DE10218129A1 - Genetic vaccine against RNA virus infections - Google Patents
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Abstract
Der genetische Impfstoff ist zur Immunisierung gegen eine Infektion mit einem RNA-Virus genetischer Heterogenität geeignet und umfaßt Nukleotidsequenzen, die für Proteine und/oder Proteinfragmente dieses RNA-Virus kodieren. Er zeichnet sich dadurch aus, daß die Nukleotidsequenzen voneinander verschieden sind, nämlich von Genabschnitten einer Mehrzahl verschiedener Genotypen und/oder Subtypen dieses RNA-Virus mittels Transkription oder Translation abgeleitet sind und für Proteine und/oder Proteinfragmente dieser Mehrzahl verschiedener Genotypen und/oder Subtypen dieses RNA-Virus kodieren.The genetic vaccine is suitable for immunization against an infection with an RNA virus of genetic heterogeneity and comprises nucleotide sequences which code for proteins and / or protein fragments of this RNA virus. It is characterized in that the nucleotide sequences are different from one another, namely derived from gene segments of a plurality of different genotypes and / or subtypes of this RNA virus by means of transcription or translation and for proteins and / or protein fragments of this plurality of different genotypes and / or subtypes thereof Encode RNA virus.
Description
Die Erfindung betrifft einen genetischen Impfstoff (eine DNA-Vakzine), der (die) zur Immunisierung gegen eine Infektion mit einem RNA-Virus genetischer Heterogenität geeignet ist und der (die) Nukleotidesquenzen (Nukleinsäuren) umfaßt, die für Proteine und/oder Proteinfragmente dieses RNA-Virus kodieren. The invention relates to a genetic vaccine (a DNA vaccine) Immunization against infection with an RNA virus of genetic heterogeneity is suitable and which comprises the nucleotide sequences (nucleic acids) necessary for proteins and / or encode protein fragments of this RNA virus.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffes. The invention also relates to a method for producing this vaccine.
Der Begriff "RNA-Virus mit genetischer Heterogenität" bezeichnet RNA-Virusarten, die mit einer eigenen Polymerase replizieren, welche mit einer relativ großen Fehlerrate arbeitet, wodurch regelmäßig Mutationen in das Virusgenom eingebaut werden. Dies gilt auch für Retroviren wie HIV, die zu den Viren zählen, die mit Einzelstrang-RNA und Doppelstrang-DNA-Zwischenprodukt und einer ungenauen RNA-Polymerase replizieren. Die hohe Mutationsrate (z. B. für HCV um 1.4-1.9 × 10-3 Basenveränderungen pro definierter Genomstelle pro Jahr) ist charakteristisch für RNA- Viren und führt zur Veränderung der Oberflächenstruktur und des Proteinmusters der Virushülle. Diese Veränderungen sind die Ursache dafür, daß die betreffende RNA-Viren mittlerweile eine solche genetische Vielfalt aufweisen, dass in jeder dieser Virenarten heute mehrere (im Fall von HCV sechs) verschiedene Genotypen klassifiziert und in jedem Genotyp eine Vielzahl von Subtypen unterschieden werden. Die biologische Konsequenz besteht zum einen darin, daß das RNA-Virus im Laufe der Infektion nicht mehr oder nur partiell vom Immunsystem des Wirts erkannt werden kann und das Virus der Immunantwort des Patienten, nämlich neutralisierenden Antikörpern oder zytotoxischen T-Lymphozyten, entkommen kann. Zum zweiten wird der Wirt initial bei der Virusinokulation mit einer solchen genetischen Vielfalt und damit Oberflächenvariabilität des RNA-Virus konfrontiert, daß auch eine breite Immunantwort in der Regel nicht ausreicht, alle genetisch unterschiedlichen Genotypen und Subtypen dieses Virus zu eliminieren. Durch die Selektion von Mutanten kann das RNA-Virus trotz einer deutlichen Immunantwort des Patienten dauerhaft persistieren. Bei HCV-, HIV-, Influenza- und vergleichbaren Infektionserkrankungen bzw. malignen Tumoren wird dies als einer der Hauptmechanismen, wenn nicht sogar als entscheidender Mechanismus angesehen, der zur Chronifizierung der Infektionserkrankung oder zur dauerhaften Etablierung einer Tumorerkrankung führt. The term "RNA virus with genetic heterogeneity" denotes RNA virus types that replicate with their own polymerase, which works with a relatively large error rate, as a result of which mutations are regularly incorporated into the virus genome. This also applies to retroviruses like HIV, which are among the viruses that replicate with single-stranded RNA and double-stranded DNA intermediate and an inaccurate RNA polymerase. The high mutation rate (e.g. for HCV by 1.4-1.9 × 10 -3 base changes per defined genome site per year) is characteristic of RNA viruses and leads to changes in the surface structure and the protein pattern of the virus envelope. These changes are the reason why the RNA viruses in question now have such a genetic diversity that today several (in the case of HCV six) different genotypes are classified in each of these virus types and a large number of subtypes are distinguished in each genotype. The biological consequence is that the RNA virus can no longer or only partially be recognized by the host's immune system in the course of the infection and the virus can escape the patient's immune response, namely neutralizing antibodies or cytotoxic T-lymphocytes. Secondly, the host is initially confronted with such a genetic diversity and thus surface variability of the RNA virus during virus inoculation that even a broad immune response is usually not sufficient to eliminate all genetically different genotypes and subtypes of this virus. By selecting mutants, the RNA virus can persist in spite of a clear immune response from the patient. In HCV, HIV, influenza and comparable infectious diseases or malignant tumors, this is regarded as one of the main mechanisms, if not the decisive mechanism, that leads to the chronification of the infectious disease or the permanent establishment of a tumor disease.
Die Infektion mit Hepatitis C Virus (HCV) gilt als häufigste Ursache für die Entwicklung einer Posttransfusions- bzw. Non-A-Non-B-Hepatitis. Die humorale und zelluläre Immunreaktion des Patienten gegen HCV ist polyklonal und multispezifisch. Sie reicht aber aus den vorstehend dargelegten Gründen in der Regel nicht aus, das Virus dauerhaft zu eliminieren. Mehr als 70-80% der infizierten Menschen bleiben nach der Exposition mit HCV in der Folge chronische Virusträger bzw. entwickeln eine chronische Hepatitis. Im weiteren Verlauf der Erkrankung kann diese chronische Hepatitis dann zu einer Leberzirrhose (in ca. 20-40% der Virusträger) oder auch zu einem hepatozellulären Karzinom führen. Diese Folgeerkrankungen gehen mit einer erheblichen Morbidität und Mortalität einher. Leider sind die therapeutischen Möglichkeiten bisher begrenzt. Die diversen Quasispezies, Subtypen und Genotypen von HCV stellen eine große Herausforderung für die Entwicklung antiviraler Strategien dar, weil Immunisierungsansätze aber auch Virusinhibitoren (z. B. NS3-Proteaseinhibitoren) mit einer großen genetischen Heterogenität konfrontiert sind. Bis dato konnte keine protektiv wirksame Hepatitis C Vakzine entwickelt werden, die ein geeignetes Mittel zur Eindämmung der Weiterverbreitung von HCV darstellt. Infection with hepatitis C virus (HCV) is the most common cause of development post-transfusion or non-A-non-B hepatitis. The humoral and cellular The patient's immune response to HCV is polyclonal and multispecific. It is enough but for the reasons set out above, the virus usually does not last to eliminate. More than 70-80% of infected people stay after the exposure with HCV subsequently chronic virus carriers or develop chronic hepatitis. As the disease progresses, this chronic hepatitis can lead to Cirrhosis of the liver (in about 20-40% of virus carriers) or to a hepatocellular Lead to carcinoma. These complications go with significant morbidity and Mortality. Unfortunately, the therapeutic options have so far been limited. The Diverse quasi-species, subtypes and genotypes of HCV represent a big one Challenge to develop antiviral strategies because Immunization approaches but also virus inhibitors (e.g. NS3 protease inhibitors) are faced with a great genetic heterogeneity. So far, none protective hepatitis C vaccine are developed, which are a suitable agent for Curbing the spread of HCV.
Im Prinzip ganz ähnlich stellt sich die Situation im Fall von Humane- Immundefizienzvirus-(HIV)-, Influenzavirus-A- oder Influenzavirus-B-Infektionen dar. In principle, the situation is very similar in the case of human Immunodeficiency Virus (HIV), Influenza Virus A, or Influenza Virus B infections.
Als Vakzine gegen RNA-Viren kommen insbesondere die DNA-Vakzine und die Protein- bzw. Peptidvakzine in Betracht. The vaccine against RNA viruses comes in particular from the DNA vaccine and the Protein or peptide vaccine into consideration.
Das Prinzip der DNA-Vakzine bzw. DNA-Immunisierung beruht darauf, daß ein Plasmid, das die genetische Information für ein gewünschtes Zielprotein trägt, in die Patientenzellen injiziert wird. Die Injektion kann intrakutan oder intramuskulär erfolgen. The principle of DNA vaccine or DNA immunization is based on the fact that a Plasmid that carries the genetic information for a desired target protein into the Patient cells is injected. The injection can be intracutaneous or intramuscular.
Nach der Aufnahme des Plasmids in die Zellen wird endogen das bzw. die gewünschte(n) Protein(e) exprimiert. Diese Proteine oder gegebenenfalls aus diesen durch Spaltung bzw. Prozessing hervorgegangene Peptide werden im endoplasmatischen Retikulum auf MHC-Moleküle geladen und auf der Zelloberfläche vornehmlich im MHC-Klasse I Kontext präsentiert. Das führt zu einer MHC-restringierten Aktivierung von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), die bei der Viruselimination eine große Rolle spielen. Gleichzeitig kann das exprimierte Protein von Makrophagen aufgenommen werden und eine MHC-Klasse II Antwort induzieren, die wiederum zur Stimulation von T-Helfer- und B-Zellen führt. Die stimulierten T-Helfer- und B-Zellen produzieren antigenspezifische Antikörper und damit die humorale Immunantwort. After the plasmid has been taken up into the cells, the desired endogenous product is endogenously Protein (s) expressed. These proteins or, if appropriate, from these by cleavage Peptides resulting from processing are located in the endoplasmic reticulum MHC molecules loaded and on the cell surface primarily in MHC class I Context presented. This leads to an MHC-restricted activation of CD8 + cytotoxic T lymphocytes (CTL), which play a major role in virus elimination play. At the same time, the expressed protein can be taken up by macrophages and induce an MHC class II response, which in turn stimulates T helper and B cells leads. Produce the stimulated T helper and B cells antigen-specific antibodies and thus the humoral immune response.
Untersuchungen zur Immunantwort nach DNA-Immunisierung gegen die Strukturproteine von HCV sind im Stand der Technik bekannt. Es wurde gezeigt, daß das HCV Core Protein, wenngleich hochkonserviert zwischen den Genotypen, nicht sehr immunogen ist (vgl. Geissler, M. et al., 1997 und Tokushige, K. et al., 1996). Die publizierten Ergebnisse von Untersuchungen zur Immunogenität gegen die HCV Envelope Proteine sind kontrovers (vgl. Salto, T. et al. 1997 und Nakano, I. et al. 1997), bei diesen Envelope Proteinen besteht das Problem der hohen genetischen Variabiltät zwischen Genotypen und Subtypen. Die Induktion einer humoralen und zellulären Immunantwort gegen die Nichtstrukturproteine von HCV ist ebenfalls beschrieben (Encke, J. et. al., 1998). Keines dieser bekannten Untersuchungsergebnisse liefert aber einen konkreten Anhaltpunkt oder gar Ausgangsstoff für die Entwicklung einer HCV- Vakzine mit zumindest befriedigenden therapeutischen Eigenschaften. Investigation of the immune response after DNA immunization against the Structural proteins of HCV are known in the prior art. It has been shown that the HCV core protein, although highly conserved between the genotypes, not very much is immunogenic (see Geissler, M. et al., 1997 and Tokushige, K. et al., 1996). The published results of studies on immunogenicity against HCV Envelope proteins are controversial (cf. Salto, T. et al. 1997 and Nakano, I. et al. 1997), with these envelope proteins there is the problem of high genetic variability between genotypes and subtypes. The induction of a humoral and cellular Immune response to the non-structural proteins of HCV is also described (Encke, J. et. Al., 1998). However, none of these known test results provide a concrete reference point or even raw material for the development of an HCV Vaccine with at least satisfactory therapeutic properties.
Bei der Entwicklung von Protein- bzw. Peptidvakzinen als prophylaktische Vakzine gegen RNA-Viren besteht das Problem, daß diese Vakzinen im wesentlichen allein eine MHC-Klasse II Antwort d. h. ein Antikörperproduktion induzieren, und daß die infolge der Immunisierung mit rekombinatem Protein eines oder auch mehrerer RNA-Virus- Genotypen und Subtypen gebildeten neutralisierenden Antikörperspezies nach den bisherigen Erfahrungen - insbesondere am Beispiel von HCV - nicht ausreichen, um die Vielzahl aller RNA-Virus-Genotypen und -Subtypen therapeutisch wirksam zu bekämpfen. Die DNA-Vakzine hat demgegenüber den Vorteil, daß sie vornehmlich und zu allererst eine Immunantwort über den MHC-Klasse-I-Weg induziert, nämlich eine zytotoxische T-Zellantwort, und zusätzlich eine MHC-Klasse II Antwort. In the development of protein or peptide vaccines as a prophylactic vaccine against RNA viruses there is the problem that these vaccines are essentially single MHC Class II Answer d. H. to induce antibody production, and that as a result immunization with recombinant protein of one or more RNA virus Genotypes and subtypes formed neutralizing antibody species according to the previous experience - especially with the example of HCV - is not sufficient to Variety of all RNA virus genotypes and subtypes are therapeutically effective fight. The DNA vaccine has the advantage that it primarily and first of all induces an immune response via the MHC class I pathway, namely one cytotoxic T cell response, plus an MHC class II response.
Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff bzw. eine Vakzine gegen RNA-Viren zu entwickeln, der bzw. die dazu geeignet ist, eine therapeutisch wirksame Immunreaktion gegen eine Vielzahl verschiedener Genotypen und Subtypen des betreffenden RNA-Virus zu erzeugen und damit die Weiterverbreitung von RNA-Virus-Infektionserkrankungen, insbesondere von Hepatitis-C-Virus-(HCV)-, Humane-Immundefizienzvirus-(HIV)-, Influenzavirus-A- oder Influenzavirus-B- Infektionserkrankungen einzudämmen. The object of the present invention is therefore to provide a vaccine or to develop a vaccine against RNA viruses which is suitable for the purpose of therapeutically effective immune response against a variety of different genotypes and to generate subtypes of the RNA virus in question and thus the further spread of RNA virus infectious diseases, in particular of hepatitis C virus (HCV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Influenza Virus A or Influenza Virus B Curb infectious diseases.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines genetischen Impfstoffes der eingangs beschriebenen Art, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Nukleotidsequenzen (bzw. Nukleinsäuren) voneinander verschieden sind, nämlich von Genabschnitten einer Mehrzahl (d. h. wenigstens zweier) verschiedener Genotypen und/oder Subtypen dieses RNA-Virus mittels Transkription oder Translation abgeleitet sind und für Proteine und/oder Proteinfragmente dieser Mehrzahl verschiedener Genotypen und/oder Subtypen dieses RNA-Virus kodieren. One solution to this problem is to provide a genetic vaccine of the type described in the introduction, which is characterized in that the Nucleotide sequences (or nucleic acids) are different from one another, namely from Genetic sections of a plurality (i.e. at least two) of different genotypes and / or subtypes of this RNA virus are derived by means of transcription or translation are and for proteins and / or protein fragments of this plurality different Encode genotypes and / or subtypes of this RNA virus.
"Abgeleitet" heißt im vorliegenden Zusammenhang, daß die Nukleotidsequenzen vollständig oder nahezu vollständig homolog oder komplementär zu den betreffenden Genabschnitten sind, wobei die Abweichungen in einzelnen Nukleotidpositionen im Fall der nur nahezu vollständigen Homologie oder Komplementarität auf die Degeneration des Gentischen Codes zurückzuführen sind, oder daß die Nukleotidsequenzen zumindest mit diesen Genabschnitten unter stringenten Bedingungen hybridisieren. In the present context, "derived" means that the nucleotide sequences completely or almost completely homologous or complementary to the concerned Gene segments are, with the deviations in individual nucleotide positions in the case of almost complete homology or complementarity to degeneration of the genetic code, or that the nucleotide sequences at least hybridize with these gene segments under stringent conditions.
Die Anzahl der verschiedenen RNA-Virus-Genotypen und/oder -Subtypen beträgt vorzugsweise etwa 10 bis etwa 40. The number of different RNA virus genotypes and / or subtypes is preferably about 10 to about 40.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen genetischen Impfstoffes sind die verschiedenen Nukleinsäuren von Genabschnitten verschiedener bekannter und charakterisierter Genotypen und/oder Subtypen des RNA-Virus abgeleitet. Diese Impfstoffvariante stellt eine sogenannte "definierte Immunisierungslibrary" dar, bei der bekannt ist, welche und wieviele verschiedene Genotypen/Subtypen des betreffenden RNA-Virus in welchen Mengen vorhanden sind. Eine Alternative hierzu besteht in derjenigen Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen genetischen Impfstoffes, bei der die verschiedenen Nukleinsäuren von Genabschnitten verschiedener, in einem Pool aus mehreren, hinsichtlich des betreffenden RNA-Virus-positiven Patientenseren vorhandener HCV-Genotypen und/oder Subtypen abgeleitet sind. Diese Impfstoffvariante stellt eine sogenannte "undefinierte Immunisierungslibrary" dar, denn der Impfstoff enthält eine unbekannte Menge genetischer Virusheterogenität, d. h. hier ist nicht oder zumindest nicht genau bekannt, welche und wieviel verschiedene Genotypen/Subtypen des betreffenden RNA- Virus in welchen Mengen vorhanden sind. In a preferred embodiment variant of the genetic according to the invention Vaccine, the different nucleic acids are different from gene segments known and characterized genotypes and / or subtypes of the RNA virus derived. This vaccine variant represents a so-called "defined Immunization Library "in which it is known which and how many different Genotypes / subtypes of the RNA virus in question in which amounts are present. An alternative to this is that variant of the Genetic vaccine according to the invention, in which the different nucleic acids of gene segments of different, in a pool of several, with regard to the concerned RNA virus positive patient sera of existing HCV genotypes and / or subtypes are derived. This vaccine variant represents a so-called "Undefined immunization library" because the vaccine contains an unknown Amount of genetic virus heterogeneity, i.e. H. here is not or at least not exactly known which and how many different genotypes / subtypes of the relevant RNA Virus in what quantities are present.
Die verschiedenen Nukleotidsequenzen, die für die verschiedenen Proteine und/oder Proteinfragmente der verschiedenen Genotypen und/oder Subtypen des betreffenden RNA-Virus kodieren, sind vorzugsweise in einem Vektor insertiert, und zwar entweder alle oder wenigstens gruppenweise in demselben Vektor oder einzeln bzw. separiert bzw. vereinzelt, d. h. jede Art für sich, jeweils einem Vektor. Als Vektoren kommen sowohl Plasmide n als auch Adenovirein betracht. In der Praxis haben sich insbesondere die Plasmide pM-CG1b und pc DNA 3.1 als gut geeignet erwiesen. The different nucleotide sequences for the different proteins and / or Protein fragments of the various genotypes and / or subtypes of the subject RNA virus encoding are preferably inserted into a vector, either all or at least in groups in the same vector or individually or separately or isolated, d. H. each type for itself, one vector each. Both come as vectors Consider plasmids as well as adenovirein. In practice, the Plasmids pM-CG1b and pc DNA 3.1 proved to be well suited.
Die Erfindung betrifft neben dem Impfstoff auch ein Verfahren zur Herstellung eines genetischen Impfstoffes, welches durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet ist: (a) Isolierung der Virus-RNA aus einer Mehrzahl positiver Patientenseren, (b) Amplifizierung der isolierten Virus-RNA mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die Genabschnitten des RNA-Virus-Genoms entsprechen, (c) Ligierung/Insertierung der gewonnenen Amplifikate in einen oder mehrere Vektoren, vorzugsweise in eine oder mehrere Plasmide, Klonierung dieses/dieser rekombinanten Vektors/Vektoren bzw. Plasmids/Plasmide, nämlich (d) Transfektion von kompetenten Zellen, mit diesem/diesen rekombinanten Vektor(en) bzw. Plasmid(en) und (e) Selektionierung und Vermehrung der transformierten Zellen, (t) Gewinnung des Vektors aus den transformierten Zellen mittels (vorzugsweise pyrogenfreier) Plasmid- Mini-, -Mega- oder -Giga-Präparation, (h) Aufnahme der Vektoren in physiologischer Lösung, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung. In addition to the vaccine, the invention also relates to a method for producing a genetic vaccine, which is characterized by the following process steps is: (a) isolation of virus RNA from a plurality of positive patient sera, (b) Amplification of the isolated virus RNA by means of PCR using Oligonucleotide primers which correspond to gene sections of the RNA virus genome, (c) ligation / insertion of the amplificates obtained into one or more vectors, preferably in one or more plasmids, cloning this recombinant Vectors / vectors or plasmids / plasmids, namely (d) transfection of competent Cells with this recombinant vector (s) or plasmid (s) and (e) selection and propagation of the transformed cells, (t) extraction of the Vector from the transformed cells using (preferably pyrogen-free) plasmid Mini, Mega or Giga preparation, (h) recording of the vectors in physiological Solution, preferably in physiological saline.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden Plasmide als Vektor eingesetzt, vorzugsweise die oder eines der Plasmide pM-CG1b und/oder pc DNA 3.1, und zur Transfektion gemäß Schritt (d) werden kompetente E. coli-Zellen verwendet. Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (a) gewonnene Virus-RNA oder die in Schritt (b) erhaltenen Virus-RNA- Amplifikate hinsichtlich des Genotyps und/oder Subtyps des betreffenden RNA-Virus identifiziert ist bzw. sind, und daß die Ligation gemäß Schritt (e) entweder in den gleichen Vektor erfolgt oder in verschiedene Vektoren erfolgt. Das hiermit gewonnene Produkt ist eine sogenannte definierte Immunisierungslibrary - im Unterschied zur sogenannten undefinierten Immunisierungslibrary, bei der die verschiedenen Genotypen und/oder Subtypen des betreffenden RNA-Virus nicht identifiziert und damit nicht definiert sind. In a preferred embodiment of this method, plasmids are used as vectors used, preferably the or one of the plasmids pM-CG1b and / or pc DNA 3.1, and competent E. coli cells are used for the transfection according to step (d). Another advantageous variant of the method is characterized in that the in Virus RNA obtained in step (a) or the virus RNA obtained in step (b) Amplificates with regard to the genotype and / or subtype of the RNA virus in question is or are identified, and that the ligation according to step (e) is either in the the same vector or in different vectors. The hereby won Product is a so-called defined immunization library - in contrast to the so-called undefined immunization library, in which the different genotypes and / or subtypes of the RNA virus in question and therefore not identified are defined.
Der erfindungsgemäße genetische Impfstoff bzw. die erfindungsgemäße genetische Vakzine ermöglicht erstmals eine wirksame prophylaktische Immunisierung gegen ein heterogenes Virusinokulum (d. h. gegen eine Vielzahl diverser RNA-Sequenzen bzw. -Sequenzabschnitte und Proteine eines bestimmten RNA-Virus), wie es gewöhnlich bei einer Neuinfektion mir einem RNA-Virus, beispielsweise einer HCV-, HIV- oder Influenza-Neuinfektion vorliegt. The genetic vaccine according to the invention or the genetic vaccine according to the invention For the first time, vaccine enables effective prophylactic immunization against a heterogeneous virus inoculum (i.e. against a variety of diverse RNA sequences or Sequence sections and proteins of a particular RNA virus), as is usually the case with a new infection with an RNA virus, for example an HCV, HIV or New influenza infection.
Die Vektor- bzw. Plasmid-Konstrukte der erfindungsgemäßen DNA-Vakzine können schnell, ohne besonderen technischen Aufwand und preisgünstig hergestellt werden. In relativ kurzer Zeit kann eine große Anzahl von Vektor- bzw. Plasmid-Konstrukten konstruiert und kloniert werden, welche die unterschiedlichsten genetischen Informationen einer Vielzahl verschiedener Genotypen bzw. Subtypen und/oder Mutanten eines bestimmten RNA-Virus, insbesondere eines Hepatitis-C-Virus (HCV), eines Humanen Immundefizienzvirus (HIV), eines Influenzavirus A oder eines Influenzavirus B enthalten und infolgedessen gegen zumindest alle diese verschiedenen Genotypen bzw. Subtypen und/oder Mutanten dieses bestimmten RNA-Virus, insbesondere des Hepatitis-C-Virus (HCV) oder des Humanen Immundefizienzvirus (HIV) oder des Influenzavirus A oder B eine zelluläre und eine humorale Immunantwort induzieren können. The vector or plasmid constructs of the DNA vaccine according to the invention can can be produced quickly, without special technical effort and inexpensively. In a large number of vector or plasmid constructs can be used in a relatively short time are constructed and cloned, which have the most diverse genetic Information from a large number of different genotypes or subtypes and / or Mutants of a certain RNA virus, in particular a hepatitis C virus (HCV), a human immunodeficiency virus (HIV), an influenza virus A or one Influenza B virus and consequently against at least all of these different Genotypes or subtypes and / or mutants of this particular RNA virus, in particular the hepatitis C virus (HCV) or the human immunodeficiency virus (HIV) or the influenza virus A or B a cellular and a humoral immune response can induce.
Die erfindungsgemäße DNA-Vakzine hat außerdem den Vorteil, daß die Vektor-DNA, insbesondere die Plasmid-DNA oder das Adenovirus bei Raumtemperatur gelagert werden kann. Diese Eigenschaft ermöglicht den Einsatz einer solchen Vakzine auch in Ländern der Dritten Welt. The DNA vaccine according to the invention also has the advantage that the vector DNA, in particular the plasmid DNA or the adenovirus stored at room temperature can be. This property also enables the use of such a vaccine in Third world countries.
Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel einer DNA-Vaccine gegen HCV- Infektionen sowie an DNA-Vaccinen gegen HIV und Influenza-Viren näher erläutert. Die Beispiele umfaßt Herstellungs und Anwendungsverfahren mit dazugehörigen Figuren. The invention is described below using the example of a DNA vaccine against HCV Infections and DNA vaccines against HIV and influenza viruses explained in more detail. The examples include manufacturing and application processes with associated ones Characters.
Unter den Figuren zeigen: Below the figures show:
Fig. 1 die Lage der zur PCR verwendeten Primer innerhalb des HCV-Genoms Fig. 1 shows the location of the primers used for PCR within the HCV genome
Fig. 2 Schema zur Herstellung der HCV-Konstrukte und Klonierung der Konstrukte in Plasmide für die DNA-Vakzine Fig. 2 scheme for the preparation of the HCV constructs and cloning of the constructs in plasmids for the DNA vaccine
Fig. 3 DNA-Vakzine-Konstrukte und Impfstoffgruppen Figure 3 DNA vaccine constructs and vaccine groups
Fig. 4 Immunisierungsschema zur DNA-Vakzinierung Fig. 4 immunization scheme for DNA vaccination
Fig. 5 ELISA (I) gegen rekombinantes HCV E1 Protein Fig. 5 ELISA (I) against recombinant HCV E1 protein
Fig. 6 ELISA (II) gegen ein Peptid-Mix von HCV E1 Fig. 6 ELISA (II) against a peptide mix of HCV E1
Fig. 7 T-Zell-Proliferationsassay gegen HCV E1 Fig. 7 T cell proliferation assay against HCV E1
Fig. 8 ELISPOT-Assay gegen HCV E1 Fig. 8 ELISPOT assay against HCV E1
Das Prinzip der erfindungsgemäßen "multigenetischen" Anti-HCV-DNA-Vakzine besteht darin, entweder (A) definierte Nukleotidsequenzen einer Mehrzahl bekannter Genotypen und/oder Subtypen des HCV (eine sogenannte "definierte Immunisierungslibrary") in ein definiertes Plasmid zu integrieren (inserieren, ligieren) oder (B) eine unbekannte Menge genetischer Virusheterogenität (eine sogenannte "undefinierten Immunisierungslibrary") in ein definiertes Plasmid zu integrieren (inserieren, ligieren). The principle of the "multigenetic" anti-HCV DNA vaccine according to the invention exists therein, either (A) defined nucleotide sequences of a plurality of known genotypes and / or subtypes of HCV (a so-called "defined immunization library") in one integrate defined plasmid (insert, ligate) or (B) an unknown amount genetic virus heterogeneity (a so-called "undefined immunization library") to integrate into a defined plasmid (insert, ligate).
Als Ausgangsmaterial diente aus HCV-positiven Patientenseren isolierte und charakterisierte HCV-E1-RNA verschiedener bekannter und charakterisierter HCV- Genotypen und -Subtypen gemäß Tabelle 1. Diese virale RNA wurde mittels RT-PCR und anschließender nested PCR revers transkribiert und amplifiziert. Als Primer dienten die in Tabelle 2 aufgelisteten und charakterisierten Oligonukleotidprimer (CS1, E2AS1, E1AS2, CS2 und E1AS2HIS), in die jeweils zwei Restriktionsschnittstellen (EcoRV und HindlII) sowie ein Start-Codon vor der Virussequenz (Sense-Primer) und ein Stop- Codon danach (Antisense-Primer) integriert wurden. Um die verschiedenen HCV- Genotypen und -Subtypen zuverlässig zu erfassen, wurden teilweise degenerierte Primer verwendet. Die Lage der zur PCR verwendeten Primer innerhalb des HCV-Genoms ist auf die Genomabschnitte für das Virusprotein E1 exemplarisch beschränkt und in Fig. 1 näher dargestellt. HCV-positive patient sera isolated and characterized HCV-E1-RNA from various known and characterized HCV genotypes and subtypes according to Table 1 were used as starting material. This viral RNA was reverse transcribed and amplified by RT-PCR and subsequent nested PCR. The oligonucleotide primers (CS1, E2AS1, E1AS2, CS2 and E1AS2HIS) listed and characterized in Table 2 were used as primers, into each of which two restriction sites (EcoRV and HindII) and a start codon before the virus sequence (sense primer) and a stop Codon afterwards (antisense primer) were integrated. In order to reliably detect the various HCV genotypes and subtypes, partially degenerate primers were used. The location of the primers used for the PCR within the HCV genome is limited to the genome sections for the virus protein E1 by way of example and is shown in more detail in FIG. 1.
Mit dieser Methode wurden die HCV-E1-RNA-Amplifikate (cDNA-Klone) A1, B1, C1, D1, F1, H77, I1, J1 und K2 gewonnen, wobei die Benennung analog der Benennung der Patientenseren erfolgte. Zusätzlich wurde ein HCV-E1-RNA-Amplifikat "MIX-Pos" gewonnen, indem ein RNA-Gemisch aller vorhandenen RNA-Proben der RT-PCR unterworfen wurde. Dieses als "MIX-Pos" bezeichnete HCV-E1-RNA-Amplifikat stellt eine definierte Genbibliothek für HCV-E1 dar, die die virale Heterogenität in diesem Bereich abdeckt. Als Positiv-Kontrolle in der PCR diente der Ansatz H77 (Genotyp 1b). Die verschiedenen HCV-E1-RNA-Amplifikate wurden jeweils mit dem Fachmann bekannten und geläufigen Verfahren in die Plasmide pM-CG16 und pcDNA3.1. Zeo(-) ligiert. Mit den rekombinanten Plasmiden wurden anschließend kompetente E. coli transfiziert und die transformierten Zellen selektioniert und vermehrt. Als Kontrolle wurde ein Transfektionsansatz mit dem "leeren" Plasmid, dh. dem Plasmid ohne inseriertes HCV-RNA-Amplifikate (pM-CG16), durchgeführt. Von den Transfektionsansätzen "MIX-Pos" und "D" wurden jeweils 20 Klone, von allen anderen Ansätzen jeweils 2 Klone gepickt und der (dem Fachmann bekannten und geläufigen) Plasmid-Minipräparation unterworfen. Der Erfolg der Klonierung wurde durch einen Restriktionsverdau und Auftrennen auf einem Agarose-Gel überprüft. With this method, the HCV-E1 RNA amplificates (cDNA clones) A1, B1, C1, D1, F1, H77, I1, J1 and K2 won, the naming analogous to the naming of the Patient sera took place. In addition, an HCV-E1 RNA amplificate "MIX-Pos" obtained by an RNA mixture of all existing RNA samples of the RT-PCR has been subjected. This HCV-E1 RNA amplificate, designated as "MIX-Pos", provides is a defined gene library for HCV-E1, the viral heterogeneity in this Area. Approach H77 (genotype 1b) served as a positive control in the PCR. The various HCV-E1 RNA amplificates were in each case with the expert known and common methods in the plasmids pM-CG16 and pcDNA3.1. Zeo (-) ligated. Competent E. coli were then used with the recombinant plasmids transfected and the transformed cells selected and multiplied. As a control was a transfection with the "empty" plasmid, ie. the plasmid without inserted HCV-RNA amplificates (pM-CG16). Of the Transfection approaches "MIX-Pos" and "D" were 20 clones each, from all others Approaches picked 2 clones each and the (known to those skilled in the art) Subjugated to plasmid preparation. The success of the cloning was confirmed by a Restriction digestion and separation checked on an agarose gel.
Das Prinzip dieses Verfahrens zur Gewinnung einer multigenetischen Anti-HCV-E1- DNA-Vakzine auf der Basis einer definierten Immunisierungslibrary ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. The principle of this method for obtaining a multigenetic anti-HCV E1 DNA vaccine based on a defined immunization library is shown schematically in FIG. 2.
Positive Bakterienklone aus der Minipräparation wurden zur pyrogenfreien Plasmid Mega- bzw. Gigapräparation verwendet. Positive bacterial clones from the mini preparation became a pyrogen-free plasmid Mega or Giga preparation used.
Die gewonnenen Plasmid-HCV-E1-Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau und Sequenzierung kontrolliert. Das Ergebnis dieser Kontrolluntersuchung ist in Tabelle 3 dargestellt. The plasmid-HCV-E1 constructs obtained were obtained by restriction digestion and Sequencing checked. The result of this control examination is in Table 3 shown.
In dieser Tabelle 3 sind die Sequenzen der Inserts der Plasmide pM-A1, pM-B1, pM-C1, pM-D1, pM-F2, pM-I1, pM-J1, pM-K2, pM-H77-1, pc-B-HIS und pc-J-HIS in direkter Gegenüberstellung aufgelistet und außerdem die Sequenzen der PCR-Primer. Die in allen untersuchten Plasmidsequenzabschnitten übereinstimmenden Nukleotide sind in der Tabelle grau unterlegt. Diese Gegenüberstellung verdeutlicht, wie sehr sich die verschiedenen klonierten HCV-Genotypen und -Subtypen auf der Nukleotidebene unterscheiden. In this Table 3 the sequences of the inserts of the plasmids pM-A1, pM-B1, pM-C1, pM-D1, pM-F2, pM-I1, pM-J1, pM-K2, pM-H77-1, pc-B-HIS and pc-J-HIS in direct Comparison and also lists the sequences of the PCR primers. The one in all plasmid sequence sections matched nucleotides are in the Table with a gray background. This comparison shows how much the different cloned HCV genotypes and subtypes at the nucleotide level differ.
Alle dargestellten Plasmidsequenzabschnitte weisen (in 5'-3'-Richtung) die Restriktionsschnittstelle EcoRV (GATATC) auf, gefolgt von einem Startcodon (ATG) und der sich daran anschließenden Sequenz des Sense-Primers CS2. All plasmid sequence sections shown have (in the 5'-3 'direction) Restriction interface EcoRV (GATATC) followed by a start codon (ATG) and the subsequent sequence of the sense primer CS2.
Die von dem Vektor pM-CG16 abgeleiteten Plasmid-HCV-E1-Konstrukte (pM-A1, pM- C1, pM-B1, pM-H77, pM-D1, pM-F2, pM-J1, pM-I1 und pM-K2) weisen in den dargestellten Plasmidsequenzabschnitten im Anschluß an die Primersequenz eine 639 Nukleotide (= 213 Aminosäuren) lange Nukleinsäure auf, gefolgt von einem Stoppcodon (TGA) und der sich daran anschließenden Restriktionsschnittstelle HindIII (AAGCTT). Die von dem Vektor pcDNA3.1. Zeo(-) abgeleiteten Plasmid-HCV-E1-Konstrukte (pc-B-HIS und pc-J-HIS) weisen in den dargestellten Plasmidsequenzabschnitten im Anschluß an die Primersequenz ebenfalls eine 639 Nukleotide (= 213 Aminosäuren) lange Nukleinsäure gefolgt von einem Stopcodon (TGA) auf. Zusätzlich enthalten diese beiden Plasmidsequenzabschnitte zwischen dem Ende der E1-Sequenz und dem Stopcodon eine 6 × Histidinsequenz (CATCACCATCATCACCAT). The plasmid HCV-E1 constructs derived from the vector pM-CG16 (pM-A1, pM- C1, pM-B1, pM-H77, pM-D1, pM-F2, pM-J1, pM-I1 and pM-K2) have in the plasmid sequence sections shown following the primer sequence a 639 Nucleotides (= 213 amino acids) long nucleic acid followed by a stop codon (TGA) and the subsequent restriction interface HindIII (AAGCTT). The of the vector pcDNA3.1. Zeo (-) derived plasmid-HCV-E1 constructs (pc-B-HIS and pc-J-HIS) have in the plasmid sequence sections shown in Following the primer sequence also a 639 nucleotide (= 213 amino acids) long nucleic acid followed by a stop codon (TGA). They also contain these two plasmid sequence sections between the end of the E1 sequence and the Stop codon a 6 × histidine sequence (CATCACCATCATCACCAT).
Als Ausgangsmaterial diente wiederum aus HCV-positiven Patientenseren isolierte HCV-E1-RNA verschiedener HCV-Genotypen und -Subtypen. Im Unterschied zur Vorgehensweise nach Beispiel (1A) wurden im vorliegenden Fall die HCV-positiven Patientenseren von 20 verschiedenen Patienten gepoolt und aus diesen gepoolten Seren die HCV-E1-RNA isoliert. Das Poolen erfolgte derart, daß alle Klone die von den 20 verschiedenen Patientenseren gewonnen worden waren, durch Überstreichen der Nährbodenplatte in einen gemeinsamen Bakterienkulturansatz eingebracht wurden. Die eigentlichen Virussequenzen sind bei dieser Vorgehensweise (1B) zwar nicht mehr bekannt, es ist aber davon auszugehen, daß zumindest die meisten wenn nicht gar alle in den 20 gepoolten Patientenseren enthaltenen HCV-E1-RNA-Sequenzen der verschiedensten HCV-Genotypen und HCV-Subtypen in der Immunisierungslibrary abgebildet werden. In turn, isolated from HCV-positive patient sera served as the starting material HCV E1 RNA of various HCV genotypes and subtypes. In contrast to The procedure according to example (1A) was the HCV-positive in the present case Patient sera pooled from 20 different patients and from these pooled sera the HCV-E1 RNA isolated. The pooling was carried out in such a way that all clones from the 20th various patient sera had been obtained by sweeping over the Culture medium plate were introduced into a common bacterial culture approach. The The actual virus sequences are no longer with this procedure (1B) known, but it can be assumed that at least most, if not all, of the 20 pooled patient sera containing HCV-E1 RNA sequences from various HCV genotypes and HCV subtypes in the immunization library be mapped.
Die gewonnene gepoolte virale RNA wurde mittels RT-PCR und anschließender nested PCR revers transkribiert und amplifiziert. Das erhaltene und als "MIX-Lib" bezeichnete HCV-E1-RNA-Amplifikat wurde mit dem Fachmann bekannten und geläufigen Verfahren in die Plasmide pM-CG16 und pcDNA3.1. Zeo(-) insertiert (ligiert) und kloniert. Hierbei wurde wie in Beispiel (1A) beschrieben vorgegangen. The pooled viral RNA obtained was nested using RT-PCR and subsequent PCR reverse transcribed and amplified. The one received and designated as "MIX-Lib" HCV-E1 RNA amplificate was known and familiar to the person skilled in the art Methods in the plasmids pM-CG16 and pcDNA3.1. Zeo (-) inserted (ligated) and cloned. The procedure was as described in Example (1A).
Mit den rekombinanten Plasmiden wurden anschließend kompetente E. coli transfiziert und selektioniert. Als Kontrolle wurde ein Transfektionsansatz mit dem "leeren" Plasmid ohne insertiertes HCV-RNA-Amplifikat (pM-CG16) durchgeführt. Von den Transfektionsansätzen wurden jeweils etwa 40 Klone gepickt und der (dem Fachmann bekannten und geläufigen) Plasmid-Minipräparation unterworfen. Der Erfolg der Klonierung wurde durch einen Restriktionsverdau, Auftrennen auf einem Agarose-Gel und Sequnezierung überprüft. Competent E. coli were then transfected with the recombinant plasmids and selected. As a control, a transfection batch with the "empty" plasmid was used performed without inserted HCV-RNA amplificate (pM-CG16). Of the About 40 clones were picked from each of the transfection batches and the (to the expert known and common) subjected to plasmid mini-preparation. The success of Cloning was carried out by restriction digestion, separation on an agarose gel and sequencing checked.
Das Prinzip dieses Verfahrens zur Gewinnung einer multigenetischen Anti-HCV-DNA- Vakzine auf der Basis einer undefinierten Immunisierungslibrary ist ebenfalls in Fig. 2 schematisch dargestellt. The principle of this method for obtaining a multigenetic anti-HCV DNA vaccine based on an undefined immunization library is also shown schematically in FIG. 2.
In Abb. 4 sind noch einmal die verschiedenen Vakzinierungsgruppen zusammengefasst. Fig. 4 summarizes the different vaccination groups.
Analog der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurden die HCV-E1-DNA- Plasmid-Konstrukte gemäß Fig. 3 und daraus die beiden multigenetischen Anti-HCV-E1- DNA-Vakzinen "MIX-pos" (definierte Immunisierungslibrary) und "MIX-Lib" (undefinierte Immunisierungslibrary), sowie zu Vergleichszwecken die herkömmlichen "unigenetischen" Vakzinen "pM-A-1", "pM-B-1", "pM-C-1", "pM-D-1", "pM-F-2", "pM-I-1", "pM-J-1", "pM-K-2" und "pM-H77-1" hergestellt. Hierzu wurde die betreffende Plasmid-DNA in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, und zwar in der Konzentration 75 µg HCV-E1-DNA pro 100 µl physiologischer Kochsalzlösung. 13 Gruppen von jeweils 10 Balb/c und C57/Black-Mäusen wurden mit Bupivacain 0,25% präinjeziert. Fünf Tage später wurde jeder Maus intramuskulär in den Oberschenkel injiziert. Diese Behandlung wurde im Abstand von 14 Tagen zweimal wiederholt. 12 Tage nach der dritten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, die Seren jeder (Impf-)Gruppe gepoolt und die humorale und zelluläre Immunantwort mittels ELISA, T-Zell-Proliferationsassay (CD4+-T-Zellantwort) und als Maß der zytotoxischen T-Zellantwort (CD8+-T-Zellen) mit ELISPOT gemessen. Analogously to the procedure described in Example 1, the HCV-E1-DNA plasmid constructs according to FIG. 3 and from them the two multigenetic anti-HCV-E1-DNA vaccines "MIX-pos" (defined immunization library) and "MIX-Lib "(undefined immunization library), as well as for comparison purposes the conventional" unigenetic "vaccines" pM-A-1 "," pM-B-1 "," pM-C-1 "," pM-D-1 "," pM- F-2 "," pM-I-1 "," pM-J-1 "," pM-K-2 "and" pM-H77-1 ". For this purpose, the plasmid DNA in question was taken up in physiological saline, namely in a concentration of 75 μg HCV-E1-DNA per 100 μl physiological saline. 13 groups of 10 Balb / c and C57 / Black mice each were pre-injected with 0.25% bupivacaine. Five days later, each mouse was injected intramuscularly into the thigh. This treatment was repeated twice every 14 days. The mice were sacrificed 12 days after the third immunization, the sera from each (vaccination) group were pooled and the humoral and cellular immune response by means of ELISA, T cell proliferation assay (CD4 + T cell response) and as a measure of the cytotoxic T cell response ( CD8 + T cells) measured with ELISPOT.
Als Testantigen für den ELISA (I) und auch zur ex vivo Stimulation in den anderen immunologischen Assays kam ein rekombinantes, E. coli exprimiertes E1 Protein, Genotyp I "HCV-E1-Genotyp-1" (Fa. Biogenesis, UK) zur Anwendung. Die Ergebnisse des ELISAs (I) sind in Fig. 5 dargestellt. Alle Mausgruppen zeigten eine deutliche humorale Immunantwort, nämlich eine Induktion signifikanter Antikörperlevel. Der Antikörperlevel nach Impfung mit der definierten multigenetischen Anti-HCV-E1-DNA- Vakzine (definierten Immunisierungslibrary) "MIX-Pos" war im Vergleich zu den "unigenomischen" Vakzinen in fast allen Fällen signifikant höher. Die Antikörperlevel nach Impfung mit der undefinierten multigenetischen Anti-HCV-E1-DNA-Vakzine (undefinierten Immunisierungslibrary) "MIX-Lib" lagen zumindest deutlich über dem Hintergrund (nach Immunisierung mit Mock Plasmid pM-CG-16). A recombinant, E. coli-expressed E1 protein, genotype I "HCV-E1 genotype-1" (from Biogenesis, UK) was used as the test antigen for the ELISA (I) and also for ex vivo stimulation in the other immunological assays , The results of the ELISA (I) are shown in FIG. 5. All mouse groups showed a clear humoral immune response, namely an induction of significant antibody levels. The antibody level after vaccination with the defined multigenetic anti-HCV E1 DNA vaccine (defined immunization library) "MIX-Pos" was significantly higher in almost all cases compared to the "unigenomic" vaccine. The antibody levels after vaccination with the undefined multigenetic anti-HCV E1 DNA vaccine (undefined immunization library) "MIX-Lib" were at least significantly above the background (after immunization with mock plasmid pM-CG-16).
Als Testantigen für den ELISA (II) diente ein definierter Peptid-Mix aus vier definierten Peptiden (Prädiktion der Epitope durch Computerprogramm) mit Sequenzen, die einem Genotyp I entnommen wurden). Die Ergebnisse des ELISAs (II) sind in Fig. 6 dargestellt. Nur die Mausgruppen, die mit der "unigenetischen" Vakzine gegen die HCV- Genotypen IV und V geimpft bzw. immunisiert worden waren, nämlich die Gruppen "pM-I-1", "pM-J-1" und "pM-K-2" (vgl. Tab. 1), und die Mausgruppe, die mit der definierten multigenetischen Anti-HCV-E1-DNA-Vakzine (definierten Immunisierungslibrary) "MIX-Lib" geimpft bzw. immunisiert worden war, zeigten eine deutliche humorale Immunantwort, nämlich eine Induktion signifikanter Antikörperlevel. A defined peptide mix of four defined peptides (prediction of the epitopes by computer program) with sequences which were taken from a genotype I served as test antigen for the ELISA (II). The results of the ELISA (II) are shown in Fig. 6. Only the mouse groups that had been vaccinated or immunized with the "unigenetic" vaccine against HCV genotypes IV and V, namely the groups "pM-I-1", "pM-J-1" and "pM-K- 2 "(cf. Tab. 1), and the mouse group which had been vaccinated or immunized with the defined multigenetic anti-HCV-E1 DNA vaccine (defined immunization library)" MIX-Lib "showed a clear humoral immune response, namely an induction of significant antibody levels.
In Fig. 7 sind die Ergebnisse des T-Zell-Proliferationsassays gegen HCV E1 dargestellt, nämlich der Proliferationsindex bzw. Stimulationindex von CD4-T-Zellen nach dreitägiger in-vitro Stimulation mit dem oben beschriebenen rekombinanten Protein "HCV-E1-Genotyp-1" (Fa. Biogenesis, UK). Ein Proliferationsindex bzw. Stimulationindex größer 2 war nur bei derjenigen Mausgruppe nachweisbar, die mit der "unigenetischen" Vakzine gegen die HCV-Genotypen V ("pM-K-2") geimpft bzw. immunisiert worden war. Siginifikant hohe T-Zell-Proliferationslevel wurden aber auch bei denjenigen Mausgruppen ermittelt, die mit den definierten multigenetischen Anti- HCV-E1-DNA-Vakzinen (definierten Immunisierungslibraries) "MIX-Pos" und "MIX-Lib" geimpft bzw. immunisiert worden waren. In Fig. 7 shows the results of T-cell proliferation assays against HCV are shown E1, namely, the proliferation index and stimulation index of CD4 + T-cells after three days of in vitro stimulation with the above-described recombinant protein "HCV E1 genotype 1 "(Biogenesis, UK). A proliferation index or stimulation index greater than 2 was only detectable in the mouse group that had been vaccinated or immunized with the "unigenetic" vaccine against the HCV genotypes V ("pM-K-2"). However, significantly high T cell proliferation levels were also found in those mouse groups which had been vaccinated or immunized with the defined multigenetic anti-HCV E1 DNA vaccines (defined immunization libraries) "MIX-Pos" and "MIX-Lib" ,
In Fig. 8 sind die Ergebnisse des ELISPOT-Assays gegen das Genotyp I HCV E1 rekombinanten Protein (Fa. Biogenesis, UK) dargestellt. Der ELISPOT bildet die Zahl der IFN-gamma produzierenden T-Zellen auf Einzelzellebene ab und gilt damit als relatives Maß für die zytotoxische T-Zellantwort. Nach Immunisierung mit den beschriebenen multigenetischen und unigenetischen Vakzinen wurde eine signifikant hohe CD8-T-Zellaktivität bei denjenigen Mausgruppen festgestellt, die mit den multigenetischen Anti-HCV-E1-DNA-Vakzinen (Immunisierungslibraries) "MIX-Pos" und "MIX-Lib" geimpft bzw. immunisiert worden waren, und ebenfalls bei derjenigen Mausgruppe, die mit der "unigenetischen" Vakzine gegen die HCV-Genotypen Ib geimpft bzw. immunisiert worden war ("pM-H77-1"). In FIG. 8 shows the results of ELISPOT assays against the genotype I HCV E1 recombinant protein are (Fa. Biogenesis, UK), respectively. The ELISPOT shows the number of IFN-gamma producing T cells at the individual cell level and is therefore considered a relative measure of the cytotoxic T cell response. After immunization with the multigenetic and unigenetic vaccines described, a significantly high CD8-T cell activity was found in those mouse groups which were treated with the multigenetic anti-HCV-E1 DNA vaccines (immunization libraries) "MIX-Pos" and "MIX-Lib" had been vaccinated or immunized, and also in the mouse group which had been vaccinated or immunized with the "unigenetic" vaccine against the HCV genotypes Ib ("pM-H77-1").
Insgesamt zeigen die Ergebnisse der immunologischen Experimente nach genetischer Immunisierung gegen E1 deutlich, dass die erfindungsgemäßen multigenetischen Vakzinen unterschiedliche Genotypen unterschiedliche Epitope anderer oder gleicher Genotypen erkennen, übergreifende Immunantworten induzieren und damit für eine erfolgreiche HCV Bekämpfung geeignet sind. Overall, the results of immunological experiments show genetic Immunization against E1 clearly shows that the multigenetic according to the invention Vaccines of different genotypes of different epitopes of different or the same Recognize genotypes, induce overarching immune responses and thus for one successful HCV control are suitable.
Hüllenproteine von HIV oder Influenza-Virus unterschiedlicher Genotypen und Subtypen werden analog dem DNA-Impfstoff für HCV (vgl. Bsp. 1) in ein Plasmid oder einen Adenovirus kloniert. Für Influenza wird dabei das Hämagglutinin und das Neuraminidasegen verschiedener Subtypen verwendet (isoliert aus Serum von Patienten oder Vögeln bzw. Säugetierarten in Südostasien). Bei HIV wird gp120 als Membranprotein mit hoher Variabilität neben anderen Membranproteinen verwendet (Klonierung aus Patientenseren analog zu HCV). Über degenerierte Primer an den Enden dieser Proteine werden mittels RT-PCR die Genabschnitte in einen Plasmid- oder viralen Vektor eingebracht und nachfolgend mittels Westernblotanalyse in vitro überprüft. Zur Geno- bzw. Subtyp-unabhängigen Expressionsnalyse mit Immunoblot wird ein myc-Tag in das Plasmid mit eingebracht. Envelope proteins of HIV or influenza virus of different genotypes and Subtypes are analogous to the DNA vaccine for HCV (see Example 1) in a plasmid or cloned an adenovirus. For influenza, hemagglutinin and Neuraminidase genes of various subtypes used (isolated from patient serum or birds or mammals in Southeast Asia). In HIV, gp120 is considered Membrane protein with high variability used in addition to other membrane proteins (Cloning from patient sera analogous to HCV). Via degenerate primers at the ends these proteins are converted into a plasmid or viral gene segment using RT-PCR Vector introduced and subsequently checked in vitro by Western blot analysis. to Expression or genotype-independent expression analysis with immunoblot becomes a myc tag introduced into the plasmid.
Analog der in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise werden BALB/c und C57/BL6 Mäuse mehrfach intramuscular und/oder subcutan mit der gemäß Beispiel 3 gewonnenen DNA-Vakzine gegen HIV oder gegen Influenza-Virus immunisiert. Die Messung der humoralen Immunantwort erfolgt über einen ELISA. Dabei werden Proteine unterschiedlicher Genotypen und Subtypen bzw. in der Literatur publizierte Peptidsequenzen unterschiedlicher Subtypen von HIV oder Influenza-Virus verwendet. Subtyp-übergreifende humorale Immunantworten mit Subtyp-übergreifenden neutralisiernden Antikörpern beweisen die breite genetische Hetrogenität, die mit einer solchen erfindungsgemäßen Impfung abgedeckt wird. Gleiches gilt für die zelluläre Immunantwort. Hier wird die CD4-T-Zellantwort im Thymidin-Proliferationsassay bzw. im ELISPOT und die CD8-zytotoxische T-Zellantwort über mit den Adenoviren infizierte Zielzellen gemessen. Beide spielen für eine Viruselimination, vor allen Dingen auch bei bereits infizierten Patienten (Einsatz als therapeutische Vakzine), eine entscheidende Rolle. Im Mausmodell wird mit den beschriebenen Immunisierungen eine genotyp/subtyp übergreifende breite Immunantwort erzeugt, die dem Virus eine Immunevasion über genetische Mutation (die nach herkömmlichen Impfungen auftritt) unmöglich macht. Es können keine oder nur geringste Mengen sog. Escape-Mutanten entstehen. Analogous to the procedure described in Example 2, BALB / c and C57 / BL6 Mice multiple times intramuscularly and / or subcutaneously with that obtained according to Example 3 DNA vaccine immunized against HIV or against influenza virus. The measurement of humoral immune response is via an ELISA. In doing so, proteins different genotypes and subtypes or published in the literature Peptide sequences of different subtypes of HIV or influenza virus are used. Cross-subtype humoral immune responses with cross-subtype neutralizing antibodies demonstrate the broad genetic heterogeneity associated with a such vaccination according to the invention is covered. The same applies to the cellular Immune response. Here, the CD4 T cell response in the thymidine proliferation assay or in ELISPOT and the CD8 cytotoxic T cell response via with the adenoviruses infected target cells measured. Both play for virus elimination, above all also in patients who are already infected (use as a therapeutic vaccine), one decisive role. In the mouse model, the described immunizations are used genotype / subtype generated broad immune response that the virus Immune evasion via genetic mutation (which occurs after conventional vaccinations) makes impossible. There can be no or only very small amounts of so-called escape mutants arise.
In einem Virus-Challenge Modell in Affen wird die prophylaktische Wirksamkeit der
gemäß Beispiel 1 oder Beispiel 3 gewonnenen "multigenetischen" DNA-Vakzine gegen
HCV oder HIV oder Influenza-Virus durch erfolgreichen Elimination des
Challengeisolates verschiedener Geno- und Subtypen bewiesen.
Literaturzitate
1. Saito, T. et al.: Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural
proteins: immune responses in mice. Gastroenterology 112, 1321-30 (1997).
2. Geissler, M. et al.: Enhancement of cellular and humoral immune responses to
hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with
cytokineexpressing plasmids. J Immunol 158, 1231-7 (1997).
3. Tokushige, K. et al.: Expression and immune response to hepatitis C virus core
DNA-based vaccine constructs. Hepatology 24, 14-20 (1996).
4. Nakano, I. et al.: Immunization with plasmid DNA encoding hepatitis C virus
envelope E2 antigenic domains induces antibodies whose immune reactivity is
linked to the injection mode. J Virol 71, 7101-9 (1997).
5. Encke, J. et al.: Genetic immunization generates cellular and humoral immune
responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in a murine
model. J Immunol 161, 4917-23 (1998). Tabelle 1
Genotypen der zur Klonierung verwendeten (Patienten-)Seren
Tabelle 2
Zur PCR verwendete Oligonukleotidprimer
Tabelle 3
Sequenzvergleich der insertierten HCV-Konstrukte in den Plasmiden für die
DNA-Vakzine
In a virus challenge model in monkeys, the prophylactic effectiveness of the "multigenetic" DNA vaccine obtained according to Example 1 or Example 3 against HCV or HIV or influenza virus is demonstrated by successfully eliminating the challenge isolate from various genotypes and subtypes. References 1. Saito, T. et al .: Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immune responses in mice. Gastroenterology 112, 1321-30 (1997).
2. Geissler, M. et al .: Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokineexpressing plasmids. J Immunol 158, 1231-7 (1997).
3. Tokushige, K. et al .: Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs. Hepatology 24, 14-20 (1996).
4. Nakano, I. et al .: Immunization with plasmid DNA encoding hepatitis C virus envelope E2 antigenic domains induces antibodies whose immune reactivity is linked to the injection mode. J Virol 71, 7101-9 (1997).
5. Encke, J. et al .: Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis C virus in a murine model. J Immunol 161, 4917-23 (1998). Table 1 Genotypes of the (patient) sera used for cloning
Table 2 Oligonucleotide primers used for PCR
Table 3 Sequence comparison of the inserted HCV constructs in the plasmids for the DNA vaccine
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