DE10210312A1

DE10210312A1 - Use of superantigen, preferably staphylococcal enterotoxin, for treatment of bladder carcinoma, stimulates production of antibodies and cytokines

Info

Publication number: DE10210312A1
Application number: DE2002110312
Authority: DE
Inventors: Frank Perabo; Patricia Willert; Andreas Wirger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-03-10
Filing date: 2002-03-10
Publication date: 2003-12-24

Abstract

Use of a composition (A), containing a superantigen (I) as active ingredient and at least one carrier, for treatment of carcinoma of the bladder. ACTIVITY : Cytostatic. Transitional cell carcinoma (TCC) of the bladder was induced in female rats by transurethral instillation of N-methyl-N-nitrosourea (MNU), then animals with superficical TCC were treated by instillation of the staphylococcal superantigen B (SEB) (1 or 10 Microg/ml), 14 weeks after start of treatment with MNU, with 1 application per week for 6 weeks. Two days after the last treatment the bladders were removed for analysis. Only 3 of 14 test animals still had tumors, and all these were apoptotic. Extensive migration of immunologically active cells into the bladder wall and the periphery of the tumor was detected. MECHANISM OF ACTION : (I), which binds specifically to the Vbeta region of the T cell receptor, induces synthesis of cytokines (interferongamma , interleukins 1, 2 and 6, and tumor necrosis factor alpha ); stimulates sproduction of antibodies and causes apoptosis and necrosis of tumor cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were incubated with SEB (1 Microg/ml) for 5-7 hours, then co-cultured with RT12 bladder cancer cells for 12 hours. The rate of apoptosis in treated cells was 419% of that observed when unstimulated PBMC were used.

Description

Das Harnblasenkarzinom ist der 5. häufigste aller malignen Tumore und ist für 2-3% aller humanen Malignome verantwortlich. Die Inzidenz beim Mann wird mit 30 neuen Fällen pro Jahr pro 100 000 Einwohner, bei der Frau mit 8/100 000 angegeben. In der Bundesrepublik bedeutet das rund 16 000 neue Fälle pro Jahr und etwa 5000 Menschen versterben jährlich in der Bundesrepublik tumorbedingt (Hartenstein, 1995). In den letzten Jahrzehnten findet sich eine zunehmende Tendenz der Erkrankung, wobei die Inzidenz in industrialisierten Ländern höher liegt als in nicht industrialisierten. Stadtbewohner erkranken doppelt so oft wie Landbewohner. Das mittlere Alter der Betroffenen liegt zwischen 65-70 Jahren, Männer erkranken im Verhältnis 3 : 1 häufiger als Frauen (Richie et. al., 1985). Bladder cancer is the 5th most common of all malignant tumors and is for 2-3% of all responsible for human malignancies. The incidence in men is 30 new cases per year per 100,000 inhabitants, given as 8/100,000 for women. In the Federal Republic means that around 16,000 new cases a year and about 5,000 people die annually in the Federal Republic due to tumor (Hartenstein, 1995). There has been one in recent decades increasing tendency of the disease, the incidence being higher in industrialized countries lies as in non-industrialized. Urban residents get sick twice as often as rural residents. The average age of those affected is between 65-70 years, men fall ill in the 3: 1 ratio more common than women (Richie et. Al., 1985).

Pathogenesis and stage classification

90% aller Harnblasenkarzinome sind Urothelkarzinome (engl. Transitional cell carcinoma [TCC). In 7% finden sich Plattenepithelkarzinome und in 1% Adenokarzinome, auch vom Urachus ausgehend. Bei Erstdiagnose handelt es sich in 60-70% um oberflächliche, vor allem papilläre Tumore Ta und T1, in ca. 20% findet sich eine oberflächliche Muskelinvasion (T2) und in weiteren 20% tief muskelinvasive Tumore im Stadium T3 und höher (Tab. 2) (UICC, 1992). 85% der Tumore sind zu diesem Zeitpunkt noch auf die Harnblase beschränkt. Die Metastasierung erfolgt lymphogen und hämatogen, bevorzugt in die Lymphknoten des kleinen Beckens sowie Lunge, Leber und Knochen (Hautmann und Huland, 1997). 90% of all bladder cancers are transitional cell carcinomas [TCC). Squamous cell carcinomas are found in 7% and adenocarcinomas in 1%, also from Urachus outgoing. Initial diagnosis is 60-70% superficial, especially papillary tumors Ta and T1, in about 20% there is a superficial muscle invasion (T2) and in a further 20% deep muscle-invasive tumors in stage T3 and higher (Tab. 2) (UICC, 1992). At this point, 85% of the tumors were still restricted to the bladder. The Metastasis occurs lymphogenically and hematogenously, preferably in the lymph nodes of the small one Pelvis, lungs, liver and bones (Hautmann and Huland, 1997).

Die histologische Einteilung in Differenzierungsgrade ("Grading") erfolgt nach zellulären Atypien (Zellkerngröße, Chromatingehalt, Nukleoli) und nach Anzahl der Mitosen (Tab. 2). Der Differenzierungsgrad steht in engem Zusammenhang mit der Infiltrationstiefe, z. B. überwiegt bei einem infiltrierenden Tumor (> T1) der höhere Malignitätsgrad (> G2). Tabelle Stadieneinteilung nach dem UICC (1992), TNM-System

The histological division into degrees of differentiation ("grading") is based on cellular atypia (cell nucleus size, chromate content, nucleoli) and the number of mitoses (Tab. 2). The degree of differentiation is closely related to the depth of infiltration, e.g. B. with an infiltrating tumor (> T1) the higher degree of malignancy (> G2) predominates. Table classification according to the UICC (1992), TNM system

Superficial bladder cancer

Im Stadium Ta G1 beträgt die Progressionsrate 4,4%, Metastasen entwickeln sich in 0,7% (Rübben und Jocham, 1991). In stage Ta G1 the progression rate is 4.4%, metastases develop in 0.7% (Rübben and Jocham, 1991).

Eine Sonderstellung nimmt das Carcinoma in situ (Tis) ein. Es handelt sich dabei um einen nichtinfiltrierenden, intraepithelialen Blasentumor mit meist hohem Malignitätsgrad (G3). In über 80% entwickelt sich aus einem Carcinoma in situ ein invasives Karzinom (Kelley et al., 1985; Mostofi et al., 1956). Die schlechte Abgrenzbarkeit zur Dysplasie, das gleichzeitige Auftreten exophytischer Tumore, fokale oder generalisierte Ausbreitungsform und die Einbeziehung der prostatischen Harnröhre erschweren die Definition dieses Tumorstadiums. Carcinoma in situ (Tis) occupies a special position. It is a non-infiltrating, intraepithelial bladder tumor with mostly high degree of malignancy (G3). In Over 80% of carcinomas develop invasive carcinoma in situ (Kelley et al., , 1985; Mostofi et al., 1956). Poor delimitation to dysplasia, the simultaneous Occurrence of exophytic tumors, focal or generalized form of spread and the Inclusion of the prostatic urethra complicates the definition of this stage of the tumor.

Besondere Bedeutung hat aufgrund der schlechten Differenzierung der T1 G3-Tumor. In diesem Stadium ist die Basalmembran bereits durchbrochen. Die Progressionsrate und/oder das Auftreten von Metastasen beträgt 25%-30% (Anderström et al., 1980). Due to the poor differentiation of the T1 G3 tumor is particularly important. In this Stage the basement membrane is already broken. The progression rate and / or that Occurrence of metastases is 25% -30% (Anderström et al., 1980).

Ungefähr 2/3 aller Harnblasenkarzinome treten als oberflächliche oder als oberflächlich infiltrierende Urothelzellkarzinome (pTa, pT1, Tis) auf. Die Rezidivrate beträgt 70%-80%, dies insbesondere in den ersten Jahren nach der transurethralen Resektion (Haaff, 1986). Approximately 2/3 of all bladder cancers occur as superficial or as superficial infiltrating urothelial cell carcinomas (pTa, pT1, Tis). The recurrence rate is 70% -80%, this especially in the first years after transurethral resection (Haaff, 1986).

Die initiale Behandlung von oberflächlichen Blasentumoren ist die transurethrale Resektion des Tumors, ggf. mit Quadranten-PE, ggf. mit einer anschließenden Nachresektion bei nicht gesicherter vollständiger Tumorentfernung im Gesunden. Auch nach vollständiger und histologisch gesicherter Resektion aller Tumoranteile führt die Erkrankung bei bis zu 2/3 aller Patienten zum Rezidiv (Rübben, 2000). The initial treatment for superficial bladder tumors is the transurethral resection of the Tumor, if necessary with quadrant PE, if necessary with a subsequent resection if not assured complete tumor removal in healthy people. Even after complete and histologically confirmed resection of all tumor parts leads to up to 2/3 of the disease Patients for relapse (Rübben, 2000).

Die Rezidivhäufigkeit, aber auch die Progressions- und Überlebensraten zeigen dabei eine enge Abhängigkeit von der Infiltrationstiefe (T-Stadium) und dem Differenzierungsgrad (G) des Tumors. Die Überlebensraten von Patienten mit einem nichtinvasiven, gut differenzierten Tumor (Ta) weisen sehr gute Überlebensraten auf: 99,3% dieser Patienten überleben metastasenfrei 5 Jahre, Ta G1-2 Tumore führen in weniger als 1% zur Metastasierung. Infiltriert ein gut differenzierter Tumor in die Basalmembran verschlechtert sich die 5-Jahre-Überlebensrate bereits auf 81%, die Metastasierungshäufigkeit liegt bei 14%. Eine ungünstige Prognose zeigen Patienten mit schlecht differenzierten (G3-4) T1 Karzinomen Die Progressionsrate und/oder das Auftreten von Metastasen betragen 25%-30% (Anderström, 1980). Eine weitere Hochrisikogruppe beinhaltet Patienten mit einem Carcinoma in situ (CIS), in über 80% entwickelt sich aus einem Carcinoma in situ ein invasives Karzinom (Mostofi, 1956, Kelley, 1985). Tabelle 3 5-Jahre-Überlebensrate, Metastasierungsneigung und Progression oberflächlicher Tumoren in Abhängigkeit von T-Stadium und Differenzierung (n. Rübben, 1991)

The recurrence rate, but also the progression and survival rates show a close dependence on the depth of infiltration (T stage) and the degree of differentiation (G) of the tumor. The survival rates of patients with a non-invasive, well-differentiated tumor (Ta) show very good survival rates: 99.3% of these patients survive 5 years without metastases, Ta G1-2 tumors lead to metastasis in less than 1%. If a well-differentiated tumor infiltrates the basement membrane, the 5-year survival rate already deteriorates to 81%, and the frequency of metastasis is 14%. Patients with poorly differentiated (G3-4) T1 carcinomas show an unfavorable prognosis. The progression rate and / or the occurrence of metastases are 25% -30% (Anderström, 1980). Another high-risk group includes patients with carcinoma in situ (CIS), invasive carcinoma develops from carcinoma in situ in over 80% (Mostofi, 1956, Kelley, 1985). Table 3 5-year survival rate, tendency to metastasis and progression of superficial tumors depending on the T stage and differentiation (n. Rübben, 1991)

Therapy of superficial bladder cancer

Um das Auftreten eines Rezidiv zu verhindern bzw. zu verzögern und um einer Tumorprogression vorzubeugen, wird eine adjuvante intravesikale Instillationstherapie durchgeführt. Alle oberflächlichen Harnblasentumore, insbesondere Tis und T1 G3-Tumore sowie bei prognostischen Risikofaktoren wie multifokales Auftreten, Größe und Rezidivtumor, sollten mit einer adjuvanten intravesikalen Instillationstherapie behandelt werden. Eine Ausnahme stellen kleine, primäre, solitäre pTa G1-Tumoren dar. Die Rezidivrate oder Progression dieser Tumoren beträgt deutlich weniger als 5%. Zytologische und zystoskopische Nachkontrollen sind in diesem Fall ausreichend (Morrison, 1984). To prevent or delay the occurrence of a recurrence and to prevent it Preventing tumor progression becomes adjuvant intravesical instillation therapy carried out. All superficial bladder tumors, especially Tis and T1 G3 tumors as well as prognostic risk factors such as multifocal occurrence, size and relapse tumor, should be treated with adjuvant intravesical instillation therapy. A Small, primary, solitary pTa G1 tumors are an exception. The relapse rate or The progression of these tumors is significantly less than 5%. Cytological and cystoscopic Follow-up checks are sufficient in this case (Morrison, 1984).

Zur Installationsbehandlung stehen verschiedene Chemotherapeutika (u. a. Thiotepa, Mitomycin- C und Doxorubicin) als auch Immuntherapeutika, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Interferon oder Interleukin zur Verfügung. Der Hauptvorteil der intravesikalen Instillationstherapie ist die geringe systemische Resorption bei gleichzeitig optimalem Kontakt zwischen Therapeutikum und Tumor bei hoher lokaler Dosis. Various chemotherapy drugs are available for installation treatment (including thiotepa, mitomycin C and doxorubicin) as well as immunotherapeutics such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Interferon or interleukin available. The main advantage of intravesical Instillation therapy is the low systemic absorption combined with optimal contact between therapeutic agent and tumor at high local dose.

thiotepa

Molekulargewicht 189, hohe Absorption und systemische Toxizität (Myelosuppression). Die kompletten Remissions-Raten für Thiotepa liegen zwischen 35%-55%. Patienten mit einem G1-Tumor scheinen besonders von diesem Medikament zu profitieren (Lutzeyer, 1982, Prout, 1983; Koontz, 1984). Molecular weight 189, high absorption and systemic toxicity (myelosuppression). The complete remission rates for thiotepa are between 35% -55%. Patient with a G1 tumors seem to benefit particularly from this drug (Lutzeyer, 1982, Prout, 1983; Koontz, 1984).

doxorubicin

Hohes Molekulargewicht 580, selten Absorption und systemische Toxizität. Als Nebenwirkung treten in bis zu 25% aller behandelten Patienten chemische Zystitis und vereinzelt allergische Reaktionen auf. Die Raten für komplette Remission betragen für das Carcinoma in situ bis ca 70% (Jakse, 1984). Für Ta und T1-Tumore (ohne vorangehende Resektion) finden sich in der Literatur unterschiedliche Angaben, es werden komplette Remissionen von 20% (Nijima, 1978) bis 70% (Edsmyr, 1980) beschrieben. Bei der Chemorezidivprophylaxe wird die Rezidivrate des Tumors mit 30% beschrieben (Nijima, 1983). High molecular weight 580, rare absorption and systemic toxicity. As a side effect Chemical cystitis and isolated allergies occur in up to 25% of all treated patients Reactions to. The rates for complete remission for the carcinoma in situ are up to approx 70% (Jakse, 1984). For Ta and T1 tumors (without previous resection) are found in the Literature different information, there are complete remissions of 20% (Nijima, 1978) to 70% (Edsmyr, 1980). In the case of chemoreceptive prophylaxis, the relapse rate of the Tumors described with 30% (Nijima, 1983).

Mitomycin-C

Molekulargewicht 329, minimale Absorption. Selten tritt eine Myelosuppresion auf. Als Nebenwirkung treten chemische Zystitis (17,6%) und allergische Reaktionen (4,7%) auf. Komplette Remission wurde für das Carcinoma in situ in 42%, für Ta und T1-Tumore (ohne vorangehende Resektion) in 38% erzielt (Soloway, 1984). Bei der Chemorezidivprophylaxe wird die Rezidivrate des Tumors mit 7% dargestellt (Huland, 1984). Molecular weight 329, minimal absorption. Myelosuppression rarely occurs. As Side effects include chemical cystitis (17.6%) and allergic reactions (4.7%). Complete remission was observed for the carcinoma in situ in 42%, for Ta and T1 tumors (without previous resection) was achieved in 38% (Soloway, 1984). With chemorezidiv prophylaxis the recurrence rate of the tumor is shown at 7% (Huland, 1984).

Interferon / interleukin-2

Limitierte klinische Studien weisen auf einen potentiellen Erfolg bei der intravesikalen Instillationstherapie hin. Es liegen jedoch keine Langzeitergebnisse vor, zudem ist eine effektive Rezidivprophylaxe nicht nachgewiesen (Rübben, 2000). Limited clinical trials indicate potential success in intravesical Instillation therapy. However, there are no long-term results and an effective one Relapse prevention not proven (Rübben, 2000).

Bacillus Calmette-Guerin (BCG)

Im Jahre 1904 isolierte A. Nocard von einer Kuh mit tuberkulöser Mastitis ein Mycobakterium bovis. Calmette und Guerin passagierten die Kultur unter Zugabe von Rindergallenflüssigkeit über Jahre bis eine Avirulenz nachgewiesen werden konnte (Guerin, 1957). Dieser spezielle Mycobakterium bovis-Stamm wurde als Bacillus von Calmette und Guerin (BCG) bezeichnet. Der Anti-Tumor-Effekt des Tuberkulose-Erregers ist seit 1929 bekannt, damals wurde bei Autopsien festgestellt, daß bei Patienten mit florider Tuberkulose nur äußerst selten gleichzeitig maligne Tumorerkrankungen vorlagen (Pearl, 1929). Holmgren therapierte Patienten mit Tuberkulin und/oder BCG und berichteten über deutliche Tumorremissionen (Holmgren, 1935). In 1904 A. Nocard isolated a mycobacterium from a cow with tubercular mastitis bovis. Calmette and Guerin passaged the culture with the addition of bovine bile for years until avirulence could be demonstrated (Guerin, 1957). That special one Mycobacterium bovis strain was named Bacillus by Calmette and Guerin (BCG). The anti-tumor effect of the tuberculosis pathogen has been known since 1929, when Autopsies found that patients with florid tuberculosis are extremely rare at the same time malignant tumor diseases were present (Pearl, 1929). Holmgren treated patients with Tuberculin and / or BCG and reported significant tumor remissions (Holmgren, 1935).

Nach ausgedehnten tierexperimentellen Vorarbeiten berichteten Morales et al. 1976 erstmals über die intravesikale Immuntherapie des oberflächlichen Blasenkarzinoms des Menschen. Hierzu instillierte Morales bei Patienten mit einem Harnblasenkarzinom, gelöstes BCG in die Blase (Morales, 1976). Diese ersten erfolgversprechenden Daten konnten in der Folgezeit von vielen Arbeitsgruppen bestätigt werden. Große multizentrische Studiengruppen wie die Southwest Oncology Group (SWOG) in den USA, die European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) und viele lokale Studien trugen dazu bei die Rolle der BCG- Immuntherapie zu bestimmen und die Behandlungsergebnisse zu verbessern, so daß heute die BCG-Therapie des oberflächlichen Harnblasenkarzinoms weltweiter Standard ist (Böhle und Jocham, 1998). After extensive preliminary animal experiments, Morales et al. 1976 for the first time about intravesical immunotherapy for superficial bladder cancer in humans. For this purpose, Morales instilled BCG in the patients with a bladder carcinoma Bubble (Morales, 1976). These first promising data could subsequently be obtained from many working groups are confirmed. Large multicenter study groups like that Southwest Oncology Group (SWOG) in the USA, the European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) and many local studies contributed to the role of BCG- To determine immunotherapy and to improve the treatment results, so that today BCG therapy of superficial bladder cancer is the worldwide standard (Böhle and Jocham, 1998).

Die Mechanismen, über welche BCG die anti-Tumor-Wirkung vermittelt, sind dennoch im Detail unklar. Die Wirkung scheint teils in spezifischen (B- und T-Zell-Aktivierung), teils in unspezifischen immunologischen Zellantworten begründet zu sein sowie eines direkt BCG- zytotoxischen Effektes (Davies, 1982; El-Demiry, 1987; Cozzolino, 1987; Böhle, 1990). Neuere Arbeiten deuten auf einen T-Zell-abhängigen Mechanismus der BCG-Tumor-Interaktion hin (Ratliff, 1987). Durch die T-Zell-Aktivierung erfolgt der Ablauf der Zytokinkaskade mit Sekretion von Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-6, Interferon-γ und TNF-α (Böhle, 1990; De Boer, 1992, Prescott, 1990). The mechanisms by which BCG mediates the anti-tumor effect are still in the Unclear detail. The effect appears partly in specific (B and T cell activation), partly in non-specific immunological cell responses as well as a direct BCG- cytotoxic effect (Davies, 1982; El-Demiry, 1987; Cozzolino, 1987; Böhle, 1990). newer Work suggests a T cell-dependent mechanism of BCG-tumor interaction (Ratliff, 1987). Through the activation of the T cell, the cytokine cascade also occurs Secretion of interleukin-1, interleukin-2, interleukin-6, interferon-γ and TNF-α (Böhle, 1990; De Boer, 1992, Prescott, 1990).

Die Behandlung mit diesen Medikamenten geht dennoch oft mit zahlreichen Nebenwirkungen einher. Die Nebenwirkungen einer intravesikalen BCG-Instillation sind vielfältig, Lamm untersuchte die Daten von 1278 Patienten, welche BCG-Instillationen erhalten hatten. Bei bis zu 90% aller Patienten traten Zystitis-ähnliche Beschwerden auf. U. a. traten auf: Hämaturie (45%), Fieber (27%), Krankheitsgefühl (24%) und Übelkeit (8%) (Lamm, 1986). Bei 5% der Patienten werden schwere Komplikationen beobachtet, hierbei kann es notwendig werden, eine antituberkulotische Therapie durchzuführen. Insgesamt sind bisher unter BCG-Therapie 7 Todesfälle aufgetreten (Lamm, 1992). Die Nebenwirkungsrate von BCG ist gegenüber den Chemotherapeutika deutlich höher (> 90% bei BCG versus 25% bei Doxorubicin, 17,6% bei Mitomycin-C) (Crawford, 1986, Witjes, 1991). However, treatment with these drugs often comes with numerous side effects associated. The side effects of an intravesical BCG instillation are varied, lamb examined the data from 1278 patients who had received BCG instillations. At up to 90% of all patients experienced cystitis-like complaints. Among others occurred: hematuria (45%), Fever (27%), feeling sick (24%) and nausea (8%) (Lamm, 1986). In 5% of the patients If serious complications are observed, it may be necessary to perform antituberculotic therapy. A total of 7 are currently under BCG therapy Deaths have occurred (Lamm, 1992). The side effect rate of BCG is compared to that Chemotherapy drugs significantly higher (> 90% for BCG versus 25% for doxorubicin, 17.6% for Mitomycin-C) (Crawford, 1986, Witjes, 1991).

Die klinischen Resultate der intravesikalen Instillationstherapie und Rezidivprophylaxe sind gut, auch wenn manche Tumore nicht auf diese Therapie ansprechen. Die Raten der kompletten Remission betragen von 64% (Carcinoma in situ) -83% (Ta, T1) (Brosman, 1982, Brosman, 1985, Witjes, 1993). Die BCG-Instillation sowie die Chemotherapeutikainstillation mit Mitomycin-C und Doxorubicin sind annähernd äquieffektiv (Witjes, 1991). Die Wirksamkeit einer BCG-Therapie ist in manchen Fällen abhängig vom verwendeten BCG-Stamm. Der Vorteil einer intravesikalen BCG-Instillationstherapie gegenüber der intravesikalen Instillationen von Chemotherapeutika sind u. a. langjährige Erfahrung, gesicherte Therapieresultate und niedrigere Kosten (Debruyne, 1993, Witjes; 1993; Bouffioux, 1995). Tabelle 4 Komplette Remission des Carcinoma in situ nach intravesikaler Therapie (n. Rübben, 1991)

Tabelle Phase III Studien zur Rezidivprophylaxe durch intravesikale Chemo- bzw. Immuntherapie (n. Rübben, 1991)

The clinical results of intravesical instillation therapy and relapse prevention are good, even if some tumors do not respond to this therapy. The rates of complete remission are from 64% (carcinoma in situ) -83% (Ta, T1) (Brosman, 1982, Brosman, 1985, Witjes, 1993). BCG instillation and chemotherapeutic instillation with mitomycin-C and doxorubicin are approximately equieffective (Witjes, 1991). The effectiveness of BCG therapy depends in some cases on the BCG strain used. The advantages of an intravesical BCG instillation therapy compared to the intravesical instillation of chemotherapeutic drugs include many years of experience, reliable therapy results and lower costs (Debruyne, 1993, Witjes; 1993; Bouffioux, 1995). Table 4 Complete remission of carcinoma in situ after intravesical therapy (n. Rübben, 1991)

Table Phase III studies on relapse prevention through intravesical chemotherapy or immunotherapy (n. Rübben, 1991)

Prognosis of superficial bladder cancer

Wichtigste Prognosekriterien beim Harnblasenkarzinom für ein Tumorrezidiv bzw. eine Progression der Erkrankung sind das Tumorstadium und der Differenzierungsgrad (Tabelle 6). Tabelle 5-Jahres-Überlebensrate beim Urothelkarzinom der Harnblase (OSP Bonn, 1997)

The most important prognostic criteria for bladder cancer for tumor recurrence or disease progression are the tumor stage and the degree of differentiation (Table 6). Table 5-year survival rate in bladder urothelial carcinoma (OSP Bonn, 1997)

superantigen Staphylococcal enterotoxin B / SEB

Superantigene werden von vielen verschiedenen Pathogenen produziert, darunter Bakterien, Mykoplasmen und Viren. Die Staphylokokken Enterotoxine sind eine Gruppe von Proteinen, die von Staphylokokkus aureus exprimiert werden und zur Familie der Superantigene gehören. Diese Proteine haben die Fähigkeit, an menschliche und murine Histokompatibilitätsfaktoren (MHC) zu binden. Die Superantigene binden an die seitliche Oberfläche sowohl des MHC-II- Moleküls als auch der Vβ-Region des αβT-Zell-Rezeptors der Lymphozyten. Diese Bindung kann an eine oder mehrere der verschiedenen Vβ-Regionen erfolgen, diese Art der Anregung ist nicht spezifisch und führt zu einer maximalen T-Zell-Proliferation sowie massiven Produktion von Zytokinen. Superantigens are produced by many different pathogens, including bacteria, Mycoplasma and viruses. The staphylococcal enterotoxins are a group of proteins that from Staphylococcus aureus and belong to the family of superantigens. These proteins have the ability to target human and murine histocompatibility factors (MHC) tie. The superantigens bind to the lateral surface of both the MHC-II Molecule as well as the Vβ region of the αβT cell receptor of the lymphocytes. This bond can be done to one or more of the different Vβ regions, this is kind of stimulation not specific and leads to maximum T cell proliferation and massive production of cytokines.

Immunological importance and mechanism of action

Die Reaktion auf Superantigene betrifft hauptsächlich CD4 und CD8-T-Zellen. In bestimmten Fällen (Toxic Shock Syndrom, ausgelöst durch Staphylokokken Toxin) steigt die Prozentzahl der stimulierten peripheren T-Zellen mit der Vβ-Region um das 5-fache. Hierbei wird u. a. eine starke Erhöhung von Interferon-γ, IL-1, IL-2, IL-6 und TNF-α beobachtet (Kappler, 1989; Marrack, 1990). Die von T-Lymphozyten sezernierten Zytokine stimulieren nicht nur die allgemeine Antikörperproduktion, sondern auch über Interferon-γ die B-Zell-induzierte Immunglobulinproduktion (Martich, 1993; Marrack, 1994). The response to superantigens mainly affects CD4 and CD8 T cells. In particular Cases (Toxic Shock Syndrome, triggered by staphylococcal toxin) the percentage of stimulated peripheral T cells with the Vβ region 5-fold. Here u. a. a strong increase in interferon-γ, IL-1, IL-2, IL-6 and TNF-α was observed (Kappler, 1989; Marrack, 1990). The cytokines secreted by T lymphocytes not only stimulate the general antibody production, but also via interferon-γ which induced the B cell Immunoglobulin production (Martich, 1993; Marrack, 1994).

Carswell et. al. zeigten, daß ein Faktor, später als TNF identifiziert, durch Endotoxin induziert wird und zu einer hämorrhagischen Nekrose des Tumors führt. Die Mechanismen scheinen sowohl auf direkte zytotoxische und zytostatische Aktivität von TNF, als auch über die Suppression und Zytolyse von transformierten Zellen durch aktivierte Makrophagen zurückzuführen sein (Carswell, 1975, Glazier, 1995). Carswell et. al. showed that a factor later identified as TNF was induced by endotoxin and leads to hemorrhagic necrosis of the tumor. The mechanisms seem both on direct cytotoxic and cytostatic activity of TNF, as well as on the Suppression and cytolysis of transformed cells by activated macrophages be attributed (Carswell, 1975, Glazier, 1995).

Clinical use and therapy results for tumor diseases

Die Anwendung der Endotoxine beschränkte sich hauptsächlich auf die experimentelle Untersuchung des septischen Schocks und dessen Abläufen an menschlichen und Tiermodellen (Martich, 1993). Prinzipiell ist darüber hinaus bekannt, daß Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) in vitro und in vivo zytotoxische T Zellen aktivieren kann und diese MHC II positive Tumorzellen (Leukämie) lysieren können (Hedlund, 1993). Diese Tatsache wird bei der Immuntherapie von verschiedenen malignen Tumoren genutzt. Um eine T-Zell basierte Therapie zu entwickeln, wurde das Superantigen Staphylokokken Enterotoxin A durch genetische Fusion mit einem Fab Fragment eines monoklonalen Antikörpers gegen Kolonkarzinome tumorspezifisch aktiviert (Dohlsten, 1995; Hansson, 1997). Das Prinzip der Fusion Proteins (Verbindung von Superantigen mit monoklonalem Antikörper) wurde inzwischen bei mehreren Tumorentitäten geprüft (Lando, 1995; Nielsen, 2000; Alpaugh, 1998; Rosendahl, 1998; Giatonio, 1997). The use of endotoxins was mainly limited to experimental ones Investigation of the septic shock and its processes on human and animal models (Martich, 1993). In principle, it is also known that staphylococcal enterotoxin A (SEA) can activate cytotoxic T cells in vitro and in vivo and these MHC II positive Lysing tumor cells (leukemia) (Hedlund, 1993). This fact is reflected in the Immunotherapy used by various malignant tumors. To be a T cell based To develop therapy, the superantigen Staphylococcal Enterotoxin A was developed genetic fusion with a Fab fragment of a monoclonal antibody against Colon cancer is activated in a tumor-specific manner (Dohlsten, 1995; Hansson, 1997). The principle of Fusion Proteins (combination of superantigen with monoclonal antibody) was meanwhile examined for several tumor entities (Lando, 1995; Nielsen, 2000; Alpaugh, 1998; Rosendahl, 1998; Giatonio, 1997).

apoptosis

Der apoptotische Zelltod entspricht einem physiologischen Prozeß, der der Eliminierung unerwünschter, funktionell gestörter oder mutierter Zellen innerhalb des Gesamtindividuums dient. Bei der Apoptose bleibt die Funktionalität und Integrität des Zellverbandes erhalten. Apoptotic cell death corresponds to a physiological process, that of elimination unwanted, functionally disturbed or mutated cells within the total individual serves. In the case of apoptosis, the functionality and integrity of the cell structure is preserved.

Fas / Fas ligand system

Die Induktion des Zelltodes wird über eine Familie von Zelloberflächenrezeptoren vermittelt, die bisher untersuchten Rezeptoren der TNF-Familie sind CD95 (Fas, APO-1), TNFR1, TNFR2, DR-3, HVEM und CAR1. Die Mechanismen der Signalübermittlung, über welche nach Fas- Aktivierung (Oligomerisierung der zytoplasmatischen Region) der Zelltod induziert wird sind nur teilweise bekannt. Aber es gibt Hinweise, daß die Apoptose, welche über Fas und TNFR1 induziert wird, einen gemeinsamen Mechanismus beinhaltet. Beide Rezeptoren tragen intrazytoplasmatische Regionen, die DD (death domain) genannt werden. Die Aktivierung erfolgt durch spezifische Interaktion durch aktivierten Fas-Rezeptor nach Fas-Ligand-Bindung (z. B. durch zytotoxische T-Lymphozyten). Die death domain für den Fas-Rezeptor entspricht teilweise auch der des TNFR1 (Thompson et al., 1995; Nagata, 1997; Rokhlin et al., 1997; Wallach et al., 1997). The induction of cell death is mediated through a family of cell surface receptors that Receptors of the TNF family investigated so far are CD95 (Fas, APO-1), TNFR1, TNFR2, DR-3, HVEM and CAR1. The mechanisms of signal transmission via which Activation (oligomerization of the cytoplasmic region) which induces cell death only partially known. But there is evidence that apoptosis, which occurs via Fas and TNFR1 is induced involves a common mechanism. Both receptors carry intracytoplasmic regions called DD (death domain). The activation takes place through specific interaction by activated Fas receptor after Fas ligand binding (e.g. by cytotoxic T lymphocytes). The death domain for the Fas receptor corresponds partly also that of TNFR1 (Thompson et al., 1995; Nagata, 1997; Rokhlin et al., 1997; Wallach et al., 1997).

Letztlich führt das zentrale apoptotische Signal zu einer Aktivierung der ICE/CED-3-Proteasen- Familie (Interleukin-1β converting enzyme; cell death protein). Insgesamt setzt sich diese Familie aus 10 verschiedenen Proteasen (Cystein Proteasen, Caspasen) zusammen. Die ICE- Familie ist maßgeblich am Ablauf der apoptotischen Signalübertragung beteiligt, eine Hemmung von Caspase-1 (auch: ICE) oder- 3 (CPP32, Yama, Apopain) blockiert die Fas und TNF- abhängige Apoptose. Im weiteren Verlauf des apoptotischen Signaling kommt es an der Membran des Kerns, des endoplasmatischen Retikulums sowie der Mitochondrien zu Veränderung an der Bcl-2/CED-9-Familie. Da die Induktion der Apoptose an die Expression spezifischer Gene gebunden ist, sind neben den oben beschriebenen signalübertragenden Faktoren die nukleären Zielgene und die entsprechenden nukleären Proteine, welche als Transkriptionsfaktoren fungieren, von Bedeutung. Die Funktion des Tumorsuppressorgens und Transkriptionsfaktors p53 ist in diesem Zusammenhang ebenfalls als signalübermittelnder Faktor nachgeschalteter apoptosespezifischer Gene zu sehen (Colatta, 1992). Letztlich wird die Apoptose durch Freisetzung von Endonukleasen eingeleitet, die zur DNS-Schädigung führt. Ultimately, the central apoptotic signal activates the ICE / CED-3 proteases. Family (Interleukin-1β converting enzyme; cell death protein). Overall, this continues Family composed of 10 different proteases (cysteine proteases, caspases). The ICE Family is significantly involved in the process of apoptotic signal transmission, an inhibition from Caspase-1 (also: ICE) or- 3 (CPP32, Yama, Apopain) blocks the Fas and TNF- dependent apoptosis. In the further course of apoptotic signaling, it comes to the Membrane of the nucleus, the endoplasmic reticulum and the mitochondria Change in the Bcl-2 / CED-9 family. Since the induction of apoptosis is related to expression specific genes are bound in addition to the signal-transmitting described above Factors the nuclear target genes and the corresponding nuclear proteins, which as Transcription factors act, important. The function of the tumor suppressor gene and In this context, transcription factor p53 is also a signal-transmitting factor downstream apoptosis-specific genes can be seen (Colatta, 1992). Ultimately, the Apoptosis initiated by the release of endonucleases, which leads to DNA damage.

Scientific rationales

Die intravesikale Instillationsbehandlung mit BCG besteht nun schon seit 19 Jahren. Grundsätzlich hat sich außer Modifikationen der Dosis, der Therapieintervalle und des Einsatzes verschiedener BCG-Stämme in diesem Zeitraum keine wesentliche Änderung dieser Therapieform ergeben. Die Nebenwirkungsrate dieser Therapie ist hoch und erscheint in manchen Fällen nicht tolerabel. Auch der Einsatz von Chemotherapeutika zur intravesikalen Instillationstherapie und Prophylaxe erbrachte beim oberflächlichem Harnblasenkarzinom keine signifikante Verbesserung der Therapieresultate. Intravesical instillation treatment with BCG has been in existence for 19 years. Basically there have been modifications of the dose, the therapy intervals and the use various BCG strains did not change significantly during this period Form of therapy result. The side effect rate of this therapy is high and appears in not tolerable in some cases. Also the use of chemotherapy drugs for intravesical Instillation therapy and prophylaxis did not result in superficial bladder cancer significant improvement in therapy results.

Deshalb erscheint die Prüfung eines neuen Therapieansatzes und eines aktuellen Immunmodulatoren sinnvoll. Therefore, the examination of a new therapy approach and a current one appears Immunomodulators make sense.

Während die BCG-vermittelte T-Lymphozytenaktivierung vermutlich über eine Bindung an den variablen Anteil des Rezeptors erfolgt, wird die Aktivierung der T-Lymphozyten durch Enterotoxin als Superantigen, durch die Bindung am Vβ-Anteil des Rezeptors bewirkt. Es kann daher angenommen werden, daß dieser Effekt zu einer ausgeprägten Zytokinexpression und somit stärkeren immunologischen Stimulierung und anti-Tumoraktivität führt. While BCG-mediated T lymphocyte activation is believed to bind to the variable portion of the receptor occurs, the activation of the T lymphocytes by Enterotoxin as a superantigen, caused by binding to the Vβ portion of the receptor. It can therefore, it is believed that this effect leads to pronounced cytokine expression and thus leading to stronger immunological stimulation and anti-tumor activity.

Daraus ergaben sich folgende Fragestellungen:

1. 1. Welche Zeit/Dosis-Beziehung induziert bei der Superantigen-Behandlung von PBMC die Aktivierung von Fas-Ligand Expression und Zytokin-Ausschüttung?
2. 2. Kann in Co-Kultur-Experimenten nachgewiesen werden, ob diese aktivierten PBMC funktionell wirksam sind, d. h. zur Apoptose in Harnblasenkarzinomzellen führt?
3. 3. Ist in einem Harnblasentumor-Tiermodell der Ratte eine Superantigenbehandlung in Form einer intravesikalen Instillationen mit vertretbarer Toxizität durchführbar?
4. 4. Führt die intravesikale Instillationsbehandlung mit Superantigen beim oberflächlichen Harnblasenkarzinom der Ratte zu einer Tumorreduktion?
5. 5. Induziert eine Superantigen-Behandlung Apoptose im Blasentumor der Ratte?
6. 6. Kann im Urothel der Harnblase der Ratte eine vermehrte Leukozyteninvasion nachwiesen werden und wo ist diese lokalisiert?

This resulted in the following questions:

1. 1. Which time / dose relationship induces the activation of Fas ligand expression and cytokine release in the superantigen treatment of PBMC?
2. 2. Can it be demonstrated in co-culture experiments whether these activated PBMC are functionally effective, ie lead to apoptosis in bladder carcinoma cells?
3. 3. Can a superantigen treatment in the form of intravesical instillations with acceptable toxicity be carried out in a rat bladder tumor animal model?
4. 4. Does intravesical instillation treatment with superantigen lead to tumor reduction in superficial bladder carcinoma of the rat?
5. 5. Does superantigen treatment induce apoptosis in the bladder tumor of the rat?
6. 6. Can an increased leukocyte invasion be detected in the urothelium of the rat urinary bladder and where is it located?

cell

Es wurden Harnblasenkarzinom-Zellinien RT4, RT112, T24 und TCCSUP der American Type Culture Collection (ATCC) verwendet. Kulturbedingungen: 37°C, 100% relative Luftfeuchtigkeit, 95% Raumluft, 5% CO₂. Alle Zellinen werden in RPMI 1640 Medium (+10% FKS, nicht-essentielle Aminosäuren, Glutamin, Vitamine, Streptomycin, Penicillin, Amphotericin B) in Kultur gehalten. Die Charakteristika der Zellinien sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle Charakteristika und Kulturbedingungen der eingesetzten Zellinien (Hepburn, 1983)

Bladder carcinoma cell lines RT4, RT112, T24 and TCCSUP from the American Type Culture Collection (ATCC) were used. Culture conditions: 37 ° C, 100% relative humidity, 95% indoor air, 5% CO ₂ . All cellines are kept in culture in RPMI 1640 medium (+ 10% FCS, non-essential amino acids, glutamine, vitamins, streptomycin, penicillin, amphotericin B). The characteristics of the cell lines are shown in Table 7. Table characteristics and culture conditions of the cell lines used (Hepburn, 1983)

Supernatants from cell cultures

Zur Untersuchung der Zellkulturüberstände im ELISA wurden bei PBMC nach Co-Kultur bei genau definierter Zellzahl 1 ml des Kulturmedium entnommen und bei -80°C eingefroren. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte nach Waschen, Trypsinieren und Zentrifugieren (wie unter 2.2.1) beschrieben. Anschliessend wurde die Zellsuspension im Verhältnis 1 : 1 (50 µl) mit Trypan-Blau-Lösung vermischt. Avitale Zellen mit defekter Zellmembran inkorporieren den Farbstoff und stellen sich im Mikroskop als blau gefärbt dar. Die Zellzahl wurde in der Neubauer Zählkammer bestimmt und auf die entsprechende Verdünnung hochgerechnet. To examine the cell culture supernatants in the ELISA, PBMC was used after co-culture 1 ml of the culture medium is taken from a precisely defined number of cells and frozen at -80 ° C. The The cell number was determined after washing, trypsinizing and centrifuging (as under 2.2.1). The cell suspension was then added in a ratio of 1: 1 (50 µl) Trypan blue solution mixed. Avital cells with a defective cell membrane incorporate the Dye and appear in the microscope as colored blue. The cell count was in the Neubauer Counting chamber determined and extrapolated to the corresponding dilution.

Flow cytometry with FACS Fluorescence-activated cell sorter

Ein "Fluoreszencence activated cell-sorter (FACS)" kann sowohl zur Analyse als auch zur Auftrennung einer Zellsuspension benutzt werden. Die drei wesentlichen Komponenten dieses Systems sind ein Flüssigkeitsleitsystem, ein optisches System und ein Rechner mit entsprechender Software. Simultan können mit diesem System Größe, interne Zellstrukturen, insbesondere die Granulation und die Kern-Plasma-Relation, sowie die verschiedenen Fluoreszensen der an die Oberfläche der Zellen oder intrazellulär gebundenen Antikörper bestimmt werden. Dabei wird die zu untersuchende Zellsuspension mittels des sog. "hydrodynamic focussing" in der Mitte eines laminaren Flüssigkeitstrahls, der sog. "sheat"- Flüssigkeit, eingespritzt. So passieren die Zellen jeweils einzeln nacheinender das optische System und können dementsprechend einzeln gemessen werde. Das optische System setzt sich aus einer Lichtquelle (C¹⁴ Carbon Laser) und mehreren damit gekoppelten Detektoren zusammen. Die Detektorfelder transformieren die auftreffenden Lichtimpulse mittels "Photomultipliern" zu elektrischen Signalen. Mit dem der Lichtquelle direkt gegenüberliegenden Detektor wird die Zellgröße gemessen. Drei weitere Detektorplatten sind im 90° Winkel zu Flüssigkeits- und Laserstrahl angeordnet. Einer von diesen Detektoren mißt das von den inneren Strukturen der Zelle gesteuerte Laserlicht. Es werden umsomehr Steuersignale aufgefangen, je dichter das Zellinnere mit gering lichtdurchlässigen Strukturen durchsetzt ist (intraplasmatische Granula, Kernstruktur). Wenn die Zellen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, deren Spektrum innerhalb der Wellenlänge des verwendeten Lasers liegt, wird der Farbstoff angeregt und sendet einen Lichtimpuls aus. Die so entstehenden Impulse werden ebenfalls mit rechtwinkelig angeordneten Detektoren erfaßt. A "Fluorescence activated cell sorter (FACS)" can be used both for analysis and for the separation of a cell suspension. The three main components of this system are a liquid control system, an optical system and a computer with the appropriate software. Simultaneously, size, internal cell structures, in particular the granulation and the nuclear-plasma relation, as well as the different fluorescence of the antibodies bound to the surface of the cells or intracellularly can be determined with this system. The cell suspension to be examined is injected by means of the so-called "hydrodynamic focusing" in the middle of a laminar liquid jet, the so-called "sheat" liquid. The cells pass through the optical system one after the other and can be measured individually. The optical system consists of a light source (C ¹⁴ carbon laser) and several detectors coupled to it. The detector fields transform the impinging light pulses into "electrical signals" using "photomultipliers". The cell size is measured with the detector directly opposite the light source. Three further detector plates are arranged at a 90 ° angle to the liquid and laser beams. One of these detectors measures the laser light controlled by the internal structures of the cell. The more control signals are intercepted, the more densely the cell interior is penetrated by slightly translucent structures (intraplasmic granules, core structure). If the cells are marked with fluorescent dyes, the spectrum of which lies within the wavelength of the laser used, the dye is excited and emits a light pulse. The resulting pulses are also detected with detectors arranged at right angles.

Diese, eine Zelle lasermorphologisch charakterisierenden Signale werden mit einem Computer ausgewertet und für spätere Analysen auf einem Datenträger gespeichert. Durch die Messung mehrerer tausend Zellen pro Ansatz und die Zusammenfassung der Meßergebnisse kann für jeden der genannten Parameter ein sog. Histogramm erstellt werden. Darüber hinaus ist es möglich, die Korrelation zwischen zwei Parametern graphisch darzustellen, z. B. im sog. "Dot Plot". in dem jeder Punkt eine bestimmte Zellzahl repräsentiert. These signals, which characterize a cell by laser morphology, are processed with a computer evaluated and saved on a data carrier for later analysis. By measurement several thousand cells per batch and the summary of the measurement results can be used for a histogram is created for each of the parameters mentioned. Beyond that it is possible to display the correlation between two parameters graphically, e.g. B. in the so-called "Dot Plot "in which each point represents a certain cell number.

Dieses Verfahren ermöglicht sehr präzise und zuverlässige quantitative Bestimmungen von Zellpopulationen, die mit Antikörpern (im Regelfall monoklonale IgG 1 Antikörper) gegen verschiedene Antigene markiert sind. Eine entsprechende Software liefert sowohl die graphische Auswertung in Form von Histogramm und Dot-Plot als auch die statistische Auswertung mit Prozentangaben. This method enables very precise and reliable quantitative determinations of Cell populations with antibodies (usually monoclonal IgG 1 antibodies) against different antigens are marked. Appropriate software provides both the graphic Evaluation in the form of a histogram and dot plot as well as the statistical evaluation Percentages.

Carrying out the flow cytometry for the detection of Fas / Fas ligand

Für sämtliche FACS-Analysen wurden sowohl die Tumorzellen und PBMC in 25 cm² Kulturflaschen (1 × 106/Flasche) ausgesät und 24-48 h in Vollmedium inkubiert. Dies ermöglicht ein nahezu maximal konfluentes bzw. logarithmisches Wachstum der Zellen und stellt optimale Bedingungen dar. Die Zellen wurden dann entweder nativ oder nach Behandlung mit den entsprechenden Substanzen gemessen. For all FACS analyzes, both the tumor cells and PBMC were sown in 25 cm ² culture bottles (1 × 106 / bottle) and incubated in complete medium for 24-48 h. This enables an almost maximum confluent or logarithmic growth of the cells and represents optimal conditions. The cells were then measured either natively or after treatment with the corresponding substances.

Hierzu wurde der Mediumüberstand (5 ml) abgenommen und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (Fa. Falcon) überführt. Zur Ablösung der adhärenten Zellen wurden auf den Zell-Monolayer 5 ml Trypsin-EDTA aufgetragen und dort 45 sec. belassen. Danach wurde das Trypsin entfernt und die Flasche für 3 min im Brutschrank inkubiert. Nach dieser Einwirkungszeit war der komplette Zellrasen vom Flaschenboden gelöst und die Zellen konnten mit 10 ml FACS-Puffer (PBS mit 5% FCS und 0,2% Na-Zitrat) abgewaschen werden. Sie wurden dem vorher abgenommenen Überstand hinzugegeben und diese Zellsuspension wurde nach gründlichen Vortexen (ca. 10 sec. bei mittlerer Stufe) in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Bei Suspensionszellen wurde lediglich das komplette Medium mit Zellen aufgenommen und anschließend ebenfalls gewaschen und gevortext. Jeweils 3 × 105 Zellen wurden in ein FACS- Röhrchen überführt, mit 4 ml kaltem calcium- und magnesiumfreiem PBS gewaschen und 10 min bei 400 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet in 50 µl FACS- Puffer mit 6 µl FITC konjugiertem anti-Fas moAK bzw. 6 µl FITC konjugiertem anti-Fas-L mAK (Klon NOK-1, Pharmingen, oder Klon H-11, Alexis) oder 5 µl FITC konjugiertem Kontroll-AK resuspendiert. Die Zellen wurden nach kurzem Vortexen für 30 min. bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Danach wurde 2× mit 4 ml kaltem PBS gewaschen und ein weiteres Mal für 10 min. bei 400 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet in 200 µl FACS-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen sofort durchflusszytometrisch mit dem FACScan (Becton Dickinson, San Diego, CA) untersucht. Ein Minimum von 10 000 Ereignissen wurde für jede Probe bestimmt. Für die Bestimmung der Fas-Ligand Expression wurden die Kulturen 24 h mit Matrix Metalloproteinase Inhibitor KB8301 10 µM inkubiert, zusätzlich wurden dem FACS-Puffer ebenfalls 10 µM MMPI zugegeben. For this purpose, the medium supernatant (5 ml) was removed and placed in a 50 ml centrifuge tube (Falcon) transferred. To detach the adherent cells, 5 ml were applied to the cell monolayer Trypsin-EDTA applied and left there for 45 sec. The trypsin was then removed and incubated the bottle in the incubator for 3 min. After this exposure time was the Complete cell turf detached from the bottle bottom and the cells could be filled with 10 ml FACS buffer (PBS with 5% FCS and 0.2% Na citrate). You became that before removed supernatant added and this cell suspension was after thorough Vortexing (approx. 10 sec. At medium level) counted in a Neubauer counting chamber. at Suspension cells were taken up only the complete medium with cells and then also washed and vortexed. 3 × 105 cells each were placed in a FACS Transfer tubes, wash with 4 ml of cold calcium and magnesium free PBS and wash for 10 min Centrifuged at 400 × g. The supernatant was decanted and the cell pellet in 50 µl FACS Buffer with 6 µl FITC conjugated anti-Fas moAK or 6 µl FITC conjugated anti-Fas-L mAb (clone NOK-1, Pharmingen, or clone H-11, Alexis) or 5 µl FITC conjugated Control AK resuspended. The cells were vortexed for 30 min. at 4 ° C in Incubated in the dark. It was then washed twice with 4 ml of cold PBS and again for 10 min. Centrifuged at 400 × g. The supernatant was decanted and the pellet in 200 µl FACS buffer resuspended. The cells were then immediately subjected to flow cytometry the FACScan (Becton Dickinson, San Diego, CA). A minimum of 10,000 Events were determined for each sample. For the determination of Fas ligand expression the cultures were incubated for 24 h with matrix metalloproteinase inhibitor KB8301 10 µM, in addition, 10 µM MMPI was also added to the FACS buffer.

Carrying out the flow cytometry for the detection of apoptosis

Apoptose-Bestimmung durch Messung von Annexin/Propidiumiodid (PI) im FACS: Annexin-V, ein calcium- und phospholipidbindendes Protein, hat eine sehr hohe Bindungskapazität für Phosphatidylserin. Dieses sitzt normalerweise auf der Innenseite der Zellmembran und wird nur bei in Apoptose befindlichen Zellen auf deren Außenseite transferiert. Apoptosis determination by measurement of annexin / propidium iodide (PI) in FACS: annexin-V, a calcium and phospholipid binding protein, has a very high binding capacity for Phosphatidylserine. This usually sits on the inside of the cell membrane and only becomes transferred to the outside of cells in apoptosis.

Die Zellen werden in PBS (Phosphate buffered sahne) gewaschen und dann in einem calciumhaltigen Binding Buffer resuspendiert. Anschließend werden die Zellen mit FITC (Flourescinisothionyacid)-konjugiertem Annexin-V und PI (Propidiumiodid) inkubiert. Apoptotische Zellen weisen auf ihrer Oberfläche Bindungstellen für Annexin-V auf. Bei spätapoptotischen und nekrotischen Zellen kann das PI durch die beschädigte Membran in das Innere der Zelle eindringen und an die Nucleinsäuren binden. The cells are washed in PBS (Phosphate buffered cream) and then in one calcium-containing binding buffer resuspended. Then the cells with FITC (Flourescinisothionyacid) conjugated Annexin-V and PI (propidium iodide) incubated. Apoptotic cells have binding sites for Annexin-V on their surface. at late apoptotic and necrotic cells can penetrate the PI through the damaged membrane Penetrate inside the cell and bind to the nucleic acids.

Durch eine FACS-Analyse dieser Zellen kann nun eine quantitative Aussage über die Menge an apoptotischen (Annexin-V+/PI-), nekrotischen (Annexin-V-/PI+) und spätapoptotischen (Annexin-V+/PI+) Zellen gemacht werden. A FACS analysis of these cells can now provide a quantitative statement about the amount of apoptotic (Annexin-V + / PI-), necrotic (Annexin-V- / PI +) and late apoptotic (Annexin-V + / PI +) cells are made.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Der ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay) ist ein sogenannter "Sandwich enzym immunoassay", der mit monoklonalen Antikörpern arbeitet. Ein für ein Protein spezifischer Antikörper wird auf dem Boden eines jeden Wells (Vertiefung) einer Mikrotiterplatte aufgebracht, auf die die zu untersuchende Substanz aufpipettiert wird. Hierbei kommt es zu einer spezifischen Bindung des gesamten zu untersuchenden Proteins an den stationären Antikörper. An diesen Antigen-Antikörper-Komplex bindet ein anschliessend applizierter ebenfalls spezifischer monoklonaler biotinkonjugierter Detektorantikörper. Ungebundenes Material wird ausgewaschen und ein Streptavidin/Biotin bindender Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Antikörper hinzugegeben, der an den Detektor-Antikörper bindet. Die Meerrettich-Peroxidase katalysiert die Umwandlung des chromogenen Substrates Tera-Methyl-Benzedin von einer farblosen zu einer blauen bzw. gelben (nach Zugabe des Stopreagenz) Lösung, deren Intensität proportional zur Menge des spezifischen Proteins ist. Diese wird mittels eines ELISA-Readers bei einer vorgegebenen Wellenlänge gemessen. The ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is a so-called "sandwich enzyme immunoassay "that works with monoclonal antibodies. One specific for a protein Antibody is placed on the bottom of each well (well) of a microtiter plate applied to which the substance to be examined is pipetted. This leads to a specific binding of the entire protein to be examined to the stationary antibody. A subsequently applied also binds to this antigen-antibody complex specific monoclonal biotin-conjugated detector antibody. Unbound material will washed out and a streptavidin / biotin binding horseradish-peroxidase-conjugated Added antibody that binds to the detector antibody. The horseradish peroxidase catalyzes the conversion of the chromogenic substrate tera-methyl-benzedin from one colorless to a blue or yellow (after adding the stop reagent) solution, its intensity is proportional to the amount of the specific protein. This is done using an ELISA reader measured at a given wavelength.

ELISA for soluble Fas and soluble Fas ligand

sFas und sFas-Ligand wurden im Überstand der Harnblasenkarzinomzellen mit einem kommerziellen ELISA (Enzym-gekoppelten Immunosorbent Assay ([sFas] Endogene, Woburn, MA/[sFas-Ligand] MBL, Naka-ku Nagoya, Japan) gemessen. Die Böden der Mikrotiterplatten waren mit einem monoklonalen Antikörper, der jeweils ein Epitop von Fas, bzw. zwei verschiedene Epitope von Fas-Ligand (Klone 4H9 und 4A5) erkennt, beschichtet. Die Standards und die 1 : 20 verdünnten Proben wurden in die Wells (Vertiefungen) pipettiert und sofort der dazugehörige, mit Meerrettich-Peroxidase (HPR) konjugierte Antikörper hinzugefügt. Nach Inkubation wurden die ungebundenen Enzymkonjugierten Antikörper durch Waschen entfernt und eine Substratlösung in die Wells gegeben. Ein farbiges Produkt entstand proportional zur Menge von jeweils Fas und Fas-Ligand. Die Reaktion wurde mit Schwefelsäure gestoppt und die Absorption photometrisch mit einem ELISA-Reader bei 450 nm (SLT, Crailsheim) gemessen. Die Konzentrationen von Fas und Fas-Ligand wurden anhand der Standardkurve bestimmt. sFas and sFas ligand were used in the supernatant of the bladder carcinoma cells with a commercial ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay ([sFas] endogenous, Woburn, MA / [sFas ligand] MBL, Naka-ku Nagoya, Japan). The bottom of the microtiter plates were with a monoclonal antibody, each an epitope of Fas, or two recognizes different epitopes of Fas ligand (clones 4H9 and 4A5). The standards and the 1:20 diluted samples were pipetted into the wells and immediately the associated horseradish peroxidase (HPR) conjugated antibodies added. To Incubation, the unbound enzyme-conjugated antibodies were removed by washing and added a substrate solution to the wells. A colored product was created in proportion to Amount of Fas and Fas ligand, respectively. The reaction was stopped with sulfuric acid and the Absorption measured photometrically with an ELISA reader at 450 nm (SLT, Crailsheim). The concentrations of Fas and Fas ligand were determined using the standard curve.

ELISA (IL-2, IFN-γ, TNF-α)

Vorbereitung der Standards erfolgte zunächst durch Auflösen der Trockensubstanz von IL-2, IFN-γ, und TNF-α mit einer entsprechend Vorschrift angegebenen Menge destillierten Wassers. Hiernach erfolgte die Erstellung einer Verdünnungsreihe mit dem im Test-Kit verfügbaren Probenverdünnungsmedium in den entsprechenden Antigen-Konzentrationen. Die Zellkulturüberstände wurden mit dem im Kit bereitgestellten Probenverdünnungsmedium je 1 : 10 verdünnt, die Serumproben wurden entsprechend 1 : 1 verdünnt. Für Zellkulturüberstände und Proben deren IL-2, IFN-γ, und TNF-α Konzentration bei der 1. Messung jenseits des Messbereiches lag wurde eine Verdünnung 1 : 50 durchgeführt. Desweiteren erfolgte eine Überprüfung der Genauigkeit der erstellten Verdünnung durch mehrfache Messung gleicher Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten. The standards were first prepared by dissolving the dry substance of IL-2, IFN-γ, and TNF-α with a specified amount of distilled water. This was followed by the preparation of a dilution series using the one available in the test kit Sample dilution medium in the appropriate antigen concentrations. The Cell culture supernatants were each 1:10 with the sample dilution medium provided in the kit diluted, the serum samples were diluted 1: 1. For cell culture supernatants and Samples whose IL-2, IFN-γ, and TNF-α concentration at the 1st measurement beyond the Dilution 1:50 was carried out. Furthermore there was a Check the accuracy of the dilution created by measuring the same several times Samples at different times.

Jeweils 50 µl der Proben und der Standards wurden auf je zwei Wells der mit einem anti-IL-2, IFN-γ, und TNF-α-Antikörper vorbeschichteten 96-Well Mikrotiterplatte aufpipettiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Um den unspezifischen Einfluss der Lichtbrechung durch das Plastik der Mikrotiterplatte zu berücksichtigen, wurden zwei unbefüllte Wells (sog. Blanks) belassen. Nach dreimaligem Waschen mit der im Testkit vorhandenen Pufferlösung, Aufpipettieren von 50 µl des biotinkonjugierten Detektorantikörpers erfolgte eine erneute Inkubation für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Hiernach wiederum dreimaliges Waschen der Mikrotiterplatte und nach Aufbringen von 100 µl der verdünnten Streptavidin-Meerrettich- Peroxidase-Lösung Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach nochmals dreimaligem Waschen und auftragen der bereits vorgemischten Tera-Methyl-Benzedin-Lösung. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 Minuten wurde dann das Stop-Reagenz zugegeben. Die Messung der Extinktion des Farbumschlages erfolgte innerhalb von 15 Minuten mittels des ELISA Readers bei 450 nm. 50 µl each of the samples and the standards were placed on two wells each with an anti-IL-2, IFN-γ, and TNF-α antibody pre-coated 96-well microtiter plate and pipetted for 1 Incubated for one hour at room temperature. To the non-specific influence of light refraction taking into account the plastic of the microtiter plate, two unfilled wells (so-called blanks) leave. After washing three times with the buffer solution in the test kit, Another 50 µl of the biotin-conjugated detector antibody was pipetted on Incubate for 60 minutes at room temperature. Then again wash the three times Microtiter plate and after applying 100 µl of the diluted streptavidin horseradish Peroxidase solution incubation for 30 minutes at room temperature. Then again Wash three times and apply the pre-mixed tera methyl benzedin solution. After a further incubation period of 30 minutes, the stop reagent was then added. The absorbance of the color change was measured within 15 minutes using the ELISA readers at 450 nm.

Co-culture attempts

Periphere Blutlymphozyten (PBMC) wurden durch Ficoll-Zentrifugierung von Frischblut freiwilliger Spender gewonnen. Fas sensitive Jurkat-T-Leukämiezellen, die Fas exprimieren und sensitiv für Fas-Ligand induzierte Apoptose sind, wurden freundlicherweise von Dr. J. Wessendorf, Klinik und Poliklinik für Dermatologie der Universität Bonn zur Verfügung gestellt. Harnblasenkarzinomzellen RT112 sowie Jurkat und PBMC wurden in RPMI 1640 mit 10% FCS, Penicillin/Streptomycin und Glutamin kultiviert. PBMC oder Jurkatzellen (im Medium schwimmend) wurden mit RT112 (am Boden anheftend) für 1, 3, 5, 7, 12 und 24 Stunden in einem Effektor/Zielverhältnis (E/Z) von 10 : 1 Zellen co-kultiviert. Sämtliche Versuche wurden mit drei Armen durchgeführt:

1. 1. Blasentumorzellen + mit verschiedenen Konz. SEB-stimulierte PBMC
2. 2. Blasentumorzellen + mit verschiedenen Konz. SEB-stimulierte PBMC + Zellkulturüberstände (Zytokine)
3. 3. Blasentumorzellen + Zellkulturüberstände (Zytokine).

Peripheral blood lymphocytes (PBMC) were obtained by Ficoll centrifugation of fresh blood from volunteer donors. Fas sensitive Jurkat T leukemia cells that express Fas and are sensitive to Fas ligand-induced apoptosis have been kindly provided by Dr. J. Wessendorf, Clinic and Polyclinic for Dermatology at the University of Bonn. Bladder carcinoma cells RT112, Jurkat and PBMC were cultivated in RPMI 1640 with 10% FCS, penicillin / streptomycin and glutamine. PBMC or Jurkat cells (floating in the medium) were co-cultured with RT112 (attached to the bottom) for 1, 3, 5, 7, 12 and 24 hours in an effector / target ratio (E / Z) of 10: 1 cells. All experiments were carried out with three arms:

1. 1. Bladder tumor cells + with various conc. SEB-stimulated PBMC
2. 2. Bladder tumor cells + with various conc. SEB-stimulated PBMC + cell culture supernatants (cytokines)
3. 3. Bladder tumor cells + cell culture supernatants (cytokines).

Als Kontrolle wurden PBMC alleine, Jurkat und RT112 unter gleichen Bedingungen kultiviert. Nach der Co-Kultivierung wurden die schwimmenden Jurkat bzw. PBMC Zellen abgenommen und anschließend die am Boden haftenden RT112 Zellen trypsiniert und mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen getrennt nach dem Annexin V/PI Färbungsprotokoll mit Durchflusszytometrie auf Apoptose untersucht. As controls, PBMC alone, Jurkat and RT112 were used under the same conditions cultured. After the co-cultivation, the floating Jurkat or PBMC cells removed and then trypsinized the RT112 cells adhering to the bottom and with PBS washed. Then the cells were separated according to Annexin V / PI Staining protocol with flow cytometry examined for apoptosis.

animal model

Ziel des Tierversuchs war die Induktion eines Urothelkarzinoms der Harnblase (TCC) bei Ratten. Hierzu wurde 4 Wochen alten, weiblichen Fischer 344-Ratten durch transurethrale Instillation N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU) in die Blase eingebracht. Bei Instillationszeiten von 45 min. wurden 0,15 ml MNU in einer Konzentration von 1 g MNU/100 ml NaCl über Angiocatheter (Polyethylen) einmal 14-tägig über 6 Wochen (d. h. Instillationen Woche 0, 2, 4, 6) verabreicht. Die hierzu erforderliche Narkose wurde mit Äther ausgeführt. Eine antibiotische Prophylaxe wurde mit Trimethoprim und Sulfamethoxazol durchgeführt (Steinberg, 1990). Die Tiere wurden in Einzelställen gehalten, der Tag/Nacht-Zyklus betrug 24 Stunden. The aim of the animal experiment was to induce urinary bladder cancer (TCC) Rats. For this purpose, 4-week-old female Fischer 344 rats were transurethral Instillation N-methyl-N-nitrosourea (MNU) introduced into the bladder. At instillation times from 45 min. 0.15 ml of MNU in a concentration of 1 g of MNU / 100 ml of NaCl was transferred Angiocatheter (polyethylene) once every fortnight for 6 weeks (i.e. instillations week 0, 2, 4, 6) administered. The necessary anesthetic was carried out with ether. An antibiotic Prophylaxis was carried out with trimethoprim and sulfamethoxazole (Steinberg, 1990). The Animals were kept in individual stalls, the day / night cycle was 24 hours.

Zur Überprüfung der Tumorinduktionsrate und Festlegung des durchschnittlichen Zeitraumes zur Erzeugung von Epitheldysplasien, oberflächlichen, bzw. muskelinvasiven Tumoren wurden je 10 Tiere/Instillationsabschnitt nach 12, 14, 16, 20, 24 Wochen durch CO₂ Inhalation geopfert und die Blasen in toto entnommen. To check the tumor induction rate and determine the average period for the generation of epithelial dysplasia, superficial or muscle-invasive tumors, 10 animals / instillation section were sacrificed by CO ₂ inhalation after 12, 14, 16, 20, and 24 weeks and the blisters were removed in total.

Die durchschnittliche Zeitdauer zur Erzeugung oberflächlicher Tumoren wird bei diesem Tiermodell mit 10-12 Wochen angegeben, die von oberflächlich invasiven mit 16-18 Wochen. Der nächste Schritt ist die Festlegung der histopathologischen Tumorinfiltrationstiefe und der Tumordifferenzierung durch H.E.-Färbung und Begutachtung unter dem Lichtmikroskop (Steinberg, 1990). The average time it takes to create superficial tumors is this Animal model indicated with 10-12 weeks, that of superficially invasive with 16-18 weeks. The next step is to determine the histopathological depth and depth of the tumor Tumor differentiation by H.E. staining and assessment under the light microscope (Steinberg, 1990).

Die Gesamtzahl der für den gesamten Versuch eingesetzten Tiere betrug 35 Ratten. The total number of animals used for the entire experiment was 35 rats.

experimental design Dose finding enterotoxin

Weibliche Fischer 344-Ratten, Intravesikale Instillation von Enterotoxin B (Sigma Chem., Deutschland) in Verdünnungsreihen von 100 µg/ml/0,1 ml; 10 µg/ml/0,1 ml 1 µg/ml/0,1 ml. Ermittlung der maximal verträglichen Dosis. Female Fischer 344 rats, intravesical instillation of enterotoxin B (Sigma Chem., Germany) in dilution series of 100 µg / ml / 0.1 ml; 10 µg / ml / 0.1 ml 1 µg / ml / 0.1 ml. Determination of the maximum tolerated dose.

therapy

Gruppe 1: 10 Tiere mit oberflächlichem TCC. Beginn der 1 µg/ml Superantigen- Instillationsbehandlung 14 Wochen nach Beginn der MNU-Instillation. Durchführung der Instillationen über 6 Zyklen (Applikation 1× wöchentlich über 6 Wochen). Group 1: 10 animals with superficial TCC. Start of 1 µg / ml superantigen Instillation treatment 14 weeks after the start of MNU instillation. Implementation of the Instillations over 6 cycles (application once a week for 6 weeks).

Gruppe 2: 10 Tiere mit oberflächlichem TCC. Beginn der 10 µg/ml Superantigen- Instillationsbehandlung 14 Wochen nach Beginn der MNU-Instillation. Durchführung der Instillationen über 6 Zyklen (Applikation 1× wöchentlich über 6 Wochen). Group 2: 10 animals with superficial TCC. Start of 10 µg / ml superantigen Instillation treatment 14 weeks after the start of MNU instillation. Implementation of the Instillations over 6 cycles (application once a week for 6 weeks).

Gruppe 3 (Kontrollgruppe): 10 Tiere mit oberflächlichem TCC. Beginn der NaCl 0,9% Instillationsbehandlung 14 Wochen nach Beginn der MNU-Instillation. Durchführung der Instillationen über 6 Zyklen (Applikation 1× wöchentlich über 6 Wochen). Group 3 (control group): 10 animals with superficial TCC. Beginning of NaCl 0.9% Instillation treatment 14 weeks after the start of MNU instillation. Implementation of the Instillations over 6 cycles (application once a week for 6 weeks).

Zwei Tage nach Beendigung der Therapiephase wurden die Tiere geopfert und die Blasen entnommen. The animals were sacrificed two days after the end of the therapy phase and the Bubbles removed.

Zur histopathologischen Beurteilung von Tumorstadium und Differenzierungsgrad wurde eine H.E.-Färbung angefertigt. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Apoptoserate durch den TUNEL-Test und die immunhistochemischen Färbungen der Immunmarker. For the histopathological assessment of tumor stage and degree of differentiation made an H.E. The apoptosis rate was then determined by the TUNEL test and the immunohistochemical staining of the immune markers.

H.E. staining

Zur besseren Haftung der Präparate auf dem Objektträger, wurde dieser zuerst kurz über offener Flamme geflämmt, dann zur Fixierung für 30 sec in Formalin eingebracht. Hiernach erfolgte die Spülung in aqua dest. Für 30 sec. wurde der Schnitt jetzt in Hämatoxylin-Lösung eingetaucht, danach unter warmen Wasser gebläut und im folgenden in eine Eosin-Lösung für 10 sec. gegeben. Im Anschluß wurden durch Spülung in Wasser überschüssige Farbstoffmenge entfernt und die Objektträger für je 30 sec. in eine aufsteigende Alkoholreihe abgestellt. Im folgenden wurden die Präparate in ein organisches Medium, Xylol, überführt und mit dem Abdeckmedium Eukit® und einem Deckgläschen auf Dauer haltbar gemacht. To improve the adhesion of the specimens to the slide, it was first opened briefly Flamed flame, then placed in formalin for fixation for 30 sec. This was followed by the Rinse in aqua dest. The cut was now immersed in hematoxylin solution for 30 seconds. then blued under warm water and then in an eosin solution for 10 sec. given. Excess amount of dye was then removed by rinsing in water and the slides are placed in an ascending alcohol row for 30 seconds each. Hereinafter the preparations were transferred into an organic medium, xylene, and with the covering medium Eukit® and a cover slip made durable.

TUNEL TEST

Eine sensitive Methode zur Bestimmung der Apoptoserate im Gewebe ist die Markierung von für den programmierten Zelltod charakteristischen DNA-Einzelstrangbrüchen. A sensitive method for determining the apoptosis rate in the tissue is the labeling of DNA single-strand breaks characteristic of programmed cell death.

Hierzu wurden Paraffinschnitte von 3 µm Dicke hergestellt. Die nötige Permeabilisierung der Zellen wurde durch Kochen in frischem Citratpuffer unter Druck erreicht. Nach einer Spülung mit Wasser wurden endogene Enzymaktivitäten durch eine Blocking-Solution (Fa.DAKO) unterbunden, die 20 min auf die Präparate einwirkte. Nach Pufferung in PBS erfolgte die Identifizierung des apoptotischen Zelltodes in situ durch die Antikörper vermittelte enzymatische Markierung von DNA-Einzelstrangbrüchen mittels TUNEL (Tdt-mediated dUTP Nick End Labeling). Hierbei werden durch das Enzym Terminale-Deoxynucleotidyl-Transferase markierte Nucleotide an charakteristischen DNA-Bruchstellen polymerisiert. Dazu wurde das TUNEL- Reagenz für 15 min aufgebracht und inkubiert. Danach folgte eine Spülung in PBS und zur Vermeidung unspezifischer Bindungen in der Folgeprozedur eine Inkubation mit 1 : 5 verdünnten Schweineserum. Auf erneutes Spülen in PBS schloss sich als nächster Schritt die Umsetzungsreaktion mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Antifluoreszin-Antikörper (Converter-Behandlung) für 30 min an. Als nächster Schritt wurden die so markierten Zellkerne durch Behandlung mit 3-Amino-Ethyl-Carbazol (AEC) sichtbar gemacht und das Gewebe mit Hämatoxilin gegengefärbt. Die Auswertung erfolgte unter dem Lichtmikrokop. For this purpose, paraffin sections with a thickness of 3 µm were produced. The necessary permeabilization of the Cells were reached by boiling in fresh citrate buffer under pressure. After a rinse endogenous enzyme activities were blocked with water using a blocking solution (Fa.DAKO) prevented that acted on the preparations for 20 min. After buffering in PBS the Identification of apoptotic cell death in situ by the antibody-mediated enzymatic Labeling of DNA single-strand breaks using TUNEL (Tdt-mediated dUTP nick end Labeling). Here, terminal deoxynucleotidyl transferase is labeled by the enzyme Nucleotides polymerized at characteristic DNA breaks. For this, the TUNEL Reagent applied for 15 min and incubated. This was followed by a rinse in PBS and to Avoiding unspecific binding in the subsequent procedure dilute an incubation with 1: 5 Pig serum. The next step was to rinse again in PBS Reaction reaction with alkaline phosphatase conjugated antifluoresin antibody (Converter treatment) for 30 min. The next step was the labeled cell nuclei visualized by treatment with 3-amino-ethyl-carbazole (AEC) and the tissue with Hematoxilin counterstained. The evaluation was carried out under the light microscope.

immunohistochemistry Leukocyte esterase, CD 4, CD 8, CD 43, ED2

Hierbei wird ein Antikörper auf Gewebeschnitte aufgetragen, der spezifisch an ein Antigen bindet. Dieser Komplex wird, an ein Enzym gekoppelt, von einem farblosen Substrat in ein farbiges Produkt umgewandelt, dessen Ablagerungen im Mikroskop direkt zu beobachten sind. Paraffinschnitte mit einer Dicke von 3 µm wurden hergestellt. Nach einer Spülung mit Wasser erfolgte eine Permeablisierungsbehandlung durch Kochen in Citratpuffer unter Druck für 1 min. Um endogene Peroxidaseaktivität zu unterbinden, folgte die Inkubation mit einer Blocking- Solution (FA. DAKO) für 20 min. Nach Pufferung in TBS wurde der entsprechende Primärantikörper in einer Verdünnung von 1 : 20 aufgetragen und für 30 min belassen. Hiernach wurde in TBS gepuffert und es galt unspezifische Hintergrundbindungen durch Inkubation mit 1 : 5 verdünnten Schweineserum auszuschalten. Nach erneuter TBS-Spülung folgte jetzt der entsprechende erste Sekundärantikörper (1 : 30), der für 30 min auf den Präparaten verblieb. Ebenfalls für diese Zeitdauer wurde der zweite entsprechende Sekundärantikörper (1 : 50) aufgebracht und anschließend mit 3-Amino-Ethyl-Carbazol (AEC) die Umwandlung in ein im Lichtmikroskop sichtbares, farbiges Produkt bewerkstelligt. Das umliegende Gewebe wurde zur Kontrastierung und besseren Beurteilbarkeit mit 10% Hämatoxilin gegengefärbt. An antibody is applied to tissue sections that specifically targets an antigen binds. This complex is coupled to an enzyme from a colorless substrate into one Colored product converted, the deposits can be observed directly under the microscope. Paraffin sections with a thickness of 3 µm were made. After a rinse with water Permeablization was carried out by boiling in citrate buffer under pressure for 1 min. To prevent endogenous peroxidase activity, the incubation followed with a blocking Solution (FA.DAKO) for 20 min. After buffering in TBS the corresponding one Primary antibody applied at 1:20 dilution and left for 30 min. hereafter was buffered in TBS and nonspecific background binding by incubation also applied Turn off 1: 5 diluted pig serum. After another TBS flush, the now followed corresponding first secondary antibody (1:30), which remained on the preparations for 30 min. The second corresponding secondary antibody (1:50) was also used for this period. applied and then with 3-amino-ethyl-carbazole (AEC) the conversion into an im Light microscope visible, colored product accomplished. The surrounding tissue became Contrasting and better assessability counterstained with 10% hematoxylin.

statistical evaluation

Die Auswertung der angefertigten Präparate erfolgte unter dem Lichtmikroskop. The prepared preparations were evaluated under the light microscope.

Evaluation of the H.E. staining

Die H.E.-Färbung fungierte in dieser Studie als histopathologische Übersichtsfärbung. Anhand dieser Präparate wurden ein Tumorstaging nach der TNM-Klassifikation und eine Beurteilung des Differenzierungsgrades (Grading; Tabelle 1 und 2) durchgeführt. In this study, the H.E.-staining acted as a histopathological overview staining. Based of these preparations were tumor staging according to the TNM classification and an assessment the degree of differentiation (grading; Tables 1 and 2).

Danach wurde das Tumorstadium endgültig festgelegt. The tumor stage was then finally determined.

Evaluation to determine the rate of apoptosis and immunostaining

Für die Auswertung beider Untersuchungen kam dasselbe Auswertungsmodell zur Anwendung. Im Lichtmikroskop wurde eine Übersichtsvergrößerung eingestellt und "Hot spots", die Zentren apoptotischer bzw. auffälliger Aktivität des Gewebes identifiziert. Diese wurden fokussiert, bis eine 200-fache Vergrößerung erreicht war. In einem vorgegebenen Zählraster von 0,0092 mm wurden die positiven Zählkerne einerseits, und die negativen andererseits, ausgezählt. Aus diesen Zählungen konnten Prozentwerte ermittelt werden. Diese Prozedur wurde an je 5 "Hot spots" pro Präparat durchgeführt (Weidner et al., 1992). The same evaluation model was used to evaluate both investigations. A magnification overview was set in the light microscope and "hot spots", the centers Apoptotic or conspicuous activity of the tissue identified. These were focused until 200x magnification was achieved. In a given counting grid of 0.0092 mm the positive counting cores were counted on the one hand, and the negative ones on the other. Out Percentages could be determined from these counts. This procedure was done on 5 "Hot spots "per preparation (Weidner et al., 1992).

Results Determination of Fas on bladder carcinoma cells

Die Zelloberflächenexpression von Fas ist unabdingbare Vorraussetzung für eine effektive Fas/Fas-Ligand-Interaktion zwischen Immun- und Tumorzellen. Deshalb erfolgte die FACS- Analyse der Fas-Expression auf RT112. Wie in Abb. 3 dargestellt zeigte sich eine hohe Fas- Expression in der untersuchten Harnblasenkarzinomzellinie. The cell surface expression of Fas is an indispensable prerequisite for an effective Fas / Fas ligand interaction between immune and tumor cells. The FACS analysis of the Fas expression was therefore carried out on RT112. As shown in Fig. 3, there was a high Fas expression in the bladder carcinoma cell line examined.

Fas-ligand induction at PBMC and Jurkat by SEB

Als Grundlage für die Untersuchungen wurde zuerst die Expression von Fas-ligand auf immunkompetenten Zellen nachgewiesen. Hierbei diente zum einen die Jurkat Zellinie als T- Leukämiezellinie, welche permanent aktiviert ist, und schon früher als Modell für aktivierte T- Zellen diente als positive Kontrolle und zum anderen wurden PBMC mit Ionomycin/PMA stimuliert (5 µl/ml Zellsuspension über 12 h) um Fas-ligand zu induzieren. Nicht aktivierte PBMC weisen keine Fas-Ligand-Expression auf (Vergleiche Abb. 4). The expression of Fas ligand on immunocompetent cells was first demonstrated as the basis for the investigations. On the one hand, the Jurkat cell line served as a T-leukemia cell line, which is permanently activated, and earlier it served as a model for activated T cells as a positive control, and on the other hand, PBMC was stimulated with ionomycin / PMA (5 µl / ml cell suspension over 12 h ) to induce Fas ligand. Non-activated PBMC show no Fas ligand expression (see Fig. 4).

Die Induktion von Fas-ligand auf PBMC ist Zeit- und Dosis abhängig. Die unten aufgeführten flowzytometrischen Analysen zeigen wie 5 h-7 h nach Stimulation der PBMC mit 1,0 µg/ml SEB die Expression des Fas-liganden nachweisbar wird und diese nach 24 h post-stimulationem wieder verschwunden ist (siehe Abb. 5). The induction of Fas ligand on PBMC is time and dose dependent. The flow cytometric analyzes shown below show how the expression of the Fas ligand can be detected 5 h-7 h after stimulation of the PBMC with 1.0 µg / ml SEB and how this has disappeared after 24 h post-stimulation (see Fig. 5).

Detection of cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α) after SEB stimulation

Unter normalen Zellkulturbedingungen kommt es nur zu einer geringen Zytokinausschüttung (berechneter Mittelwert über 24 h: IL-2[~15 pg/ml], IFN-_[~10 pg/ml], TNF-_[~8 pg/ml]). Hingegen führte SEB-Inkubation von PBMC zu einer Zeit- und Dosisabhängigen Sekretion von Zytokinen schon nach 3 Stunden. Die maximale Sekretion wurde je nach Zytokin nach ca. 7-12 Stunden erreicht (1,0 µg/ml SEB: IL-2 [~816,0 pg/ml], IFN-_[~567,6 pg/ml], TNF-_[~668,4 pg/ml]). Nach 24 h war im Zellkulturüberstand eine niedrigere Zytokinkonzentration nachweisbar als nach 12 h was daraufhindeutet, daß möglicherweise regulative Vorgänge die weitere Zytokinausschüttung herunterregulieren. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit könnte die Instabilität dieser Proteine unter in vitro Bedingungen sein. Dennoch ist die Zytokinkonzentration auch nach 24 h um den Faktor 100 höher als unter Normalbedingungen. IL-2

IFN-_

TNF-_

Tabelle: Darstellung der Zytokin-Ausschüttung in pg/ml nach SEB-Stimulation von PBMC. Die Bestimmung der Zytokine erfolgte aus dem Zellkulturüberstand mittels ELISA. Under normal cell culture conditions there is only a low release of cytokines (calculated mean over 24 h: IL-2 [~ 15 pg / ml], IFN -_ [~ 10 pg / ml], TNF -_ [~ 8 pg / ml]) , In contrast, SEB incubation of PBMC resulted in time and dose-dependent secretion of cytokines after only 3 hours. Depending on the cytokine, the maximum secretion was reached after approx. 7-12 hours (1.0 µg / ml SEB: IL-2 [~ 816.0 pg / ml], IFN -_ [~ 567.6 pg / ml], TNF -_ [~ 668.4 pg / ml]). After 24 h, a lower cytokine concentration was detectable in the cell culture supernatant than after 12 h, which indicates that possibly regulatory processes down-regulate further cytokine release. Another explanation could be the instability of these proteins under in vitro conditions. Nevertheless, the cytokine concentration is higher by a factor of 100 after 24 hours than under normal conditions. IL-2

IFN-_

TNF-_

Table: Representation of the cytokine release in pg / ml after SEB stimulation by PBMC. The cytokines were determined from the cell culture supernatant by means of ELISA.

Effect of induced PBMC-Fas ligand on bladder carcinoma cells

In der Harnblasenkarzinomzellinie RT12 wird durch SEB-stimulierte PBMC Apoptose induziert. Die PBMC wurden vor der Co-Kultur 5-7 Stunden mit 1,0 µg/ml SEB stimuliert, die Inkubation/Co-kultur von stimulierten PBMC und Blasentumorzellen erfolgte 12 h. Die Co- Kultur-Versuche erfolgten durch stimulierte PBMC alleine (ohne Zellkulturüberstand der Stimulationsversuche mit den darin befindlichen Zytokine), durch stimulierte PBMC mit Zytokinen im Zellkulturüberstand und durch Co-Kultur von Blasentumorzellen mit Zytokinen (im Zellkulturüberstand) alleine. Anschließend wurden beide Zellinien auf Apoptose untersucht. Die größte Apoptoserate bei RT112 wird erzielt, wenn stimulierte PBMC und Zytokine gleichzeitig mit den Blasentumorzellen inkubiert werden. PBMC, die mit einer Dosis von 10 µg/ml SEB stimuliert wurden, induzieren eine um den Faktor 5 (537,5%) gesteigerte Apotoserate in Harnblasenkarzinomzellen.

Tabelle: Apoptoseraten von RT122 Blasentumorzellen in % Steigerung gegenüber der normalen Apoptoserate nach Behandlung mit SEB-stimulierten PBMC. Apoptosis is induced in the bladder carcinoma cell line RT12 by SEB-stimulated PBMC. The PBMC were stimulated with 1.0 µg / ml SEB for 5-7 hours before the co-culture, the incubation / co-culture of stimulated PBMC and bladder tumor cells took place for 12 h. The co-culture experiments were carried out by stimulated PBMC alone (without cell culture supernatant from the stimulation experiments with the cytokines contained therein), by stimulated PBMC with cytokines in the cell culture supernatant and by co-culture of bladder tumor cells with cytokines (in the cell culture supernatant) alone. Then both cell lines were examined for apoptosis. The greatest rate of apoptosis at RT112 is achieved when stimulated PBMC and cytokines are incubated simultaneously with the bladder tumor cells. PBMC stimulated with a dose of 10 µg / ml SEB induce a 5-fold increase (537.5%) in apotectomy in bladder carcinoma cells.

Table: Apoptosis rates of RT122 bladder tumor cells in% increase compared to the normal apoptosis rate after treatment with SEB-stimulated PBMC.

In vivo results of SEB therapy

Ca. 20% der (3 von 14 auswertbaren) Tiere trugen nach der Behandlung noch einen Tumor.
Anhang Bild 1: Normale Rattenblase (HE)
Anhang Bild 2: Tumor in Rattenblase (HE)
Anhang Bild 3: Rattenblase nach Behandlung (HE)
Anhang Bild 4: Apoptotischer Resttumor in Rattenblase (TUNEL). Approximately 20% of the (3 out of 14 evaluable) animals still had a tumor after treatment.
Appendix Figure 1: Normal rat bladder (HE)
Appendix Figure 2: Tumor in rat bladder (HE)
Appendix Figure 3: Rat bladder after treatment (HE)
Appendix Figure 4: Apoptotic residual tumor in rat bladder (TUNEL).

Der Nachweis von Leukozytenesterase zeigte eine massive Einwanderungen von immunaktiven Zellen in der Blasenwand der Ratte und an der Tumorperipherie nach SEB Behandlung. Eine geringe lymphozytäre und CD 4/CD 8 und granulozytäre Infiltration des Resttumors aber nicht der Blasenwand wurde eindeutig nachgewiesen. Eine Infiltration der Blasenwand mit Monozyten konnte nicht gezeigt werden. Nur bei insgesamt 3 Ratten von insgesamt 14 auswertbaren Tieren waren überhaupt noch tumoröse Veränderungen nachweisbar. Im TUNEL Test waren alle diese verbliebenen Tumoren apoptotisch (siehe Tabelle). Rattenblase Tumor

Tabelle: Histologische Veränderungen im Resttumor der Rattenblase nach Bedandlung mit SEB intravesikal. Zeichenerklärung: sehr starke Expression +++, mäßige Expression ++, schwache Expression +, keine Expression - der jeweiligen immunhisochemischen Färbungen. Rattenblase Stroma

Tabelle: Histologische Veränderungen im Resttumor der Rattenblase nach Bedandlung mit SEB intravesikal. Zeichenerklärung: sehr starke Expression +++, mäßige Expression ++, schwache Expression +, keine Expression - der jeweiligen immunhisochemischen Färbungen. Referenzen 1) Anderström C, Johansson S. Nilsson S. The significance of lamina propria invasion on the prognosis of patients with bladder tumors. J. Urol. 1980; 124: 23-26
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Table: Histological changes in the residual tumor of the rat bladder after treatment with SEB intravesically. Explanation of symbols: very strong expression +++, moderate expression ++, weak expression +, no expression - of the respective immunhisochemical stains. Rat bladder stroma

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Claims

1. Use of a pharmaceutical composition for the treatment of Bladder cancer containing superantigen as a therapeutically active substance and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

2. Use according to claim 1, wherein the superantigen is a staphylococcal enterotoxin is.

3. Use according to claim 2, wherein the superantigen is staphylococcal enterotoxin B.

4. Use according to claim 1 to 3, wherein the bladder carcinoma by intravesical Instillation is treated.

5. Use according to claim 1 to 4, wherein the treatment of bladder cancer as sole therapy, as combination treatment, as prophylaxis or aftertreatment is carried out.

6. Use according to claim 1 to 5, wherein the bladder carcinoma from epithelial cells has arisen and / or has been diagnosed as urothelial carcinoma, TCC or CIS.

7. Use according to claim 1 to 6, wherein the pharmaceutical composition Contains 0.01 µg / ml to 100 µg / ml superantigen.