DE10219031A1 - Detecting biologically active compounds, useful for detecting toxins and in drug screening, based on their effect on luminescent bacteria - Google Patents

Detecting biologically active compounds, useful for detecting toxins and in drug screening, based on their effect on luminescent bacteria

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Abstract

Method for detecting biologically active compounds (I) from their effect on luminescent microorganisms (A). Method for detecting biologically active compounds (I) from their effect on luminescent microorgansims (A) comprises: (a) coating a carrier, on which test compounds have been deposited, with a suspension of (A); and (b) detecting (I) from a change in luminescence of (A). The new feature is that luminescence is stimulated before and/or during detection and/or the duration of luminescence is extended using substances (II) that regulate or prolong luminescence. An Independent claim is also included for a kit for the process comprising (A), in stable form for transport or storage; at least one growth medium (or receptor for it or its individual components) and additives (or their biochemical precursors) for stimulating growth and/or luminescence of (A), and/or (II).

Description

Lumineszenztests haben für die Untersuchung der biologischen Aktivität von Substanzen allgemeine Bedeutung erhalten und werden z. B. in ökotoxikologischen Anwendungen oder beim Screening von Prüfsubstanzen der pharmazeutischen Forschung eingesetzt. Die Testverfahren beruhen auf der direkten Beeinflussung von Biolumineszenzvorgängen durch Substanzen und zeigen biologische Wirkung bzw. Toxizität durch Änderung der Lumineszenzintensität an. Dabei werden toxische Substanzeigenschaften häufig durch Verringerung der Biolumineszenz nachgewiesen, während spezifische biologische Wirkungen in der Regel durch die Stimulation von Reportergensystemen auf Biolumineszenzbasis selektiv erfasst werden. Luminescence tests have been used to study the biological activity of Substances receive general meaning and are used for. B. in ecotoxicological Applications or in the screening of test substances of pharmaceutical Research used. The test procedures are based on the direct influence of Bioluminescence processes by substances and show biological effects or Toxicity by changing the luminescence intensity. This will cause toxic Substance properties often demonstrated by reducing bioluminescence, while specific biological effects are usually stimulated by Bioluminescence-based reporter gene systems are selectively detected.

Ein verbreitet angewendetes Verfahren zur Bestimmung der Toxizität nutzt die Verringerung der Lumineszenz von Leuchtbakterien in Gegenwart toxischer Substanzen. Nach dieser Methode wird die zu prüfende Substanz zu einer Suspension lumineszenter Bakterien gegeben. Toxische Substanzen reduzieren die Intensität der Lumineszenz und können auf diese Weise erfasst werden [A. A. Bulich, Bioluminescence Assays, S. 57-74 in G. Bitton und B. J. Dutka, Toxicity Testing Using Microorganisms, Vol 1, 1986, CRC Press, Boca Raton]. Für komplexe Substanzgemische, die bei realen Proben häufig vorliegen, liefert dieses Testverfahren lediglich summarische Resultate und lässt keine Rückschlüsse auf die aktive Komponente zu. Darüber hinaus kommt es beim gleichzeitigen Vorliegen von toxischen Substanzen (Lumineszenzverringerung) und Verbindungen, die die Lumineszenz stimulieren zu falschen Bewertungen derartiger Proben. A widely used method for determining toxicity uses the reduction in the luminescence of luminous bacteria in the presence of toxic substances. According to this method, the substance to be tested is added to a suspension of luminescent bacteria. Toxic substances reduce the intensity of the luminescence and can be detected in this way [AA Bulich, Bioluminescence Assays, pp. 57-74 in G. Bitton and BJ Dutka, Toxicity Testing Using Microorganisms, Vol 1 , 1986 , CRC Press, Boca Raton] , For complex substance mixtures that are often present in real samples, this test procedure only provides summary results and does not allow any conclusions to be drawn about the active component. In addition, the simultaneous presence of toxic substances (luminescence reduction) and compounds that stimulate luminescence leads to incorrect evaluations of such samples.

Zur sicheren Beurteilung der biologischen Aktivität von Gemischen müssen diese in Einzelkomponenten zerlegt und nachfolgend Komponenten-weise geprüft werden. Ein direktes Verfahren hierzu beruht auf der Kopplung von Biolumineszenz mit chromatographischen Trenntechniken (chromatographische Wirkungsdetektion). Dabei werden Substanzgemische dünnschichtchromatographisch getrennt und toxische Substanzen durch Beschichtung der Dünnschichtchromatographie-Platte mit Leuchtbakterien über die Lumineszenzminderung detektiert [US Patent 6,017,722; US Patent 6,340,572; US Patent 6,238,928; G. Eberz, H.-G. Rast, K. Burger, W. Kreiss, C. Weisemann, Chromatographia 43, 5 (1996)]. For a reliable assessment of the biological activity of mixtures, these must be broken down into individual components and subsequently checked component by component. A direct method for this is based on the coupling of bioluminescence with chromatographic separation techniques (chromatographic effect detection). Mixtures of substances are separated by thin-layer chromatography and toxic substances are detected by coating the thin-layer chromatography plate with luminous bacteria via the reduction in luminescence [US Pat. No. 6,017,722; U.S. Patent 6,340,572; U.S. Patent 6,238,928; G. Eberz, H.-G. Rast, K. Burger, W. Kreiss, C. Weisemann, Chromatographia 43, 5 ( 1996 )].

Die grundsätzlich leistungsfähige chromatographische Wirkungsdetektion nach dem bekannten Stand der Technik hat sich bisher in der Praxis nicht breit durchsetzen können, da die erfolgreiche Anwendung gleichzeitig analysentechnisches und mikrobiologisches Know How und entsprechend umfangreiche Laborausstattungen erfordert. The basically powerful chromatographic effect detection after Known prior art has so far not been widely used in practice can, since the successful application at the same time analytical and microbiological know-how and correspondingly extensive laboratory equipment requires.

Zusätzlich zur chromatographischen Substanztrennung muss für den Detektionsschritt eine frische Kultur mit vitalen lumineszenten Bakterien in ausreichender Menge bereitgestellt werden. Die nach dem Stand der Technik ausgeführte Lumineszenzdetektion liefert auf der Dünnschichtchromatographieplatte nur geringe Lumineszenz, so dass die Detektion nur mit hohem Aufwand, z. B. über höchstsensitive Imagingsysteme mit Restlichtverstärkung möglich wird. In addition to the chromatographic separation of substances for the Detection step a fresh culture with vital luminescent bacteria in sufficient Amount to be provided. The state-of-the-art Luminescence detection provides only a small amount on the thin-layer chromatography plate Luminescence, so that the detection only with great effort, e.g. B. about highly sensitive Imaging systems with low light amplification is possible.

Der in US Patent 6,340,572 beschriebene Kit sieht die Anwendung eines Verdünnungsmittels für das biolumineszente Agens vor, d. h. für die Herstellung des Detektionsmittels werden dort zwei Komponenten und ein Verdünnungsschritt konzipiert. The kit described in US Patent 6,340,572 provides for the use of a Diluent for the bioluminescent agent, i.e. H. for the production of the Detection means there are designed two components and a dilution step.

Das in US Patent 6,017,722 beschriebene Verfahren weist die dort beschriebene Einschränkung hinsichtlich der Dauer der Biolumineszenz auf dem Chromatographiemedium auf. Diese Einschränkung folgt aus Verdunstungsprozessen, die die Vitalität der Mikroorganismen beeinträchtigen. The method described in US Patent 6,017,722 has the method described there Limitation on the duration of bioluminescence on the Chromatography medium. This limitation follows from evaporation processes that affect vitality of the microorganisms.

Für Vibrio harveyi ist die Lumineszenzsteigerung durch Boratdiester bekannt [X. Chen, S. Schauder, N. Potier, A. von Dorsselaer, I. Pelczer, B. L. Bassler, F. M. Hughson, Nature, Vol. 415, 545, 2002]. Es ist weiterhin bekannt, dass N-Acylhomoserinlactone geeignet sind, die als bakterielle Signalstoffe die Biolumineszenz in Vibrio fischeri stimulieren [J. Throup, M. K. Winson, N. J. Bainton, B. W. Bycroft, G. S. A. B. Stewart; Proceedings of the 8th International Symposium of Bioluminescence and Chemiluminescence, Cambridge 1994, S. 89-92, John Wiley]. The increase in luminescence by borate diesters is known for Vibrio harveyi [X. Chen, S. Schauder, N. Potier, A. von Dorsselaer, I. Pelczer, BL Bassler, FM Hughson, Nature, Vol. 415, 545, 2002]. It is also known that N-acylhomoserine lactones are suitable which, as bacterial signal substances, stimulate the bioluminescence in Vibrio fischeri [J. Throup, MK Winson, NJ Bainton, BW Bycroft, GSAB Stewart; Proceedings of the 8th International Symposium of Bioluminescence and Chemiluminescence, Cambridge 1994, pp 89-92, John Wiley].

Die in US Patent 6,017,722 beschriebene Beschichtung der Platte durch eine Spraytechnik weist in der Praxis zahlreiche Nachteile auf. Mit Labor-üblichen Apparaturen gelingt keine gleichmäßige Beschichtung der Oberfläche. Dies wird durch die in US Patent 6,017,722 angegebenen Beispiele deutlich belegt. Durch Verdunstungsprozesse während des Sprühvorgangs wird ein Teil der Bakterien geschädigt, so dass nur reduzierte Lumineszenzausbeuten erreicht werden. Darüber hinaus ist beim Arbeiten mit Mikroorganismen die Aerosolbildung aus Gründen des Arbeitsschutzes zu vermeiden, d. h. eine Beschichtung durch Sprühen mit lebenden Bakterien erfordert eine wirksame Absaugeinrichtung. The coating of the plate described in US Patent 6,017,722 by a Spray technology has numerous disadvantages in practice. With standard laboratory equipment the surface cannot be evenly coated. This is explained in US Patent 6,017,722 examples clearly demonstrated. By Evaporation processes during the spraying process damage some of the bacteria, so only reduced luminescence yields can be achieved. In addition, when working aerosol formation with microorganisms for reasons of occupational safety avoid, d. H. coating by spraying with living bacteria requires one effective suction device.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Kit zum Nachweis biologisch aktiver Substanzen bereitzustellen, dass für den praktischen Einsatz der chromatographischen Wirkungsdetektion die Einschränkungen des bisherigen Standes der Technik überwindet und eine für die Detektion ausreichend stabile bzw. langandauernde Lumineszenzemission auch bei geringer Konzentration der Mikroorganismen bereitstellt. The object of the invention is to provide a method and a kit for detecting biologically provide active substances that for the practical use of the chromatographic effect detection the limitations of the previous state of the Technology overcomes and a stable or stable enough for the detection Long-term luminescence emission even with a low concentration of the microorganisms provides.

Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Detektion biologisch aktiver Substanzen enthaltend die Schritte:

  • a) Bereitstellung eines Trägers mit zu prüfenden Substanzen
  • b) Bereitstellung einer Suspension mit lumineszierenden Mikroorganismen,
  • c) Beschichtung des Trägers mit der Mikroorganismen-Suspension,
  • d) Nachweis der biologisch aktiven Substanzen auf dem Träger durch Detektion der Lumineszenzänderung der Mikroorganismen-Suspension, dadurch gekennzeichnet, dass
  • e) die Lumineszenz der Mikroorganismen vor oder während der Detektion stimuliert wird, und/oder
  • f) die Dauer der Lumineszenz der Mikroorganismen durch Substanzen zur Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen verlängert wird.
The object of the invention is achieved by a method for the detection of biologically active substances comprising the steps:
  • a) Provision of a carrier with substances to be tested
  • b) provision of a suspension with luminescent microorganisms,
  • c) coating the support with the microorganism suspension,
  • d) detection of the biologically active substances on the carrier by detection of the change in luminescence of the microorganism suspension, characterized in that
  • e) the luminescence of the microorganisms is stimulated before or during the detection, and / or
  • f) the duration of the luminescence of the microorganisms is extended by substances for regulating and extending the luminescence duration of the microorganisms.

Um die Lumineszenzleistung der eingesetzten Mikroorganismen-Suspension zu steigern, werden im erfindungsgemäßen Verfahren Substanzen eingesetzt, die gezielt die Biolumineszenz stimulieren. Als Lumineszenz stimulierende Substanzen können N- Acylhomoserinlactone wie N-(3-Oxohexanoyl)-L-Homoserinlacton, Dipeptide, Oligopeptide, Borverbindungen wie Boratdiester oder Chinolone oder biochemische Vorläufersubstanzen von Lumineszenz induzierenden Substanzen eingesetzt werden. In order to increase the luminescence performance of the microorganism suspension used, substances are used in the method according to the invention which specifically stimulate bioluminescence. N-acylhomoserine lactones such as N- ( 3- oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, dipeptides, oligopeptides, boron compounds such as borate diesters or quinolones or biochemical precursors of luminescence-inducing substances can be used as luminescence-stimulating substances.

In der Regel zeigen biologische Wirkungen eine ausgeprägte Zeitabhängigkeit. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können akut toxische Wirkungen von antibiotischen Effekten, die erst nach längerer Einwirkungszeit auftreten, gut unterschieden werden. Zur Untersuchung dieser Zeitabhängigkeit benötigt man hinreichende Stabilität der Lumineszenz auf dem Träger über den Beobachtungszeitraum. Für die Regulierung und Verlängerung, also die zeitliche Stabilisierung der Biolumineszenz, können Substanzen eingesetzt werden, die z. B. ein rasches Austrocknen des mit Mikroorganismen beschichteten Trägers verhindern. Für diesen Zweck eignen sich insbesondere Oligomere und Polymere, insbesondere biokompatible und hydrophile, z. B. auf Polysaccharid-Basis. Bevorzugt werden hierfür Acrylate, Polyvinylpyridine, Polyethylenglykole, Polyetherderivate, Polysaccharide, Dextrane, modifizierte Zellulosen, Peptide und Proteine eingesetzt, besonders bevorzugt in Konzentration bis zu 2% des sie enthaltenden Mediums. As a rule, biological effects show a pronounced dependence on time. With the method according to the invention can have acutely toxic effects of antibiotic effects, which appear only after a longer exposure time, well differentiated become. Sufficient is needed to investigate this time dependency Stability of the luminescence on the support over the observation period. For the Regulation and extension, i.e. the temporal stabilization of bioluminescence, can be used substances that e.g. B. a quick drying of the Prevent coated organisms from microorganisms. Are suitable for this purpose especially oligomers and polymers, especially biocompatible and hydrophilic, z. B. based on polysaccharide. Acrylates, polyvinylpyridines, Polyethylene glycols, polyether derivatives, polysaccharides, dextrans, modified Celluloses, peptides and proteins used, particularly preferably in a concentration up to to 2% of the medium containing them.

Die Anzuchtlösung für die Mikroorganismen-Suspension kann die stimulierenden Substanzen für die Lumineszenz der Mikroorganismen oder Bestandteile zur Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen enthalten. The growth solution for the microorganism suspension can be the stimulating one Substances for the luminescence of the microorganisms or components for Regulation and extension of the luminescence duration of the microorganisms included.

Mikroorganismen-Suspensionen können aus gefriergetrockneten Mikroorganismen oder gefrorenen Zellkonzentraten durch Rekonstitution mit einem Rekonstitutionsmedium gewonnen werden. Für die rasche Rekonstitution gefriergetrockneter oder durch Zentrifugation konzentrierter Mikroorganismen ist eine Stimulation der Lumineszenz oder Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen durch eine Zugabe entsprechender Substanzen zum Verdünnungsmedium oder Rekonstitutionsmedium besonders vorteilhaft, da ohne Stimulation nur geringe Lumineszenzintensitäten oder -dauern erreicht werden. Microorganism suspensions can be made from freeze-dried microorganisms or frozen cell concentrates by reconstitution with a Reconstitution medium can be obtained. For quick reconstitution of freeze-dried or centrifugation of concentrated microorganisms stimulates the Luminescence or regulation and extension of the luminescence duration of the Microorganisms by adding appropriate substances to the Dilution medium or reconstitution medium is particularly advantageous because without stimulation only low luminescence intensities or durations can be achieved.

Bei der Verdünnung von Mikroorganismen-Suspensionen mit Induktor-haltigen Medien ist es ebenfalls vorteilhaft dem Verdünnungsmedium Substanzen zur Lumineszenzstimulation oder -verlängern zuzugeben. Damit werden geringere Mengen lumineszenter Mikroorganismen benötigt ohne Einbußen bei der Qualität des Nachweises der Lumineszenz hinnehmen zu müssen, so dass sich der Aufwand für die Bereitstellung verringert. When diluting microorganism suspensions with those containing inductors Media, it is also advantageous to add substances to the dilution medium Add luminescence stimulation or prolongation. This means smaller quantities luminescent microorganisms needed without sacrificing the quality of the To have to accept the luminescence, so that the effort for the Deployment decreased.

Eine Lumineszenzsteigerung kann weiterhin durch eine hohe Zelldichte von mehr als 2.109 Zellen/ml in der Mikroorganismen-Suspension erreicht werden, zum Beispiel dadurch, dass zum Anzuchtmedium der Mikroorganismen Aminosäuren oder anderen Carbonsäuren, insbesondere Asparaginsäure zugesetzt werden. An increase in luminescence can also be achieved by a high cell density of more than 2.10 9 cells / ml in the microorganism suspension, for example by adding amino acids or other carboxylic acids, in particular aspartic acid, to the growth medium of the microorganisms.

Als lumineszente Mikroorganismen können z. B. die marinen Leuchtbakterien Vibrio fischeri verwendet werden. Weiterhin eignen sich auch andere lumineszente Mikroorganismen wie z. B. Vibrio harveyi, Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum, Photorhabdus luminescens. Darüber hinaus können auch gentechnisch modifizierte lumineszente Mikroorganismen eingesetzt werden. As luminescent microorganisms z. B. Vibrio marine luminous bacteria fischeri can be used. Other luminescent materials are also suitable Microorganisms such as B. Vibrio harveyi, Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum, Photorhabdus luminescens. They can also be genetically engineered modified luminescent microorganisms can be used.

Der Träger mit den biologisch aktiven Substanzen kann eine Dünnschichtchromatographieplatte oder ein Elektrophoresegel oder ein anderes, bevorzugt planares, Trennsystem sein, auf dem sich die biologisch aktiven Substanzen in Form von Zonen befinden. Die biologisch aktiven Substanzen können sich auch auf einem Träger in Form von Spots eines Substanzarrays befinden. The carrier with the biologically active substances can be a Thin layer chromatography plate or an electrophoresis gel or another, preferably planar, Separation system on which the biologically active substances in the form of Zones. The biologically active substances can also be on a carrier in the form of spots of a substance array.

Die Detektion der Lumineszenz der Mikroorganismen-Suspension kann durch photographische Verfahren oder Imagingtechniken erfolgen. The luminescence of the microorganism suspension can be detected by photographic processes or imaging techniques.

Die Beschichtung des Trägers kann durch Tauchen des Trägers in eine Suspension von Mikroorganismen erfolgen. Während des Tauchvorgangs findet auf der zu beschichtenden Oberfläche eine Anreicherung der lumineszenten Mikroorganismen statt. So kann z. B. die Suspension von Vibrio fischeri aus einer Übernachtkultur bis auf das mehr als fünffache Volumen verdünnt werden und es wird immer noch die sichere Detektion toxischer Substanzen z. B. auf einer mit Kieselgel beschichteten Dünnschichtplatte erreicht. Dieser Effekt ist überraschend, da man beim pH-Wert der Tauchsuspension (ca. pH 7) von einer negativen Ladung der Kieselgelmatrix und gleichzeitig einer negativen Oberflächenladung der Leuchtbakterien ausgehen muss. Eine Erklärungsmöglichkeit für dieses unerwartete Verhalten bietet die Kompensation der elektrostatischen Kräfte durch andere Wechselwirkungen sowie eine reduzierte negative Ladungsdichte für die Bakterienhülle. Messungen des Zetapotentials von Vibrio fischeri in der Tauchlösung stützen diese Annahme. The carrier can be coated by immersing the carrier in a suspension of microorganisms. During the diving process takes place on the coating surface an enrichment of the luminescent microorganisms instead of. So z. B. the suspension of Vibrio fischeri from an overnight culture be diluted to more than five times the volume and it will still be the reliable detection of toxic substances e.g. B. coated on a silica gel Thin film plate reached. This effect is surprising since the pH value of the Immersion suspension (approx. PH 7) from a negative charge of the silica gel matrix and at the same time a negative surface charge of the luminous bacteria must go out. The provides an explanation for this unexpected behavior Compensation of the electrostatic forces through other interactions as well as one reduced negative charge density for the bacterial envelope. Measurements of the zeta potential from Vibrio fischeri in the diving solution support this assumption.

Durch das Tauchen erfolgt außerdem eine raschere Beschichtung des Trägers und es ergibt sich damit die Möglichkeit von zeitabhängigen Messungen bereits nach kurzen Einwirkungszeiten. Auf diese Weise können akute toxische Effekte bereits innerhalb weniger Sekunden nachgewiesen werden. Weiterhin bleibt die Auftrennung von Substanzen auf dem Träger mit hoher Qualität erhalten, da in der kurzen Zeit kaum eine Diffusion der Substanzzonen stattfindet. Dipping also causes the carrier and it to coat more quickly This results in the possibility of time-dependent measurements after a short time Exposure times. In this way, acute toxic effects can already occur within be detected in a few seconds. The separation of Preserve substances on the carrier with high quality, because in the short time hardly any Diffusion of the substance zones takes place.

Die Beschichtung des Trägers erfolgt bevorzugt homogen, was einen gleichmäßigen Hintergrund und ein verbessertes Signal/Rausch-Verhältnis bei der Lumineszenzmessung zur Folge hat. The carrier is preferably coated homogeneously, which is uniform Background and an improved signal / noise ratio at the Luminescence measurement results.

Die biologische Aktivität kann, abhängig vom verwendeten biologischen System, sowohl eine Verringerung wie auch eine Zunahme der Lumineszenz bewirken. In einem Messregime kann der zeitliche Verlauf der Inhibierung bzw. Stimulierung der Lumineszenz der Mikroorganismen-Suspension aufgezeichnet und ausgewertet werden. The biological activity can, depending on the biological system used, cause both a decrease and an increase in luminescence. In The time course of the inhibition or stimulation of the Luminescence of the microorganism suspension is recorded and evaluated become.

Eine weitere Erhöhung der Lumineszenzintensität der Mikroorganismen und damit eine Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit für die Detektion kann durch Kühlung der Mikroorganismen oder durch Lichteinstrahlung auf die Mikroorganismen erreicht werden. A further increase in the luminescence intensity of the microorganisms and thus an improvement in detection sensitivity for detection can be achieved by Cooling of the microorganisms or by light irradiation on the microorganisms can be achieved.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Kit zur einfachen Durchführung der Wirkungsdetektion, der folgende Bestandteile enthalten kann:

  • - Mikroorganismen in einer für Transport und Lagerung stabilisierten Form,
  • - ein oder mehrere Anzuchtmedien oder Rezepturen für Anzuchtmedien oder die Einzelbestandteile für Anzuchtmedien für die Mikroorganismen,
  • - Zusätze zur Stimulierung des Wachstums und/oder der Lumineszenz von Mikroorganismen oder deren biochemische Vorstufen und/oder Zusätze zur Verlängerung der Lumineszenzdauer von Mikroorganismen.
The invention furthermore relates to a kit for simple performance detection, which can contain the following components:
  • Microorganisms in a form stabilized for transport and storage,
  • one or more culture media or formulations for culture media or the individual components for culture media for the microorganisms,
  • - Additives to stimulate the growth and / or luminescence of microorganisms or their biochemical precursors and / or additives to extend the luminescence period of microorganisms.

Die Mikroorganismen können durch Gefriertrocknung oder durch Einfrieren mit geeigneten Konservierungsmitteln oder durch Adsorption an geeignete poröse Trägermaterialien oder durch Einschluss in gelförmige Materialien stabilisiert sein. The microorganisms can by freeze-drying or by freezing with suitable preservatives or by adsorption on suitable porous Carrier materials or be stabilized by inclusion in gel-like materials.

Der Kit kann weiterhin eine Tauchkammer für die homogene Beschichtung eines Trägers mit den Mikroorganismen enthalten. Bevorzugt weist eine solche Tauchkammer einen Kühlmantel oder Wärmeaustauscher zur Kühlung der Mikroorganismen-Suspension auf. The kit can also be a plunge chamber for the homogeneous coating of a Contain carrier with the microorganisms. Such one preferably Immersion chamber a cooling jacket or heat exchanger for cooling the Microorganism suspension.

Die Anwendung einer Tauchkammer für den Beschichtungsschritt erhöht die Lumineszenz der Bakterien-Oberfläche und führt zu gleichmäßiger Beschichtung. Der aus der Beschichtungsqualität folgende gleichmäßige Hintergrund erlaubt eine sichere Erkennung von Substanzzonen. The use of an immersion chamber for the coating step increases the Luminescence of the bacteria surface and leads to an even coating. The one out The uniform background following the coating quality allows a safe Detection of substance zones.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb eines Qualitätssicherungssystems werden in der Regel Aussagen zur Kalibrierung, Validierung und Prüfmittelüberwachung gefordert. Für diese Aufgaben wurde als Bestandteil des erfindungsgemäßen Kits ein Test-Träger konzipiert, der in einem Arbeitsschritt die geforderten Aussagen liefert. Der Test-Träger weist definierte Mengen einer Referenzsubstanz mit bekannter biologischer Wirkung auf. Durch einfaches Tauchen des Test-Trägers in die zu prüfende Suspension lumineszenter Mikroorganismen und nachfolgende Messung mit einem Imagingsystem kann die Qualitätsprüfung bzw. Kalibrierung erfolgen. When using the method according to the invention within a Quality assurance system are usually statements on calibration, validation and Test equipment monitoring required. For these tasks was part of the Kits designed a test carrier according to the invention, the in one step provides required statements. The test carrier has defined amounts of one Reference substance with a known biological effect. By simply diving the Test carrier in the suspension to be tested luminescent microorganisms and subsequent measurement with an imaging system can Calibration done.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Test-Träger aus einem Streifen aus Papier, Glas, einem polymeren Material oder Metall mit definiert aufgebrachten Spots der Referenzsubstanzen. Besonders bevorzugt ist der Test-Träger mit porösen Materialien wie Kieselgel beschichtet. In a preferred embodiment, the test carrier consists of a strip made of paper, glass, a polymeric material or metal with defined application Spots of the reference substances. The test carrier with porous is particularly preferred Materials like silica gel coated.

Wird als Referenzsubstanz z. B. 4-Nitrophenol oder ein Kupfersalz verwendet, so werden als Prüfergebnis im Imagingsystem dunkle Zonen an den Positionen der Referenzsubstanzspots ausgewiesen. Damit können sowohl die Funktion des mikrobiologischen Kits wie auch des für die eigentliche Messung notwendigen bildgebenden Systems validiert werden. Is used as a reference substance for. B. 4-nitrophenol or a copper salt, so As a test result in the imaging system, dark zones at the positions of the Reference substance spots reported. This allows both the function of the microbiological kits as well as the imaging necessary for the actual measurement Systems are validated.

Der erfindungsgemäße Kit enthält als Option für Laboratorien oder sonstige Testumgebungen ohne Mikrobiologie-Ausstattung eine Vorrichtung zur vereinfachten Anzucht von Mikroorganismen. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht diese aus einem Glas- oder Kunststoffbehälter, das durch seine Formgebung einen guten Sauerstoffaustausch mit der Anzuchtsuspension gewährleistet und einen Magnetrührstab enthält und optional bereits mit einer Anzuchtlösung und/oder einem Verdünnungsmedium und/oder einem Rekonstitutionsmedium gefüllt ist. Nach Animpfen mit Mikroorganismen wird dieser Behälter bei Raumtemperatur auf einen auf geringe Rührgeschwindigkeit eingestellten Magnetrührer gestellt. Auf diese Weise können auf Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens mit üblichen Laborgeräten Übernachtkulturen hergestellt werden, ohne dass zusätzliche Apparaturen wie z. B. thermostatisierte Schütteltische für die Anzucht erforderlich werden. The kit according to the invention contains an option for laboratories or others Test environments without microbiology equipment a device for simplified Cultivation of microorganisms. In a preferred embodiment, this exists from a glass or plastic container, which has a good shape due to its shape Guaranteed oxygen exchange with the cultivation suspension and one Magnetic stir bar contains and optionally already with a growing solution and / or Dilution medium and / or a reconstitution medium is filled. After inoculation with microorganisms, this container is reduced to a small one at room temperature Stirring speed set magnetic stirrer. That way you can based on the method according to the invention with conventional laboratory equipment Overnight cultures are produced without additional equipment such. B. thermostatted shaking tables may be required for growing.

In dem erfindungsgemäßen Kit kann das Anzuchtmedium Substanzen, Substanzgemische oder deren Lösungen oder deren biochemische Vorläufer als Zusatz enthalten, die das Wachstums- und/oder die Lumineszenz der Mikroorganismen stimulieren. In the kit according to the invention, the growth medium can contain substances Mixtures of substances or their solutions or their biochemical precursors as additives contain the growth and / or luminescence of the microorganisms stimulate.

In einer Ausführungsform enthalten die Anzuchtmedien Dipeptide, Oligopeptide, Borverbindungen, Chinolone oder N-Acylhomoserinlactone oder deren biochemische Vorläufer. In einer bevorzugten Ausführungsformen werden zur Stimulation der Biolumineszenz von Vibrio fischeri N-(3-Oxohexanoyl)-L-Homoserinlacton und/oder Borverbindungen eingesetzt. In one embodiment, the growth media contain dipeptides, oligopeptides, boron compounds, quinolones or N-acylhomoserine lactones or their biochemical precursors. In a preferred embodiment, N- ( 3- oxohexanoyl) -L-homoserine lactone and / or boron compounds are used to stimulate the bioluminescence of Vibrio fischeri.

In einer weiteren Ausführungsform werden Anzuchtmedien eingesetzt, die zusätzlich zu den für die Anzucht von Mikroorganismen üblichen Bestandteilen Aminosäuren oder Carbonsäuren mit Konzentrationen bis zu 2% enthalten. In einer anderen Ausführungsform werden Vibrio fischeri in einem Medium angezüchtet, das zwischen 10 mg/l und 500 mg/l Asparaginsäure enthält. Mit solchen Anzuchtmedien können in Übernachtkulturen sehr hohe Zelldichten erreicht werden. In a further embodiment, growth media are used, which additionally to the amino acid constituents customary for the cultivation of microorganisms or contain carboxylic acids with concentrations up to 2%. In another Embodiment Vibrio fischeri are grown in a medium between Contains 10 mg / l and 500 mg / l aspartic acid. With such growing media, in Overnight cultures very high cell densities can be achieved.

Die Anzuchtmedien können auch Additive enthalten, die die Biolumineszenz regulieren und verlängern. Solche Additive können Oligomere oder Polymere sein, oder aber auch Acrylate, Polyvinylpyridine, Polyethylenglykole, Polyetherderivate, Polysaccharide, Dextrane, modifizierte Zellulosen, Peptide und Proteine. The growth media can also contain additives that promote bioluminescence regulate and extend. Such additives can be oligomers or polymers, or but also acrylates, polyvinylpyridines, polyethylene glycols, polyether derivatives, Polysaccharides, dextrans, modified celluloses, peptides and proteins.

Alternativ oder gleichzeitig können ein im Kit enthaltenes Verdünnungsmedium zur Verdünnung der Mikroorganismen-Suspension oder Rekonstitutionsmedium zur Herstellung gebrauchsfertiger Mikroorganismen-Suspensionen aus Zellkonzentraten oder stabilisierten Präparationen von Mikroorganismen Wachstums- und/oder Lumineszenz-stimulierende Zusätze oder deren biochemische Vorstufen enthalten wie N- Acylhomoserinlactone, Dipeptide, Oligopeptide, Borverbindungen oder Chinolone. Alternatively or simultaneously, a diluent medium contained in the kit can be used Dilution of the microorganism suspension or reconstitution medium for Production of ready-to-use microorganism suspensions from cell concentrates or stabilized preparations of microorganisms growth and / or Luminescence stimulating additives or their biochemical precursors contain such as N- Acyl homoserine lactones, dipeptides, oligopeptides, boron compounds or quinolones.

Das Verdünnungs- und/oder Rekonstitutionsmedium kann auch Additive enthalten, die die Lumineszenz regulieren und verlängern wie Oligomere oder Polymere, Acrylate, Polyvinylpyridine, Polyethylenglykole, Polyetherderivate, Polysaccharide, Dextrane, modifizierte Zellulosen, Peptide und Proteine. The dilution and / or reconstitution medium can also contain additives which regulate and extend the luminescence like oligomers or polymers, Acrylates, polyvinylpyridines, polyethylene glycols, polyether derivatives, polysaccharides, Dextrans, modified celluloses, peptides and proteins.

In einer bevorzugten Ausführungsformen enthalten das Verdünnungs- und/oder Rekonstitutionsmedium zur Stimulation der Lumineszenz von Vibrio fischeri N-(3- Oxohexanoyl)-L-Homoserinlacton und/oder Borverbindungen. In a preferred embodiment, the diluent and / or contain Reconstitution medium for stimulating the luminescence of Vibrio fischeri N- (3- Oxohexanoyl) -L-homoserine lactone and / or boron compounds.

Der erfindungsgemäße Kit kann weiterhin eine Lichtquelle und/oder ein Mittel zur Kühlung der Mikroorganismen-Suspension enthalten. Es kann außerdem eine Vorrichtung zur Auftrennung von Proben mittels planarer Separationstechniken wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder Gelelektrophorese enthalten. The kit according to the invention can also be a light source and / or a means for Cooling of the microorganism suspension included. It can also be a Device for the separation of samples using planar separation techniques such. B. Thin layer chromatography or gel electrophoresis included.

Dem Kit können außerdem Arbeitsvorschriften zu den einzelnen Arbeitsschritten bei der Präparation der Mikroorganismensuspension und der Lumineszenz-Messung und/oder Informationen zu Anwendungsbeispielen beigelegt sein The kit can also include working instructions for the individual work steps the preparation of the microorganism suspension and the luminescence measurement and / or information on application examples must be enclosed

Durch das erfindungsgemäße Verfahren und den Kit wird auch bei geringer Konzentration an Mikroorganismen eine hohe Sensitivität für die Detektion möglich und insgesamt eine hohe Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erreicht. With the method and the kit according to the invention, even at low Concentration of microorganisms a high sensitivity for the detection possible and overall, the process is highly economical.

Das erfindungsgemäße Verfahren erreicht durch spezielle Anzuchtverfahren, durch gezielte Stimulation der Biolumineszenz und durch die eventuelle Anreicherung im Tauchschritt eine besonders hohe Leistung und erlaubt wegen seiner Robustheit eine besonders einfache Ausführungsform. The method according to the invention is achieved by means of special cultivation methods targeted stimulation of bioluminescence and possible enrichment in the Diving step a particularly high performance and due to its robustness allows one particularly simple embodiment.

Der erfindungsgemäße Kit stellt einen signifikanten Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar, da er die praktische Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für Untersuchungslaboratorien ermöglicht, ohne dort mikrobiologisches Know How und apparative Ausstattung für mikrobiologische Arbeiten vorauszusetzen. Durch die gezielte Steigerung der Biolumineszenz wird eine hohe Robustheit der Messung erreicht. Darüber hinaus kann auf die aufwändige Anreicherung von lumineszenten Mikroorganismen, z. B. durch Zentrifugation, verzichtet werden. Die hohe Lumineszenzleistung lässt sogar eine weitgehende Verdünnung des Detektionsmediums zu. The kit according to the invention represents a significant advance over the state of the art, since it is the practical application of the method according to the invention for test laboratories without microbiological know-how and equipment for microbiological work. Through the A targeted increase in bioluminescence will make the measurement extremely robust reached. In addition, the complex enrichment of luminescent can Microorganisms, e.g. B. by centrifugation. The height Luminescence power even allows the detection medium to be largely diluted.

Zur Steigerung der Lumineszenz beim Verdünnen von Übernachtkulturen oder beim Rekonstituieren von Bakterien, die z. B. durch Gefriertrocknung oder Einfrieren in eine lagerfähige Form gebracht wurden, enthält der Kit Medien mit geeigneten Zusätzen oder Rezepturen für derartige Medien. To increase the luminescence when diluting overnight cultures or when Reconstituting bacteria, e.g. B. by freeze drying or freezing in the kit contains media with suitable ones Additions or formulations for such media.

Darüber hinaus ermöglicht eine Tauchkammer eine schnelle Beschichtung und erlaubt damit die Untersuchung von sehr rasch einsetzenden biologischen Wirkungen. Gleichzeit bleibt bei dieser schnellen Detektion die Auftrennung der Substanzzonen z. B. auf einer Dünnschichtplatte weitgehend erhalten, da hier nur kurze Diffusionszeiten möglich sind. Ein weiterer Vorteil der Tauchkammer liegt bei der Arbeitshygiene, da hier im Gegensatz zu Spraytechniken keine Aerosole von Mikroorganismen entstehen. In addition, a plunge chamber enables quick coating and thus allows the investigation of biological effects that set in very quickly. At the same time, the separation of the substance zones remains with this rapid detection z. B. largely preserved on a thin-film plate, since only short ones Diffusion times are possible. Another advantage of the diving chamber is that Work hygiene, since here, in contrast to spray techniques, no aerosols from microorganisms arise.

Abbildungen und BeispieleIllustrations and examples

Die Figuren zeigen: The figures show:

Fig. 1 Lumineszenzbilder einer DC-Platte 1 min und 10 min nach Inkubation mit einer Bakterien-Suspension. Fig. 1 Luminescence images of a TLC plate 1 min and 10 min after incubation with a bacteria suspension.

Fig. 2 Lumineszenzdetektion mit einer Bakterien-Suspension, zum Vergleich hergestellt ohne und mit Zusatz von Asparaginsäure zum Anzuchtmedium. Fig. 2 luminescence detection with a bacterial suspension, made for comparison without and with the addition of aspartic acid to the growth medium.

Beispiel 1example 1

In Beispiel 1 wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der spezifische Nachweis von Substanzen, die die Lumineszenz von Mikroorganismen ändern, mit dem erfindungsgemäßen Kit gezeigt. In example 1, the specific detection is carried out using the method according to the invention of substances that change the luminescence of microorganisms with the shown kit according to the invention.

Zur Detektion der Lumineszenzänderung wurde eine Dünnschichtchromatographie- (DC-)platte, auf der eine Gemischtrennung mittels AMD-Technik [Lit.: K. Burger, Chemistry of Plant Protection, 12, 181-195 (1995)] ausgeführt worden war, mit Vibrio fischeri durch Eintauchen des DC-Trägers in eine Vibrio fischeri-Suspension beschichtet. To detect the change in luminescence, a thin-layer chromatography (DC) plate, on which mixture separation had been carried out using AMD technology [Lit .: K. Burger, Chemistry of Plant Protection, 12, 181-195 ( 1995 )], was carried out with Vibrio fischeri coated by immersing the DC carrier in a Vibrio fischeri suspension.

Untersucht wurden Reaktionsproduktgemische, die als bakterientoxische Komponente 4-tert. Butylphenol enthielten sowie Fraktionen aus einem Aufarbeitungsprozess, in dem 4-tert. Butylphenol abgereichert werden sollte. Das folgende Auftrageschema ordnet diese Proben zu:
1: 30 ng 4-tert.-Butylphenol Referenz
2: 1 µl Reaktionsprodukt 1
3: 1 µl Reaktionsprodukt 2
4: 100 µl Aufarbeitung A von Reaktionsprodukt 1
5: 100 µl Aufarbeitung B von Reaktionsprodukt 1
6: 100 µl Aufarbeitung C von Reaktionsprodukt 1
7: 100 µl Aufarbeitung D von Reaktionsprodukt 1
8: 30 ng 4-tert.-Butylphenol Referenz Reaction product mixtures were investigated which are 4-tert. Contained butylphenol and fractions from a work-up process in which 4-tert. Butylphenol should be depleted. The following order scheme assigns these samples:
1: 30ng 4-tert-butylphenol reference
2: 1 µl reaction product 1
3: 1 µl reaction product 2
4: 100 µl work-up A of reaction product 1
5: 100 µl work-up B of reaction product 1
6: 100 µl work-up C of reaction product 1
7: 100 µl work-up D of reaction product 1
8:30 ng 4-tert-butylphenol reference

Herstellung der Vibrio fischeri TauchsuspensionProduction of the Vibrio fischeri diving suspension

Aus einer Stammkonserve Vibrio fischeri wurden die Bakterien in einen Erlenmeyerkolben, der 400 ml Anzucht-Medium enthält überimpft. Anschließend wird die beimpfte Anzucht-Lösung in einem Schüttelinkubator bei 28°C über Nacht inkubiert. The bacteria were transformed from one stock of Vibrio fischeri into one Erlenmeyer flask containing 400 ml culture medium inoculated. Then the inoculated culture solution incubated in a shaking incubator at 28 ° C overnight.

Das Anzucht-Medium enthielt:
30 g/l NaCl
6,1 g/l NaH2PO4.H2O
2.75 g/l K2HPO4.3H2O
0.204 g/l MgSO4.7H2O
0.5 g/l (NH4)2HPO4
5 g/l Pepton aus Casein (Merck)
0.5 g/l Hefe-Extrakt (DIFCO)
3 ml/l Glyzerin
und wurde mit Hilfe von 1 N HCl bzw. 1 N NaOH auf pH 7,2 ± 0,2 eingestellt. Das Medium wurde vor Gebrauch bei 121°C für 20 min autoklaviert. The growth medium contained:
30 g / l NaCl
6.1 g / l NaH 2 PO 4 .H 2 O
2.75 g / l K 2 HPO 4 .3H 2 O
0.204 g / l MgSO 4 .7H 2 O
0.5 g / l (NH4) 2 HPO 4
5 g / l peptone from casein (Merck)
0.5 g / l yeast extract (DIFCO)
3 ml / l glycerin
and was adjusted to pH 7.2 ± 0.2 using 1N HCl or 1N NaOH. The medium was autoclaved at 121 ° C for 20 min before use.

Lumineszenzdetektionluminescence

Die Bakteriensuspension wurde in eine CAMAG Tauchkammer für die Dünnschichtchromatographie gegeben. Zur Beschichtung der Dünnschichtplatte wurde diese für wenige Sekunden in die Bakteriensuspension getaucht. Von der beschichteten Platte wurden im feuchten Zustand mit dem Kamerasystem Nightow1 (EG&G Berthold) Lumineszenzbilder aufgenommen. Die Auswertung des Fluoreszenzbildes erfolgte visuell am Bildschirm des Videoimagingsystems (Fig. 1). Zur Dokumentation wurden TIFF-Files mit geeigneten Grafikprogrammen formatiert und beschriftet (Adobe Photoshop, MS Powerpoint). The bacterial suspension was placed in a CAMAG immersion chamber for thin layer chromatography. To coat the thin-layer plate, it was immersed in the bacterial suspension for a few seconds. Luminescence images were taken of the coated plate when wet using the Nightow1 camera system (EG&G Berthold). The fluorescence image was evaluated visually on the screen of the video imaging system ( FIG. 1). For documentation purposes, TIFF files were formatted and labeled with suitable graphics programs (Adobe Photoshop, MS Powerpoint).

ErgebnisResult

Das Ergebnis der Luminezenzdetektion nach 1 min und 10 min Inkubationszeit ist in Fig. 1 zu sehen. Die Bakterien-toxischen Substanzen werden in der Biolumineszenzdetektion durch Löschung der Biolumineszenz angezeigt. Auf den DC-Bahnen 1 und 8 waren jeweils 30 ng 4-tert. Butylphenol aufgetragen. Dies entspricht etwa dem 4- tert. Butylphenol-Anteil in den Reaktionsprodukten 1 und 2 (Bahnen 2 und 3). Die Aufarbeitungen A bis D (Bahnen 4-7), die in der 100fachen Menge aufgetragen wurden, wiesen einen deutlich verringerten Anteil von 4-tert. Butylphenol auf. Bei der hohen Auftragemenge wurden weitere Spurenanteile Lumineszenz-löschender Substanzen sichtbar. Der Vergleich der Lumineszenzbilder nach 1 min und nach 10 min Inkubation auf der DC-Platte ergab für Bahn 6 eine zusätzliche aktive Komponente, die nach längerer Inkubationszeit nicht mehr sichtbar war. Offenbar lag hier eine Substanz vor, die nur kurzzeitig die Vitalität der Bakterienzellen beeinträchtigt. Die schnelle Lumineszenzdetektion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren liefert damit Hinweise zu unterschiedlichen Wirkungsweisen von Gemischkomponenten und erhält darüber hinaus die anfängliche Trennschärfe der dünnschichtchromatographischen Trennung. Die diffusionsbedingte Zonenverbreiterung wird bereits beim Vergleich der beiden 9 min auseinanderliegenden Lumineszenzbilder deutlich. The result of the luminescence detection after 1 min and 10 min incubation time can be seen in FIG. 1. The bacteria-toxic substances are displayed in the bioluminescence detection by deleting the bioluminescence. On DC lanes 1 and 8 , 30 ng were 4-tert. Butylphenol applied. This corresponds approximately to the 4th tert. Butylphenol content in reaction products 1 and 2 (lanes 2 and 3 ). Work-ups A to D (lanes 4-7 ), which were applied in 100 times the amount, showed a significantly reduced proportion of 4-tert. Butylphenol. With the large amount applied, trace amounts of luminescence-quenching substances became visible. The comparison of the luminescence images after 1 min and after 10 min incubation on the TLC plate revealed an additional active component for lane 6 , which was no longer visible after a longer incubation period. Apparently there was a substance here that only briefly affected the vitality of the bacterial cells. The rapid luminescence detection using the method according to the invention thus provides information on the different modes of action of mixture components and moreover maintains the initial selectivity of the thin-layer chromatographic separation. The diffusion-related broadening of the zone is already apparent when comparing the two luminescence images 9 minutes apart.

Beispiel 2Example 2

In Beispiel 2 wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Lumineszenzsteigerung infolge verbesserten Wachstums unter Zusatz von Asparaginsäure zum Anzuchtmedium gezeigt. In Example 2, the Luminescence increase due to improved growth with the addition of aspartic acid to the Growing medium shown.

In zwei parallel ausgeführten Anzuchtversuchen wurden Bakteriensuspensionen nach dem unten beschriebenen Verfahren hergestellt. Zur Prüfung des Einflusses von Asparaginsäure war dem Anzuchtmedium in einem der beiden Ansätze 12,5 mg Asparaginsäure zugesetzt worden. Der Effekt des Asparaginsäurezusatzes wurde durch Aufnahme von Lumineszenzbildern mit dem Kamerasystem Nightow1 von EG&G Berthold nachgewiesen und ist in den Fig. 2a und 2b dargestellt. Im vorliegenden Fall zeigte der mit Asparaginsäure versetzte Ansatz bereits nach 18 h Inkubation deutliche Lumineszenz (rechtes Anzuchtgefäß in Fig. 2a), während im Asparaginsäure-freien Medium erst zu einem späteren Zeitpunkt die Biolumineszenz eintritt (Fig. 2b). In two cultivation experiments carried out in parallel, bacterial suspensions were prepared using the method described below. To test the influence of aspartic acid, 12.5 mg aspartic acid had been added to the growth medium in one of the two batches. The effect of the addition of aspartic acid was demonstrated by taking luminescence images with the Nightow1 camera system from EG&G Berthold and is shown in FIGS . 2a and 2b. In the present case, the batch containing aspartic acid already showed clear luminescence after 18 hours of incubation (right-hand culture container in FIG. 2a), while in the medium free of aspartic acid, bioluminescence only occurs at a later time ( FIG. 2b).

Anzuchtverfahren für Vibrio fischeriCultivation method for Vibrio fischeri

Aus einer Stammkonserve Vibrio fischeri wurden die Bakterien in eine Gewebekulturflasche (z. B. Falcon Art. Nr. 353110), die 125 ml Anzucht-Medium und einen Magnetrührstab enthält überimpft. Anschließend wurde die beimpfte Anzucht-Lösung unter langsamem Rühren auf einem Magnetrührer bei Raumtemperatur inkubiert. The bacteria were transformed from a stock of Vibrio fischeri into a Tissue culture flask (e.g. Falcon Art. No. 353110), the 125 ml culture medium and one Magnetic stir bar contains inoculated. Then the was inoculated Growing solution with slow stirring on a magnetic stirrer at room temperature incubated.

Claims (55)

1. Verfahren zum Nachweis biologisch aktiver Substanzen enthaltend die Schritte a) Bereitstellung eines Trägers mit zu prüfenden Substanzen b) Bereitstellung einer Suspension mit lumineszierenden Mikroorganismen, c) Beschichtung des Trägers mit der Mikroorganismen-Suspension, d) Nachweis der biologisch aktiven Substanzen auf dem Träger durch Detektion der Lumineszenzänderung der Mikroorganismen-Suspension, dadurch gekennzeichnet, dass e) die Lumineszenz der Mikroorganismen vor oder während der Detektion stimuliert wird, und/oder f) die Dauer der Lumineszenz der Mikroorganismen durch Substanzen zur Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen verlängert wird. 1. A method for the detection of biologically active substances containing the steps a) Provision of a carrier with substances to be tested b) provision of a suspension with luminescent microorganisms, c) coating the support with the microorganism suspension, d) detection of the biologically active substances on the carrier by detection of the change in luminescence of the microorganism suspension, characterized in that e) the luminescence of the microorganisms is stimulated before or during the detection, and / or f) the duration of the luminescence of the microorganisms is extended by substances for regulating and extending the luminescence duration of the microorganisms. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anzuchtlösung für die Mikroorganismen-Suspension stimulierende Substanzen für die Lumineszenz der Mikroorganismen oder Bestandteile zur Regulierung und Verlängerung der Lmineszenzdauer der Mikroorganismen enthält. 2. The method according to claim 1, characterized in that a Cultivation solution for the microorganism suspension stimulating substances for the Luminescence of the microorganisms or components for regulation and Includes extension of the luminescence duration of the microorganisms. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen-Suspension aus gefriergetrockneten Mikroorganismen oder gefrorenen Zellkonzentraten durch Rekonstitution mit einem Rekonstitutionsmedium gewonnen wird. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Microorganism suspension from freeze-dried microorganisms or frozen cell concentrates by reconstitution with a Reconstitution medium is obtained. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anzuchtlösung für die Mikroorganismen durch ein Verdünnungsmedium verdünnt wird. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that a culture solution for the microorganisms through a dilution medium is diluted. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Verdünnungsmedium oder das Rekonstitutionsmedium stimulierende Substanzen für die Lumineszenz der Mikroorganismen oder Bestandteile zur Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen enthält. 5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that the Dilution medium or substances stimulating the reconstitution medium for the luminescence of the microorganisms or components for regulation and extending the luminescence duration of the microorganisms. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Lumineszenz stimulierende Substanzen N-Acylhomoserinlactone wie N- (3-Oxohexanoyl)-L-Homoserinlacton, Dipeptide, Oligopeptide, Borverbindungen wie Boratdiester oder Chinolone eingesetzt werden. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that N-acylhomoserine lactones such as N- ( 3 -oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, dipeptides, oligopeptides, boron compounds such as borate diesters or quinolones are used as luminescence stimulating substances. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Lumineszenz stimulierende Substanzen biochemische Vorläufersubstanzen von Lumineszenz induzierenden Substanzen eingesetzt werden. 7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that as Luminescence stimulating substances biochemical precursors of Luminescence inducing substances are used. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Bestandteile zur Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen Oligomere oder Polymere eingesetzt werden. 8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that as Components for regulating and extending the luminescence duration of the Microorganisms, oligomers or polymers are used. 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Bestandteile zur Regulierung und Verlängerung der Lumineszenzdauer der Mikroorganismen Acrylate, Polyvinylpyridine, Polyethylenglykole, Polyetherderivate, Polysaccharide, Dextrane, modifizierte Zellulosen, Peptide und Proteine eingesetzt werden. 9. The method according to claim 1 to 8, characterized in that as Components for regulating and extending the luminescence duration of the Microorganisms acrylates, polyvinylpyridines, polyethylene glycols, Polyether derivatives, polysaccharides, dextrans, modified celluloses, peptides and proteins be used. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lumineszenzsteigerung weiterhin durch eine hohe Zelldichte von mehr als 2.109 Zellen/ml in der Mikroorganismen-Suspension erreicht wird. 10. The method according to claim 1 to 9, characterized in that an increase in luminescence is further achieved by a high cell density of more than 2.10 9 cells / ml in the microorganism suspension. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die hohe Zelldichte durch Zusatz von Aminosäuren oder anderen Carbonsäuren, bevorzugt in Konzentrationen bis 2%, zum Anzuchtmedium der Mikroorganismen erreicht wird. 11. The method according to claim 10, characterized in that the high Cell density by adding amino acids or other carboxylic acids, preferred in concentrations up to 2%, to the growth medium of the microorganisms is achieved. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatz Asparaginsäure ist. 12. The method according to claim 11, characterized in that the addition Is aspartic acid. 13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als lumineszente Mikroorganismen Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum, Photorhabdus luminescens oder gentechnisch modifizierte lumineszente Mikroorganismen eingesetzt werden. 13. The method according to claim 1 to 12, characterized in that as luminescent microorganisms Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum, Photorhabdus luminescens or genetically modified luminescent microorganisms can be used. 14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mit den biologisch aktiven Substanzen eine Dünnschichtchromatographieplatte oder ein Elektrophoresegel oder ein anderes, bevorzugt planares, Trennsystem ist, auf dem sich die biologisch aktiven Substanzen in Form von Zonen befinden. 14. The method according to claim 1 to 13, characterized in that the carrier with the biologically active substances Thin layer chromatography plate or an electrophoresis gel or another, preferably planar, Separation system is based on which the biologically active substances in the form of Zones. 15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger bereitgestellt wird, auf dem sich die Spots eines Substanzarrays befinden. 15. The method according to claim 1 to 13, characterized in that a carrier is provided on which the spots of a substance array are located. 16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Mikroorganismen-Suspension um eine verdünnte Mikroorganismen-Suspension handelt. 16. The method according to claim 1 to 15, characterized in that it is dilute the microorganism suspension Microorganism suspension acts. 17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung des Trägers homogen erfolgt. 17. The method according to claim 1 to 16, characterized in that the Coating of the carrier takes place homogeneously. 18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung des Trägers mit den Mikroorganismen durch das Tauchen des Trägers in die Mikroorganismen-Suspension erfolgt. 18. The method according to claim 1 to 17, characterized in that the Coating the carrier with the microorganisms by dipping the Carrier takes place in the microorganism suspension. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Tauchen eine Anreicherung von Mikroorganismen an der Trägeroberfläche stattfindet. 19. The method according to claim 18, characterized in that by the Dip an accumulation of microorganisms on the carrier surface takes place. 20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Lumineszenz der Mikroorganismen-Suspension durch photographische Verfahren oder Imagingtechniken erfolgt. 20. The method according to claim 1 to 19, characterized in that the Detection of the luminescence of the microorganism suspension by photographic processes or imaging techniques. 21. Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch aktiven Substanzen eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf die Lumineszenz der Mikroorganismen-Suspension haben. 21. The method according to claim 1 to 20, characterized in that the biologically active substances have a stimulating or inhibiting effect have the luminescence of the microorganism suspension. 22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Verlauf der Inhibierung bzw. Stimulierung der Lumineszenz der Mikroorganismen-Suspension aufgezeichnet wird und ausgewertet wird. 22. The method according to claim 21, characterized in that the temporal Course of inhibition or stimulation of the luminescence of the Microorganism suspension is recorded and evaluated. 23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen-Suspension vor und/oder während des Detektionsvorgangs einer Kühlung unterworfen werden. 23. The method according to claim 1 to 22, characterized in that the Microorganism suspension before and / or during the detection process of a Be subjected to cooling. 24. Verfahren nach Anspruch 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen-Suspension vor und/oder während des Detektionsvorgangs einer Lichteinstrahlung unterworfen werden. 24. The method according to claim 1 to 23, characterized in that the Microorganism suspension before and / or during the detection process of a Be exposed to light. 25. Kit zum Nachweis biologisch aktiver Substanzen auf einem Träger enthaltend, Mikroorganismen in einer für Transport und Lagerung stabilisierten Form, ein oder mehrere Anzuchtmedien oder Rezepturen für Anzuchtmedien oder die Einzelbestandteile für Anzuchtmedien für die Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass er Zusätze zur Stimulierung des Wachstums und/oder der Lumineszenz von Mikroorganismen oder deren biochemische Vorstufen und/oder Zusätze zur Verlängerung der Lumineszenzdauer von Mikroorganismen enthält. 25. Kit for the detection of biologically active substances on a support containing microorganisms in a stabilized for transport and storage Form, one or more culture media or recipes for culture media or the individual components for culture media for the microorganisms, characterized in that it contains additives to stimulate growth and / or the luminescence of microorganisms or their biochemical Precursors and / or additives to extend the luminescence duration of Contains microorganisms. 26. Kit nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen durch Gefriertrocknung oder durch Einfrieren mit geeigneten Konservierungsmitteln oder durch Adsorption an geeignete poröse Trägermaterialien oder durch Einschluss in gelförmige Materialien stabilisiert wurden. 26. Kit according to claim 25, characterized in that the microorganisms by freeze drying or by freezing with suitable Preservatives or by adsorption on suitable porous carrier materials or have been stabilized by inclusion in gel-like materials. 27. Kit nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Tauchkammer für die homogene Beschichtung eines Trägers mit den Mikroorganismen enthält. 27. Kit according to claim 25 or 26, characterized in that it is a Dip chamber for the homogeneous coating of a carrier with the Contains microorganisms. 28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Tauchkammer einen Kühlmantel oder Wärmeaustauscher zur Kühlung der Mikroorganismen-Suspension aufweist. 28. Kit according to claim 27, characterized in that the immersion chamber Cooling jacket or heat exchanger for cooling the Has microorganism suspension. 29. Kit nach Anspruch 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Test- Träger, auf dem definierte Referenzsubstanzmengen mit bekannter biologischer Wirkung aufgebracht sind, enthält. 29. Kit according to claim 25 to 28, characterized in that it has a test Carrier on which defined reference substance quantities with known biological effects are applied. 30. Kit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, der Test-Träger eine planarer Träger aus Papier, Glas, polymeren Materialien oder Metallen ist und vorzugsweise in Streifenform ausgebildet ist. 30. Kit according to claim 29, characterized in that the test carrier is a planar Carrier made of paper, glass, polymeric materials or metals is and is preferably formed in strip form. 31. Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der planare Träger mit porösen Materialien, vorzugsweise Kieselgel, beschichtet ist. 31. Kit according to claim 30, characterized in that the planar carrier with porous materials, preferably silica gel, is coated. 32. Kit nach Anspruch 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Test-Träger als Referenzsubstanz 4-Nitrophenol oder ein Kupfersalz enthält. 32. Kit according to claim 29 to 31, characterized in that the test carrier contains 4 -nitrophenol or a copper salt as reference substance. 33. Kit nach Anspruch 25 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin eine Vorrichtung für die Anzucht von Mikroorganismen enthaltend einen Glas- oder Kunststoffbehälter, enthält. 33. Kit according to claim 25 to 32, characterized in that it also has a Device for growing microorganisms containing a glass or plastic container. 34. Kit nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Glas- oder Kunststoffbehälter durch seine Formgebung einen guten Sauerstoffaustausch mit der Anzuchtsuspension gewährleistet und einen Magnetrührstab aufweist. 34. Kit according to claim 33, characterized in that the glass or Plastic container with a good oxygen exchange due to its shape of the cultivation suspension and has a magnetic stir bar. 35. Kit nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Behälter eine Anzuchtlösung und/oder ein Verdünnungsmedium und/oder ein Rekonstitutionsmedium enthält. 35. Kit according to claim 33 or 34, characterized in that the container a growing solution and / or a dilution medium and / or a Reconstitution medium contains. 36. Kit nach Anspruch 25 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzuchtmedien die Wachstums- und/oder Lumineszenz-stimulierenden Zusätze oder deren biochemische Vorstufen enthalten. 36. Kit according to claim 25 to 35, characterized in that the Growth media the growth and / or luminescence stimulating additives or contain their biochemical precursors. 37. Kit nach Anspruch 25 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzuchtmedien Dipeptide, Oligopeptide, Borverbindungen wie Boratdiester, Chinolone oder N-Acylhomoserinlactone wie N-(3 -Oxohexanoyl)-L-Homoserinlacton enthalten. 37. Kit according to claim 25 to 35, characterized in that the growth media contain dipeptides, oligopeptides, boron compounds such as borate diesters, quinolones or N-acylhomoserine lactones such as N- ( 3- oxohexanoyl) -L-homoserine lactone. 38. Kit nach Anspruch 25 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzuchtmedien Aminosäure- oder Carbonsäurezusätze, bevorzugt in Konzentrationen bis 2%, enthalten. 38. Kit according to claim 25 to 35, characterized in that the Culture media amino acid or carboxylic acid additives, preferably in concentrations up to 2%. 39. Kit nach Anspruch 25 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzuchtmedien Asparaginsäure, bevorzugt zwischen 10 mg/l und 500 mg/l, enthalten. 39. Kit according to claim 25 to 35, characterized in that the Cultivation media contain aspartic acid, preferably between 10 mg / l and 500 mg / l. 40. Kit nach Anspruch 25 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzuchtmedien Additive enthalten, die die Biolumineszenz regulieren und verlängern. 40. Kit according to claim 25 to 35, characterized in that the Cultivation media contain additives that regulate and regulate bioluminescence extend. 41. Kit nach Anspruch 25 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass er Verdünnungsmedien zur Verdünnung von Mikroorganismen-Suspensionen enthält. 41. Kit according to claim 25 to 40, characterized in that it Contains dilution media for the dilution of microorganism suspensions. 42. Kit nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnungsmedien Wachstums- und/oder Lumineszenz-stimulierenden Zusätze oder deren biochemische Vorstufen enthalten. 42. Kit according to claim 41, characterized in that the dilution media Growth and / or luminescence stimulating additives or their contain biochemical precursors. 43. Kit nach Anspruch 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnungsmedien Additive enthalten, die die Biolumineszenz regulieren und verlängern. 43. Kit according to claim 41 or 42, characterized in that the Diluent media contain additives that regulate and regulate bioluminescence extend. 44. Kit nach Anspruch 25 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass er Rekonstitutionsmedien zur Herstellung gebrauchsfertiger Mikroorganismen-Suspensionen aus Zellkonzentraten oder stabilisierten Präparationen von Mikroorganismen enthält. 44. Kit according to claim 25 to 43, characterized in that it Reconstitution media for the production of ready-to-use microorganism suspensions from cell concentrates or stabilized preparations of microorganisms contains. 45. Kit nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekonstitutionsmedien Wachstums- und/oder Lumineszenz stimulierende Substanzen oder deren biochemische Vorstufen enthalten. 45. Kit according to claim 44, characterized in that the Reconstitution media growth and / or luminescence stimulating substances or contain their biochemical precursors. 46. Kit nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekonstitutionsmedien Additive enthalten, die die Biolumineszenz regulieren und verlängern. 46. Kit according to claim 44 or 45, characterized in that the Reconstitution media contain additives that regulate and regulate bioluminescence extend. 47. Kit nach Anspruch 42 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Lumineszenz- stimulierenden Zusätze N-Acylhomoserinlactone, Dipeptide, Oligopeptide, Borverbindungen oder Chinolone sind. 47. Kit according to claim 42 to 46, characterized in that the luminescence stimulating additives N-acyl homoserine lactones, dipeptides, oligopeptides, Boron compounds or quinolones. 48. Kit nach Anspruch 25 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass er Additive für das Anzuchtmedium und/oder Verdünnungsmedium und/oder Rekonstitutionsmedium enthält, die die Biolumineszenz regulieren und verlängern. 48. Kit according to claim 25 to 47, characterized in that it contains additives for the growth medium and / or dilution medium and / or Contains reconstitution medium that regulate and prolong bioluminescence. 49. Kit nach Anspruch 40, 43, 46 oder 48 dadurch gekennzeichnet, dass die Additive Oligomere oder Polymere sind. 49. Kit according to claim 40, 43, 46 or 48, characterized in that the Are additive oligomers or polymers. 50. Kit nach Anspruch 40, 43, 46 oder 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Additive Acrylate, Polyvinylpyridine, Polyethylenglykole, Polyetherderivate, Polysaccharide, Dextrane, modifizierte Zellulosen, Peptide und Proteine sind. 50. Kit according to claim 40, 43, 46 or 48, characterized in that as Additive acrylates, polyvinyl pyridines, polyethylene glycols, polyether derivatives, Polysaccharides, dextrans, modified celluloses, peptides and proteins are. 51. Kit nach Anspruch 25 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin eine Lichtquelle enthält. 51. Kit according to claim 25 to 50, characterized in that it also has a Contains light source. 52. Kit nach Anspruch 25 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin ein Mittel zur Kühlung der Mikroogranismen-Suspension enthält. 52. Kit according to claim 25 to 51, characterized in that it is also a Contains means for cooling the microgranism suspension. 53. Kit nach Anspruch 25 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin eine Vorrichtung zur Auftrennung von Proben mit planaren Separationstechniken wie der Dünnschichtchromatographie oder der Gelelektrophorese enthält. 53. Kit according to claim 25 to 52, characterized in that it also has a Device for separating samples using planar separation techniques such as thin layer chromatography or gel electrophoresis. 54. Kit nach Anspruch 25 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin Arbeitsvorschriften zu den einzelnen Arbeitsschritten bei der Präparation der Mikroorganismensuspension und der Lumineszenz-Messung und/oder Informationen zu Anwendungsbeispielen enthält. 54. Kit according to claim 25 to 53, characterized in that it further Working instructions for the individual steps in the preparation of the Microorganism suspension and the luminescence measurement and / or Contains information on application examples. 55. Kit nach Anspruch 25 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen Vibrio fischeri sind. 55. Kit according to claim 25 to 54, characterized in that the Microorganisms Vibrio fischeri are.
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