DE10209451A1

DE10209451A1 - Specific gene expression in colon carcinoma cell lines

Info

Publication number: DE10209451A1
Application number: DE2002109451
Authority: DE
Inventors: Andreas Block
Original assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Current assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Priority date: 2002-03-05
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2003-09-18
Also published as: WO2003074692A3; WO2003074692A2; AU2003229263A1; AU2003229263A8

Abstract

Das Verfahren dient zur Durchführung einer spezifischen Genexpression in Kolonkarzinom-Zell-Linien. Es werden zur Genexpression rekombinante adenovirale Vektoren verwendet. Die Genexpression wird durch einen Mucin-1/DF3-Promoter vermittelt. Zur Amplifikation der Genexpression wird ein Gal4/VP16 Fusionsprotein erzeugt.The method is used to carry out a specific gene expression in colon carcinoma cell lines. Recombinant adenoviral vectors are used for gene expression. Gene expression is mediated by a mucin-1 / DF3 promoter. A Gal4 / VP16 fusion protein is generated to amplify gene expression.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer spezifischen Genexpression in Kolonkarzinom-Zell-Linien, bei dem zur Genexpression rekombinante adenovirale Vektoren verwendet werden. The invention relates to a method for carrying out a specific gene expression in colon carcinoma cell lines, in the adenoviral vectors recombinant for gene expression be used.

Mit 20% stellt das kolorektale Karzinom eine der Haupttodesursachen maligner Erkrankungen in der westlichen Welt dar. Die Entwicklung von kolorektalen Karzinomen aus Adenomen gilt heute als gesichert und die rechtzeitige endoskopische Entfernung dieser Präkanzerosen kann die Entstehung des Kolonkarzinoms verhindern. Bei bereits fortgeschrittenem oder metastasiertem Tumorleiden sind die therapeutischen Möglichkeiten jedoch gering und das 5- Jahres-Überleben beträgt nur 5%. Daher stellt die metastasierte Tumorerkrankung eine der größten Herausforderungen in der Onkologie dar. Durch das Einschleusen therapeutischer Gene in Tumorzellen eröffnen gentherapeutische Ansätze neue Perspektiven in der Therapie dieser Erkrankungen. Colorectal cancer is one of the 20% Main causes of death of malignant diseases in the western World represents. The development of colorectal cancer Today's adenoma is considered secure and timely endoscopic removal of these precancerous can Prevent colon carcinoma from developing. At already advanced or metastatic tumor diseases are the therapeutic options but few and the 5- Annual survival is only 5%. Therefore, the metastatic tumor disease one of the largest Challenges in oncology Opening therapeutic genes into tumor cells gene therapy approaches new perspectives in therapy of these diseases.

Erst durch die Entwicklung geeigneter Vektorsysteme wurden gentherapeutische Ansätze ermöglicht. In den letzten 10 Jahren wurden eine Vielzahl unterschiedlicher Vektorsysteme sowohl viralen als auch nichtviralen Ursprungs entwickelt. Die direkte Injektion von DNA in Gewebe resultierte in keiner nennenswerten Genexpression. In Liposomen verpackt kann DNA mittels Endozytose von Zellen aufgenommen werden. Komplexierung mit geeigneten Proteinen ermöglicht eine rezeptorvermittelte Aufnahme. In der Regel ist jedoch mit diesen nichtviralen Systemen eine nur geringgradige und temporäre Transgen-Expression möglich. Mit Hilfe viraler Vektoren ist fremdgenetisches Material sehr viel effizienter über den hoch entwickelten viralen Infektionsmechanismus in die Tumorzellen zu schleusen. Für den viralen Transfer von Genen wurden insbesondere Adenoviren und Retroviren, daneben auch adeno-assoziierte Viren, Herpes simplex-Viren und Hepatitis B-Viren verwendet. Retroviren integrieren ihr Genom in das Genom der infizierten Zelle. It was only through the development of suitable vector systems gene therapy approaches. In the last 10 Years ago a variety of different vector systems both viral and non-viral in origin. The direct injection of DNA into tissue resulted in no notable gene expression. Packed in liposomes DNA can be taken up by cells by endocytosis. Complexation with suitable proteins enables one receptor-mediated uptake. Usually, however, with these non-viral systems are only minor and temporary transgene expression possible. With the help of viral Vectors are a lot of foreign genetic material more efficient over the sophisticated viral To infect the infection mechanism into the tumor cells. For the viral transfer of genes have been particular Adenoviruses and retroviruses, also adeno-associated ones Viruses, herpes simplex viruses and hepatitis B viruses used. Retroviruses integrate their genome into the genome the infected cell.

Bei der Gentherapie metabolischer Erkrankungen zur dauerhaften Genexpression möglicherweise erwünscht, ist eine permanente Genexpression bei der Gentherapie maligner Erkrankungen nicht erforderlich. Präparationen mit höheren Virustitern und signifikant höhere Transduktions-Effizienz auch sich zum Zeitpunkt der Infektion nicht teilender Zellen lassen rekombinante Adenoviren für die experimentelle Therapie kolorektaler und anderer Karzinome geeigneter erscheinen. Das adenovirale Genom wird nicht in das Wirtsgenom integriert und die Expression adenoviraler Gene ist nur temporär. Die langfristige Expression ist bei der Therapie maligner Erkrankungen nicht erforderlich oder sogar nicht erwünscht, da die Eradikation der Tumorzellen im Vordergrund steht und die Expression zytotoxischer Gene oder Zytokingene auf die Dauer der Tumoreradikation beschränkt bleiben sollte. Die adenovirale Expression von Suizidgenen in Pankreaskarzinomen und Kolonkarzinomen führt nach Gabe der entsprechenden Prodrugs zu einer signifikanten Tumorregression im Tiermodell, eine Überlebensverlängerung durch antitumorale Immunstimulation konnte durch suizidgentherapeutische Ansätze allein nicht erzielt werden. Die adenoviral vermittelte Expression von Zytokinen ermöglichte neue Möglichkeiten zur Induktion von zytotoxischen T-Lymphozyten (insbesondere Interleukin-2 und Interleukin-12). In gene therapy for metabolic diseases permanent gene expression may be desirable permanent gene expression in malignant gene therapy Diseases not required. Preparations with higher Virus titers and significantly higher transduction efficiency also not dividing at the time of infection Cells leave recombinant adenoviruses for that experimental therapy of colorectal and other cancers seem more appropriate. The adenoviral genome is not in integrates the host genome and expression adenoviral Gene is only temporary. Long-term expression is at therapy of malignant diseases is not necessary or even undesirable because the eradication of the tumor cells the focus is on the expression of cytotoxic genes or cytokine genes for the duration of tumor eradication should remain limited. Adenoviral expression of Suicide genes in pancreatic and colon carcinomas result after administration of the corresponding prodrugs to a significant tumor regression in the animal model, a Prolongation of life through anti-tumor immune stimulation couldn't by suicide therapeutic approaches alone be achieved. The adenoviral mediated expression of Cytokines opened new possibilities for the induction of cytotoxic T lymphocytes (especially interleukin-2 and Interleukin-12).

Mit der adenoviralen Expression von Interleukin-18 und Interleukin-12 ist auch eine effiziente Aktivierung von NK- Zellen möglich geworden, die insbesondere eine Bedeutung bei der Gentherapie MHC-I negativer Tumoren haben wird. Nicht nur suizidgentherapeutische Ansätze sondern insbesondere auch Ansätze zur adenoviralen Expression von Zytokinen sind durch die Transgen-abhängige Toxizität limitiert. Diese wird nicht nur durch infizierte Tumorzellen sondern insbesondere auch durch die Transduktion umgebender Parenchymzellen bedingt. So führt die systemische und portalvenöse Gabe von rekombinanten Adenoviren im tumorfreien Tiermodell zur überwiegenden Transduktion von Hepatozyten. Selbst bei direkter intratumoraler Injektion hepatischer Metastasen mit überwiegender Transduktion der Tumorzellen kommt es zur signifikanten Infektion benachbarter Hepatozyten mit einer Dosislimitierung durch die hieraus resultierende Hepatotoxizität. With the adenoviral expression of interleukin-18 and Interleukin-12 is also an efficient activation of NK- Cells have become possible, which is of particular importance will have MHC-I negative tumors in gene therapy. Not just suicide therapeutic approaches but in particular also approaches to adenoviral expression of Cytokines are due to the transgene-dependent toxicity limited. This is not only infected by Tumor cells but in particular also by the Transduction of surrounding parenchyma cells conditional. So she leads systemic and portal venous administration of recombinant Most of the adenoviruses in the tumor-free animal model Transduction of hepatocytes. Even with direct intratumoral injection of hepatic metastases with predominant transduction of the tumor cells occurs significant infection of neighboring hepatocytes with a Dose limitation through the resulting Hepatotoxicity.

Die Verwendung tumor- und gewebespezifischer Promotoren ermöglicht die Reduktion der Transgen-Expression in umliegenden nicht malignen Zellen mit der Zielsetzung einer niedrigeren Toxizität dieser gentherapeutischen Ansätze. The use of tumor and tissue-specific promoters enables the reduction of transgene expression in surrounding non-malignant cells with the objective of a lower toxicity of these gene therapy approaches.

Eine gewebespezifische und sogar tumorspezifische Genexpression kann durch tumor- und gewebespezifische Promotoren erzielt werden. Derartige tumorspezifische Ansätze in der retroviralen- und adenoviralen Gentherapie sind für eine Vielzahl verschiedener Malignome entwickelt worden. Tabelle 1 gibt eine Übersicht zu tumorspezifischen bzw. allgemein gewebespezifischen Promotoren. A tissue-specific and even tumor-specific Gene expression can be caused by tumor and tissue specific Promoters can be achieved. Such tumor-specific Approaches in retroviral and adenoviral gene therapy are developed for a variety of different malignancies Service. Table 1 gives an overview of tumor-specific or generally tissue-specific promoters.

Ein idealer tumorspezifischer Promoter vereint dabei folgende Eigenschaften: (1) Eine hohe Genexpression im Tumorgewebe mit (2) vergleichsweise geringer Genexpression in dem umgebenden Gewebe, sowie (3) die breite Verwendungsmöglichkeit innerhalb einer Tumorentität. An ideal tumor-specific promoter combines following properties: (1) A high gene expression in Tumor tissue with (2) comparatively low gene expression in the surrounding tissue, as well as (3) the broad Possibility of use within a tumor entity.

Das karzinoembryonale Antigen (CEA) konnte in 70% aller kolorektaler Karzinome nachgewiesen werden und in 60% aller Patienten mit Kolonkarzinom sind die CEA-Serumspiegel erhöht. Bei der Entwicklung eines spezifischen adenoviral gentherapeutischen Ansatzes zur Therapie hepatischer Metastasen kolorektaler Karzinome ermöglicht die Verwendung des CEA-Promoters die selektive Genexpression in CEA- positiven Kolonkarzinomen mit vernachlässigbarer Expression in Hepatozyten. Die Transgen-Expression ist jedoch nur auf CEA-exprimierende, differenzierte Kolonkarzinom-Zellen beschränkt und die Genexpression ist signifikant niedriger als bei Verwendung des in der Gentherapie verbreiteten Cytomegalievirus-Promoters. The carcinoembryonic antigen (CEA) was found in 70% of all colorectal cancers are detected in 60% of all Patients with colon cancer are the CEA serum levels elevated. When developing a specific adenoviral gene therapy approach to the therapy of hepatic Colorectal carcinoma metastases allow use of the CEA promoter the selective gene expression in CEA positive colon carcinomas with negligible expression in hepatocytes. However, transgene expression is only on CEA-expressing, differentiated colon carcinoma cells limited and gene expression is significantly lower than when using the gene therapy Cytomegalovirus promoter.

Mucine wurden erstmals im Endothel des Gastrointestinaltraktes beschrieben und die Expression dieser Mucine wurde bereits 1994 als potentielles immunologisches Target bei der Therapie gastrointestinaler Karzinome diskutiert. Die Mucin-1-mRNA Expression konnte regelhaft in kolorektalen Karzinomen, aber nicht in Hepatozyten nachgewiesen werden und die Mucinexpression korreliert im Gegensatz zur CEA-Expression positiv mit der hepatischen Metastasierung und Tumorentwicklung. Die Veröffentlichung "SCHWARTZ, B., BRESALIER, R. S. and KIM, Y. S. (1992). The role of mucin in coloncancer metastasis. Int J Cancer 52, 60-65" erläutert die entsprechenden Hintergründe. Mucins were first found in the endothelium of the Gastrointestinal tract described and expression this mucine was already considered potential in 1994 immunological target in the treatment of gastrointestinal Carcinomas discussed. Mucin-1 mRNA expression failed regularly in colorectal cancer, but not in Hepatocytes are detected and mucin expression In contrast to CEA expression, correlates positively with the hepatic metastasis and tumor development. The Publication "SCHWARTZ, B., BRESALIER, R. S. and KIM, Y.S. (1992). The role of mucin in coloncancer metastasis. Int J Cancer 52, 60-65 "explains the corresponding Backgrounds.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung adenoviraler Vektoren für die Gentherapie kolorektaler Karzinome, die eine spezifische, aber dennoch effiziente Transgen-Expression ermöglichen und damit die therapeutische Breite eines solchen experimentellen Ansatzes erhöhen. The object of the present invention is the development adenoviral vectors for colorectal gene therapy Carcinomas that are specific, yet efficient Enable transgene expression and thus the therapeutic breadth of such an experimental approach increase.

Die Expression adenoviraler Gene soll durch die Verwendung eines singulären adenoviralen Vektorsystems gering gehalten werden und die rekombinanten, replikationsdefizienten Adenoviren sollten in hohen Titern mit guter Transduktions- Effizienz gegenüber einer Vielzahl verschiedener Kolonkarzinom-Zell-Linien synthetisiert werden können. Daraus ergeben sich folgende Zielvorgaben:

1. Rekombinante, replikationsdefiziente Adenoviren des Serotyps Ad5
2. Spezifische Genexpression in mucin-positiven Zellen
3. Effiziente, dem Cytomegalovirus-Promoter vergleichbare Genexpression
4. Konstruktion singulärer adenoviraler Vektoren.

The expression of adenoviral genes is said to be kept low by using a singular adenoviral vector system and the recombinant, replication-deficient adenoviruses should be able to be synthesized in high titers with good transduction efficiency in relation to a large number of different colon carcinoma cell lines. This results in the following targets:

1. Recombinant, replication-deficient adenoviruses of the Ad5 serotype
2. Specific gene expression in mucin-positive cells
3. Efficient gene expression comparable to the cytomegalovirus promoter
4. Construction of singular adenoviral vectors.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Genexpression durch einen Mucin-1/DF3 Promotor vermittelt wird und daß zur Amplifikation der Genexpression ein GAL4/VP16-Fusionsprotein erzeugt wird. The object is achieved in that the Gene expression mediated by a mucin-1 / DF3 promoter and that to amplify gene expression GAL4 / VP16 fusion protein is generated.

Bei der Entwicklung dieser spezifischen und zugleich potenten adenoviralen Vektoren für die Gentherapie kolorektaler Karzinome wurde ein System zur Amplifikation der Transgen-Expression integriert. Dazu wurde ein Gal4/VP16-Fusionsprotein kodierendes Gen unter der Kontrolle des spezifischen DF3/Muc-1 Promoters in die E1- Region rekombinanter Adenoviren kloniert. In demselben Adenovirus wurden dann weiter downstream Gal4-Bindungsstellen für die Induktion der Transgen-Expression integriert. In developing this specific and at the same time potent adenoviral vectors for gene therapy Colorectal cancer was an amplification system of transgene expression integrated. To do this, a Gene encoding Gal4 / VP16 fusion protein under the Control of the specific DF3 / Muc-1 promoter in the E1 Region of recombinant adenoviruses cloned. In the same Adenovirus were then further downstream Integrated Gal4 binding sites for the induction of transgene expression.

Gal4 wurde bereits 1974 in der Regulation des Galaktosestoffwechsels in Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Erst 11 Jahre später wurde die korrespondierende Bindungsstelle identifiziert. Die Fusion dieses Gal4 mit VP16, einem Herpes Simplex Virus Transskriptions- Aktivator der "Immediate early viral genes" resultierte in einem in eukaryonten Zellen ungewöhnlich potenten Transskriptions-Aktivator. Die Kombination von 5 Gal4- Bindungsstellen erbrachte darüber hinaus eine 36fache Amplifikation der Expression gegenüber einer Gal4- Bindungsstelle. Dieses System wurde beispielsweise von "Tantin, D., CHI, T., HORI, R., PYO, S., and CAREY, M (1996). Biochemical mechanism of transcriptional activation by GAL4-VP16. Methods Enzymol 274, 133-149" charakterisiert und in adenoviralen Vektoren zur Expression des BAX-Genes verwendet. Gal4 was already regulated in 1974 in the regulation of Galactose metabolism in Saccharomyces cerevisiae described. It wasn't until 11 years later that corresponding binding site identified. The fusion of this Gal4 with VP16, a herpes simplex virus transcription Activator of the "Immediate early viral genes" resulted in one unusually potent in eukaryotic cells Transskriptions activator. The combination of 5 Gal4 Binding sites also yielded 36 times Amplification of expression against a Gal4 Binding site. This system was developed by "Tantin, D., CHI, T., HORI, R., PYO, S., and CAREY, M (1996). Biochemical mechanism of transcriptional activation by GAL4-VP16. Methods Enzymol 274, 133-149 " and in adenoviral vectors for expression of the BAX gene used.

Der hier beschriebene Ansatz stellt die erstmalige Verwendung des Gal4VP16-Transaktivator-Systems in einem adenoviralen Vektor zur mucin-spezifischen Genexpression dar. Die Quantifikation der Genexpression erfolgte unter Verwendung des Luciferase Systems. The approach described here represents the first Use of the Gal4VP16 transactivator system in one adenoviral vector for mucin-specific gene expression The gene expression was quantified under Using the Luciferase system.

Mit einer weiten Verbreitung der Mucinexpression in einer Vielzahl verschiedener gastrointestinaler Tumoren ermöglichte die Verwendung des erstmals im Mammakarzinom beschriebenen DF3/Muc-1 Promoters einen neuen, universelleren Ansatz in der Gentherapie kolorektaler Karzinome und deren hepatischer Metastasen. Die bisherigen gentherapeutischen Studien des Mammakarzinoms unter Verwendung des DF3/Muc-1 Promoters in "CHEN, L., CHEN, D., MANOME, Y., DONG, Y., FINE, H. A., and KUFE, D. W. (1995) Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. J Clin Invest 96, 2775-2782" zeigten eine spezifische aber im Vergleich zum CMV-Promoter deutlich schwächere Genexpression. With a wide spread of mucin expression in one Numerous different gastrointestinal tumors allowed the use of the first in breast cancer described a new, DF3 / Muc-1 promoter more universal approach to colorectal gene therapy Carcinomas and their hepatic metastases. The previous gene therapy studies of breast cancer under Use of the DF3 / Muc-1 promoter in "CHEN, L., CHEN, D., MANOME, Y., DONG, Y., FINE, H.A., and KUFE, D.W. (1995) Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3 / MUC1 promoter. J Clin Invest 96, 2775-2782 " a specific one but compared to the CMV promoter significantly weaker gene expression.

Immunohistochemical detection of Muc-1 in tumor tissue and cell culture

Gewebe primärer Tumoren oder hepatischer Metastasen wurden in 10% Formalin fixiert (pH 7,3) und in Parat in eingebettet. In 5 µm Dünnschnitten wurde mit xylene das Paraffin extrahiert und die Proben nach Demaskierung antigener Strukturen durch Citrat-Vorbehandling mit einer 1 : 100 Verdünnung eines murinen, monoklonalen anti-Mucin-1 Antikörpers (Klon VU 4-H-5, Maus IgGl, #sc-7313, Santa Cruz, USA) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ wurden Objektträger mit kultivierten Tumorzellen Azeton-fixiert, luftgetrocknet und mit einer 1 : 50 Verdünnung Schafserum präinkubiert. Der Nachweis gebundener mucinspezifischer Antikörper erfolgte durch alkalische Phosphatase-antialkalische Phosphatase-Zweitantikörper (APAAP). Die alkalische Phosphatase-Aktivität wurde schließlich mit Hilfe von Neufuchsin nachgewiesen und die Gewebsschnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt. In den Zellkulturpräparationen erfolgte zur Inhibition endogener alkalischer Phosphatase-Aktivität eine Präinkubation mit 0,8 mg/ml Levamisol. Tissues of primary tumors or hepatic metastases were found fixed in 10% formalin (pH 7.3) and in parat embedded. This was done with xylene in 5 µm thin sections Paraffin extracted and the samples after unmasking antigenic structures by citrate pretreatment with a 1: 100 dilution of a murine, monoclonal anti-mucin-1 Antibody (clone VU 4-H-5, mouse IgGl, # sc-7313, Santa Cruz, USA) incubated for 1 hour at room temperature. Alternatively, slides with cultured tumor cells were used Acetone-fixed, air-dried and with a 1:50 Dilution of sheep serum pre-incubated. Evidence of bound mucin-specific antibodies were made by alkaline Secondary phosphatase-anti-alkaline phosphatase antibodies (APAAP). The alkaline phosphatase activity was finally proven with the help of Neufuchsin and the Tissue sections counterstained with hematoxylin. In the Cell culture preparations were made to inhibit endogenous alkaline phosphatase activity with a pre-incubation 0.8 mg / ml levamisole.

Cell lines

Die Kultivierung der 293-Nierenkarzinom-Zelllinie erfolgte in HGDMEM-Zellkulturmedium (Gibco, Rockville, MD). Die humane HepG2 HCC-Zelllinie sowie die humanen Kolonkarzinom- Zelllinen Colo320, Colo205, HT29, Lovo, SkCo1, SW620 wurden in den jeweils empfohlenen Medien (ATCC) propagiert. Alle Zellkulturmedien wurden mit 10% fetalem Kälberserum sowie 1% Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin supplementiert. Die Kultivierung erfolgte nach Zellkultur- Standardprozeduren. The 293 renal carcinoma cell line was cultivated in HGDMEM cell culture medium (Gibco, Rockville, MD). The human HepG2 HCC cell line as well as the human colon carcinoma Cell lines Colo320, Colo205, HT29, Lovo, SkCo1, SW620 were propagated in the recommended media (ATCC). All Cell culture media were mixed with 10% fetal calf serum as well 1% glutamine and 1% penicillin streptomycin supplemented. The cultivation was carried out after cell culture Standard procedures.

Cloning adenoviral expression plasmids

Klonierung des pAd.CMV-luc: Das Luciferase-Gen wurde mittels Kpn1/Sal1Verdau aus pGL3 herausgeschnitten und in den adenoviralen Expressionsvektor pAd.CMV-pA ligiert. Klonierung des pAd.Muc1/DF3-luc: Der Mucin-Promoter wurde durch Xba1/Kpn1-Verdau von pDF3-CAT+3-7 isoliert und ersetzte in pAd.CMV-pA den CMV-Promoter. Das Luciferase-Gen wurde nach Kpn1/Sal1 Verdau in den pGreenLantern Vektor zwischenkloniert und nach Kpn1/Not1-Verdau in die multiple cloning site des pAd.Muc1/DF3pA eingebaut. Cloning of the pAd.CMV-luc: The luciferase gene was cut out of pGL3 using Kpn1 / Sal1 digestion and in ligated the adenoviral expression vector pAd.CMV-pA. Cloning of the pAd.Muc1 / DF3-luc: The mucin promoter was isolated by Xba1 / Kpn1 digestion of pDF3-CAT + 3-7 and replaced the CMV promoter in pAd.CMV-pA. The luciferase gene was digested in Kpn1 / Sal1 in the pGreenLantern vector intermediate cloned and after Kpn1 / Not1 digestion into the multiple cloning site of pAd.Muc1 / DF3pA built.

Klonierung des pAd.Muc1/DF3_bin-luc: Das Gal4VP16 enthaltende HindIII Fragment des pSGVP wurde in die HindIII Region des pGal4B5-CAT 5'-terminal der Gal4-Bindungsstelle kloniert. Das SV40pA aus pBK-CMV wurde nachfolgend durch KpnI/MluI Verdau und Blunt-End-Ligation in die Pstl Region zwischen Gal4VP16 und Gal4B5 integriert. Partialverdau mit HindIII sowie SacI führte zur Isolation der das binäre System enthaltenden Kassette, welche in die Multiple cloning site von pBK-CMV kloniert wurde. Nachfolgender Verdau mit ClaI und SacI sowie Blunt-End-Ligation in die KpnI-Region 3- terminal des Mucin-Promoters des pAd.Muc1/DF3-luc resultierte in dem adenoviralen Expressionsplasmid pAd.Muc1/DF3bin-luc. Cloning of the pAd.Muc1 / DF3 _bin -luc: The HindIII fragment of the pSGVP containing Gal4VP16 was cloned into the HindIII region of the pGal4B5-CAT 5'-terminal of the Gal4 binding site. The SV40pA from pBK-CMV was subsequently integrated into the Pstl region between Gal4VP16 and Gal4B5 by KpnI / MluI digestion and blunt-end ligation. Partial digestion with HindIII and SacI resulted in isolation of the cassette containing the binary system, which was cloned into the multiple cloning site of pBK-CMV. Subsequent digestion with ClaI and SacI and blunt-end ligation into the KpnI region 3-terminal of the mucin promoter of the pAd.Muc1 / DF3-luc resulted in the adenoviral expression plasmid pAd.Muc1 / DF3bin-luc.

Plasmid transfection from 293 cells

2.10⁵ 293-Zellen wurden für 12 Stunden in 6-well Zellkulturplatten inkubiert und nachfolgend mit 0,3 µg gereinigter DNA und 0,3 µg eines pSV-β-Galaktosidase Kontrollplasmides Kalziumphosphat-kopräzipitiert. 4,5 Stunden später wurde Medium ergänzt und nach 24 Stunden die Zellen zur Luciferase- und Galaktosidaseaktivität in 150 µl Zellkultur-Lysis-Reagenz lysiert. Die Bestimmung von Galaktosidase und Luciferase erfolgte gemäß der Protokolle des Herstellers (Tropix, Foster City, CA). 2.10 ⁵ 293 cells were incubated for 12 hours in 6-well cell culture plates and subsequently calcium-phosphate-coprecipitated with 0.3 μg of purified DNA and 0.3 μg of a pSV-β-galactosidase control plasmid. 4.5 hours later, medium was added and after 24 hours the cells were lysed for luciferase and galactosidase activity in 150 μl cell culture lysis reagent. Galactosidase and luciferase were determined in accordance with the manufacturer's protocols (Tropix, Foster City, CA).

Generation of recombinant, replication deficient adenoviruses

Nach Reduktion der LPS-Kontamination von Plasmid-DNA durch Triton-X Extraktion erfolgte die Generation rekombinanter Adenoviren durch Kopräzipitation und homologe Rekombination der korrespondierenden adenoviralen Expressionsplasmide mit pBHG10 in 293-Zellen. Die Aufreinigung rekombinanter Adenoviren nach Replikation in 293-Zellen erfolgte durch CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation. Plaque-forming units wurden durch Infektion von 293-Zellen mit seriellen Verdünnungen und Agarose-Overlay bestimmt. Die resultierenden Titer waren 7,5.10⁹ p.f.u./ml (Ad.CMV-luc), 8,4.10⁹ p.f.u./ml (Ad.Muc-luc) sowie 2,5.10⁹ p.f.u./ml (Ad.Muc_bin- luc). Virale DNA wurde mit Hilfe eines Qiagen DNA Blood- Kits isoliert und partiell sequenziert, um die Integration der Promoter- und Transaktivator-Elemente zu bestätigen. After reducing the LPS contamination of plasmid DNA by Triton-X extraction, recombinant adenoviruses were generated by coprecipitation and homologous recombination of the corresponding adenoviral expression plasmids with pBHG10 in 293 cells. Recombinant adenoviruses were purified after replication in 293 cells by CsCl density gradient centrifugation. Plaque-forming units were determined by infecting 293 cells with serial dilutions and an agarose overlay. The resulting titers were 7.5.10 ⁹ pfu / ml (Ad.CMV-luc), 8.4.10 ⁹ pfu / ml (Ad.Muc-luc) and 2.5.10 ⁹ pfu / ml (Ad.Muc _bin -luc). Viral DNA was isolated using a Qiagen DNA Blood Kit and partially sequenced to confirm the integration of the promoter and transactivator elements.

Adenoviral infection of human tumor cells

Die hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie HepG2 sowie die humanen Kolonkarzinom-Zell-Linien HT29, Colo205 und SkCo1 wurden mit jeweils 10⁶ Zellen pro well 6 Stunden vor geplanter Infektion mit rekombinanten Adenoviren in 6 well-Zellkultur-Platten inkubiert. Aufgereinigte Viruspräparationen wurden mit McCoy-Zellkulturmedium verdünnt und die Tumorzellen für 1 Stunde in jeweils 500 µl inkubiert. Anschließend erfolgte die Kultivierung über 24 Stunden in dem entsprechenden Wachstumsmedium. Die Bestimmung der Luciferase-Aktivität erfolgte abschließend aus den Zelllysaten. The hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and the human colon carcinoma cell lines HT29, Colo205 and SkCo1 were incubated with 10 ⁶ cells per well 6 hours before planned infection with recombinant adenoviruses in 6 well cell culture plates. Purified virus preparations were diluted with McCoy cell culture medium and the tumor cells were incubated for 1 hour in 500 µl each. The cultivation then took place over 24 hours in the appropriate growth medium. The luciferase activity was finally determined from the cell lysates.

Quantification of luciferase gene expression

Die Transgen-Expression wurde durch Quantifizierung des Luciferase-Reportergenes im Zelllysat bestimmt. Standardkurven unter Verwendung von rekombinanter Luciferase in Konzentrationen von 1 pg/ml bis 300 ng/ml dienten zur Ermittlung einer biphasischen exponentiellen Annäherung. Die Funktionsberechnung erfolgte mit Hilfe der PRISM-Software (GraphPad Software, Inc. SanDiego, CA). Die Luciferase-Expression wurde mit dem Gesamtzell-Protein korreliert, welches mit Hilfe eines DC-Protein Assay Kits bestimmt wurde. Transgene expression was assessed by quantifying the Luciferase reporter genes determined in cell lysate. Standard curves using recombinant Luciferase in concentrations from 1 pg / ml to 300 ng / ml were used to determine a biphasic exponential Approach. The function was calculated using the PRISM software (GraphPad Software, Inc. SanDiego, CA). The Luciferase expression was associated with the whole cell protein correlates which with the help of a DC protein assay kit was determined.

SDS-Page and immunoblotting

Zelllysate von HepG2, HT29, Colo205 und SkCo1 nach Infektion mit Ad.Muc-luc oder Ad.Muc_bin-luc wurden nach Aufkochen in Laemmli-Probenpuffer unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-Acrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und die Proteine auf 0,45 µm Immobilon-P transferiert. Nach Blockierung erfolgte die Detektion von Aktin und Gal4VP16 durch anti-Aktin-Antikörper und polyklonale anti-VP16-Antikörper. Nach Waschen der Blots mit 0,1% Tween-20 in TBS, pH 7,5 erfolgte die Inkubation mit einem Peroxidase-markierten Zweitantikörper und Visualisierung durch Chemilumineszenz-Detektion entsprechend den Angaben des Herstellers. Cell lysates of HepG2, HT29, Colo205 and SkCo1 after infection with Ad.Muc-luc or Ad.Muc _bin -luc were separated after boiling in Laemmli sample buffer under reducing conditions using SDS-acrylamide gel electrophoresis and the proteins on 0.45 µm Immobilon -P transferred. After blocking, the actin and Gal4VP16 were detected by anti-actin antibodies and polyclonal anti-VP16 antibodies. After washing the blots with 0.1% Tween-20 in TBS, pH 7.5, they were incubated with a peroxidase-labeled second antibody and visualized by chemiluminescence detection according to the manufacturer's instructions.

test results Mucin expression in colon carcinoma

Zur Testung dieses mucin-spezifischen adenoviralen Systems mit Gal4VP16 amplifizierter Genexpression wurden Kolonkarzinom-Gewebe und verschiedene Zell-Linien bezüglich ihrer Mucin-Genexpression hin untersucht. Der Mucinnachweis in humanen Kolonkarzinom-Geweben erfolgte entsprechend Fig. 1. Hier ist die Muzin-1 Expression im humanen Kolonkarzinom (A) und einer hepatischen Metastase (B) veranschaulicht. In Paraffin-fixierten Schnitten wurde das Mucin-1 mittels monoklonaler Antikörper und einer Alkalische Phosphatase vermittelten Neufuchsin-Farbreaktion nachgewiesen. In den Kolonkarzinomzellen finden sich intrazytoplasmatische Mucindepots sowohl in dem Primärtumor als auch in der hepatischen Metastase. Umliegende Hepatozyten (B, unterer Bildabschnitt) weisen keine Mucin-1 Färbung auf. To test this mucin-specific adenoviral system with Gal4VP16 amplified gene expression, colon carcinoma tissue and various cell lines were examined with regard to their mucin gene expression. Mucin detection in human colon carcinoma tissues was carried out in accordance with FIG. 1. Here, the mucin-1 expression in human colon carcinoma (A) and a hepatic metastasis (B) is illustrated. Mucin-1 was detected in paraffin-fixed sections using a monoclonal antibody and an alkaline phosphatase-mediated neufuchsin color reaction. In the colon carcinoma cells, intracytoplasmic mucin deposits are found both in the primary tumor and in the hepatic metastasis. Surrounding hepatocytes (B, lower part of the image) show no mucin-1 staining.

Die Färbung von Kolonkarzinom-Zellen erfolgte nach Fixierung mit Azeton entsprechend Fig. 2. Hier ist der Nachweis von Mucin-1 in humanen Kolonkarzinom-Zell-Linien veranschaulicht. Nach Fixierung und Inkubation mit einem monoklonalen Antikörper gegen Mucin-1 konnte Mucin in verschiedenen humanen Kolonkarzinom-Zell-Linien nachgewiesen werden (HT29, SW620, Lovo, Colo205, SkCo1). Colo320 und die humane HCC-Zellinie HepG2 wiesen keine Mucin-1 Expression auf. In dem Primärtumor sind Cluster von Kolonkarzinom-Zellverbänden zu erkennen, umgeben von mucin- negativen Fibroblasten. Die hepatischen Metastasen dieses Kolonkarzinoms exprimieren signifikante Mengen Mucin ohne Nachweis von Muc-1 in dem umliegenden hepatischen Gewebe. Colonic carcinoma cells were stained after fixation with acetone in accordance with FIG. 2. The detection of mucin-1 in human colon carcinoma cell lines is illustrated here. After fixation and incubation with a monoclonal antibody against mucin-1, mucin could be detected in various human colon carcinoma cell lines (HT29, SW620, Lovo, Colo205, SkCo1). Colo320 and the human HCC cell line HepG2 showed no mucin-1 expression. Clusters of colon carcinoma cell groups can be seen in the primary tumor, surrounded by mucin-negative fibroblasts. The hepatic metastases of this colon carcinoma express significant amounts of mucin without detection of Muc-1 in the surrounding hepatic tissue.

In der humanen HCC-Zelllinie HepG2 konnte ebenfalls kein Muc-1 nachgewiesen werden, welches Voruntersuchungen auf muc-1 mRNA-Ebene entspricht. In den verschiedenen humanen Kolonkarzinom-Zell-Linien konnte eine unterschiedlich ausgeprägte Mucin- Expression nachgewiesen werden. Abgesehen von Colo320, bei der keine Muc-1 Expression nachweisbar war, exprimierten alle anderen getesteten Zell-Linien Mucin mit maximaler Expression in SkCo1. Die HCC-Zelllinie HepG2 sowie HT29 mit niedriger-, Colo205 mit mittlerer- und SkCo1 mit hoher Mucin-1 Expression wurden für die nachfolgenden Untersuchungen zur adenoviral vermittelten, mucin-1 abhängigen amplifizierten Transgen-Expression verwendet. Neither in the human HCC cell line HepG2 could Muc-1 can be detected, which preliminary examinations on muc-1 corresponds to mRNA level. In the different human Colon carcinoma cell lines could be different pronounced mucin Expression can be demonstrated. Aside from Colo320, at expressing no Muc-1 expression all other tested cell lines with maximum mucin Expression in SkCo1. The HCC cell line HepG2 and HT29 with lower, Colo205 with medium and SkCo1 with high Mucin-1 expression was used for the following Studies on the adenovirally mediated, mucin-1 dependent amplified transgene expression used.

Adenoviral vectors for amplified mucin-specific gene expression

Rekombinante adenovirale Vektoren wurden gemäß Fig. 3 mit folgenden Promoter-Elementen konstruiert: Cytomegalovirus (CMV)-kontrollierte Luciferase-Genexpression (A), mucin-1 spezifische Genexpression unter Verwendung des DF3/Muc-1 Promoters (B) und ein mucin-1 spezifisches Genexpressionssystem zur Luciferase-Genexpression unter Verwendung einer integrierten Kassette zur Gal4VP16- Transaktivator-Fusionsprotein-vermittelten Amplifikation der Genexpression (C). Dabei erfolgt die Luciferase- Genexpression sekundär nach mucin-1 abhängiger Gal4VP16 Expression und Bindung an die weiter downstream gelegenen Gal4-Bindungsstellen mit VP16 vermittelter Transaktivierung dieser sekundären Genexpression. Diese Elemente wurden in die E1-Region adenoviraler Expressionsplasmide kloniert und die Expressionsplasmide mit pBHG10 wie beschrieben, zur Generation rekombinanter Adenoviren in 293-Zellen homolog rekombiniert. Recombinant adenoviral vectors were constructed according to FIG. 3 with the following promoter elements: cytomegalovirus (CMV) -controlled luciferase gene expression (A), mucin-1 specific gene expression using the DF3 / Muc-1 promoter (B) and a mucin-1 specific gene expression system for luciferase gene expression using an integrated cassette for Gal4VP16 transactivator fusion protein-mediated amplification of gene expression (C). The luciferase gene expression takes place secondarily after mucin-1 dependent Gal4VP16 expression and binding to the further downstream Gal4 binding sites with VP16 mediated transactivation of this secondary gene expression. These elements were cloned into the E1 region of adenoviral expression plasmids and the expression plasmids were homologously recombined with pBHG10 as described for the generation of recombinant adenoviruses in 293 cells.

Durch partielle Sequenzierung wurden Promoter-Insertion, Transaktivator-Elemente und das Luciferase-Gen verifiziert. Nach Päzipitation der adenoviralen Expressionsplasmide in 293-Zellen sowie Infektion von HT29-Zellen mit den entsprechenden Adenoviren konnte die Luciferase-Genexpression nachgewiesen werden. Fig. 3 veranschaulicht graphisch das System zur amplifizierten Genexpression. Der mucin-1 spezifische Promoter (DF3/Muc1) dient nicht direkt der Kontrolle der Transgen-Expression (B) sondern zunächst der Expression eines Gal4VP16 Fusionsproteins (C). Dieser sehr potente Transaktivator führt nach Bindung an eine weiter downstream gelegene Gal4-Bindungsstelle über die VP16- Domäne zur Aktivierung der nachgeschalteten Transgen- Expression. Diese Konstrukte wurden mit der Transgen- Expression durch einen CMV Promotor (A) verglichen. Gal4B5: In 5facher Kopie vorliegende Gal4-Bindungsstelle. Partial sequencing verified promoter insertion, transactivator elements and the luciferase gene. After the adenoviral expression plasmids had been precipitated in 293 cells and the HT29 cells had been infected with the corresponding adenoviruses, the luciferase gene expression could be detected. Fig. 3 graphically illustrates the system for the amplified gene expression. The mucin-1 specific promoter (DF3 / Muc1) is not used directly to control transgene expression (B) but first to express a Gal4VP16 fusion protein (C). After binding to a downstream Gal4 binding site via the VP16 domain, this very potent transactivator leads to activation of the downstream transgene expression. These constructs were compared to transgene expression by a CMV promoter (A). Gal4B5: 5-fold copy of the Gal4 binding site.

Fig. 4 veranschaulicht die Klonierung adenoviraler Vektoren zur spezifischen, amplifizierten Genexpression. Die in Fig. 3 beschriebenen Konstrukte wurden in die E1- Region entsprechender rekombinanter, replikationsdefizienter Adenoviren eingebaut. Die Konstruktion dieser Adenoviren erfolgte durch nachfolgende Kopräzipitation mit pBHG10 zur homologen Rekombination in 293-Zellen. Figure 4 illustrates the cloning of adenoviral vectors for specific, amplified gene expression. The constructs described in FIG. 3 were inserted into the E1 region of corresponding recombinant, replication-deficient adenoviruses. These adenoviruses were constructed by subsequent coprecipitation with pBHG10 for homologous recombination in 293 cells.

Amplification of gene expression by Gal4vP16- transactivation

Um die Amplifikation der Genexpression durch Integration eines Gal4VP16-Fusionsprotein-Genes und der entsprechenden Gal4-Bindungsstellen zu quantifizieren, wurden verschiedene, mucin-negative (HepG2) und mucin-positive (HT29, Colo205, SkCo1) Zell-Linien mit Ad.Muc-luc oder Ad.Muc_bin-luc infiziert, und nach 24 Stunden die Luciferase- Genexpression pro zelluläres Gesamtprotein verglichen, die Ergebnisse sind in Fig. 5 veranschaulicht. In order to quantify the amplification of the gene expression by integrating a Gal4VP16 fusion protein gene and the corresponding Gal4 binding sites, various mucin-negative (HepG2) and mucin-positive (HT29, Colo205, SkCo1) cell lines with Ad.Muc- luc or Ad.Muc _bin -luc, and after 24 hours the luciferase gene expression per total cellular protein was compared, the results are illustrated in FIG. 5.

Fig. 5 zeigt insbesondere die Amplifikation der Genexpression durch das binäre System. Zur Quantifikation der Amplifikation wurden HepG2 (HCC) und verschiedene humane Kolonkarzinom-Zell-Linien (HT29, Colo205 und SkCo1) mit unterschiedlichen viralen Dosen (multiplicity of infection = m.o.i.) der Adenoviren Ad.Muc_bin-luc und Ad.Muc-luc infiziert und die Luciferase-Aktivität als Maß der Transgen-Expression quantifiziert. Fig. 5 shows in particular, the amplification of gene expression by the binary system. HepG2 (HCC) and various human colon carcinoma cell lines (HT29, Colo205 and SkCo1) were infected with different viral doses (multiplicity of infection = moi) of the adenoviruses Ad.Muc _bin -luc and Ad.Muc-luc to quantify the amplification and quantified luciferase activity as a measure of transgene expression.

Die rekombinanten Adenoviren Ad.Muc-luc und Ad.Muc_bin-luc beinhalten beide den mucin-1 spezifischen Promotor, unterscheiden sich jedoch bezüglich des Vorhandenseins eines binären Systems zur Amplifikation der Genexpression. In HepG2 konnte eine, unabhängig von der m.o.i. der verwendeten rekombinanten Adenoviren, 50-200fache Amplifikation der Genexpression erreicht werden. In den mucin-1 positiven Zell-Linien war die Amplifikation von der verwendeten m.o.i. abhängig und betrug bis 250fach. Bei einer m.o.i. von 100 entsprach die Amplifikation der Genexpression im mucin-negativen System der Amplifikation in den mucin-positiven Zell-Linien. The recombinant adenoviruses Ad.Muc-luc and Ad.Muc _bin -luc both contain the mucin-1 specific promoter, but differ in the presence of a binary system for amplifying gene expression. In HepG2, independent of the moi of the recombinant adenoviruses used, a 50-200 fold amplification of the gene expression could be achieved. In the mucin-1 positive cell lines, the amplification was dependent on the moi used and was up to 250 times. With a moi of 100, the amplification of the gene expression in the mucin-negative system corresponded to the amplification in the mucin-positive cell lines.

Comparison of amplified, specific expression with that CMV promoter

Der konstitutive virale Cytomegalovirus (CMV)-Promoter ermöglicht in einer Vielzahl adenoviral gentherapeutischer präklinischer- und klinischer Studien eine zwar nur temporäre aber hohe Transgen-Expression. Es wurde daher der Frage nachgegangen, ob die adenoviralen Vektoren zur mucin- spezifischen und Gal4VP16-amplifizierten Genexpression eine mit dem CMV-Promoter vergleichbare Genexpression besitzen und damit effektive gentherapeutische Ansätze zur spezifischen Gentherapie ermöglichen. The constitutive viral cytomegalovirus (CMV) promoter enables in a variety of adenoviral gene therapy preclinical and clinical studies only one temporary but high transgene expression. It was therefore the Investigated whether the adenoviral vectors for mucin specific and Gal4VP16-amplified gene expression have comparable gene expression with the CMV promoter and thus effective gene therapy approaches to enable specific gene therapy.

Dazu wurden wiederum verschiedene mucin-positive und mucin- negative Zell-Linien mit unterschiedlichen m.o.i. von entweder Ad.CMV-luc, Ad.Muc-luc oder Ad.Muc_bin-luc infiziert und nach 24 Stunden die Luciferase-Transgenexpression bezogen auf das Gesamt-Zellprotein bestimmt. Fig. 6 zeigt hierzu einen Vergleich der amplifizierten spezifischen Genexpression mit der CMV-vermittelten Genexpression. Verschiedene mucin-1 positive- und negative Zell-Linien wurden wiederum mit unterschiedlichen m.o.i. der Adenoviren Ad.Muc_bin-luc, Ad.Muc-luc und Ad.CMV-luc infiziert und die Luciferase-Genexpression quantifiziert. In addition, different mucin-positive and mucin-negative cell lines were infected with different moi of either Ad.CMV-luc, Ad.Muc-luc or Ad.Muc _bin -luc and after 24 hours the luciferase transgene expression based on the total -Cell protein determined. Fig. 6 shows this, a comparison of the amplified specific gene expression with the CMV-mediated gene expression. Different mucin-1 positive and negative cell lines were again infected with different moi of the adenoviruses Ad.Muc _bin -luc, Ad.Muc-luc and Ad.CMV-luc and the luciferase gene expression was quantified.

Die Verwendung des Ad.Muc_bin-luc ergab im Vergleich zum Ad.CMV-luc bereits in der mucin-negativen Zelllinie HepG2 eine 7- bis 1,3fach (m.o.i. = 100) höhere Luciferase- Genexpression, in mucin-positiven Zell-Linien war die Ad.Muc_bin-luc vermittelte Genexpression gegenüber Ad.CMV-luc mit jedoch bis zu 590fach deutlich überlegen. Insbesondere bei den höheren und damit nebenwirkungsrelevanteren m.o.i.s (10 und 100) resultierte eine höher-spezifische Genexpression durch den DF3/Muc-1-Promoter in mucin- positiven Zellen in einer deutlichen Überlegenheit dieses Systems im Vergleich zu Ad.CMV-luc. Diese Daten illustrieren das Potential des Ad.Muc_bin-luc für eine spezifische und hocheffiziente Gentherapie mucin-1 positiver Tumorzellen. The use of the Ad.Muc _bin -luc, compared to the Ad.CMV-luc, resulted in a 7- to 1.3-fold (moi = 100) higher luciferase gene expression in the mucin-negative cell line HepG2, in mucin-positive cell lines Ad.Muc _bin -luc mediated gene expression was clearly superior to Ad.CMV-luc with up to 590-fold. Particularly in the case of the higher and therefore more side effect-relevant mois (10 and 100), a more specific gene expression by the DF3 / Muc-1 promoter in mucin-positive cells resulted in a clear superiority of this system in comparison to Ad.CMV-luc. These data illustrate the potential of the Ad.Muc _bin -luc for a specific and highly efficient gene therapy of mucin-1 positive tumor cells.

Darüber hinaus wurde die Transgen-Expression von Ad.Muc- luc, also dem adenoviralen Vektor zur spezifischen, aber nicht amplifizierten Transgen-Expression, mit dem Ad.CMV- luc verglichen, auch hierzu sind die Ergebnisse in Fig. 6 veranschaulicht. Trotz spezifischer Genexpression ist bei höheren m.o.i. diese Transgen-Expression selbst in mucin- positiven Zell-Linien ohne Amplifikation der Verwendung des CMV-Promoters unterlegen. In addition, the transgene expression of Ad.Mucluc, that is to say the adenoviral vector for specific but not amplified transgene expression, was compared with the Ad.CMV-luc, and the results are also illustrated in FIG. 6. Despite specific gene expression, this transgene expression is inferior to the use of the CMV promoter even in mucin-positive cell lines without amplification at higher moi.

In Tabelle 2 werden verschiedene mucin-positive Kolonkarzinom-Zell-Linien mit der mucin-negativen HepG2- Zellinie bezüglich der Transgen-Expression nach Infektion mit entweder Ad.Muc-luc (links) oder Ad.Muc_bin-luc (rechts) verglichen. Erkennbar ist eine durch das binäre System im Vergleich zum nicht amplifizierten DF3/Muc-1 geringere, aber insbesondere bei höheren m.o.i. erhaltene Spezifität der mucin-abhängigen Genexpression. In Table 2, various mucin-positive colon carcinoma cell lines are compared with the mucin-negative HepG2 cell line with respect to transgene expression after infection with either Ad.Muc-luc (left) or Ad.Muc _bin -luc (right). One can see a lower specificity of the mucin-dependent gene expression compared to the non-amplified DF3 / Muc-1, but in particular obtained with higher moi, due to the binary system.

Dose-corrected transgene expression and Western blot analysis

Die Zell-Linien HepG2, HT29, Colo205 und SkCo1 unterscheiden sich bezüglich ihrer unterschiedlichen adenoviralen Transduktions-Effizienz. Um eine spezifische und amplifizierte Transgen-Expression unabhängig von der Transduktions-Effizienz der untersuchten Zelllinie bestimmen zu können, wurden zunächst die adenoviralen Titer bestimmt, die unter Verwendung des Ad.CMV-luc zu einer, auf das Gesamt-Zellprotein bezogen vergleichbaren Transgen- Expression führen. Mit einer m.o.i. von 6 (HepG2), 80 (HT29), 240 (Colo205) und 100 (SkCo1) ergab sich bei der Infektion dieser Zell-Linien mit Ad.CMV-luc bezüglich der Luciferase-Genexpression kein signifikanter Unterschied, dies ist in Fig. 7 dargestellt. Insbesondere ist hier die dosis-adaptierte Transgen-Expression veranschaulicht. Zur Kompensation einer unterschiedlichen Transduktions- Effizienz der verschiedenen Karzinom-Zell-Linien wurden verschiedene m.o.i. ermittelt, die unter Verwendung des Ad.CMV-luc zu einer vergleichbaren Transgen-Expression führten (HepG2: 6 m.o.i., HT29: 80 m.o.i., Colo205: 240 m.o.i., SkCo1: 100 m.o.i.). Wird der Ad.CMV-luc Vektor gegen das rekombinante Adenovirus zur spezifischen, amplifizierten Genexpression, Ad.Muc_bin-luc ausgetauscht, so kommt es zu einer für HT29 und Colo205 signifikanten und SkCo1 gegenüber HepG2 hochsignifikanten Zunahme der Transgen-Expression. Im übrigen sind die Transgen- Expressionsraten signifikant höher als bei dem Ad.CMV-luc unter entsprechender m.o.i. The cell lines HepG2, HT29, Colo205 and SkCo1 differ in their different adenoviral transduction efficiency. In order to be able to determine a specific and amplified transgene expression independently of the transduction efficiency of the investigated cell line, the adenoviral titers were first determined which, using the Ad.CMV-luc, resulted in a comparable transgene expression based on the total cell protein to lead. With a moi of 6 (HepG2), 80 (HT29), 240 (Colo205) and 100 (SkCo1), there was no significant difference in the infection of these cell lines with Ad.CMV-luc with regard to the luciferase gene expression, this is in Fig. 7 shown. In particular, the dose-adapted transgene expression is illustrated here. To compensate for a different transduction efficiency of the different carcinoma cell lines, different moi were determined, which led to a comparable transgene expression using the Ad.CMV-luc (HepG2: 6 moi, HT29: 80 moi, Colo205: 240 moi , SkCo1: 100 moi). If the Ad.CMV-luc vector is exchanged for the recombinant adenovirus for specific, amplified gene expression, Ad.Muc _bin -luc, there is an increase in transgene expression which is significant for HT29 and Colo205 and SkCo1 is highly significant compared to HepG2. Otherwise, the transgene expression rates are significantly higher than with the Ad.CMV-luc under the corresponding moi

Die oben erwähnten Zell-Linien wurden jetzt mit den entsprechenden m.o.i. Ad.Muc_bin-luc infiziert und die Luciferase-Genexpression nach 24 Stunden auf das Gesamt- Zellprotein bezogen quantifiziert. Im Vergleich zu HepG2 ergab sich jetzt für die mucin-1 positiven Zell-Linien HT29 eine signifikant - (p < 0,05) und für Colo205 (p < 0,01) sowie SkCo1 (p < 0,005) eine hochsignifikant überlegene Transgen-Expression. Zelllysate nichtinfizierter Zellen, mit Ad.CMV-luc sowie Ad.Muc_bin-luc infizierter Zellen wurden nachfolgend bezüglich der Expression des Gal4VP16- Fusionsproteins hin untersucht, die Expression ist in Fig. 8 veranschaulicht. Insbesondere ist hier die Western Blot Analyse der Gal4VP16-Transaktivator-Expression dargestellt. Zelllysate des unter Fig. 7 vorgestellten Experimentes wurden im Western-Blot auf die Anwesenheit des Gal4VP16-Fusionsproteins hin untersucht. Das Fusionsprotein konnte in mucin-1 positiven Zellen nach Infektion mit Ad.Muc_bin-luc, nicht jedoch in HepG2, nichtinfizierten oder Ad.CMV-luc infizierten Zellen nachgewiesen werden. Diese Daten belegen die adenoviral vermittelte mucin-1 abhängige Expression des Gal4VP16 Fusionsproteins und daraus resultierende Transaktivierung der Luciferase-Genexpression. The cell lines mentioned above were now infected with the corresponding moi Ad.Muc _bin -luc and the luciferase gene expression was quantified based on the total cell protein after 24 hours. Compared to HepG2, there was now a significant - (p <0.05) for the mucin-1 positive cell lines HT29 and for Colo205 (p <0.01) and SkCo1 (p <0.005) a highly significantly superior transgene expression , Cell lysates of uninfected cells, cells infected with Ad.CMV-luc and Ad.Muc _bin -luc were subsequently examined for the expression of the Gal4VP16 fusion protein. The expression is illustrated in FIG. 8. In particular, the Western blot analysis of the Gal4VP16 transactivator expression is shown here. Cell lysates from the experiment presented in FIG. 7 were examined for the presence of the Gal4VP16 fusion protein in a Western blot. The fusion protein could be detected in mucin-1 positive cells after infection with Ad.Muc _bin -luc, but not in HepG2, uninfected or Ad.CMV-luc infected cells. These data demonstrate the adenoviral-mediated mucin-1 dependent expression of the Gal4VP16 fusion protein and the resulting transactivation of the luciferase gene expression.

Das Fusionsprotein konnte in mit Ad.Muc_bin-luc infizierten mucin-1 positiven Tumorzellen nachgewiesen werden, nicht jedoch in HepG2-Zellen, in nichtinfizierten oder mit Ad.CMV-luc infizierten Tumorzellen. Die Aktin-Genexpression zeigte in den untersuchten Zelllysaten erwartungsgemäß keinen Unterschied. The fusion protein could be detected in mucin-1 positive tumor cells infected with Ad.Muc _bin -luc, but not in HepG2 cells, in uninfected or Ad.CMV-luc infected tumor cells. As expected, actin gene expression showed no difference in the cell lysates examined.

Evaluation of the test results

Die vorstehend erläuterten Experimente beschreiben erstmals ein singuläres rekombinantes adenovirales Vektorsystem mit integriertem Gal4VP16 und korrespondierenden Gal4- Bindungsstellen zur Amplifikation spezifischer Genexpression. The experiments described above describe for the first time a singular recombinant adenoviral vector system with integrated Gal4VP16 and corresponding Gal4- Binding sites for amplification specific Gene expression.

Es wurde ein DF3/Muc-1 Promoter zur spezifischen Genexpression in mucin-1 positiven Kolonkarzinom-Zellen verwandt und die Transgen-Expression mittels Luciferase- Genexpression quantifiziert. Die hohe Transgen-Expression in mucin-positiven Kolonkarzinom-Zellen sowie vergleichsweise niedrige Transgen-Expression in mucin- negativen Zellen ermöglichen eine gewebe- und tumorspezifische adenovirale Gentherapie. Es konnte gezeigt werden, dass die amplifizierte, tumorspezifische Genexpression in diesem System signifikant höher als in vergleichbaren adenoviralen Vektoren unter Verwendung des Cytomegalovirus-Promoters war. A DF3 / Muc-1 promoter for specific Gene expression in mucin-1 positive colon carcinoma cells related and transgene expression using luciferase Gene expression quantified. The high transgene expression in mucin-positive colon carcinoma cells as well comparatively low transgene expression in mucin negative cells allow tissue and tumor-specific adenoviral gene therapy. It could be shown be that the amplified, tumor-specific Gene expression in this system was significantly higher than in comparable adenoviral vectors using the Was a cytomegalovirus promoter.

Die Amplifikation der Transgen-Expression durch Integration des Gal4VP16-Systems resultierte in einer bis zu 250fach gesteigerten Transgen-Expression. Bemerkenswerterweise konnte in mucin-1 positiven Zellen eine Abhängigkeit der Amplifikation von der verwendeten m.o.i. gezeigt werden. Diese Ergebnisse sind möglicherweise durch einen potenzierenden Effekt der Transgen-Expression nach mehrfacher Infektion derselben Zielzelle zurückzuführen, bei der gebildete Gal4VP16-Fusionsproteine an allen verfügbaren Gal4-Bindungsstellen zur Transaktivierung der Luciferase-Genexpression führen können. Amplification of transgene expression by integration of the Gal4VP16 system resulted in up to 250 times increased transgene expression. Remarkably, could show a dependency of the in mucin-1 positive cells Amplification from the m.o.i. to be shown. These results may be due to one potentiating effect of transgene expression multiple infections of the same target cell, at which Gal4VP16 fusion proteins are formed at all available Gal4 binding sites to transactivate the Luciferase gene expression can lead.

Eine fehlende Steigerung der Amplifikation durch höhere m.o.i. in der mucin-negativen HepG2-Zelllinie ist möglicherweise auf die im Vergleich zu den anderen Zell- Linien höhere Transduktions-Effizienz und Sättigung bereits bei niedriger m.o.i. zurückzuführen. Weitere Untersuchungen sind nötig, um dieses Phänomen hinreichend zu erklären, bei hohen und damit toxizitäts-relevanten m.o.i. jedoch bestehen bezüglich der Amplifikation der spezifischen Genexpression keine Unterschiede zwischen mucin-positiven und mucin-negativen Zell-Linien. A lack of amplification due to higher ones m.o.i. in the mucin-negative HepG2 cell line possibly on the compared to the other cellular Lines already have higher transduction efficiency and saturation at low m.o.i. due. Further investigations are needed to adequately explain this phenomenon at high and thus toxicity-relevant m.o.i. however exist regarding the amplification of the specific Gene expression made no difference between mucin-positive and mucin-negative cell lines.

Die Amplifikation der spezifischen Genexpression durch das binäre System (Gal4VP16-Gal4-Bindungsstellen) führte nicht zu einem signifikanten Verlust der Spezifität dieses therapeutischen Ansatzes und der Vergleich mit dem Cytomegalovirus-Promoter ergab eine bis 590fach höhere Transgen-Expression in mucin-1 positiven Zell-Linien. In der mucin-negativen HepG2-Zelllinie war die amplifizierte Transgen-Expression 7-1,3fach höher als mit vergleichbaren CMV-Promoter Konstrukten. Diese Daten illustrieren die Potenz adenoviraler Vektoren mit integriertem Gal4VP16- Gal4B5 in der tumorspezifischen Gentherapie; gegenüber konventionellen Promotoren wird sich bei dieser hohen Transgenexpressions-Effizienz die adenovirale Dosis (m.o.i.) und damit adenoviral bedingte toxische Nebenwirkungen sogar reduzieren lassen. The amplification of the specific gene expression by the binary system (Gal4VP16-Gal4 binding sites) not a significant loss of specificity this therapeutic approach and comparison with that Cytomegalovirus promoters were up to 590 times higher Transgene expression in mucin-1 positive cell lines. In the mucin-negative HepG2 cell line was the amplified one Transgene expression 7-1.3 times higher than with comparable CMV promoter constructs. These data illustrate the Potency of adenoviral vectors with integrated Gal4VP16- Gal4B5 in tumor-specific gene therapy; across from conventional promoters will turn out to be high at this Transgene expression efficiency the adenoviral dose (m.o.i.) and thus adenoviral-related toxic Even reduce side effects.

Die Überlegenheit der adenoviralen Vektoren zur spezifischen und amplifizierten Transgenexpression gegenüber Ad.CMV-luc in mucin-positiven Tumorzellen konnte auch nach Kompensation der unterschiedlichen Transduktions- Effizienzen in den verschiedenen Zell-Linien durch entsprechend angepasste m.o.i. illustriert werden und die Expression des Gal4VP16-Fusionsproteins im Western-Blot korrelierte mit der Luciferase-Genexpression. The superiority of the adenoviral vectors specific and amplified transgene expression against Ad.CMV-luc in mucin-positive tumor cells even after compensation of the different transduction Efficiencies in the different cell lines correspondingly adjusted m.o.i. are illustrated and the Expression of the Gal4VP16 fusion protein in a Western blot correlated with luciferase gene expression.

Diese Ergebnisse unterstützen weiterführende Experimente zur portalvenösen und selbst intravenös-systemischen Applikation in mucin-1 positiven hepatischen Mikrometastasen-Tiermodellen. Derzeit wird die Organdistribution der Transgen-Expression nach entsprechender Applikation von rekombinanten Adenoviren zur spezifischen und amplifizierten Expression eines roten Fluoreszenzproteins (RFP2) in vivo untersucht. Diese Distribution der Genexpression wird durch simultane Gabe von rekombinanten Adenoviren zur CMV-kontrollierten Genexpression des Green Fluorescent Protein (GFP) mit dem Verteilungsmuster konventioneller adenoviral gentherapeutischer Ansätze verglichen. Dabei ist die Expression sowohl in mucin-1 positiven intrahepatischen Kolonkarzinom-Metastasen als auch in mucin-1 positiven nicht malignen Zellen z. B. des Gastrointestinaltraktes von besonderem Interesse. These results support further experiments for portal venous and even intravenous systemic Application in mucin-1 positive hepatic Micrometastases animal models. Currently the Organ distribution after transgene expression appropriate application of recombinant adenoviruses specific and amplified expression of a red Fluorescent protein (RFP2) examined in vivo. This Distribution of gene expression is achieved through simultaneous administration from recombinant adenoviruses to CMV-controlled Gene expression of the green fluorescent protein (GFP) with the Distribution pattern of conventional adenoviral gene therapy approaches compared. Here is the Expression in both mucin-1 positive intrahepatic Colon carcinoma metastases as well as in mucin-1 positive not malignant cells e.g. B. the gastrointestinal tract of of special interest.

Die Verwendung des Muc-1/DF3 Promotersystems hat gegenüber dem CEA-Promoter verschiedene Vorzüge: Gastrointestinale Tumoren und insbesondere kolorektale Karzinome exprimieren häufiger Mucin-1 als CEA, darüber hinaus kommt es im Gegensatz zur CEA-Expression bei Metastasierung und Tumorprogression zu einem Anstieg der Mucin-1 Genexpression. Vor Beginn eines derartigen Ansatzes könnte eine immunhistologische Untersuchung auf Mucin-1, wie in dieser Arbeit illustriert, Aufschluß über die mögliche Effizienz dieser experimentellen Therapie geben. The use of the Muc-1 / DF3 promoter system has opposed various advantages to the CEA promoter: gastrointestinal Express tumors and especially colorectal cancer Mucin-1 more common than CEA, moreover it occurs in Contrast to CEA expression in metastasis and Tumor progression to an increase in mucin-1 Gene expression. Before starting such an approach an immunohistological test for mucin-1, as in this work illustrates, shedding light on the possible Give efficiency of this experimental therapy.

Bisher konnten 12 verschiedene Mucine charakterisiert werden. Mit Restriktion einiger Mucine auf bestimmte Organe wird das membranassoziierte Mucin-1 auf fast allen Drüsenepithelzellen, nicht jedoch in Hepatozyten gefunden. Dies begünstigt mucin-1 spezifische Therapieansätze zur Behandlung intrahepatischer Metastasen einer Vielzahl verschiedener Karzinome glandulären Ursprungs. Bei der systemischen Administration dieser Vektoren muß allerdings auch das hohe Potential der amplifizierten Transgen- Expression in glandulären, epithelialen Zellen bedacht werden. Vorteilhaft ist die bei systemischer Applikation rekombinanter Adenoviren bislang nicht nennenswerte Transduktion dieser Zellen. So far, 12 different mucins have been characterized become. With some mucins restricted to certain organs the membrane-associated mucin-1 becomes on almost all Glandular epithelial cells, but not found in hepatocytes. This favors mucin-1 specific therapeutic approaches Treatment of a variety of intrahepatic metastases various carcinomas of glandular origin. In the Systemic administration of these vectors must, however also the high potential of amplified transgenic Expression in glandular, epithelial cells considered become. This is advantageous for systemic application recombinant adenoviruses so far not significant Transduction of these cells.

Oben erwähnte Studien zur in vivo Expression von Fluoreszenz-Proteinen werden helfen, das Potential einer möglicherweise sogar systemischen Applikation abzuschätzen, bei der intratumoralen intrahepatischen und portalvenösen Applikation werden diese Vektoren die Sicherheit adenoviral gentherapeutischer Ansätze signifikant erhöhen. Die Integration tumorspezifischer oder gewebespezifischer Gal4VP16-Expression und korrespondierender Gal4- Bindungsstellen mit dem gewünschten Transgen in einem adenoviralen Konstrukt führte zu einer gegenüber Zwei- Vektorsystemen überlegenen Amplifikation der Transgen- Expression, da dieser Ansatz nicht die simultane Infektion einer Zielzelle mit zwei verschiedenen Adenoviren zur Amplifikation voraussetzt. Above-mentioned studies on the in vivo expression of Fluorescence proteins will help unlock the potential of one possibly even to estimate systemic application, in intratumoral intrahepatic and portal venous Applied, these vectors become adenoviral security significantly increase gene therapy approaches. The Integration of tumor-specific or tissue-specific Gal4VP16 expression and corresponding Gal4 Binding sites with the desired transgene in one adenoviral construct resulted in a versus Vector systems superior amplification of transgenic Expression because this approach is not the simultaneous infection a target cell with two different adenoviruses Requires amplification.

6. Technical use and economic prospects

Dieses System zur spezifischen und amplifizierten adenoviralen Transgen-Expression stellt ein innovatives Konzept in der adenoviralen Gentherapie gastrointestinaler und anderer Tumoren dar. Diese Konstrukte können durch spezifische Expression die Sicherheit zukünftiger gentherapeutischer Ansätze erhöhen. Durch Amplifikation der spezifischen Genexpression wird auch bei systemischer Administration eine signifikante Transgen-Expression erzielt werden können, die der Verwendung des konstitutiven CMV-Promoters vergleichbar ist. This system for specific and amplified adenoviral transgene expression represents an innovative Concept in gastrointestinal adenoviral gene therapy and other tumors. These constructs can by specific expression the security of future increase gene therapy approaches. By amplifying the specific gene expression is also used in systemic Administration of significant transgene expression can be achieved using the constitutive CMV promoter is comparable.

Abhängig von einer möglichen Transduktion anderer, mucin-1 positiver, nichtmaligner Zellen werden diese Vektoren zur systemischen Administration geeignet sein. Unabhängig von einer solchen Transduktion eröffnet die portalvenöse Gabe dieser Vektoren bereits jetzt neue Möglichkeiten bei der Gentherapie intrahepatischer Metastasen kolorektaler Karzinome. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, daß entsprechende Vektoren zur Zytokinexpression (Interleukin- 12 und Interleukin-18) gegenüber der Verwendung konstitutiver Promotoren (CMV) eine höhere therapeutische Breite und Effizienz im Tiermodell besitzen. Möglich ist bei Infektion einer heterogenen Tumorpopulation eine Induktion antitumoraler T-Lymphozyten und NK-Zellen, die nicht isoliert gegen die zytokinproduzierenden, mucin-1 positiven Karzinomzellen gerichtet ist, sondern sich gegen gemeinsame, auf mucin-1 positiven und -negativen Zellen vorliegende immunogenen Determinanten des entsprechenden Karzinoms richtet. Depending on a possible transduction of others, mucin-1 these vectors become positive, non-malignant cells systemic administration. Independent of Such a transduction opens the portal venous gift these vectors are already offering new opportunities in the Gene therapy of intrahepatic colorectal metastases Carcinomas. The results so far show that corresponding vectors for cytokine expression (interleukin 12 and interleukin-18) versus use constitutive promoters (CMV) have a higher therapeutic Have breadth and efficiency in animal models. Is possible if a heterogeneous tumor population is infected, a Induction of antitumoral T lymphocytes and NK cells that not isolated against the cytokine-producing, mucin-1 positive carcinoma cells, but against common, on mucin-1 positive and negative cells present immunogenic determinants of the corresponding Carcinoma aimed.

Das vorgestellte System zur amplifizierten Genexpression mit Hilfe adenoviraler Vektoren läßt sich durch Integration anderer tumor- oder gewebespezifischer Promotoren auf die Therapie anderer Tumorentitäten (Therapie hepatozellulärer Karzinome durch AFP-spezifische, amplifizierte Genexpression) übertragen. The presented system for amplified gene expression with the help of adenoviral vectors by integration other tumor or tissue-specific promoters on the Therapy of other tumor entities (therapy of hepatocellular Carcinomas amplified by AFP-specific Gene expression).

Zusammenfassend ermöglichen diese adenoviralen Vektoren erstmals eine adenoviral vermittelte, tumorspezifische und dabei hohe Transgenexpression, die diesen innovbativen Therapieansatz effizienter und sicherer macht. Wahrscheinlich ist eine Reduktion möglicher, therapieassoziierter Nebenwirkungen durch Reduktion der adenoviralen Dosis bei hoher intratumoraler Transgenexpression. In summary, these enable adenoviral vectors for the first time an adenoviral mediated, tumor specific and high transgene expression that this innovative Makes therapy approach more efficient and safer. Probably a reduction is possible Therapy-associated side effects by reducing the adenoviral dose at high intratumoral Transgene expression.

Summary of the test results

Die Expression von Mucinen wurde in einer Vielzahl von Kolonkarzinomen nachgewiesen. Durch die Mucin-1/DF3- Promoter-vermittelte spezifische Genexpression konnte die systemische Toxizität in gentherapeutischen Ansätzen verringert werden. Diese spezifische, jedoch im Vergleich zu konstitutiven viralen Promotern (Cytomegalie-Virus- Promoter) zu schwache Genexpression in mucin-positiven Geweben hat entsprechende wirkungsvolle gentherapeutische Ansätze bislang verhindert. Es wurden daher neue rekombinante adenovirale Vektoren zur amplifizierten, spezifischen Genexpression entwickelt. Dabei wurde der mucin-spezifische Promoter Muc-1/DF3 zur Expression eines Gal4VP16-Fusionsproteins verwendet. Expression of mucins has been demonstrated in a variety of Colon carcinomas detected. Through the Mucin-1 / DF3- The promoter-mediated specific gene expression could systemic toxicity in gene therapy approaches be reduced. This specific, however, in comparison to constitutive viral promoters (cytomegalovirus virus Promoter) too weak gene expression in mucin-positive Tissue has correspondingly effective gene therapy So far, approaches have been prevented. So there were new ones recombinant adenoviral vectors for amplified, specific Gene expression developed. The mucin was specific Promoter Muc-1 / DF3 for the expression of a Gal4VP16 fusion protein used.

Derselbe adenovirale Vektor beinhaltet ebenfalls Gal4- Bindungsstellen unmittelbar vor der Transgen-Region. In mucin-positiven Zellen kommt es somit zur Expression des Gal4VP16-Fusionsproteins als Intermediärprodukt, welches durch seine VP16-Transaktivator-Domäne nach Bindung über die Gal4-Domäne an den Gal4-Bindungsstellen zur Transskription des therapeutischen Genes führt. Zur Validierung dieses Konzeptes der amplifizierten, spezifischen Genexpression wurden Adenoviren konstruiert, bei denen einerseits die E1-Region durch den Mucin-Promoter und das Luciferase-Gen ersetzt wurde (Ad.Muc-luc), andererseits zwischen mucin-spezifischem Promoter und Luciferase-Gen die eben erwähnten Gene für das Gal4VP16- Fusionsprotein und die fünffachen Gal4-Bindungsstellen eingefügt wurden (Ad.Muc_bin-luc). Diese innovativen adenoviralen Vektoren wurden mit Adenoviren zur Luciferase- Genexpression unter Kontrolle des konstitutiven viralen CMV-Promoter (Ad.CMV-luc) verglichen. The same adenoviral vector also contains Gal4 binding sites immediately before the transgene region. In mucin-positive cells there is thus expression of the Gal4VP16 fusion protein as an intermediate product, which leads to transcription of the therapeutic gene through its VP16 transactivator domain after binding via the Gal4 domain at the Gal4 binding sites. To validate this concept of amplified, specific gene expression, adenoviruses were constructed in which on the one hand the E1 region was replaced by the mucin promoter and the luciferase gene (Ad.Muc-luc), and on the other hand between the mucin-specific promoter and the luciferase gene the genes just mentioned for the Gal4VP16 fusion protein and the five-fold Gal4 binding sites were inserted (Ad.Muc _bin -luc). These innovative adenoviral vectors were compared to adenoviruses for luciferase gene expression under the control of the constitutive viral CMV promoter (Ad.CMV-luc).

Die Mucin-1 Genexpression wurde in einer Vielzahl kolorektaler Karzinom-Zell-Linien mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers anti-Muc1/DF3 nachgewiesen. Diese und mucin-negative Zell-Linien wurden mit den verschiedenen rekombinanten Adenoviren infiziert und bezüglich der Luciferase-Genexpression charakterisiert. Mucin-1 gene expression has been demonstrated in a variety colorectal carcinoma cell lines using a monoclonal antibody anti-Muc1 / DF3 detected. This and mucin-negative cell lines were used with the different recombinant adenoviruses infected and regarding the Characterized luciferase gene expression.

Die Integration des binären Systems, bestehend aus dem Gal4VP16-Fusionsprotein und einer entsprechenden Gal4- Bindungsstelle resultierte gegenüber adenoviralen Vektoren nur mit dem Mucin-Promoter Muc-1/DF3 in einer bis zu 250fachen Amplifikation der Genexpression in den verschiedenen Karzinom-Zell-Linien. Die Transgen-Expression in diesen mucin-1-spezifischen und Gal4VP16-amplifizierten adenoviralen Vektoren war dabei in mucin-1 positiven Kolonkarzinom-Zell-Linien bis zu 590fach höher als nach Infektion mit rekombinanten Adenoviren zur Luciferase- Genexpression unter Kontrolle des CMV-Promoters. Im Gegensatz dazu war die Genexpression durch diese binären Vektoren in Muzin-1 negativen Zell-Linien nur 1,3- bis 7fach höher als mit dem CMV-Promoter. The integration of the binary system consisting of the Gal4VP16 fusion protein and a corresponding Gal4 Binding site resulted against adenoviral vectors only with the mucin promoter Muc-1 / DF3 in up to 250 times Amplification of gene expression in the different Carcinoma cell lines. The transgene expression in these mucin-1 specific and Gal4VP16 amplified adenoviral vectors were positive in mucin-1 Colon carcinoma cell lines up to 590 times higher than after Recombinant adenovirus infection for luciferase Gene expression under the control of the CMV promoter. in the In contrast, gene expression was through this binary Vectors in mucin-1 negative cell lines are only 1.3 to 7 fold higher than with the CMV promoter.

Nachfolgend wurden verschiedene Kolonkarzinom-Zell-Linien und eine HCC-Zelllinie mit Ad.CMV-luc in unterschiedlichen adenoviralen Titern infiziert, welche die Transduktions- Effizienzen kompensieren und in einer vergleichbaren Genexpression resultierten. Erfolgte die Infektion dieser Karzinom-Zell-Linien stattdessen mit Adenoviren zur mucin-1 abhängigen Luciferase Genexpression unter Amplifikation durch ein binäres System, konnte eine signifikant bis hochsignifikant höhere Transgen-Expression in den mucin-1 positiven Kolonkarzinom-Zellen nachgewiesen werden. Im Western Blot konnte das Gal4VP16-Fusionsprotein nach Infektion von mucin-1 positiven Zell-Linien mit dem entsprechenden Adenovirus nachgewiesen werden. Diese neuartigen adenoviralen Vektoren kombinieren die gewebespezifische Genexpression durch den Muc-1/DF3- Promoter mit der hocheffizienten Genexpression durch Transaktivierung mittel des Gal4VP16-Fusionsproteins bei erhaltener Spezifität. Die Versuchsergebnisse zeigen, daß diese Vektoren tumorspezifische und effiziente adenovirale Gentherapie ermöglichen werden und die therapeutische Breite dieses experimentellen Therapieansatzes erheblich erhöhen wird. Darüber hinaus sind diese adenoviralen Vektoren in mucin-1 positiven Zell-Linien den rekombinanten Adenoviren unter Verwendung des CMV-Promoters bezüglich ihrer Transgen-Expression überlegen. Tabelle 1 Tumorspezifische Promotoren in der Gentherapie Auflistung aller gentherapeutischen Ansätze unter Verwendung tumor- oder gewebespezifischer Promotoren

Various colon carcinoma cell lines and an HCC cell line were subsequently infected with Ad.CMV-luc in different adenoviral titers, which compensate for the transduction efficiencies and resulted in a comparable gene expression. If these carcinoma cell lines were infected instead with adenoviruses for mucin-1-dependent luciferase gene expression with amplification by a binary system, a significantly to significantly higher transgene expression could be detected in the mucin-1 positive colon carcinoma cells. The Gal4VP16 fusion protein was detected in the Western blot after infection of mucin-1 positive cell lines with the corresponding adenovirus. These novel adenoviral vectors combine the tissue-specific gene expression by the Muc-1 / DF3 promoter with the highly efficient gene expression by transactivation by means of the Gal4VP16 fusion protein while maintaining specificity. The experimental results show that these vectors will enable tumor-specific and efficient adenoviral gene therapy and will significantly increase the therapeutic breadth of this experimental therapeutic approach. In addition, these adenoviral vectors in mucin-1 positive cell lines are superior to recombinant adenoviruses using the CMV promoter in terms of their transgene expression. Table 1 Tumor-specific promoters in gene therapy List of all gene therapy approaches using tumor- or tissue-specific promoters

Table 2 Relative adenoviral gene expression

Die mucin-1 spezifische Genexpression wurde durch Vergleich der Transgen-Expression in mit Ad.Muc-luc (links) und Ad.Muc_bin-luc (rechts) infizierten mucin-1 positiven Zellen (Colo205, HT29 und SkCo1) mit der mucin-1 negativen HepG2-Zelllinie ermittelt.

The mucin-1 specific gene expression was determined by comparing the transgene expression in mucin-1 positive cells (Colo205, HT29 and SkCo1) infected with Ad.Muc-luc (left) and Ad.Muc _bin -luc (right) with the mucin 1 negative HepG2 cell line determined.

Claims

1. A method for carrying out a specific gene expression in colon carcinoma cell lines, in which recombinant adenoviral vectors are used for gene expression, characterized in that the gene expression is mediated by a mucin-1 / DF3 promoter and that a Gal4 for amplification of the gene expression / VP16 fusion protein is generated.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the gene encoding Gal4 / VP16 fusion protein into the E1 region of recombinant adenoviruses is cloned.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized that continue in the same adenovirus at least one further Gal4 binding site downstream integrated for the induction of transgene expression becomes.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the E1 region by the Mucin promoter and the luciferase gene is replaced.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that between the mucin specific promoter and the luciferase gene genes for the Gal4 / VP16 fusion protein Gal4 binding sites be inserted.

6. The method according to claim 5, characterized in that for the Gal4 / VP16 fusion protein five times Gal4- Binding sites are inserted.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that as viral vectors Adenoviruses are used.

8. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that as viral vectors Retroviruses are used.

9. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that herpes as viral vectors simplex viruses are used.

10. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that as viral vectors Hepatitis B viruses are used.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the luciferase Gene expression under the control of a viral CMV Promoters is carried out.

12. The method according to claim 11, characterized characterized in that the luciferase gene by a gene to induce an anti-tumor immune response is exchanged.

13. The method according to claim 12, characterized characterized in that the luciferase gene is characterized by an IL-2 Gene is exchanged.

14. The method according to claim 12, thereby characterized in that the luciferase gene is characterized by an IL 12 gene is exchanged.

15. The method according to claim 12, characterized characterized in that the luciferase gene is characterized by an IL 18 gen is exchanged.

16. The method according to claim 12, characterized characterized in that the luciferase gene is characterized by a TNF α gene is exchanged.

17. The method according to claim 12, characterized characterized in that the luciferase gene is characterized by an IFN γ gene is exchanged.

18. The method according to any one of claims 1 to 17, characterized in that the luciferase Gene expression by genes for induction of apaptosis is exchanged.

19. The method according to claim 18, characterized characterized in that the luciferase gene expression by BAX genes are exchanged.

20. The method according to claim 18, characterized characterized in that the luciferase gene expression by FAS-L genes is exchanged.

21. The method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the luciferase Gene expression is replaced by a suicide gene.

22. The method according to claim 21, characterized characterized in that the luciferase gene expression by a thymidine kinase gene is exchanged.

23. The method according to claim 21, characterized characterized in that the luciferase gene expression by a cytosine deaminase gene is exchanged.

24. The method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the luciferase Gene expression is replaced by a marker gene.

25. The method according to claim 24, characterized characterized in that the luciferase gene expression by a β-galactosidase gene is exchanged.

26. The method according to claim 24, characterized characterized in that the luciferase gene expression by a fluorescent protein is exchanged.

27. The method according to any one of claims 1 to 26, characterized in that mucin promoter Mucin-1 / DF3 by another tissue-specific promoter is exchanged.

28. The method according to claim 27, characterized characterized in that a myelin basic protein is used.

29. The method according to claim 27, characterized characterized in that a glial fibrillary as a promoter acidic protein is used.

30. The method according to claim 27, characterized characterized in that as a promoter a prostate specific antigen is used.

31. The method according to claim 27, characterized characterized in that as a promoter Kallikrein 2nd is used.

32. The method according to claim 27, characterized characterized in that L-plastin is used as the promoter becomes.

33. The method according to claim 27, characterized characterized in that an α-fetoprotein as a promoter is used.

34. The method according to claim 27, characterized characterized in that tyrosinase is used as a promoter becomes.

35. The method according to claim 27, characterized characterized in that as a promoter thyroglobulin is used.

36. The method according to claim 27, characterized characterized in that as a promoter calcitonin CALC-I is used.

37. The method according to claim 27, characterized characterized in that an ovary spec. Promoter-1 is used.

38. The method according to claim 27, characterized characterized in that CEA is used as a promoter.

39. The method according to claim 27, characterized characterized that gastrin-releasing as a promoter Peptide is used.

40. The method according to claim 27, characterized characterized that as a promoter neuron-specific Enolase is used.

41. The method according to claim 27, characterized characterized in that osteocalcin was used as a promoter becomes.