DE10214250A1 - Microtitration plate has a transparent base plate with an optically transparent and electrically conductive coating, supporting a multiple-wave superstructure to define the cavities, held by a release bond - Google Patents
Microtitration plate has a transparent base plate with an optically transparent and electrically conductive coating, supporting a multiple-wave superstructure to define the cavities, held by a release bondInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte mit elektrisch leitfähiger und optisch-transparenter Beschichtung sowie die Verwendung der Mikrotiterplatte in einem Verfahren zur Bestimmung optischer und elektrischer Parameter an einer Mehrzahl biologischer und/oder chemischer Untersuchungssysteme. The present invention relates to a microtiter plate with an electrically conductive and optically transparent coating and the use of the microtiter plate in a method for determining optical and electrical parameters on a Most biological and / or chemical investigation systems.
Die verbreitetste Technik zur Untersuchung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) verwendet poröse Filtermembranen (Polycarbonat, Polystyrol) auf denen die Zellen kultiviert werden. Zur Messung des TER müssen die benötigten Messelektroden durch einen externen Messaufbau bereit gestellt werden. Üblich sind Filtereinsätze, die eine Kultivierung von Zellen in 6-, 12-, oder 24er aber auch 96er Mikrotiterplatten zulassen. Derartige Filtersysteme sind bei World Precision Instruments Inc. (Berlin) kommerziell erhältlich. Die Kosten der Herstellung solcher Filter sind bei derartigen Messanordnungen jedoch verhältnismäßig hoch. The most common technique for examining the transepithelial electrical Resistor (TER) uses porous filter membranes (polycarbonate, polystyrene) on which the cells are cultivated. To measure the TER you need the necessary Measuring electrodes are provided by an external measurement setup. Common are filter cartridges that also cultivate cells in 6, 12 or 24 cells Allow 96 microtiter plates. Such filter systems are at World Precision Instruments Inc. (Berlin) commercially available. The cost of making such However, filters of this type are relatively high.
Messkammern mit integrierten Gold-Film Elektroden zur Untersuchung von Gewebeschnitten (extrazelluläre Ableitung von Aktionspotentialen) sind bei Multichannel-Systems MCS GmbH (Reutlingen) erhältlich. Measuring chambers with integrated gold-film electrodes for the investigation of Tissue sections (extracellular derivation of action potentials) are included Multichannel systems MCS GmbH (Reutlingen) available.
Messkammern mit acht Kavitäten mit integrierten Gold-Film Elektroden werden von Applied BioPhysics, Inc. (Troy, New York) vertrieben. Ein ähnlicher Aufbau wurde auch von Wegener im J. Biochem Biophys. Methods 32 (1996) 151-170 beschrieben. Measuring chambers with eight cavities with integrated gold-film electrodes are sold by Applied BioPhysics, Inc. (Troy, New York). A similar structure was also developed by Wegener in J. Biochem Biophys. Methods 32 ( 1996 ) 151-170.
Optische Untersuchungen lassen sich jedoch an den oben beschriebenen Vorrichtungen, die von Gold-Film-Elektroden Gebrauch machen, nur eingeschränkt durchführen. So lassen sich adhärente Zellschichten nicht mittels photometrischer Absorptionsmessungen untersuchen, da die Substrate wegen der hohen Eigenabsorption der Metallfilme ungeeignet sind. Fluoreszenz-spektroskopische oder fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen sind nur unter Verwendung von Auflichtnicht aber inversen Mikroskopen möglich, die jedoch viele anwendungsorientierte Vorteile mit sich bringen. However, optical examinations can be carried out on the ones described above Devices that make use of gold film electrodes only to a limited extent carry out. Adherent cell layers cannot be measured using photometric methods Examine absorption measurements, because the substrates because of the high Self-absorption of the metal films are unsuitable. Fluorescence or spectroscopic fluorescence microscopic examinations are only possible using Incident light is not possible with inverted microscopes, but many are application-oriented Bring advantages.
Zur Durchführung photometrischer Experimente, auch an zellulären Systemen, sind seit einiger Zeit Mikrotiterplatten mit 96 Wells zum Beispiel von der Firma Nung GmbH erhältlich. To carry out photometric experiments, also on cellular systems for some time microtiter plates with 96 wells, for example from the company Nung GmbH available.
Aus der Fachliteratur sind Messvorrichtungen, die Indium-Zinn-Oxid (ITO) als Elektrodenmaterial zur Manipulation, insbesondere Elektroporation adhärenter Zellmonoschichten verwenden bekannt. Hierzu zählen unter anderem die von Firth et al., 1997, Biotechniques 24 (1997) 644-646, Gross et al., 1993, J. Neurosci. Methods 50 (1993) 131-143, Kimura et al., 1998, Med. Biol. Eng. Comput. 36 (1998) 493-498, und Poortinga et al., 1999, J. Microbiol. Methods 38 (1999) 183-189, beschriebenen Anordnungen. Mit derartigen Vorrichtungen sind weder gleichzeitige Messungen an einer Vielzahl von Proben bei geringem Bedarf an Zellen und Medium und höchstmöglicher Automatisierung der Messung möglich, noch eignen sich die Versuchsanordnungen zur nicht-invasiven elektrischen Charakterisierung von Zellschichten im Sinne eines Monitoring. Darüber hinaus ist die Abisolierung der Elektrodenareale bei der Herstellung einiger der genannten Vorrichtungen mittels einer Polymerbeschichtung mit weiterem Arbeits- und somit Kostenaufwand verbunden. Measuring devices which use indium tin oxide (ITO) as electrode material for manipulation, in particular electroporation of adherent cell monolayers, are known from the specialist literature. These include those by Firth et al., 1997, Biotechniques 24 ( 1997 ) 644-646, Gross et al., 1993, J. Neurosci. Methods 50 ( 1993 ) 131-143, Kimura et al., 1998, Med. Biol. Eng. Comput. 36 ( 1998 ) 493-498, and Poortinga et al., 1999, J. Microbiol. Methods 38 ( 1999 ) 183-189. With such devices, simultaneous measurements on a large number of samples with little need for cells and medium and maximum possible automation of the measurement are not possible, nor are the test arrangements suitable for the non-invasive electrical characterization of cell layers in the sense of monitoring. In addition, the stripping of the electrode areas in the manufacture of some of the devices mentioned by means of a polymer coating is associated with additional work and thus cost.
Die US 6,207,369 offenbart Materialien und Verfahren aus dem Bereich der Elektrochemilumineszenz-Untersuchungen, die ebenfalls für ein nicht-invasives Monitoring im Obigen Sinne ungeeignet sind. Insbesondere wird die chemische und physikalische Kontrolle, also die Manipulation der Untersuchungssysteme beschrieben. US 6,207,369 discloses materials and methods from the field of Electrochemiluminescence studies, also for a non-invasive Monitoring in the above sense are unsuitable. In particular, the chemical and physical control, i.e. the manipulation of the examination systems described.
Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung war es daher die Nachteile der oben beschriebenen Vorrichtungen zu überwinden und eine universell verwendbare auch unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten günstige Mikrotiterplatte zur Verfügung zu stellen, die gleichzeitige optische und elektrische und somit korrelierbare Messungen an einer Vielzahl von Proben biologischer und/oder chemischer Systeme erlaubt und daher für die automatisierte Durchführung einer großen Anzahl von Experimenten, bei minimaler Probengröße, auch unter Verwendung kommerziell erhältlicher Mess- und Pipettiergeräte geeignet ist. One of the objects of the present invention was therefore the drawbacks of the above described devices to overcome and a universally usable also economical microtiter plates are available from an economic point of view represent the simultaneous optical and electrical and thus correlatable measurements allowed on a large number of samples from biological and / or chemical systems and therefore for the automated execution of a large number of experiments, with minimum sample size, also using commercially available measurement and pipetting devices is suitable.
Die Aufgabe wurde durch Bereitstellung einer Mikrotiterplatte die eine Mehrzahl an Kavitäten aufweist, bestehend aus einer Bodenplatte und einem mit dieser verbundenen Multiwellaufsatz, der die Mikrotiterplatte in Kavitäten aufteilt, gelöst, wobei die Bodenplatte aus einem transparenten Material besteht, welches einseitig auf der dem Multiwellaufsatz zugewandten Seite mit einem optisch transparenten elektrisch leitfähigen Material beschichtet ist. The task was accomplished by providing a microtiter plate to the majority Has cavities, consisting of a base plate and with this connected multiwell attachment, which divides the microtiter plate into cavities, the base plate is made of a transparent material which is one-sided on the side facing the multiwell attachment with an optically transparent electrically conductive material is coated.
Die Bodenplatte kann grundsätzlich aus jedem transparenten Material, wie zum Beispiel transparenten organischen Polymeren, wie zum Beispiel Polycarbonat oder Polystyrol oder anorganischen Materialien, wie Glas, ausgewählt je nach Art der durchzuführenden optischen Untersuchungen unter Berücksichtigung einer möglichst geringen Eigenabsorption des eingestrahlten und/oder emittierten Lichts, bestehen. So ist zum Beispiel bei Untersuchungen im UV-Bereich die Verwendung von Quarzglas als Bodenplatte vorteilhaft, während im Bereich des sichtbaren Lichts auf verschiedene Kunststoffe zurückgegriffen werden kann. The base plate can basically be made of any transparent material, such as Example transparent organic polymers, such as polycarbonate or Polystyrene or inorganic materials, such as glass, selected depending on the type of optical investigations to be carried out taking into account a as low as possible self absorption of the incident and / or emitted light, consist. This is the case, for example, for examinations in the UV range of quartz glass as a base plate advantageous while in the range of visible light different plastics can be used.
Die Bodenplatte ist mit dem optisch transparenten elektrisch leitfähigen Elektrodenmaterial beschichtet. Als Elektrodenmaterial eignet sich grundsätzlich jedes optisch transparente und elektrisch leitfähige Material. So können zum Beispiel leitfähige organische Polymere und Metalloxide wie Indium-Zinn-Oxid (ITO) und Metalle in einer Schichtdicke, die Transparenz zulässt eingesetzt werden. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass je nach Beschichtung beziehungsweise Beschichtungsverfahren ein geeignetes Bodenplattenmaterial zu wählen ist. So eignen sich zum Beispiel auf Grund der thermischen Belastung bei einer Sputterbeschichtung mit ITO nur solche Substrate, die eine entsprechende thermische Stabilität aufweisen. The bottom plate is with the optically transparent electrically conductive Electrode material coated. Basically suitable as electrode material any optically transparent and electrically conductive material. For example conductive organic polymers and metal oxides such as indium tin oxide (ITO) and Metals in a layer thickness that allows transparency. It must however, be considered that depending on the coating respectively Coating process a suitable base plate material is to be selected. So are suitable, for example, due to the thermal load on a Sputter coating with ITO only those substrates that have a corresponding have thermal stability.
Sofern die Elektroden auch als Zellkultursubstrat dienen, bedarf es der Verwendung biokompatibler, untoxischer Materialien. Als biokompatibel hat sich zum Beispiel das kommerziell erhältliche und preisgünstige ITO bewährt, auf welchem sich sogar üblicherweise schwer in vitro kultivierbare Neuronen erfolgreich anzüchten lassen. If the electrodes also serve as a cell culture substrate, use is required biocompatible, non-toxic materials. That has proven to be biocompatible, for example commercially available and inexpensive ITO proven, on which even Usually successfully grown neurons that are difficult to cultivate in vitro.
Bodenplatten auf Basis eines transparenten Kunststoffs, Glas oder Quarz mit einer ITO-Beschichtung sind zum Beispiel bei der Präzisions Glas & Optik GmbH (Iserlohn) oder Delta Technologies (Stillwater, MN, USA) erhältlich. Base plates based on a transparent plastic, glass or quartz with a ITO coatings are for example at the precision glass & optics GmbH (Iserlohn) or Delta Technologies (Stillwater, MN, USA).
Bei der Anzucht mancher Zellen, wie zum Beispiel Endothelzellen kann es vorteilhaft sein das Elektrodenmaterial mit einem die Biokompatibilität steigernden Material zu beschichten. Hierfür eigenen sich beispielsweise Proteine, wie durch Glutaraldehyd vernetzte Gelatine. Neben einer Verbesserung der Adhäsion und Proliferation der Zellen, lässt sich darüber hinaus auf diese Weise die maximale Kultivierungsdauer teilweise um das Zigfache erhöhen. Weitere Beschichtungsmaterialien sind zum Beispiel Fibronektin, Vitronektin, Laminin, Kollagen, Matrigel™ (Gemisch aus Basalmembranproteinen, erhältlich bei Firma Sigma) oder Polylysin. It can be beneficial when growing some cells, such as endothelial cells be the electrode material with a material that increases the biocompatibility coat. Proteins such as those from glutaraldehyde are suitable for this cross-linked gelatin. In addition to improving the adhesion and proliferation of the Cells, this also allows the maximum cultivation time partially increase by a factor of several. Other coating materials are for Example fibronectin, vitronectin, laminin, collagen, Matrigel ™ (mixture of Basement membrane proteins, available from Sigma) or polylysine.
Eine Beschichtung mit vernetzter Gelatine kann zum Beispiel durch mehrstündiges Inkubieren der Kavitäten bei Raumtemperatur mit einer 0,5 gew.-%igen Gelatine- Lösung in Wasser, nachfolgendem Entfernen der Gelatine-Lösung und 15 minütigem Inkubieren mit einer 2 gew.-%igen Glutardialdehyd-Lösung und anschließender Inkubierung mit 70 vol-%igem Ethanol erhalten werden. Vor dem Ausbringen der Zellsuspension in die Kavitäten empfiehlt es sich die Kavitäten mehrfach mit Reinstwasser zu waschen. Die nachfolgende Kultivierung der Zellen erfolgt abgestimmt auf den Zelltyp unter den üblichen, dem Durchschnittsfachmann auf dem Zellkulturgebiet bekannten Bedingungen. A coating with cross-linked gelatin can, for example, take several hours Incubate the cavities at room temperature with a 0.5% by weight gelatin Solution in water, subsequent removal of the gelatin solution and 15 minutes incubation with a 2 wt .-% glutardialdehyde solution and subsequent incubation with 70 vol% ethanol can be obtained. Before the It is advisable to apply the cell suspension to the cavities wash several times with ultrapure water. The subsequent cultivation of the cells is tailored to the cell type under the usual, the average specialist conditions known in the cell culture field.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Mikrotiterplatte besitzt eine lösbare Verbindung zwischen der Bodenplatte und dem Multiwellaufsatz, die es gestattet nach erfolgter Untersuchung die Bodenplatte vom Multiwellaufsatz ohne Zerstörung der optisch transparenten elektrisch leitfähigen Beschichtung zu entfernen und gegebenenfalls sogar unter Verwendung anders aufgeteilter Multiwellaufsätze für weitere Untersuchungen wieder zur Verfügung zu stellen. A preferred embodiment of the microtiter plate has a detachable one Connection between the base plate and the multiwell attachment, which allows it after the examination, the bottom plate of the multiwell attachment without destruction remove the optically transparent electrically conductive coating and if necessary, even using differently divided multiwell attachments for to make further investigations available again.
An eine derartige lösbare Verbindung sind verschiedene Anforderungen zu stellen. Insbesondere ist eine Kompatibilität des Verbindungsmaterials mit dem zu untersuchenden System gefordert, so darf dieses zum Beispiel bei der Untersuchung lebenden Materials keine Cytotoxizität aufweisen. Eine Wechselwirkung zwischen dem Verbindungsmaterial und dem Untersuchungssystem oder Untersuchungsverfahren ist hingegen unerwünscht. Ferner sollte das Verbindungsmaterial restlos und den Untergrund, das heißt die beschichtete Bodenplatte schonend, ablösbar sein. Generell ist jedwede Art von Verbindungsmaterial, das den obigen Anforderungen genügt einsetzbar. Insbesondere Klebstoffe auf Silikon- beziehungsweise Silikonelastomerbasis haben sich hierbei als geeignet erwiesen. Insbesondere sind flexible, transparente, revisionsresistente Elastomere mit hervorragenden dielektrischen Eigenschaften, hoher Stabilität über einen weiten Temperaturbereich und niedriger Toxizität bevorzugt. Hierunter ist der unter der Bezeichnung Sylgard 184 bei der Dow Corning Corp. (Midland, Michigan, USA) erhältliche Klebstoff besonders geeignet, da er sich insbesondere bei der Untersuchung biologischer Systeme gegenüber den meisten Systemen inert verhält und eine dichte, reversible Verbindung der Bodenplatte mit dem Multiwellaufsatz ermöglicht. Various requirements have to be made of such a releasable connection. In particular, compatibility of the connecting material with the system to be examined is required, for example, it must be free from cytotoxicity when examining living material. However, an interaction between the connecting material and the examination system or examination method is undesirable. Furthermore, the connecting material should be completely and the surface, ie the coated base plate should be removable. In general, any type of connection material that meets the above requirements can be used. In particular, adhesives based on silicone or silicone elastomer have proven to be suitable. In particular, flexible, transparent, revision-resistant elastomers with excellent dielectric properties, high stability over a wide temperature range and low toxicity are preferred. This includes the one under the designation Sylgard 184 at Dow Corning Corp. (Midland, Michigan, USA) available adhesive is particularly suitable because it behaves inertly to most systems, particularly when investigating biological systems, and enables a tight, reversible connection of the base plate to the multiwell attachment.
Der Multiwellaufsatz dient im Wesentlichen zur Unterteilung der Mikrotiterplatte in einzelne Kavitäten und somit zur räumlichen Begrenzung der optisch transparenten Elektrodenfläche der Bodenplatte in einzelne Flächen, die die Böden der jeweiligen Reaktions- bzw. Kultureinheit bilden. Die Wahl des Aufsatzmaterials unterliegt keinen Beschränkungen und kann den Untersuchungsanforderungen gemäß gewählt werden. Insbesondere eigenen sich die bei der Firma Nung (Wiesbaden) erhältlichen Plastik-Aufsätze mit 12, 24, 48, 96 und mehr Wells, die für Bodenplatten des Formats 8,2 cm × 12,45 cm hergestellt werden. Die für die erfindungsgemäßen Mikrotiterplatten verwendbaren Multiwellaufsätze und Bodenplatten können je nach Anforderungen beliebige andere Formate besitzen. The multiwell attachment essentially serves to divide the microtiter plate into individual cavities and thus for the spatial limitation of the optically transparent Electrode surface of the base plate into individual surfaces that cover the floors of each Form reaction or culture unit. The choice of the attachment material is subject to no restrictions and can be according to the examination requirements to get voted. The ones at Nung (Wiesbaden) are particularly suitable Available plastic attachments with 12, 24, 48, 96 and more wells that are used for base plates 8.2 cm × 12.45 cm format. Those for the invention Microtiter plates that can be used are multiwell attachments and base plates depending on Requirements have any other format.
Eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten ist beispielhaft in den
Fig. 1 (Aufsicht), 2 (Seitenansicht) und 3 (perspektivische Darstellung)
dargestellt. Die in Fig. 2 und 3 verwendeten Bezugszeichen besitzen folgende
Bedeutung:
1 Multiwellaufsatz,
2 optisch transparentes elektrisch leitfähiges Material, z. B. ITO,
3 lösbares Verbindungsmaterial, z. B. Sylgard 184 und
4 Bodenplatte aus transparentem Material, z. B. Kunststoff oder Glas.
A microtiter plate according to the invention with 96 cavities is shown by way of example in FIGS. 1 (top view), 2 (side view) and 3 (perspective view). The reference symbols used in FIGS. 2 and 3 have the following meaning: 1 multiwell attachment,
2 optically transparent electrically conductive material, e.g. B. ITO,
3 releasable connecting material, e.g. B. Sylgard 184 and
4 base plate made of transparent material, e.g. B. plastic or glass.
Die Fig. 1 bis 3 sollen nur zur Verdeutlichung der Erfindung dienen. Insbesondere der in Fig. 2 und 3 dargestellte Schichtaufbau aus Bodenplatte, optisch transparentem elektrisch leitfähigem Material und lösbarem Verbindungsmaterial ist nicht als maßstabsgetreu zu betrachten. Figs. 1 to 3 are only intended to illustrate the invention. In particular, the layer structure shown in FIGS. 2 and 3, consisting of a base plate, optically transparent, electrically conductive material and releasable connecting material, is not to be regarded as true to scale.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Messanordnungen des Stands der Technik wird bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf eine coplanare Anordnung der Elektroden verzichtet. Zur Messung wird vielmehr eine zweite Elektrode in der jeweiligen Messkavität platziert. Dazu kann man in alle Kavitäten gleichzeitig je eine individuelle Elektrode eintauchen und mit Hilfe eines Relais zwischen den Elektroden hin und her schalten oder diese auf andere Weise getrennt ansteuern, oder aber man verwendet nur eine einzige Elektrode, die zum Beispiel mittels eines Roboterarms von einer Kavität zur nächsten geführt wird. Die Adressierung der Kavitäten erfolgt somit in beiden Fällen über die Gegenelektrode. Ein wesentlicher Vorteil dieser Anordnung besteht darin, dass in einem Experiment die gesamte Zellmonoschicht erfasst werden kann, so wie dies sonst nur bei den oben beschriebenen Filtersystemen der Fall ist. In contrast to the measuring arrangements of the status of the Technology is based on a coplanar arrangement in the device according to the invention dispensed with the electrodes. Rather, a second electrode is used in the measurement the respective measuring cavity. You can do this in all cavities at the same time Immerse individual electrode and with the help of a relay between the electrodes switch back and forth or control them separately in another way, or else only a single electrode is used, which is, for example, by means of a Robot arm is guided from one cavity to the next. Addressing the In both cases, cavities thus take place via the counter electrode. An essential one The advantage of this arrangement is that the entire Cell monolayer can be detected, as is otherwise only the case with the above described filter systems is the case.
Bei einer typischen Messanordnung dient eine ITO-Beschichtung als Arbeitselektrode und eine Platinelektrode, die in die zu untersuchende Kavität getaucht wird, als Gegenelektrode. Die Aufnahme und Auswertung der Daten kann zum Beispiel mittels des von den Erfindern entwickelten und bei diesen erhältlichen LABView-Programms erfolgen, ist jedoch nicht auf dieses beschränkt. Die Messungen können zum Beispiel in einem wasserdampfgesättigten Inkubator mit einer 5 vol.-%igen CO2-Atmosphäre bei 37°C durchgeführt werden. In a typical measuring arrangement, an ITO coating serves as the working electrode and a platinum electrode, which is immersed in the cavity to be examined, as the counter electrode. The data can be recorded and evaluated, for example, using the LABView program developed by the inventors and available from them, but is not limited to this. The measurements can be carried out, for example, in a steam-saturated incubator with a 5% by volume CO 2 atmosphere at 37 ° C.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung der optischen und elektrischen Parameter an einer Mehrzahl von Untersuchungssystemen, wobei von der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte Gebrauch gemacht wird und wobei sich die jeweiligen Untersuchungssysteme in den Kavitäten der Mikrotiterplatte befinden und während der Untersuchung der elektrischen Eigenschaften die mit einem Messgerät verbundene Gegenelektrode in das jeweilige Untersuchungssystem getaucht wird und vor, während oder nach der Durchführung der Bestimmung des elektrischen Parameters eine optische Untersuchung des gleichen Untersuchungssystems durchgeführt wird. The invention also relates to a method for determining the optical and electrical parameters on a plurality of examination systems, of the microtiter plate according to the invention is used and the respective examination systems are located in the cavities of the microtiter plate and while examining the electrical properties using a measuring device connected counter electrode is immersed in the respective examination system and before, during or after performing the determination of the electrical Parameters an optical examination of the same examination system is carried out.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl für ein bloßes Monitoring, als auch zur Manipulation des zu beobachtenden Systems, wobei beide Möglichkeiten so steuerbar sind, dass sie, je nach zu untersuchenden Parametern sowohl zeitlich getrennt, als auch zeitgleich durchführbar sind. The method according to the invention is suitable for mere monitoring as well also to manipulate the system to be observed, using both options are controllable in such a way that, depending on the parameters to be examined, they are both temporal separately, as well as can be carried out at the same time.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Gegenelektrode eine Einzelelektrode darstellen, die nacheinander in die einzelnen Kavitäten getaucht wird oder ein Elektrodenarray aus individuellen Elektroden, wobei jeder individuellen Elektrode eine Kavität zugeordnet ist und zwischen den einzelnen Elektroden hin und her geschaltet wird. When carrying out the method according to the invention, the counter electrode can represent a single electrode, which is immersed one after the other in the individual cavities is or an electrode array of individual electrodes, each individual A cavity is assigned to the electrode and between the individual electrodes and switched here.
Als mögliche untersuchbare elektrische Parameter kommen zum Beispiel Impedanz, Widerstand und Kapazität bei unterschiedlichen Frequenzen, die transepitheliale Potentialdifferenz, der Kurzschlussstrom (transepitheliale Potentialdifferenz wird kurzgeschlossen), Charge-Transfer-Widerstand in Gegenwart redoxaktiver Marker- Ionen und aus Elektrovoltamogrammen erhältliche Parameter in Frage. Possible electrical parameters that can be examined include, for example, impedance, Resistance and capacitance at different frequencies, the transepithelial Potential difference, the short circuit current (transepithelial potential difference short-circuited), charge transfer resistance in the presence of redox-active marker Ions and parameters available from electro-voltamograms in question.
Die Impedanzspektroskopie ist beispielsweise eine Methode, die es erlaubt verschiedene elektrochemische Eigenschaften eines Systems, so auch funktionelle Parameter einer Zellschicht zu untersuchen. Ein impedanzspektroskopisches Verfahren beruht zum Beispiel auf der Analyse der passiven elektrischen Eigenschaften einer Zellschicht und liefert als Ergebnis insbesondere den elektrischen Widerstand der Zellschicht sowie die Membrankapazität. Außerdem lassen sich auch Änderungen im Bereich des Zell-Substrat-Kontaktes beobachten. For example, impedance spectroscopy is a method that allows it different electrochemical properties of a system, including functional ones To investigate parameters of a cell layer. An impedance spectroscopic The method is based, for example, on the analysis of the passive electrical Properties of a cell layer and, as a result, provides in particular the electrical resistance of the cell layer as well as the membrane capacity. Moreover changes in the area of cell-substrate contact can also be observed.
Impedanzspektroskopische Untersuchungen können zum Beispiel mit einem Impedanzspektrometer SI 1260 der Firma Solartron Instruments durchgeführt werden. Als Messdaten können unter anderem der Betrag der Impedanz und die Phasenverschiebung zwischen Strom und Spannung gemessen werden. Impedance spectroscopic investigations can be carried out, for example, with an SI 1260 impedance spectrometer from Solartron Instruments. Among other things, the magnitude of the impedance and the phase shift between current and voltage can be measured.
Als optische Parameter kommen solche, die über spektroskopische oder photometrische Verfahren und Anordnungen bestimmbar sind, wie zum Beispiel Absorption oder Fluoreszenz, aber auch rein morphologische Parameter, die mit auflicht- oder durchlichtmikroskopischen Verfahren bestimmbar sind in Frage. Detektionseinheit und Einstrahlungsquelle können unterhalb der transparenten Bodenplatte und/oder neben der Gegenelektrode angeordnet sein, je nach dem welcher Parameter zu bestimmen ist. The optical parameters are those that are spectroscopic or photometric methods and arrangements can be determined, such as Absorption or fluorescence, but also purely morphological parameters associated with Incident light or transmitted light microscopic methods can be determined. Detection unit and radiation source can be below the transparent Base plate and / or be arranged next to the counter electrode, depending on the which parameter is to be determined.
Die oben beschriebene Anordnung besitzt den weiteren Vorteil, dass die Konstruktion der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte sehr einfach gehalten werden kann und eine Vorstrukturierung der Mikrotiterplatte mit Gegenelektroden, zum Beispiel im Messkammerboden nicht notwendig ist. Je weniger strukturiert und aufwändig die Bodenplatte konzipiert ist, desto einfacher gestaltet sich deren Reinigung und Wiederverwendung und desto weniger störanfällig erweist sich diese. The arrangement described above has the further advantage that the Construction of the microtiter plate according to the invention can be kept very simple can and a pre-structuring of the microtiter plate with counter electrodes to Example in the measuring chamber floor is not necessary. The less structured and the bottom plate is elaborately designed, the easier it is Cleaning and reuse and the less prone to failure this proves.
Insbesondere bei der Verwendung von Aufsätzen, welche die Mikrotiterplatte in 96 oder mehr Kavitäten unterteilen, würde eine coplanare Anordnung der Elektroden zu einem komplexen Elektrodenlayout führen, bei welchem die Zuleitungen zu den einzelnen Elektroden sehr schmal und damit hochohmig sind, was wiederum in einem schlechten Verhältnis zwischen dem Widerstand der Zellschicht, das heißt dem Signal, und dem Widerstand der Zuleitungen zum Ausdruck kommt. Eine Vergrößerung der Bodenflächen, zum Beispiel durch entsprechende Aufsätze erhöht jedoch den Bedarf an Zellmenge und verschlechtert das Verhältnis zwischen dem Signal und dem Widerstand der Zuleitungen, insbesondere bei besonders niederohmigen Zellschichten. In particular when using attachments which the microtiter plate in 96 or divide more cavities, a coplanar arrangement of the electrodes would be too lead a complex electrode layout, in which the leads to the individual electrodes are very narrow and therefore high-impedance, which in turn results in a bad relationship between the resistance of the cell layer, that is the signal, and the resistance of the leads. A Enlargement of the floor areas, for example increased by appropriate attachments however the need for cell quantity and deteriorates the relationship between that Signal and the resistance of the supply lines, especially when particularly low-resistance cell layers.
Für manche Untersuchung ist es wünschenswert die Elektrodenfläche zu verkleinern, was im Falle der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte einfach durch Aufbringen einer polymeren Isolatorschicht auf Teile der Elektrode erreichbar ist. Wie bereits angesprochen kann durch eine Veränderung der Größe der Elektrodenfläche das Verhältnis zwischen Signal und Zuleitungswiderstand gesteuert werden. So ist die Verkleinerung der Elektrodenfläche besonders bei sehr durchlässigen Zellmonoschichten vorteilhaft. For some examinations it is desirable to close the electrode surface reduce what in the case of the microtiter plate according to the invention simply by Application of a polymeric insulator layer on parts of the electrode is achievable. As already mentioned, changing the size of the Electrode area controlled the ratio between signal and lead resistance become. So the reduction of the electrode area is especially great permeable cell monolayers advantageous.
Eine Abisolierung der Randbereiche der Bodenflächen der einzelnen Kavitäten kann darüber hinaus Messfehler durch Leckströme, wie sie im Kontaktbereich zwischen Zellrasen und Kammerwand auftreten minimieren. Stripping the edge areas of the bottom surfaces of the individual cavities can In addition, measurement errors due to leakage currents, such as those in the contact area between Minimize cell turf and chamber wall occur.
Isolatorschichten können zum Beispiel durch Aufdrucken mittels eines Plotters oder Druckers des Tintenstrahltyps, indem die Tinte durch eine Isolatorlösung mit schnell verdampfendem Lösungsmittel ersetzt wird, aufgebracht werden. Des Weiteren kann in einem zweistufigen Verfahren zunächst eine Komplettbeschichtung mittels Spincoating erfolgen, woran sich eine Strukturierung mittels Photolithographie anschließt. Auf diese Arten lassen sich strukturierte Elektrodenoberflächen und somit verschiedenste Elektrodenlayouts erhalten. So ist es zum Beispiel möglich jeden Kavitätboden durch entsprechende Isolierung in mehrere Elektrodenflächen zu unterteilen und somit Mehrfachbestimmungen durchzuführen. Insulator layers can be printed, for example, by means of a plotter or Printer of the ink jet type by passing the ink through an isolating solution with fast evaporating solvent is replaced. Furthermore, in a two-stage process, first complete coating Spin coating take place, which is followed by structuring by means of photolithography followed. In this way, structured electrode surfaces and thus receive a wide variety of electrode layouts. For example, it is possible each cavity floor through appropriate insulation in several electrode areas subdivide and thus carry out multiple determinations.
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich insbesondere im Bereich eines effektiven High-Throughput-Wirkstoff-Screenings zum Beispiel unter Verwendung von Zellen eines bestimmten Zielgewebes anwenden. The method according to the invention can be used in particular in the area of a using effective high-throughput drug screening, for example of cells of a specific target tissue.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte ist in vielen Fällen eine simultane In-Situ-Bestimmung elektrischer und optischer Parameter für eine Struktur-Funktions-Analyse im Bereich der biochemischen und zellbiologischen Grundlagenforschung erstmals möglich. By the method according to the invention and the microtiter plate according to the invention is a simultaneous in-situ determination of electrical and optical in many cases Parameters for a structure-function analysis in the field of biochemical and Basic cell biological research possible for the first time.
Claims (10)
welches von einer Mikrotiterplatte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 Gebrauch macht und
wobei sich die Untersuchungssysteme in den Kavitäten der Mikrotiterplatte befinden und während der Untersuchung der elektrischen Eigenschaften eine mit einem Messgerät verbundene Gegenelektrode in das jeweilige Untersuchungssystem getaucht wird
und vor, während oder nach der Durchführung der Bestimmung des elektrischen Parameters eine optische Untersuchung des gleichen Untersuchungssystems durchgeführt wird. 7. Method for determining optical and electrical parameters on a plurality of examination systems,
which makes use of a microtiter plate according to one of claims 1 to 6 and
the examination systems being located in the cavities of the microtiter plate and a counter electrode connected to a measuring device being immersed in the respective examination system during the examination of the electrical properties
and an optical examination of the same examination system is carried out before, during or after the determination of the electrical parameter.
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