecule.

Fig. 1 zeigt einige erfindungsgemäß bevorzugte aktivierte Chelatoren. Fig. 1 shows some according to the invention preferred activated chelators.

Fig. 2 zeigt das HPLC-Chromatogramm einer Reaktionsmischung mit A = aktivierter Chelator, B = 4-Nitrophenol und ein HPLC-Chromatogramm des gereinigten aktiverten Chelators 3 (Peak C). Genauere Angaben finden sich in Beispiel 1. Fig. 2 shows the HPLC chromatogram of a reaction mixture with A = activated chelator, B = 4-nitrophenol and an HPLC chromatogram of the purified active chelator Erten 3 (Peak C). More details can be found in Example 1.

Fig. 3 zeigt die Bestimmung der Stabilität von 1,4,7,10- Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-10-essigsäure-4-nitrophenylester in gepulverten wässrigen Lösungen. Nähere Angaben finden sich in Beispiel 2. Fig. 3 shows the determination of the stability of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid-10-acetic acid 4-nitrophenyl ester in powdered aqueous solutions. More details can be found in Example 2.

Der Chelator, der entsprechend der erfindungsgemäßen Methode aktiviert und konjugiert werden kann, kann ein acyclischer oder makrocyclischer polydentater Chelator sein, der zumindest eine reaktive Säuregruppe enthält. Beispiele für derartige Chelatoren finden sich in Liu und Edwards, Bioconjugate Chem., Vol. 12, 2001, Seite 7-34, insbesondere auf Seite 11 und 12. Der Begriff "reaktive Säuregruppe" steht für eine Säurefunktion, wie z. B. Carbonsäure, Phosphorsäure, Phosphatmonoester, Sulfonsäure oder Sulfonsäuremonoester. Bevorzugt sind erfindungsgemäß Carbonsäurederivate. Symmetrische Chelatoren werden bevorzugt. The chelator that activates according to the method of the invention and can be conjugated can be an acyclic or macrocyclic be a polydentate chelator which has at least one reactive acid group contains. Examples of such chelators can be found in Liu and Edwards, Bioconjugate Chem., Vol. 12, 2001, pages 7-34, especially on page 11 and 12. The term "reactive acid group" stands for an acid function, such as z. B. carboxylic acid, phosphoric acid, phosphate monoesters, sulfonic acid or Sulfonic acid. Are preferred according to the invention Carboxylic acid derivatives. Symmetric chelators are preferred.

Bevorzugt sind die zu konjugierenden Chelatoren DTPA (Diethylentriaminepentaessigsäure), DOTA (1,4,7,10- Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure), NOTA (1,4,7- Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure) oder TETA (1,4,8,11- Tetraazacyclotetradecan-1,4,8,11-tetraessigsäure). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Chelator um DOTA. The chelators DTPA to be conjugated are preferred (Diethylenetriaminepentaacetic acid), DOTA (1,4,7,10- Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), NOTA (1,4,7- Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid) or TETA (1,4,8,11- Tetraazacy--1,4,8,11-tetra-acetic acid). In one particularly preferred embodiment, the chelator is DOTA.

Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Chelatoren durch Bildung von Estern mit einer phenolischen Komponente aktiviert. Geeignete phenolische Komponenten für diese Reaktion sind Phenole, substituierte Phenole, Thiophenole, Naphthole, Thionaphthole oder andere substituierte aromatische oder heteroaromatische C5-C25 alkohole oder Thioalkohole, bevorzugt substituierte Phenole der Formel II


wobei
R, R', R", R''' und R"" unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, OH, NO2, O-Alkyl, O-Aryl, SH, S-Alkyl, S-Aryl, SO3H, NH2, Alkyl, Aryl, H2PO4, NH-Alkyl, NH-Aryl, N(Alkyl)2, N(Aryl)2, N(Alkyl)(Aryl) sind,
mit
Alkyl = lineare, verzweigte oder cyclische C1-C12 Gruppe in der eine oder mehrere nicht benachbarte Kohlenstoffatome unabhängig voneinander durch O, NH oder S substituiert sein können,
Aryl = eine aromatische oder heteroaromatische C5-C15 Gruppe
Z = O oder S. According to the process of the invention, the chelators are activated by the formation of esters with a phenolic component. Suitable phenolic components for this reaction are phenols, substituted phenols, thiophenols, naphthols, thionaphthols or other substituted aromatic or heteroaromatic C 5 -C 25 alcohols or thio alcohols, preferably substituted phenols of the formula II


in which
R, R ', R ", R""andR""independently of one another H, F, Cl, Br, I, OH, NO 2 , O-alkyl, O-aryl, SH, S-alkyl, S-aryl , SO 3 H, NH 2 , alkyl, aryl, H 2 PO 4 , NH-alkyl, NH-aryl, N (alkyl) 2 , N (aryl) 2 , N (alkyl) (aryl),
With
Alkyl = linear, branched or cyclic C 1 -C 12 group in which one or more non-adjacent carbon atoms can be substituted independently of one another by O, NH or S,
Aryl = an aromatic or heteroaromatic C 5 -C 15 group
Z = O or S.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der phenolischen Komponente um 4-Nitrophenol, 2-Nitrophenol, 2,6-Difluorphenol, 2,3,5- Trifluorphenol oder 2,3,5,6-Tetrafluorphenol. In a preferred embodiment, the phenolic is Component around 4-nitrophenol, 2-nitrophenol, 2,6-difluorophenol, 2,3,5- Trifluorophenol or 2,3,5,6-tetrafluorophenol.

Der Chelator wird mit der phenolischen Komponente unter Bedingungen umgesetzt, die geeignet sind um den aktivierten Ester zu bilden. Geeignete Reaktionsbedingungen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird der Chelator in einem geeigneten Lösungsmittel mit der phenolischen Komponente gemischt. Da die Chelatoren in der Regel in organischen Lösungsmitteln unlöslich sind, ist ein geeignetes Lösungsmittel bevorzugt Wasser oder eine wässrige Lösung, welche 10 bis 90% eines organischen Lösungsmittels wie CH3CN oder DMSO enthält. The chelator is reacted with the phenolic component under conditions suitable to form the activated ester. Suitable reaction conditions are known to the person skilled in the art. The chelator is preferably mixed with the phenolic component in a suitable solvent. Since the chelators are generally insoluble in organic solvents, a suitable solvent is preferably water or an aqueous solution which contains 10 to 90% of an organic solvent such as CH 3 CN or DMSO.

Das Kondensationsmittel wird gleichzeitig zu dem Reaktionsgemisch gegeben oder nach dem Lösen und Mischen des Chelators und der phenolischen Komponente zugesetzt. Das Kondensationsmittel ist eine Verbindung, die die Konjugation von zwei Molekülen durch Bildung einer chemischen Bindung ohne zusätzliche Atome bewirkt. Daher werden die erfindungsgemäß geeigneten Kondensationsmittel häufig auch als " zero- length cross-linker" (siehe G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) bezeichnet. Geeignete Kondensationsmittel sind beispielsweise Carbodiimide, N,N-Carbonyldiimidazole, Phosphonium oder Aminium Salze, welche sich von HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) ableiten, wie z. B. HBTU (N-[(1 H-Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N- methylmethanaminium hexafluorophosphat N-oxid. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Kondensationsmittel um N,N'- Diisopropylcarbodiimid oder 1-Ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid × HCI (EDAC). The condensing agent simultaneously becomes the reaction mixture given or after loosening and mixing the chelator and the phenolic component added. The condensing agent is one Compound that conjugate two molecules by forming one chemical bond without additional atoms. Therefore, the Condensation agents suitable according to the invention are often also used as "zero length cross-linker "(see G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996). Suitable condensing agents are for example carbodiimides, N, N-carbonyldiimidazoles, phosphonium or Aminium salts derived from HOBt (1-hydroxybenzotriazole) such as B. HBTU (N - [(1 H-benzotriazol-1-yl) (dimethylamino) methylene] -N- methyl methanaminium hexafluorophosphate N-oxide. In a preferred one Embodiment, the condensing agent is N, N'- Diisopropylcarbodiimide or 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide × HCI (EDAC).

Typischerweise ist die Reaktion nach 2 bis 60 minütigem Rühren beendet. The reaction is typically complete after stirring for 2 to 60 minutes.

Der aktivierte Chelator nach Formel I kann mittels Flüssigkeitschromatographie, Kristallisation oder Extraktion vom Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Bevorzugt erfolgt die Isolierung des aktivierten Chelators durch Flüssigkeitschromatographie. In einer besonder bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung durch Umkehrphasen-HPLC. Bevorzugt werden die aktivierten Chelatoren nach der Isolierung gefriergetrocknet, um die Lagerungsstabilität zu erhöhen. The activated chelator according to formula I can be by means of Liquid chromatography, crystallization or extraction from Be separated reaction mixture. Isolation of the activated chelators by liquid chromatography. In a special one preferred embodiment, the purification is carried out by Reverse-phase HPLC. The activated chelators are preferably after insulation freeze-dried to increase storage stability.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der gereinigte aktivierte Chelator vor der Umsetzung mit dem Zielmolekül mit einem Nuklid komplexiert. Ein Nuklid, welches sich für die Komplexierung eignet, ist ein Isotop, das sich für die szintigraphische Bildgebung, Radioisotopentherapie oder Magnetresonanztomographie eignet, wie z. B. ein radioaktives oder paramagnetisches Isotop wie 90Y, 99mTc, 111In, 68Ga oder Gd. In one embodiment according to the invention, the purified activated chelator is complexed with a nuclide before the reaction with the target molecule. A nuclide that is suitable for complexation is an isotope that is suitable for scintigraphic imaging, radioisotope therapy or magnetic resonance imaging, such as B. a radioactive or paramagnetic isotope such as 90 Y, 99m Tc, 111 In, 68 Ga or Gd.

Der aktivierte Chelator kann sowohl komplexiert als auch unkomplexiert isoliert und als Reinsubstanz gelagert werden. Die aktiverten Chelatoren besitzen eine hohe hydrolytische Stabilität, können aber dennoch leicht mit Zielmolekülen umgesetzt werden. Im Vergleich zu NHS-Estern bieten die erfindungsgemäßen phenolischen Ester den Vorteil hoher Stabilität in wässrigen Lösungen, vereint mit einer vorteilhaften Detektierbarkeit im UV aufgrund des aromatischen Chromophors. The activated chelator can be both complex and uncomplexed isolated and stored as a pure substance. The activated chelators have a high hydrolytic stability, but can still easily with Target molecules are implemented. Compared to NHS esters, they offer phenolic esters according to the invention have the advantage of high stability aqueous solutions, combined with an advantageous detectability in UV due to the aromatic chromophore.

Zusammenfassend bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit zur Umwandlung von käuflichen Chelatoren wie DOTA in die leicht einsetzbaren aktivierten Chelatoren. Die Aufreinigung dieser Aktivester gelingt durch HPLC. Hierbei werden die reinen aktivierten Ester erhalten, die beispielsweise für die Herstellung von Markierungs-Kits eingesetzt werden können. Die Stabilität dieser aktivierten Ester ist ideal für die Entwicklung von optimierten Protokollen für die effiziente und kontrollierte Konjugation mit Proteinen, Peptiden und anderen Molekülen von biologischen Interesse, wobei die Notwendigkeit der anschließenden Abspaltung von Schutzgruppen entfällt. In summary, the method according to the invention offers the possibility for converting commercial chelators like DOTA into the easy activated chelators. Purification of these active esters succeeds with HPLC. Here the pure activated esters are obtained, used for example for the production of marking kits can be. The stability of these activated esters is ideal for that Development of optimized protocols for efficient and controlled Conjugation with proteins, peptides and other molecules of biological interest, the need for subsequent There is no need to split off protective groups.

Die aktivierten Chelatoren können effizient mit Zielmolekülen, die mindestens eine Aminogruppe enthalten, konjugiert werden. Die Reaktionsbedingungen, die für diese Konjugation benötigt werden, sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann die Konjugation unter den gleichen Reaktionsbedingungen erfolgen, unter denen die Konjugation von NHS-Estern gelingt. Optimale Reaktionsbedingungen sind ein PH-Bereich von 7 bis 9 in Puffern, die keine störenden Amine oder andere Nukleophile enthalten. Die hauptsächliche Nebenreaktion stellt die Hydrolyse der aktivierten Chelatoren dar. Je höher der pH-Wert, desto höher ist daher die Reaktivität der aktivierten Chelatoren, sowohl in Bezug auf die Konjugationsreaktion mit Aminen wie auch in Bezug auf die Hydrolysereaktion. The activated chelators can efficiently target molecules that contain at least one amino group, are conjugated. The Reaction conditions that are required for this conjugation are known to the expert. For example, the conjugation among the same reaction conditions under which the conjugation of NHS esters succeed. Optimal reaction conditions are a PH range from 7 to 9 in buffers that have no interfering amines or other nucleophiles contain. The main side reaction is the hydrolysis of the activated chelators. The higher the pH, the higher the Reactivity of the activated chelators, both in relation to the Conjugation reaction with amines as well as in relation to the Hydrolysis reaction.

Der Fachmann ist in der Lage, in Abhängigkeit von dem zu markierenden Zielmolekül geeignete erfindungsgemäß aktivierte Chelatoren auszuwählen. Bevorzugt wird die Aktivierung des Chelators mit Tetrafluorphenol durchgeführt. Wird DOTA als Chelator ausgewählt, so ist die Verwendung von 4-Nitrophenol zur Aktivierung besonders bevorzugt. The person skilled in the art is able, depending on the one to be marked Target molecule suitable chelators activated according to the invention select. Activation of the chelator is preferred with Tetrafluorophenol performed. If DOTA is selected as the chelator, then the use of 4-nitrophenol for activation is particularly preferred.

Handelt es sich bei dem Zielmolekül um ein Peptid oder Protein, so wird der Chelator typischerweise an eine Amino-Gruppen tragende Seitenkette, wie Lysin, Arginin oder Histidin ankonjugiert. If the target molecule is a peptide or protein, then the chelator typically on a side chain carrying amino groups, such as lysine, arginine or histidine.

Ein Fachmann ist in der Lage, die vorliegende Erfindung anhand der vorliegenden Offenbarung in vollem Umfang zu nutzen. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele dienen daher lediglich der näheren Beschreibung und sind nicht als einschränkend zu betrachten. A person skilled in the art is able to use the to fully utilize this disclosure. The preferred Embodiments and examples therefore serve only the closer Description and are not to be considered restrictive.

BeispieleExamples 1. Synthese von 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-10- essigsäure-4-nitrophenylester1. Synthesis of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid 10- acetic acid 4-nitrophenyl ester

DOTA (1.0 mmol) wurde in 10 ml Wasser gelöst. Eine Lösung von (2.0 mmol) 4-Nitrophenol in 6 ml Acetonitril wurde zugegeben. Zu dieser Lösung wurden tropfenweise unter starkem Rühren eine Lösung 1.0 mmol 1-Ethyl- 3-[3-(diamino)propyl]carbodiimid × HCl (EDC) in 2 ml Wasser zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 min gerührt und zur Trockene eingeengt. RP-HPLC (10 × 250 mm Säule) mit einem linearen Gradienten von 0 bis 60% Acetonitril Fuß = 4 ml/min über 15 min ergab die reine Zeitsubstanz in 58% Ausbeute nach Lyophilisation. Die Verbindung wurde mittels MALDI-MS und NMR-Spektroskopie analysiert. Das HPLC- Chromatogramm des Reaktionsgemischs und der gereinigten Substanz ist in Fig. 2 abgebildet (A = aktivierter Chelator, B = 4-Nitrophenol und das HPLC-Chromatogramm des gereinigten aktivierten Esters 3 (Peak C)). DOTA (1.0 mmol) was dissolved in 10 ml of water. A solution of (2.0 mmol) 4-nitrophenol in 6 ml acetonitrile was added. A solution of 1.0 mmol of 1-ethyl-3- [3- (diamino) propyl] carbodiimide × HCl (EDC) in 2 ml of water was added dropwise to this solution with vigorous stirring. The reaction mixture was stirred for 30 min and evaporated to dryness. RP-HPLC (10 × 250 mm column) with a linear gradient from 0 to 60% acetonitrile foot = 4 ml / min over 15 min gave the pure time substance in 58% yield after lyophilization. The compound was analyzed by MALDI-MS and NMR spectroscopy. The HPLC chromatogram of the reaction mixture and the purified substance is shown in FIG. 2 (A = activated chelator, B = 4-nitrophenol and the HPLC chromatogram of the purified activated ester 3 (peak C)).

2. Bestimmung der Stabilität von 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7- triessigsäure-10-essigsäure-4-nitrophenylester2. Determination of the Stability of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7- triacetic acid-10-acetic acid 4-nitrophenyl ester

Die Stabilität von 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-10- essigsäure-4-nitrophenylester wurde in wässriger Lösung unter verschiedenen pH-Werten bestimmt. Der aktivierte Chelator wurde in 0.2 M Boratpuffer gelöst. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und die Konzentration mittels analytischer RP-HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. The stability of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid-10-acetic acid-4-nitrophenyl ester was determined in aqueous solution at various pH values. The activated chelator was dissolved in 0.2 M borate buffer. Samples were taken at different times and the concentration was determined using analytical RP-HPLC. The results are shown in FIG. 3.

3. Konjugation von 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-10- essigsäure-4-nitrophenylester an Tyr3-Lys5-Boc-octreotid3. Conjugation of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid-10-acetic acid-4-nitrophenyl ester to Tyr 3 -Lys 5 -Boc-octreotide

50 µl einer (0.01 mol/l) Lösung von Tyr3-Lys5-Boc-octreotid in Boratepuffer (0.1 mol/l, pH 8.0) mit 20% DMF wurde auf 4°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurde 1 eq. 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-10- essigsäure-4-nitrophenylester (gelöst in 50 µl 20% DMF in Wasser) über eine Zeit von 5 min gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 min bei 4°C gerührt und dann auf eine Temperatur von 25°C kommen gelassen und weitere 30 min gerührt. RP-HPLC wurde zur Isolation des Konjugats ((10 × 250 mm column) mit einem linearen Gradient von 0 bis 100% Acetonitrile mit 0.1% Trifluoroessigsäure; Fluß = 4 ml/min über 30 min) durchgeführt. Das Konjugat wurde mittels MALDI-MS charakterisiert. 50 ul of a (0.01 mol / l) solution of Tyr 3 -Lys 5 -Boc-octreotide in borate buffer (0.1 mol / l, pH 8.0) with 20% DMF was cooled to 4 ° C. 1 eq. 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid-10-acetic acid-4-nitrophenyl ester (dissolved in 50 ul 20% DMF in water) was added over a period of 5 min. The reaction mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes and then allowed to warm to 25 ° C and stirred for a further 30 minutes. RP-HPLC was used to isolate the conjugate ((10 × 250 mm column) with a linear gradient from 0 to 100% acetonitrile with 0.1% trifluoroacetic acid; flow = 4 ml / min over 30 min). The conjugate was characterized by MALDI-MS.

Claims (13)

1. Aktivierter Ester von Chelatoren entsprechend Formel I

Chel(-Ph)m I

wobei Chel ein Chelator entsprechend einer der allgemeinen Formeln A, B oder C ist,


wobei
die gebogenen Bindungen eine C1-C6-Alkylkette sind, in der ein oder mehrere nicht benachbarte C-Atome unabhängig voneinander durch O, NH, S, N-C1-C3-alkyl, PO2H, OPO2H oder OPO2HO ersetzt sein können,
R C oder N ist,
X O, S, PH, P-C1-C3-alkyl, NH oder N-C1-C3-alkyl ist,
Y eine reaktive Säuregruppe, wie z. B. Carboxylat, Phosphat, Phosphat monoester, Sulfat oder Sulfat monoester oder die entsprechende Säure ist, wobei eine Anzahl von m Y-Gruppen Esterbindungen mit Ph bilden,
m 1 bis 4 ist für die Chelatoren nach Formel A und B und 1 bis 3 ist für die Chelatoren nach Formel C (bevorzugt ist m = 1),
Ph eine substituierte oder unsubstituierte Phenoxy-, Thiophenoxy-, Naphthoxy-, Thionaphthoxy-Gruppe oder andere aromatische oder heteroaromatische C5-C25 Aryloxy oder Thioaryloxy-Gruppe ist. 1. Activated ester of chelators according to formula I.

Chel (-Ph) m I

where Chel is a chelator according to one of the general formulas A, B or C,


in which
the bent bonds are a C 1 -C 6 alkyl chain in which one or more non-adjacent C atoms independently of one another by O, NH, S, NC 1 -C 3 alkyl, PO 2 H, OPO 2 H or OPO 2 HO can be replaced
Is RC or N,
XO, S, PH, PC 1 -C 3 alkyl, NH or NC 1 -C 3 alkyl,
Y is a reactive acid group, such as. B. carboxylate, phosphate, phosphate monoester, sulfate or sulfate monoester or the corresponding acid, a number of m Y groups forming ester bonds with Ph,
m is 1 to 4 for the chelators according to formula A and B and 1 to 3 is for the chelators according to formula C (preferably m = 1),
Ph is a substituted or unsubstituted phenoxy, thiophenoxy, naphthoxy, thionaphthoxy group or other aromatic or heteroaromatic C 5 -C 25 aryloxy or thioaryloxy group. 2. Aktivierter Ester nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ph eine Phenoxy- oder Thiphenoxy-Gruppe der Formel II ist,


wobei
R, R', R', R''' und R"" unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, I, OH, NO2, O-alkyl, O-aryl, SH, S-alkyl, S-aryl, SO3H, NH2, alkyl, aryl, H2PO4, NH-alkyl, NH-aryl, N(alkyl)2, N(aryl)2 oder N(alkyl)(aryl) sind,
mit
alkyl = eine lineare, verzweigte oder cyklische C1-C12 Gruppe, wobei ein oder mehrere C-Atome durch ein oder mehrere O, NH oder S substituiert sein können,
aryl = eine aromatische oder heteroaromatische C5-C15 Gruppe,
Z = O oder S ist. 2. Activated ester according to claim 1, characterized in that Ph is a phenoxy or thiphenoxy group of the formula II,


in which
R, R ', R', R '''and R "" independently of one another are H, F, Cl, Br, I, OH, NO 2 , O-alkyl, O-aryl, SH, S-alkyl, S-aryl , SO 3 H, NH 2 , alkyl, aryl, H 2 PO 4 , NH-alkyl, NH-aryl, N (alkyl) 2 , N (aryl) 2 or N (alkyl) (aryl),
With
alkyl = a linear, branched or cyclic C 1 -C 12 group, where one or more C atoms can be substituted by one or more O, NH or S,
aryl = an aromatic or heteroaromatic C 5 -C 15 group,
Z = O or S. 3. Aktivierter Ester nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Ph eine 4-Nitrophenoxy, 2-Nitrophenoxy, 2,6- Difluorophenoxy, 2,3,5-Trifluorophenoxy oder eine 2,3,5,6- Tetrafluorophenoxy Gruppe ist. 3. Activated ester according to one of claims 1 or 2, characterized characterized in that Ph is 4-nitrophenoxy, 2-nitrophenoxy, 2,6- Difluorophenoxy, 2,3,5-trifluorophenoxy or a 2,3,5,6- Is tetrafluorophenoxy group. 4. Aktivierter Ester nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Chel ausgewählt aus ist einer der folgenden Gruppen:


4. Activated ester according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that Chel is selected from one of the following groups:


5. Aktivierter Ester nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der aktivierte Ester mit einem Nuklid komplexiert ist. 5. Activated ester according to at least one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the activated ester is complexed with a nuclide. 6. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Estern von Chelatoren entsprechend der allgemeinen Formel I durch
Bereitstellung eines Chelators, welcher mindestens eine reaktive Säuregruppe und eine phenolische Komponente enthält;
Mischen des Chelators und der phenolischen Komponente mit einem Kondensationsmittel in einem geeigneten Lösungsmittel;
Isolierung des aktivierten Chelators aus dem Reaktionsgemisch. 6. Process for the preparation of activated esters of chelators according to the general formula I by
Providing a chelator containing at least one reactive acid group and a phenolic component;
Mixing the chelator and the phenolic component with a condensing agent in a suitable solvent;
Isolation of the activated chelator from the reaction mixture. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Chelator um DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure), NOTA (1,4,7- Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure) oder TETA (1,4,8,11- Tetraazacyclotetradecan-1,4,8,11-tetraessigsäure) handelt. 7. The method according to claim 6, characterized in that it is the chelator for DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), NOTA (1,4,7- Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid) or TETA (1,4,8,11- Tetraazacyclotetradecan-1,4,8,11-tetraacetic acid). 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der phenolischen Komponente um 4-Nitrophenol, 2- Nitrophenol, 2,6-Difluorphenol, 2,3,5-Trifluorphenol oder 2,3,5,6- Tetrafluorphenol handelt. 8. The method according to any one of claims 6 or 7, characterized in that the phenolic component is 4-nitrophenol, 2- Nitrophenol, 2,6-difluorophenol, 2,3,5-trifluorophenol or 2,3,5,6- Tetrafluorophenol. 9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kondensationsmittel ein Carbodiimid ist. 9. The method according to at least one of claims 6 to 8, characterized characterized in that the condensing agent is a carbodiimide. 10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der aktivierte Chelator mittels flüssigchromatographischer Methoden aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird. 10. The method according to at least one of claims 6 to 9, characterized characterized that the activated chelator by means of liquid chromatographic methods isolated from the reaction mixture becomes. 11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der isolierte aktivierte Chelator mit einem Nuklid komplexiert ist. 11. The method according to at least one of claims 6 to 10, characterized characterized that the isolated activated chelator with a nuclide is complex. 12. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten von Chelatoren durch Reaktion von zumindest einem aktivierten Chelator nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit zumindest einem Zielmolekül. 12. Process for the preparation of conjugates of chelators by Response of at least one activated chelator according to one of the Claims 1 to 5 with at least one target molecule. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Zielmolekül um einen Antikörper oder ein Peptid handelt. 13. The method according to claim 12, characterized in that it is the target molecule is an antibody or a peptide.
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