DE10204843A1

DE10204843A1 - New nucleic acid from Arabidopsis thaliana, useful e.g. for detecting the presence or expression of corresponding genes, involved in metabolism and detoxification

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Publication number: DE10204843A1
Application number: DE10204843A
Authority: DE
Inventors: Anton R Schaeffner; Sigrun Wegener; Oliver Thulke; Sabine Glombitza; Heidrun Gundlach; Lucien Bovet; Felix Mauch; Enrico Martinoia
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2003-08-14

Abstract

Nucleic acid (I) for qualitative or quantitative detection of Arabidopsis thaliana genes, or fragments, or derived RNA, comprises one of 275 fully defined sequences given in the specification, or their complements and/or reverse or reverse-complementary sequences, or derived RNA, or their derivatives, each able to bind specifically to genes (or their fragments or derived RNA) involved in metabolism or detoxification, is new. Independent claims are also included for: (1) a test kit for detecting the specified genes (or fragments), or their expression, that contains at least one (I); (2) detecting the specified gene (or fragments) or derived RNA by hybridization to (I); and (3) detecting expression of the specified genes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Arabidopsis thaliana-Genen, -Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA- Sequenzen. Die Erfindung betrifft weiterhin Testkits, die diese Nukleinsäuren aufweisen und Verfahren zum spezifischen Nachweis von Genen, Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen von Arabidopsis thaliana oder zum Nachweis ihrer Expression. The present invention relates to nucleic acids for qualitative and quantitative Detection of Arabidopsis thaliana genes, gene fragments or RNA derived therefrom Sequences. The invention further relates to test kits which have these nucleic acids and Method for the specific detection of genes, gene fragments or derived therefrom RNA sequences from Arabidopsis thaliana or for the detection of their expression.

Arabidopsis thaliana ist die "Modell-Pflanze" für die Forschung. Ihre geringe Größe, ihr kurzer Lebenszyklus und ihre außerordentliche Samenproduktion machen sie zu einem einfachen und preisgünstigen Organismus, der im Labor gezüchtet bzw. vermehrt werden kann und der darüber hinaus ein vergleichsweise kleines Genom von ungefähr 120 Mb umfasst. Das Genom von Mais und Weizen umfasst zum Vergleich 2.500 Mb bzw. 16.000 Mb. Arabidopsis thaliana fehlt ein großer Teil der repetitiven DNA, die in den Genomen höherer Pflanzen vorliegt, sie enthält jedoch einen vollständigen Satz an Genen zur Steuerung von Entwicklungsmustern, Metabolismus, Reaktionen auf Umwelteinflüssen und Krankheitsresistenzen. Arabidopsis thaliana is the "model plant" for research. Your small size, you short life cycle and their extraordinary seed production make them easy and inexpensive organism that can be grown or multiplied in the laboratory and which also includes a comparatively small genome of approximately 120 Mb. The genome corn and wheat for comparison comprises 2,500 Mb and 16,000 Mb of Arabidopsis, respectively thaliana lacks a large part of the repetitive DNA that is present in the genomes of higher plants, however, it contains a full set of genes that control developmental patterns, Metabolism, reactions to environmental influences and disease resistance.

Pflanzen, wie z. B. Arabidopsis thaliana, haben ein universelles Detoxifizierungssystem, mit dem sie eine große Anzahl an natürlichen und synthetischen Chemikalien metabolisieren können. Ein wichtiger Mechansimus ist dabei die Konjugation der Substanzen mit hydrophilen Gruppen wie Glutathion oder Glucose. Diese Konjugate werden anschließend in einem ATPabhängigen Mechanismus aus dem Cytosol in die Vakuole oder in den Apoplasten kompartimentiert. Diese Detoxifizierungsreaktionen haben viel Ähnlichkeiten mit den Reaktionen des sekundären Metabolismus. Transportvorgänge von Glutathion-Konjugaten in die Vakuole zeigten u. A. mechanistische Ähnlichkeiten mit ABC-Transportern, die aus medikamententoleranten menschlichen Tumorzellen bekannt sind. Plants such as B. Arabidopsis thaliana, have a universal detoxification system, with which they metabolize a large number of natural and synthetic chemicals can. An important mechanism is the conjugation of the substances with hydrophilic Groups like glutathione or glucose. These conjugates are then combined in one ATP-dependent mechanism from the cytosol into the vacuole or in the apoplast compartmentalized. These detoxification reactions are very similar to the reactions of the secondary metabolism. Transport processes of glutathione conjugates into the vacuole showed u. A. Mechanistic similarities to ABC transporters that come from drug-tolerant human tumor cells are known.

Diese Enzymsysteme bzw. deren Expressionsmuster in der Pflanze können einen wichtigen Aufschluß über das Detoxifizierungs- und Stoffwechselverhalten bezüglich Substanzen wie Agrochemikalien, Xenobiotika etc. liefern. Anhand der spezifischen Expressionsmuster bzw. Transkriptionsprofile bei Arabidopsis thaliana lassen sich auch Vorhersagen in Hinsicht auf das Verhalten von Kulturpflanzen wie Weizen, Mais etc. gegenüber der Substanz vornehmen. These enzyme systems or their expression patterns in the plant can be an important one Information about the detoxification and metabolic behavior regarding substances like Deliver agrochemicals, xenobiotics etc. Based on the specific expression pattern or Transcription profiles in Arabidopsis thaliana can also be used to predict conduct the behavior of crops such as wheat, corn, etc. towards the substance.

Aus diesem Grund existieren bereits einige Ansätze, diese Transkriptionsprofile von Arabidopsis thaliana zu untersuchen, z. B. durch DNA-Arraysysteme. Diese bisher bestehenden DNA-Arraysysteme nutzten cDNAs als Sonden [z. B. Ruan, Y.; Gilmore, J. & Conner, T. (1998) Towards Arabidopsis genome analysis: monitoring expression profiles of 1400 genes using cDNA microarrays. The Plant Journal 15, 821-833] oder Kollektionen von kurzen (20 bis 40meren) Oligonukleotiden ["Affymetrix"]. Für cDNA Arrays können öffentlich zugängliche cDNA-Banken genutzt werden (http:/ / www.arabidopsis.org/abrc/) oder eigene cDNA- Banken eingesetzt werden, auch ohne dass die Sequenzen der einzelnen Klone bekannt sind. Dies ermöglicht die Entdeckung neuer und bisher nicht charakterisierter Gene, insbesondere in nicht sequenzierten Organismen. Die meisten cDNA-Klone beinhalten Sequenzen von 500 bp bis 1,5 kb Länge, die einen hohen Anteil kodierender Sequenz aufweisen. Weil jedoch auf kodierende Bereiche ein starker Selektionsdruck wirkt, der darauf abzielt die funktionellen Domänen eines Proteins zu konservieren, bringt dieses System entscheidende Nachteile mit sich. Genfamilien, deren Mitglieder zum Teil hohe Homologien aufweisen, können aufgrund von Kreuzhybridisierungen nicht differenziert betrachtet werden. For this reason, some approaches already exist, these transcription profiles from To investigate Arabidopsis thaliana, e.g. B. by DNA array systems. These existing so far DNA array systems used cDNAs as probes [e.g. B. Ruan, Y .; Gilmore, J. & Conner, T. (1998) Towards Arabidopsis genome analysis: monitoring expression profiles of 1400 genes using cDNA microarrays. The Plant Journal 15, 821-833] or collections of short (20th to 40meren) oligonucleotides ["Affymetrix"]. For cDNA arrays can be made public accessible cDNA banks can be used (http: / / www.arabidopsis.org/abrc/) or own cDNA Banks are used, even without the sequences of the individual clones are known. This enables the discovery of new and previously uncharacterized genes, especially in non-sequenced organisms. Most cDNA clones contain 500 bp sequences up to 1.5 kb in length, which have a high proportion of coding sequence. Because, however coding areas a strong selection pressure acts, which is aimed at the functional Preserving the domains of a protein has major disadvantages yourself. Gene families, some of whose members have high homologies, can be due to of cross hybridizations are not considered differentiated.

So existieren beispielsweise über mehr als einhundert Sekundärmetabolit- Glycosyltransferasen in Arabidopsis thaliana, deren Expression bisher parallel nur über Kollektionen von kurzen, 20 bis 40meren Oligonukleotiden sinnvoll untersucht werden könnte, und zwar unter eng vorgegebenen Bedingungen. Nachteil an diesen Verfahren ist jedoch, dass für jedes einzelne Gen eine große Zahl an Oligonukleotiden verwendet werden muß (ca. 32). For example, there are more than a hundred secondary metabolites Glycosyltransferases in Arabidopsis thaliana, the expression of which has so far only been parallel Collections of short, 20 to 40 mer oligonucleotides could be sensibly examined, and under strictly specified conditions. However, the disadvantage of this method is that a large number of oligonucleotides must be used for each individual gene (approx. 32).

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen spezifischen quantitativen und/oder qualitativen Nachweis von Arabidopsis thaliana-Genen und -Genfragmenten und von hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene bereitzustellen, der die im Stand der Technik auftretenden Probleme überwindet und mit dem hochspezifische Expressionsprofile der Arabidopsis thaliana- Genexpression mit einfachen technischen Mitteln erzielt werden können. The present invention is therefore based on the object of a specific quantitative and / or qualitative detection of Arabidopsis thaliana genes and gene fragments and to provide RNA sequences derived therefrom or the expression of these genes, that overcomes the problems encountered in the prior art and with the highly specific one Expression profiles of Arabidopsis thaliana gene expression using simple technical means can be achieved.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. This object is solved by the subject matter of the independent claims. advantageous Embodiments are specified in the dependent claims.

Es ist mit spezifischen Sonden im Gegensatz zu cDNA-Klonen möglich, die relativen Expressionsniveaus einzelner Gene in gleichen Verhältnissen nachzuweisen. Derartige spezifische Nukleinsäure-Sequenzen werden erfindungsgemäß aus den 3'-untranslatierten Regionen (3'- UTR) der Gene von Mitgliedern einzelner Genfamilien hergestellt. It is possible with specific probes as opposed to cDNA clones, the relative ones Detect expression levels of individual genes in equal proportions. Such specific According to the invention, nucleic acid sequences are derived from the 3'-untranslated regions (3'- UTR) of genes produced by members of individual gene families.

Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß eines Grundgedankens Nukleinsäuren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Arabidopsis thaliana-Genen, -Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen, die zumindest eine der nachfolgenden Nukleinsäuren oder ihre komplementäre oder reverse oder revers-komplementäre Sequenz oder eine Kombination hiervon sowie die hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder Derivate dieser Sequenzen umfassen, die jeweils spezifisch an Gene oder Genfragmente oder hiervon abgeleitete RNA oder cDNA des Metabolismus und des Detoxifizierungssystems von Arabidopsis thaliana binden. Diese Nukleinsäuren weisen die Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1-275 auf. According to a basic idea, the present invention relates to nucleic acids for qualitative and quantitative detection of Arabidopsis thaliana genes, gene fragments or RNA sequences derived therefrom which contain at least one of the following nucleic acids or their complementary or reverse or reverse complementary sequence or a combination of these and the RNA sequences or derivatives of these sequences derived therefrom comprise, each specific to genes or gene fragments or RNA or derived therefrom bind cDNA of the metabolism and detoxification system of Arabidopsis thaliana. These nucleic acids have the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1-275.

Von der Erfindung umfaßt werden auch Fragmente der erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleinsäuren und der hieraus bereitgestellten Nukleinsäuren und der hieraus abgeleiteten Nukleinsäuren. Unter "Fragmenten" werden erfindungsgemäß Nukleinsäuren verstanden, die mehr als 10, bevorzugt mehr als 15, mehr als 20, mehr als 25 oder mehr als 30 und bis zu 50 Nukleotide umfassen. Der Begriff Oligonukleotide umfaßt Fragmente von 10-50 Nukleotiden und Teilbereiche hiervon. Diese Sequenzen können beliebig aus den hier vorgestellten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Diese Oligonukleotide können bevorzugt als Primer wie nachstehend ausgeführt eingesetzt werden, z. B. in der RT-PCR. The invention also includes fragments of those provided according to the invention Nucleic acids and the nucleic acids provided therefrom and those derived therefrom Nucleic acids. According to the invention, “fragments” are understood to mean nucleic acids which more than 10, preferably more than 15, more than 20, more than 25 or more than 30 and up to 50 Include nucleotides. The term oligonucleotides includes fragments of 10-50 Nucleotides and parts thereof. These sequences can be any of those presented here Nucleic acid sequences are compiled to the extent that they are at least 10 have successive nucleotides. These oligonucleotides can preferably be used as primers used below, z. B. in RT-PCR.

Ausgehend von den vorstehend offenbarten Nukleinsäuresequenzen kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate und Abwandlungen, die aus diesen Nukleinsäuren abgeleitet werden können, zu speziellen Nachweisverfahren, beispielsweise Hybridisierungsverfahren und PCR-Verfahren, geeignet sind und welche nicht oder weniger geeignet sind. Die Nukleinsäuren und Oligonukleotide der Erfindung können auch beispielsweise in größeren DNA oder RNA-Sequenzen vorliegen, z. B. flankiert von Restriktionsenzym-schnittstellen. Starting from the nucleic acid sequences disclosed above, the person skilled in the art can Debugging will determine which derivatives and modifications are made from these nucleic acids can be derived from special detection methods, for example Hybridization methods and PCR methods are suitable and which are not or less suitable. The Nucleic acids and oligonucleotides of the invention can also be found, for example, in larger ones DNA or RNA sequences are present, e.g. B. flanked by restriction enzyme interfaces.

Amplifikations- und Nachweisverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Nur beispielsweise sei hier auf dem Fachmann bekannte Laborhandbücher verwiesen, die diese Methodik beschreiben, beispielsweise auf Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, und alle nachfolgenden Auflagen. PCR-Verfahren sind z. B. beschrieben in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994 und nachfolgende Auflagen. Amplification and detection methods are known from the prior art. Just For example, reference is made here to laboratory manuals known to those skilled in the art Describe methodology, for example, on Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, and all subsequent editions. PCR methods are z. B. described in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994 and subsequent editions.

Derivate der vorstehenden Nukleinsäuren sind beispielsweise solche Nukleinsäuren, die eine oder mehrere Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen im Vergleich mit der entsprechenden Sequenz von SEQ ID NO. 1-275 aufweisen, wobei das Derivat unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen an die entsprechende Nukleinsäure von SEQ ID NO. 1-275 bindet. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß insbesondere solche Nukleinsäuren zu verstehen, bei denen zumindest 1, aber auch 2, 3, 4 oder mehr Nukleotide an einem oder beiden Enden der Nukleinsäuren oder auch im Inneren der Nukleinsäuren fehlen oder durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Derivatives of the above nucleic acids are, for example, those nucleic acids that have a or several substitutions, insertions and / or deletions compared to the corresponding sequence of SEQ ID NO. Have 1-275, with the derivative under moderate stringent or stringent conditions for the corresponding nucleic acid of SEQ ID NO. 1-275 binds. According to the invention, derivatives include, in particular, such nucleic acids understand, in which at least 1, but also 2, 3, 4 or more nucleotides on one or both Ends of the nucleic acids or also inside the nucleic acids are missing or by others Nucleotides were replaced.

Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen also auch Nukleinsäuren, die Sequenzen aufweisen, die im Wesentlichen zu den Nukleinsäuren der SEQ ID No. 1-275 äquivalent sind. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können z. B. zumindest ungefähr 80%, typischerweise zumindest ungefähr 90% oder 95% Sequenzidentität zu den Nukleinsäuren der SEQ ID No. 1-275 aufweisen. Die Erfindung stellt weiterhin Komplementärsequenzen zu den oben genannten Nukleinsäuren bereit. The nucleic acids of the present invention thus also include nucleic acids which Have sequences that are essentially related to the nucleic acids of SEQ ID No. 1-275 are equivalent. Nucleic acids according to the invention can e.g. B. at least about 80%, typically at least about 90% or 95% sequence identity to the nucleic acids of the SEQ ID No. Have 1-275. The invention also delivers complementary sequences the above nucleic acids.

Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" betrifft ein Heteropolymer von Nukleotiden oder die Sequenz dieser Nukleotide. Der Begriff "Nukleinsäure", wie hierin verwendet, umfasst sowohl RNA, DNA, einschließlich cDNA, genomische DNA und synthetische (bspw. chemisch synthetisierte) als auch an andere Polymere gebundene Basen wie PNA. The term "nucleic acid sequence" relates to a heteropolymer of nucleotides or the Sequence of these nucleotides. The term "nucleic acid" as used herein includes both RNA, DNA, including cDNA, genomic DNA and synthetic (e.g. chemical synthesized) as well as bases bound to other polymers such as PNA.

Die Erfindung umfaßt - wie oben angesprochen - auch solche Derivate, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen hybridisieren. As mentioned above, the invention also includes those derivatives which are associated with the Nucleic acids according to the invention under moderately stringent or stringent conditions hybridize.

Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man im allgemeinen die Reaktionsbedingungen, unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden insbesondere 0,2 × SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumcitrat, pH 7) bei 65°C verstanden. Bei kürzeren Fragmenten, beispielsweise Oligonukleotiden aus bis zu 20 Nukleotiden, liegt die Hybridisierungstemperatur unter 65°C, beispielsweise bei über 55°C, bevorzugt über 60°C, jeweils aber unter 65°C. Stringente Hybridisierungstemperaturen sind abhängig von der Größe bzw. Länge der Nukleinsäure und ihrer Nukleotidzusammensetzungen und sind vom Fachmann durch Handversuche zu ermitteln. Moderat stringente Bedingungen werden beispielsweise bei 42°C und Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C erreicht. Stringent hybridization and washing conditions are generally understood to mean those Reaction conditions under which only duplex molecules between oligonucleotides and desired target molecules (perfect hybrids) or only the desired one Target organism is detected. Under stringent hybridization conditions understood in particular 0.2 × SSC (0.03 M NaCl, 0.003 M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C. at shorter fragments, for example oligonucleotides of up to 20 nucleotides, is the Hybridization temperature below 65 ° C, for example above 55 ° C, preferably above 60 ° C, but in each case below 65 ° C. Stringent hybridization temperatures depend on the size or length of the nucleic acid and its nucleotide compositions and are dated Expert to determine by hand tests. Conditions become moderately stringent reached for example at 42 ° C and washing in 0.2 × SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.

Die jeweiligen Temperaturbedingungen können in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Moleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Molekülen erfolgen. The respective temperature conditions can depend on the selected Test conditions and depending on the nucleic acid sample to be examined be different and must then be adjusted accordingly. Evidence of Hybridization product can be radiolabeled, for example, by autoradiography Molecules or by fluorimetry when using fluorescence-labeled molecules respectively.

Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln. Eine geeignete Nukleinsäure- bzw. Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride). The person skilled in the art can adapt the conditions to the selected in a manner known per se Adjust investigation procedures to actually achieve stringent conditions and a to enable specific detection procedures. Suitable stringency conditions can be for example, using reference hybridizations. A suitable nucleic acid or oligonucleotide concentration must be used. The hybridization must suitable temperature (the higher the temperature, the weaker the binding of the Hybrid).

Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können z. B. als Oligonukleotidprimer in Nachweisverfahren und Amplifikationsverfahren von Arabidopsis thaliana-Genen und Gentranskripten eingesetzt werden. Der Fachmann kann diese Oligonukleotide in an sich bekannten Verfahren einsetzen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten Gene/Gentranskripte zu untersuchenden Probe mit entsprechenden Oligonukleotidprimern in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis der RNA oder der DNA der Probe durch beispielsweise PCR-Techniken, die das Vorliegen spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle vorgenannten Oligonukleotide sind auch als Primer für eine reverse Transkription von mRNA einsetzbar. Fragments of the nucleic acids according to the invention can, for. B. as an oligonucleotide primer in Methods of detection and amplification of Arabidopsis thaliana genes and Gene transcripts are used. Those skilled in the art can use these oligonucleotides in themselves use known methods. Here, the DNA or the RNA one on the presence of the genes / gene transcripts mentioned to be examined with corresponding Oligonucleotide primers contacted. The RNA or DNA is then detected of the sample using, for example, PCR techniques that determine the presence of specific DNA and / or to show RNA sequences. All of the aforementioned oligonucleotides are also available as Primer can be used for reverse transcription of mRNA.

Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. The PCR method has the advantage that very small amounts of DNA can be detected. In Depending on the material to be detected, the temperature conditions and the Modify the cycle numbers of the PCR. The optimal reaction conditions can by Manual tests can be determined in a manner known per se.

Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies-spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel-elektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenz-markierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar. The in the course of the PCR amplification by extending the primer sequences The resulting, characteristic, species-specific DNA marker fragments can, for example Gel electrophoretic or fluorimetric using fluorescent labeled Oligonucleotides are detected. Of course, others are also known to the expert known detection methods can be used.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungsreaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende DNA oder RNA nur einen sehr kleinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise "verunreinigt" im Gewebeverband. Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Oligonukleotiden durchführbar. The DNA or RNA of the sample to be examined can be used both in the PCR reaction or RT-PCR and the hybridization reaction are either in extracted form or in the form of complex mixtures in which the DNA or RNA to be examined only makes up a very small fraction of the fraction of the special biological sample. The too investigating cells can thus either be present in purified form or, for example "contaminated" in the tissue. Both in situ PCR and in situ RT-PCR are with the here described oligonucleotides feasible.

Bei der RT-PCR werden die Oligonukleotide der Erfindung zur PCR-Amplifikation von Fragmenten an cDNA Matrizen eingesetzt, die nach einer reversen Transkription mit oligo(dT) oder mit diesen Oligonukleotiden am 3'-Ende erzeugt werden. Die Expression kann dann qualitativ, in Verbindung mit geeigneten Standards und Techniken, wie einem internen Standard und einer quantitativen PCR, auch quantitativ ausgewertet werden. In RT-PCR, the oligonucleotides of the invention are used for the PCR amplification of Fragments on cDNA matrices used after reverse transcription with oligo (dT) or with these oligonucleotides at the 3 'end. The expression can then qualitatively, in conjunction with appropriate standards and techniques, such as an internal one Standard and a quantitative PCR, can also be evaluated quantitatively.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung Nukleinsäuren, die an Gene oder Genfragmente oder hiervon abgeleitete RNA oder cDNA binden, die für die durch SEQ ID NO: 1-275 spezifizierten Glycosyltransferasen, Glyoxylasen, GSH-Peroxidasen - und Reduktasen, Glutathion-S-Transferasen und ABC-Transporter des Arabidopsis thaliana Metabolismus und Detoxifizierungssystems kodieren. According to a preferred embodiment, the invention comprises nucleic acids which are Genes or gene fragments or RNA or cDNA derived therefrom bind for the by SEQ ID NO: 1-275 specified glycosyltransferases, glyoxylases, GSH peroxidases - and reductases, glutathione-S-transferases and ABC transporters of Arabidopsis thaliana Coding metabolism and detoxification system.

Zur Detektion weisen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bevorzugt eine Markierung auf Beispiele hierfür sind eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder eine mit Alkalischer Phosphatase nachweisbare Markierung. The nucleic acids according to the invention preferably have a label for detection Examples of this are radioactive labeling, fluorescent labeling, Biotin labeling, digoxigenin labeling, peroxidase labeling or one with alkaline phosphatase detectable marking.

Die alkalische Phosphatase wird als Markerenzym eingesetzt, da sich in Verbindung mit geeigneten Substanzen ein empfindliches, histochemisches Farbreagenz und Signalverstärkersystem entwickeln lässt. Substrate wie z. B. p-Nitrophenylphosphat ergeben nach der hydrolytischen Spaltung durch das Enzym farbige, photometrisch leicht messbare Reaktionsprodukte. The alkaline phosphatase is used as a marker enzyme because it is associated with suitable substances a sensitive, histochemical color reagent and Signal amplifier system can be developed. Substrates such as B. p-nitrophenyl phosphate result after hydrolytic cleavage by the enzyme colored, photometrically easily measurable reaction products.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegen die Nukleinsäuren an eine Festphasenmatrix gebunden vor, z. B. Nylonmembran, Glas oder Kunststoff. In a further embodiment of the invention, the nucleic acids are located on a Solid phase matrix bound before, e.g. B. nylon membrane, glass or plastic.

Die Nukleinsäuren können ebenfalls in einer solchen Form vorliegen, bei der die Basen an ein Protein-Rückgrat, z. B. PNA, gebunden vorliegen. The nucleic acids can also be in a form in which the bases are attached to a Protein backbone, e.g. B. PNA, bound.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Nukleinsäuren der SEQ ID Nr. 1-275 oder Fragmente oder Derivate hiervon als Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente oder moderat stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Die Stringenz-Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die vorstehend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acids of SEQ ID No. 1-275 or fragments or derivatives thereof as probes with the DNA to be examined or RNA sample brought to hybridization, being stringent or moderately stringent Hybridization conditions can be selected. The stringency conditions must be for the the respective application can be determined empirically. The conditions described above can serve as clues.

Der Begriff "Sonde", wie er hierin definiert ist, bedeutet eine Nukleinsäure, die zur Bindung an eine Zielnukleinsäure einer komplementären Sequenz durch eine oder mehrere Arten chemischer Bindungen in der Lage ist, üblicherweise durch komplementäre Basenpaarung, die üblicherweise durch Wasserstoffbrückenbildung erfolgt. The term "probe" as defined herein means a nucleic acid that is used for binding to a target nucleic acid of a complementary sequence by one or more types chemical bonds is capable, usually by complementary base pairing that usually done by hydrogen bonding.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Testkit zum Nachweis von Genen und Genfragmenten, die für Enzyme der durch SEQ ID NO: 1-275 spezifizierten Gene kodieren oder zum Nachweis ihrer Expression, verwendet. Ein derartiger Testkit enthält als Sonde zumindest eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 1-275 oder wie hierin definierte Derivate oder Bruchstücke einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche. Um einen möglichst hohen Grad an Spezifität zu erreichen, umfasst ein derartiger Testkit mehrere, bevorzugt alle der oben angegebenen Nukleinsäuren bzw. Fragmente und Derivate hiervon. According to a preferred embodiment, a test kit for the detection of genes and Gene fragments coding for enzymes of the genes specified by SEQ ID NO: 1-275 or to demonstrate their expression. Such a test kit contains as a probe at least one nucleic acid according to SEQ ID NO: 1-275 or derivatives as defined herein or Fragments one or more of the preceding claims. To be as high as possible To achieve a degree of specificity, such a test kit comprises several, preferably all of the The nucleic acids or fragments and derivatives thereof specified above.

Ein Testkit umfasst einen Behälter, der ein oder mehrere Nukleotid-Arrays enthält, wobei diese Arrays die Nukleinsäuren als Sonden an ihrer Oberfläche befestigt aufweisen. A test kit includes a container that contains one or more nucleotide arrays these arrays have the nucleic acids attached to their surface as probes.

Bevorzugte erfindungsgemäße Arrays umfassen z. B. alle der oben angegebenen Sequenzen, können jedoch auch lediglich Teilmengen dieser Sequenzen enthalten. Es kann z. B. nur eine Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt werden, die einer der erfindungsgemäß verwendeten Enzymfamilie angehören. Wie oben erwähnt, sind diese Familien die Familien der Glycosyltransferasen, Glyoxylasen, GSH-Peroxidasen- und Reduktasen, Glutathion-S-Transferasen und ABC-Transporter des Arabidopsis thaliana Metabolismus und Detoxifizierungssystems. Beispielsweise kann eine Untergruppe aus einer/mehrere dieser Gruppen ausgewählt werden, die ungefähr 50% der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in der entsprechenden Familie enthält. Bevorzugte erfindungsgemäße Arrays umfassen z. B. mehr als 100 unterschiedliche Sonden der oben beschriebenen Sonden, wobei jede unterschiedliche Sonden in einer vorher bestimmten Region des Arrays angeordnet ist. Jede Sonde ist an der Oberfläche adsorbiert oder kovalent gebunden. Die Sondendichte kann in Abhängigkeit von Trägermaterial und dem Stand der Technik variabel gestaltet sein. Preferred arrays according to the invention include e.g. B. all of the above sequences, However, they can only contain subsets of these sequences. It can e.g. B. only one Group of nucleic acids can be selected that one of the used according to the invention Belong to the enzyme family. As mentioned above, these families are the families of the Glycosyltransferases, glyoxylases, GSH peroxidases and reductases, glutathione S transferases and ABC transporters of Arabidopsis thaliana metabolism and detoxification system. For example, a sub-group can be selected from one or more of these groups, the approximately 50% of the nucleic acids according to the invention in the corresponding family contains. Preferred arrays according to the invention include e.g. B. more than 100 different Probes of the probes described above, each with different probes in a previous specific region of the array. Each probe is adsorbed or on the surface covalently bound. The probe density can depend on the carrier material and the State of the art can be designed variably.

Grundsätzlich ist eine Nukleotid-Array, wie hierin verwendet als eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleotide definiert, die an einen oder mehrere feste Träger gebunden sind. Der Begriff "Array" kann sich auf die gesamte Kollektion der Nukleotide auf dem Träger (den Trägern) oder auf eine Untergruppe hiervon beziehen. Basically, a nucleotide array is as used herein as a variety defined different nucleotides that are bound to one or more solid supports. The term "Array" can refer to the entire collection of nucleotides on the support (the supports) or refer to a subset of it.

Vorzugsweise handelt es sich beim dem Testkit um einen DNA-, RNA- oder PNA-Array. Zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Arabidopsis thaliana-Genen und ihrer Expression durch die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Nukleinsäuren können aus dem Stand der Technik bekannte Strategien eingesetzt werden, um beispielsweise eine gewebespezifische, stressabhängige oder chemikalienspezifische Expression festzustellen. The test kit is preferably a DNA, RNA or PNA array. For the qualitative and quantitative detection of Arabidopsis thaliana genes and their Expression by the nucleic acids described in the present application can be made from strategies known in the prior art can be used, for example, to implement a determine tissue-specific, stress-dependent or chemical-specific expression.

Die Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung erfolgt in an sich üblicher und bekannter Weise. Die Sonden können beispielsweise in Vektoren insertiert werden und nach Vermehrung wieder herausgeschnitten werden, sie können als Matrize durch PCR oder auch synthetisch hergestellt werden. Auch eine Herstellung in Form von Nicht-Nukleinsäuren, z. B. PNA oder derivatisierte Nukleinsäuren, um die Stabilität, die Hybridisierungseigenschaften oder Bindungseigenschaften an feste Träger zu verändern, ist möglich. The nucleic acids of the invention are prepared in a manner which is customary and known per se Wise. For example, the probes can be inserted into vectors and after Propagation can be cut out again, they can be used as a template by PCR or also be made synthetically. Production in the form of non-nucleic acids, e.g. B. PNA or derivatized nucleic acids for stability, hybridization properties or It is possible to change the binding properties of solid supports.

Der erfindungsgemäße DNA/RNA/PNA-Array kann weiterhin eine oder mehrere Nukleinsäuren aufweist, die jeweils zu der 3'-UTR von Gentranskripten aus Arabidopsis thaliana komplementär sind, die beispielsweise für folgende Enzyme kodieren: Glycosidasen, Hydroxylasen, Oxygenasen, Esterasen, Peroxidasen, Nitrilasen, Ektophosphatasen, UDPglucosephosphorylasen, MATE Transporter (multidrug and toxic compound extrusion). The DNA / RNA / PNA array according to the invention can furthermore have one or more Has nucleic acids, each to the 3'-UTR of gene transcripts from Arabidopsis are complementary thaliana, which code for example for the following enzymes: glycosidases, Hydroxylases, oxygenases, esterases, peroxidases, nitrilases, ectophosphatases, UDPglucose phosphorylases, MATE transporters (multidrug and toxic compound extrusion).

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Genen, Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen, die für Enzyme der durch SEQ ID NO: 1-275 spezifizierten Gene kodieren oder zum Nachweis ihrer Expression bereit gestellt, das die nachfolgenden Schritte umfasst: According to one embodiment of the present invention, a method for specific detection of genes, gene fragments or RNA sequences derived therefrom which code for enzymes of the genes specified by SEQ ID NO: 1-275 or for detection your expression, which includes the following steps:

Zunächst wird DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einer der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung durchgeführt. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren liegen bevorzugt im Rahmen eines Arrays vor, siehe oben. Danach erfolgt ein Nachweis der Hybridisierung der Nukleinsäuren mit der RNA oder DNA der Probe, um das Vorliegen der für die Nukleinsäuren spezifischen DNA- und/oder RNA-Sequenzen aus Arabidopsis thaliana aufzuzeigen. Das Produkt dieser Hybridisierungsreaktion wird dann durch geeignete Verfahren nachgewiesen. Vorzugsweise erfolgt das Inkontaktbringen unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen, wie oben ausführlich dargestellt ist. First of all, DNA or the RNA of a sample to be examined is at least one of the Nucleic acids of the present invention performed. The invention Nucleic acids are preferably present in the context of an array, see above. Then there is proof hybridization of the nucleic acids with the RNA or DNA of the sample to the presence the DNA and / or RNA sequences from Arabidopsis specific for the nucleic acids to show thaliana. The product of this hybridization reaction is then determined by appropriate Proven procedure. The contacting is preferably carried out under moderate stringent or stringent conditions, as detailed above.

Grundsätzlich erfolgt der Nachweis der Expression der durch SEQ ID: 1-275 spezifizierten Gene aus Arabidopsis thaliana, nach folgendem Schema:

a) Gewinnung von RNA aus der Pflanze bzw. ihren Teilen, z. B. nach Behandlung mit exogenem Faktor oder in bestimmtem Entwicklungszustand.
b) Aufbringen der RNA oder daraus abgeleiteter Nukleinsäuren auf einen Array; und
c) Nachweis der Hybridisierung der RNA oder daraus abgeleiteter Nukleinsäuren an die Nukleinsäuren des Array.

Basically, the expression of the genes from Arabidopsis thaliana specified by SEQ ID: 1-275 is detected, according to the following scheme:

a) Obtaining RNA from the plant or its parts, for. B. after treatment with an exogenous factor or in a certain state of development.
b) applying the RNA or nucleic acids derived therefrom to an array; and
c) detection of the hybridization of the RNA or nucleic acids derived therefrom to the nucleic acids of the array.

Vorzugsweise zur vereinfachten Handhabung wird hierbei Gesamt-RNA gewonnen und nachgewiesen; die Verwendung von isolierter, gereinigter mRNA ist ebenso möglich. Beispiele für exogene Faktoren sind Xenobiotika, insbesondere Herbiziden, Pathogene, Signalmoleküle, Trocken- oder Salzstreß, Hitze- oder Kältebehandlung sowie UV-B-Strahlung. Total RNA is preferably obtained here for simplified handling detected; the use of isolated, purified mRNA is also possible. examples for exogenous factors are xenobiotics, especially herbicides, pathogens, signaling molecules, Dry or salt stress, heat or cold treatment and UV-B radiation.

Der Begriff Xenobiotika oder xenobiotische Verbindungen, wie hierin verwendet, ist eine Sammelbezeichnung für chemische Verbindungen, die üblicherweise technischen, anthropogenen Ursprungs sind, wie beispielsweise Pflanzenschutz- und Schädlingsbekämpfungsmittel. The term xenobiotics or xenobiotic compounds as used herein is one Collective name for chemical compounds, usually technical, are of anthropogenic origin, such as pesticides and pesticides.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können für den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Genen oder -Genfragmenten, die für Enzyme der durch SEQ ID NO: 1-275 spezifizierten Gene kodieren oder zum Nachweis ihrer Expression verwendet werden. Dies erfolgt insbesondere im Zusammenhang der Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäuren zur Entwicklung und Identifizierung neuer Herbizide für zweikeimblättrige Pflanzen oder in der Umweltanalytik oder der Risikoeinschätzung von Agrochemikalien. The nucleic acids according to the invention can be used for the qualitative and / or quantitative Detection of genes or gene fragments responsible for enzymes identified by SEQ ID NO: 1-275 encode specified genes or be used to detect their expression. This takes place in particular in connection with the use of one or more nucleic acids for the development and identification of new herbicides for dicotyledonous plants or in environmental analysis or risk assessment of agrochemicals.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen beschrieben, wobei die Abbildung Folgendes zeigen: The present invention will now be described with reference to the accompanying drawings described, the illustration showing the following:

Abb. 1. Sequenzvergleich nach FASTA-Protokoll der Sonde GT 098 gegen Arabidopsis thaliana genomische Sequenzen und gegen kodierende Sequenzen aus A. thaliana. In beiden Fällen wird mit 100% Identität das Zielgen selbst gefunden. Im Fall der kodierenden Sequenz werden auch weitere Fällen benannt, die in diesem Fall durch stringente Waschbedingungen aber nicht zur Hybridisierung beitragen (Identität < 80%). Fig. 1. Sequence comparison according to the FASTA protocol of the GT 098 probe against Arabidopsis thaliana genomic sequences and against coding sequences from A. thaliana. In both cases, the target gene is found with 100% identity. In the case of the coding sequence, other cases are also named which, in this case, do not contribute to hybridization due to stringent washing conditions (identity <80%).

Abb. 2. Vergleich der Genaktivitäten, die mit den spezifischen Sonden ABC_K und ABC_R vs. den korrespondierenden cDNA Sonden in einem Arrayexperiment gemessen wurden. Als unabhängige Messung der Genaktivität wurde eine genspezifische RT-PCR mit Oligonukleotiden aus dem Bereich der Nukleotidsequenzen ABC_K und ABC_R durchgeführt. Es zeigt sich eine wesentliche Übereinstimmung der sensitiven Technik RT-PCR und der Messung mit den spezifischen, allerdings weniger sensitiven Sonden. Fig. 2. Comparison of the gene activities that are carried out with the specific probes ABC_K and ABC_R vs. the corresponding cDNA probes were measured in an array experiment. A gene-specific RT-PCR with oligonucleotides from the range of the nucleotide sequences ABC_K and ABC_R was carried out as an independent measurement of the gene activity. There is an essential correspondence between the sensitive technique RT-PCR and the measurement with the specific, but less sensitive probes.

Abb. 3. Organspezifische Expression der Arabidopsis thaliana Glucosyltransferasen. Neben den phyllogenetischen Stammbaum der Glucosyltransferasen sind die Expressionen in Wurzel (W), Stengel (St), Blatt (Bl), Blüte (Bt) und Schote (Sch) dargestellt. Ein schwarzes Feld bedeutet, dass keine Expression des betreffenden Gens in diesem Organ nachgewiesen werden konnte. Die Graustufen deuten unterschiedliche Expressionen an, je heller desto stärker waren die gemessenen Signale. Fig. 3. Organ-specific expression of Arabidopsis thaliana glucosyltransferases. In addition to the phyllogenetic family tree of glucosyltransferases, the expressions in root (W), stem (St), leaf (Bl), flower (Bt) and pod (Sch) are shown. A black field means that no expression of the gene in question could be detected in this organ. The grayscale indicates different expressions, the brighter the stronger the measured signals.

Abb. 4. Hauptkomponentenanalyse der Expressionsmuster aller spezifischer Sonden nach vier verschiedenen Herbizidbehandlungen. Primisulfuron 24 h (PRS24) und 36 h (PRS36), Prosulfuron 24 h (PRO24) und Bromoxynil 24 h (BXN24) nach den jeweiligen Behandlungen. Genname oder Kreuz repräsentieren jeweils ein Gen. Fig. 4. Main component analysis of the expression patterns of all specific probes after four different herbicide treatments. Primisulfuron 24 h (PRS24) and 36 h (PRS36), prosulfuron 24 h (PRO24) and bromoxynil 24 h (BXN24) after the respective treatments. Each name or cross represents a gene.

Nachfolgend einige konkrete Beispiele über verschiedene Anwendungsmöglichkeiten der hier beschriebenen Nukleinsäuren und deren Fragmente. Below are some concrete examples of various possible uses of the here described nucleic acids and their fragments.

Die wichtigsten Genfamilien, die an der Detoxifizierung beteiligt sind, Cytochrom P450 Monooxygenasen, UDP-Glycosyltransferasen, Glutathion-S-Transferasen und ABC-Transporter wurden ausgewählt, um einen funktionsbezogenen DNA-Array zu etablieren. Es wurde eine gezielte aussagekräftige Kombination genspezifische Sonden zur Erstellung von Expressionsprofilen hergestellt. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß es durch die hohe Spezifität dieser Sonden ermöglicht wurde, auch hoch homologe Mitglieder dieser Genfamilien differenziert zu betrachten und Kreuzhybridisierungen weitestgehend auszuschließen. The main gene families involved in detoxification are cytochrome P450 Monooxygenases, UDP-glycosyltransferases, glutathione-S-transferases and ABC transporters were selected to establish a function-related DNA array. there has been a targeted, meaningful combination of gene-specific probes to create Expression profiles produced. It has surprisingly been found that the high Specificity of these probes was made possible, even highly homologous members of these To look at gene families differently and to largely exclude cross-hybridizations.

example 1 Specificity of the probes

Anhand von einer Datenbankanalysen gegen die gesamte genomische Sequenz von Arabidopsis thaliana sowie gegen alle vorhergesagten transkribierten Bereiche konnte die Spezifität der Sonden und deren Eignung zur eindeutigen Erfassung der einzelenen Gene analysiert werden. In einigen Fällen wurden so auch kreuzhybridisierende andere Gene unmittelbar angezeigt und erfasst (Abb. 1); diese Information kann in nachgeschaltenen, unabhängigen Analysen benutzt werden, um die Expressionsmuster der beteiligten Gene zu differenzieren. Eine Möglichkeit dazu ist eine RT-PCR mit aus den beanspruchten Nukleotidsequenzen abgeleiteten Oligonukleotiden. Längere cDNA-Fragmente als Sonden in DANN Array Expressionsanalysen dagegen ergaben unspezifische Aussagen, die nicht durch RT-PCR verifiziert werden konnten (Abb. 2). Using a database analysis against the entire genomic sequence of Arabidopsis thaliana and against all predicted transcribed areas, the specificity of the probes and their suitability for the unambiguous detection of the individual genes could be analyzed. In some cases, cross-hybridizing other genes were also immediately displayed and recorded ( Fig. 1); this information can be used in subsequent, independent analyzes to differentiate the expression patterns of the genes involved. One possibility for this is an RT-PCR with oligonucleotides derived from the claimed nucleotide sequences. In contrast, longer cDNA fragments than probes in DANN array expression analyzes gave unspecific statements which could not be verified by RT-PCR ( Fig. 2).

Trotz hoher Spezifität sollten die Einbußen an Sensitivität möglichst gering sein. Beispielsweise können 30 µg Gesamt-RNA nach reverser Transkription zur radioaktiven Markierung in einem möglichst geringen Volumen (z. B. 3 ml) während der Hybridisierung verdünnt werden. Despite the high level of specificity, the loss in sensitivity should be as small as possible. For example, 30 μg of total RNA can be radiolabelled in reverse after reverse transcription as small a volume as possible (e.g. 3 ml) during the hybridization.

Example 2 Organ-specific expression (using the example of glucosyltransferases)

Die beanspruchten Sequenzen 1-275 wurden verwendet, um die organ-spezifische Expression der zugrundeliegenden Gene zu erfassen. Untersucht wurden die Transkription in Wurzel, Blatt, Stengel, Blütenständen und Schoten. Am Beispiel der Glucosyltransferasen ist die Verteilung der Transkription in Abb. 3 gezeigt. Damit konnte im Überblick über diese gesamte Genfamilie gewonnen werden. Es treten sowohl organ-spezifisch als auch in mehreren bis allen Oragen exprimierte Glucosyltransferasen auf. Diese Informationen über die räumliche Verteilung sind für die Beurteilung deren Beteiligung an Prozessen des Sekundärmetabolismus und deren Funktion in der Pflanze von Bedeutung. The claimed sequences 1-275 were used to record the organ-specific expression of the underlying genes. The transcription in roots, leaves, stems, inflorescences and pods were examined. The distribution of transcription is shown in Fig. 3 using the example of glucosyltransferases. This gave an overview of this entire gene family. Glucosyltransferases are expressed both organ-specifically and in several or all oragen. This information about the spatial distribution is important for the assessment of their participation in processes of secondary metabolism and their function in the plant.

Example 3 Reaction patterns in response to agrochemicals

Nach Behandlung mit zwei Herbiziden, Primisulfuron und Bromoxynil, die sich sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrem Wirkort unterscheiden und dem in Nutzpflanzenkulturen eingesetzten Safener Benoxacor wurden die Expressionsprofile der ausgewählten Genfamilien mit den hier beanspruchten Sonden erstellt. Die komplexen Reaktionsmuster stellen eine Basis für die Identifizierung einzelner responsiver Gene dar, die damit möglicherweise an der Detoxifizierung oder anderen Abwehrmaßnahmen der Pflanze beteiligt sein können. Die Wirkungsweise der eingesetzten Chemikalien in diesem Pilotversuch war bekannt: die Herbizid Primisulfuron und Prosulfuron verhindern in ähnlicher Weise die Bildung von verzweigten Aminosäuren durch die Hemmung der Acetolactatsynthase; das Herbizid Bromoxynil hemmt die Elektronentransportkette der Photosynthese; für den Safener Benoxacor war lediglich bekannt, dass er das Detoxifizierungssystem in monokotylen Kulturpflanzen induziert. After treatment with two herbicides, Primisulfuron and Bromoxynil, which are both in distinguish their structure and their place of action and that in crops The Benoxacor safeners used were the expression profiles of the selected gene families created with the probes claimed here. The complex reaction patterns provide a basis for the identification of individual responsive genes Detoxification or other plant defense measures may be involved. The The mode of action of the chemicals used in this pilot test was known: the herbicide Primisulfuron and prosulfuron similarly prevent the formation of branched ones Amino acids through the inhibition of acetolactate synthase; inhibits the herbicide bromoxynil the electron transport chain of photosynthesis; for the safener Benoxacor was only known to induce the detoxification system in monocot crops.

Unter Einsatz des erfindungsgemäßen Arrays war es möglich, die Auswirkungen dieser verschiedenen Xenobiotika auf die durch die Sequenzen 1-275 erfassten Gene des sekundären Metabolismus und der Detoxifizierung zu untersuchen. Anhand einer Hauptkomponentenanalyse wurden die Reaktionsmuster zueinander in Bezug gestellt (Abb. 4). Die strukturell verwandten Sulfonylharnstoffe Primisulfuron und Prosulfuron lösten eine ähnliche Reaktion aus, da sie in der Hauptlkomponentenanalyse ähnliche Komponenten aufweisen. Diese Komponenten oder die dadurch dargestellten Expressionsmuster waren grundverschieden von dem Expressionsprofil nach Behandlung mit Bromoxynil. Damit korreliert die Reaktion der ausgewählten Transkripte des Sekundärmetabolismus überraschenderweise mit der Wirkungsweise der Chemikalien. Umgekehrt kann man deshalb auch annehmen, dass neue, unbekannte Chemikalien auf diese Weise in verschiedene Gruppen aufgrund ihrer Wirkung auf den pflanzlichen Metabolismus klassifiziert werden können. Using the array according to the invention, it was possible to investigate the effects of these different xenobiotics on the genes of secondary metabolism and detoxification, as determined by sequences 1-275. Based on a main component analysis, the reaction patterns were related to each other ( Fig. 4). The structurally related sulfonylureas, primisulfuron and prosulfuron, triggered a similar reaction because they have similar components in the main component analysis. These components or the expression patterns represented thereby were fundamentally different from the expression profile after treatment with bromoxynil. The reaction of the selected transcripts of the secondary metabolism surprisingly correlates with the mode of action of the chemicals. Conversely, it can therefore also be assumed that new, unknown chemicals can be classified in this way into different groups based on their effect on plant metabolism.

Der erfindungsgemäße Array wurde so in nicht veröffentlichten Experimenten der Erfinder bereits zur Evaluierung weiterer Behandlungen von Arabidopsis thaliana eingesetzt und somit die Reaktion auf verschiedene Stressfaktoren wie z. B. erhöhte UV-B-Strahlung oder Behandlung mit Signalmolekülen miteinander korreliert. Völlig neu war z. B. die Beobachtung, dass die Behandlung mit den Sulfonylharnstoffen eine ähnliche Antwort wie das Signalmolekül Salicylsäure oder Pathogeninfektion hervorruft. The array according to the invention was thus the inventors' unpublished experiments already used to evaluate further treatments of Arabidopsis thaliana and thus the reaction to various stress factors such as B. increased UV-B radiation or Treatment with signaling molecules correlated with each other. Completely new was z. B. the observation that treatment with the sulfonylureas gives a response similar to that of the signaling molecule Salicylic acid or pathogen infection.

In Bezug auf die einzelnen Gene aus den untersuchten Genfamilien ist es mit diesem Ansatz der Expressionsanalyse möglich, die Anzahl der möglichen Genkandidaten einzuschränken, die in einer untersuchten Situation transkribiert werden, um auf dieser Basis gezielte, weiterführende Funktionsuntersuchungen durchführen zu können. Literaturverzeichnis Bernard, K.; Außhan, N.; Granjeaud, 5.; Victorero, G.; Schmitt-Verhulst, A.M.; Jordan, B. R. & Nguyen, C. (1996) Multiplex messenger assay: simultaneous, quantitative measurement of expression of many genes in the context of T cell activation. Nucleic Acids Res 24, 1435-42.
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SEQUENZPROTOKOLL

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SEQUENCE LISTING

Claims

1. Nucleic acids for the qualitative and quantitative detection of Arabidopsis thaliana genes, gene fragments or RNA sequences derived therefrom, characterized in that they contain at least one of the following nucleic acids or their complementary or reverse or reverse-complementary sequence or a combination thereof, and the combination thereof derived RNA sequences or derivatives of these sequences, each binding specifically to genes or gene fragments or RNA or cDNA derived therefrom of the metabolism and the detoxification system of Arabidopsis thaliana, the nucleic acids comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1-275.

2. Nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid is a fragment of one of the Nucleic acids of SEQ ID NO: 1-275 that is attached to genes or gene fragments or thereof derived RNA or cDNA binds to that specified by SEQ ID NO: 1-275 Glycosyltransferases, glyoxylases, GSH peroxidases and reductases, glutathione-S- Transferases and ABC transporters of Arabidopsis thaliana metabolism and Code detoxification system.

3. Nucleic acid according to claim 1 and 2, the one or more substitutions, insertions and / or deletions in comparison with the corresponding nucleic acid of SEQ ID NO. 1-275, being under moderately stringent or stringent Conditions for the corresponding nucleic acid from SEQ ID NO. 1-275 binds.

4. Nucleic acid according to one or more of the preceding claims, in which the Nucleic acid is chemically modified.

5. Nucleic acid according to one or more of the preceding claims has a mark.

6. Nucleic acid according to one or more of the preceding claims, in which the Radioactive labeling, fluorescent labeling, biotin labeling, Digoxigenin label, peroxidase label or one by alkaline phosphatase is detectable marking.

7. nucleic acid according to one or more of the preceding claims, connected to a solid phase matrix, e.g. B. nylon membrane, glass or plastic, bound is present.

8. nucleic acid according to one or more of the preceding claims, in which the bases are attached to a protein backbone, e.g. B. PNA, bound.

9. Test kit for the detection of genes and gene fragments for enzymes by SEQ ID NO: encode 1-275 specified genes or to detect their expression, characterized, that he has at least one nucleic acid according to one or more of the preceding Contains claims.

10. Test kit according to claim 10, which is a DNA, RNA or PNA array.

11. DNA, RNA or PNA array according to claim 10, wherein the nucleic acid to a Solid phase matrix is present.

12. DNA, RNA or PNA array according to claim 11, wherein the nucleic acid to a Nylon membrane, glass or other solid phase matrix is bound.

13. DNA / RNA / PNA array according to claim 10-12, further comprising one or more Has nucleic acids, each corresponding to the 3'-UTR of gene transcripts for genes of (Secondary) metabolism from Arabidopsis thaliana are complementary to the following Encode enzymes, e.g. B. glycosidases, hydroxylases, oxygenases, esterases, Peroxides, nitrilases, ectophosphatases, UDP-glucose phosphorylases, MATE transporters (multidrug and toxic compound extrusion).

14. A method for the specific detection of genes, gene fragments or RNA sequences derived therefrom which code for enzymes of the genes specified by SEQ ID NO: 1-275 or for the detection of their expression, with the following steps:

Contacting the DNA or the RNA of a sample to be examined with at least one of the nucleic acids according to one or more of the preceding claims; and

- Detection of the hybridization of the nucleic acids with the RNA or DNA of the sample in order to show the presence of the DNA and / or RNA sequences from Arabidopsis thaliana specific for the nucleic acids.

15. The method according to claim 14, in which the nucleic acids are used as probes in hybridization processes.

16. The method according to claim 14 or 15, at least one of the nucleic acids with the DNA or RNA to be examined is brought to hybridization and the product of this hybridization reaction is proven.

17. The method according to one or more of the preceding claims, where contacting under moderately stringent or stringent conditions he follows.

18. A method for the detection of the expression of the genes from Arabidopsis thaliana specified by SEQ ID: 1-275, which comprises the following steps:

a) contacting an Arabidopsis thaliana plant or parts thereof with an exogenous factor,

b) obtaining RNA from the plant or its parts

c) applying the RNA or nucleic acids derived therefrom to an array according to claims 12-15; and

d) Detection of the hybridization of the RNA or nucleic acids derived therefrom to the nucleic acids of the array.

19. The method according to claim 18, in which total RNA is obtained and detected.

20. The method according to claim 18 or 19, wherein the exogenous factor from xenobiotics, especially herbicides, pathogens, signaling molecules, dry and salt stress, heat and Cold treatment as well as UV-B radiation is selected.

21. Use of one or more nucleic acids according to one or more of the preceding claims for the specific qualitative and / or quantitative detection of Genes or gene fragments that are responsible for enzymes identified by SEQ ID NO: 1-275 encode specified genes or to demonstrate their expression.

22. Use of one or more nucleic acids according to one or more of the previous claims to develop and identify new herbicides for dicotyledonous plants.

23. Use of one or more nucleic acids according to one or more of the previous claims in environmental analysis or risk assessment by Agrochemicals.