DE102022208627A1 - Verfahren zur Korrektur von Hintergrundsignalen in erfassten Messwerten analoger Detektoren - Google Patents

Verfahren zur Korrektur von Hintergrundsignalen in erfassten Messwerten analoger Detektoren Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Korrektur von Hintergrundsignalen in erfassten Messwerten analoger Detektoren (3), wobei über einen Referenzzeitraum erfasste Messwerte eines Objektes analysiert und Kennwerte erfasster Hintergrundsignale ermittelt werden.
Kennzeichnend ist, dass anhand wenigstens eines Kennwerts und unter Anwendung einer Berechnungsvorschrift ein Schwellwert (Sw) ermittelt wird; der Schwellwert (Sw) auf erfasste Messwerte eines analogen Detektors (3) angewendet wird und lediglich diejenigen Messwerte für eine nachfolgende Signalauswertung verwendet werden, die größer als der Schwellwert (Sw) sind.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Mikroskop M zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Korrektur von Hintergrundsignalen in erfassten Messwerten analoger Detektoren, wie diese beispielsweise auf dem Gebiet der Korrelationsspektroskopie, insbesondere der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), eingesetzt werden.
  • Hintergrundsignale oder Hintergrundrauschen hat verschiedene Ursachen, die einzeln oder gemeinsam vorliegen und komplex zusammenwirken können. So tragen Effekte wie das Dunkelrauschen, Photonenrauschen und Ausleserauschen in unterschiedlichen Anteilen zum Hintergrundrauschen bei.
  • In einer Veröffentlichung von Scipioni et al. (L. Scipioni, L. Lanzanò, A. Diaspro, and E. Gratton, 2018, Comprehensive correlation analysis for superresolution dynamic fingerprinting of cellular compartments using the Zeiss Airyscan detector; Nature Communications 9:5120) wurde ein neues Konzept der FCS vorgestellt. Diese als CCA (comprehensive correlation analysis) bezeichnete Methode verwendet sogenannte Array-Detektoren und erlaubt dabei eine vorteilhafte Verbindung von räumlichen und zeitlichen Korrelationsmethoden.
  • Zur Erfassung von Bilddaten wird bei Scipioni et al. (2018) ein sogenannter Airyscan-Detektor verwendet, der durch eine Mehrzahl in einer Ebene angeordneter Einzeldetektoren (Array) gebildet ist. Anders als üblicherweise für die Bilddatenerfassung eingesetzte Detektortypen, die sehr oft ein signifikantes Nachpulsen (after-pulsing) sowie ein hohes Dunkelrauschen (dark count rate) aufweisen, arbeitet der Airyscan-Detektor analog. Die Verwendung von digitalen Array-Detektoren wurde ebenfalls unlängst beschrieben (E. Slenders, M. Castello, M. Buttafava, F. Villa, A. Tosi, L. Lanzanö S.V. Koho and G Vicidomini, 2021, Confocal-based fluorescence fluctuation spectroscopy with a SPAD array detector; Light: Science & Applications 10:31).
  • Um nun insbesondere bei Verwendung eines analogen Detektors präzise Werte der Korrelationen zu erhalten, ist eine ausreichende Berücksichtigung des Hintergrundrauschens erforderlich. Auch wenn das Hintergrundrauschen unkorreliert erfolgt, wird die Korrelationsamplitude durch das Hintergrundrauschen negativ beeinflusst. Ein Beispiel für das Verhalten von Funktionen der Korrelationsamplituden für ein reines Zählen erfasster Ereignisse (digital) und für eine analoge Erfassung ist in 1 angegeben. Dargestellt sind FCS-Daten von Rh123 (Rhodamin 123) in Wasser, die bei gleichen Bedingungen im Photonenzählmodus (durchgehende Volllinie) beziehungsweise in einem analogen Modus ohne Hintergrundkorrektur (unterbrochene Volllinie) erfasst wurden.
  • Aus der Publikation von Scipioni et al. (2018; siehe oben) ist eine Korrektur eines Dunkelsignals als eine Komponente eines Hintergrundrauschens beschrieben. Diese Korrektur arbeitet zufriedenstellend, wenn das vorliegende Signal-Rausch-Verhältnis (SNR, signal-to-noise ratio) gut ist. Ansonsten weist der von Scipioni et al. (2018) beschriebene Ansatz einige Nachteile auf. So wird eine lange Zeit von mehr als 20 Sekunden (10 Millionen Zeiteinheiten zu je 2,46 µs) benötigt, um Daten eines auftretenden Dunkelsignals zu sammeln. Dies bedeutet für den Nutzer die Durchführung eines weiteren Arbeitsschrittes. Außerdem werden zusätzliche Speicherkapazitäten und längere Verarbeitungszeiten benötigt. Zudem ist das vorgeschlagene Vorgehen hinsichtlich auftretender Fluktuationen des Hintergrunds insbesondere dann nicht hinreichend stabil, wenn geringe Signalstärken vorliegen. Dies kann beispielsweise der Fall sein, wenn wenige und/oder dunkle Partikel im Anregungsvolumen vorliegen. Aus der bei Scipioni et al. (2018; siehe dort Seite 3) angegebenen Formel lässt sich ableiten, dass bereits geringe Schwankungen des Dunkelsignals erhebliche Auswirkungen auf die Autokorrelationsfunktion G(τ) haben. Dieser Effekt verstärkt sich noch, wenn ein Array-Detektor, beispielsweise ein Airyscan-Detektor verwendet wird, da jeder Einzeldetektor des Arrays nur einen kleinen Anteil des erfassten Gesamtsignals erhält.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Möglichkeit zur Korrektur des Hintergrundrauschens vorzuschlagen, mittels der Nachteile des Standes der Technik verringert werden.
  • Die Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Korrektur von Hintergrundsignalen in erfassten Messwerten analoger Detektoren gemäß dem unabhängigen Anspruch gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
  • Bei Durchführung des Verfahrens werden über einen Referenzzeitraum erfasste Messwerte eines Objektes analysiert und Kennwerte erfasster Hintergrundsignale ermittelt. Kennwerte sind beispielsweise Mittelwerte und/oder Streuungsmaße wie die Standardabweichung oder Varianz der erfassten Messwerte. Ein Objekt kann dabei eine zu erfassende Probe sein. Ein Objekt kann insbesondere eine biologische Probe sein, die zur Emission von Fluoreszenzstrahlung anregbare Moleküle (Fluorophore und/oder zur Autofluoreszenz fähige Moleküle) aufweist. Es ist auch möglich, dass eine Erfassungsoptik in einen Probenraum gerichtet ist, in dem aktuell kein Objektvorhanden ist, aber die sonstigen bei einer Bilddatenerfassung eingestellten Parameter wie Temperatur, Konfiguration einer Detektionsoptik und/oder die Einstrahlung von Umgebungslicht vorliegen.
  • Kennzeichnend für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist, dass anhand wenigstens eines Kennwerts und unter Anwendung einer Berechnungsvorschrift ein Schwellwert ermittelt wird. Dieser Schwellwert wird auf erfasste Messwerte eines analogen Detektors angewendet. Für eine nachfolgende Signalauswertung, also die Auswertung erfasster Messwerte, werden lediglich diejenigen Messwerte verwendet, die gleich oder größer als der Schwellwert sind.
  • In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die über den Referenzzeitraum erfassten Messwerte vorzugsweise in eine digitalisierte Form überführt. Die digitalisierten Messwerte stellen die Datenbasis dar, auf der die für die Bestimmung des Schwellwerts verwendeten Kennwerte ermittelt werden.
  • Um für das erfindungsgemäße Verfahren eine geeignete Auflösung der digitalisierten Messwerte zur Verfügung stellen zu können, beträgt die Bittiefe eines für die Umsetzung des analogen Signals in digitale Messwerte verwendeten Analog-Digital-Wandlers mindestens 12 bit, vorteilhaft aber mindestens 16 bit.
  • Betrachtet man eine typische Ausprägung analog erfasster und digitalisierter FCS-Messwerte, wie dies in 2 beispielhaft gezeigt ist, können eindeutig einzelne Messwerte mit hohen Intensitätswerten unterschieden werden, die infolge der Erfassung wenigstens eines Photons auftreten. Zusätzlich, wenn auch auf einem deutlich niedrigerem Intensitätsniveau, ist eine Vielzahl von Intensitätswerten zu erkennen, die als Hintergrundrauschen angesehen werden.
  • Es ist erkannt worden, dass ohne Informationsverlust ein Schwellwert Sw der Intensität festgelegt werden kann, oberhalb dem ein erfasstes Signal als vom Objekt ausgehend gewertet wird, während Messwerte unterhalb des Schwellwerts Sw dem Hintergrundrauschen zugeordnet und in einer weiteren Signalauswertung optional nicht weiter berücksichtigt werden.
  • Die Hintergrundsignale werden während des Referenzzeitraums erfasst, über dessen Dauer vorteilhaft eine Beleuchtung des Objekts mit einer Anregungsstrahlung unterbrochen ist. Während des Referenzzeitraums wird daher lediglich das Hintergrundrauschen erfasst (3). Beispielsweise wird eine Laserlichtquelle, wie diese zur Anregung von in dem Objekt vorliegenden Fluorophoren verwendet wird, über die Dauer des Referenzzeitraums abgeschaltet oder abgeblendet. Zusätzlich oder alternativ kann eine Erfassung von Signalen, die von dem Objekt ausgehen, unterbrochen werden, indem beispielsweise ein vorhandener Detektionsstrahlengang abgeblendet oder geschlossen wird. Es werden Kennwerte der im Referenzzeitraum erfassten und vorzugsweise digitalisierten Messwerte ermittelt und daraus der Schwellwert abgeleitet und gespeichert.
  • Der Referenzzeitraum kann vorteilhaft sehr kurz gewählt sein und beispielsweise 100 ms betragen. Gegenüber dem Stand der Technik ist damit eine mehr als zwei Größenordnungen (> Faktor 100) kürzere Erfassungsdauer des Hintergrundrauschens ausreichend.
  • Nach erfolgter Ermittlung des Schwellwerts kann dieser dann auf Messwerte angewendet werden, die beispielsweise von einem Objekt erfasst werden, das mit einer Anregungsstrahlung beleuchtet wird. Die während des Referenzzeitraums erfassten Messwerte können verworfen werden. Optional werden die dem Schwellwert zu Grunde liegenden Kennwerte gespeichert, um die weitere Signalauswertung nachvollziehbar zu gestalten.
  • Um diejenigen Messwerte, die kleiner als der ermittelte Schwellwert sind, aus dem auszuwertenden Datensatz zu entfernen, können diese auf einen Wert von Null gesetzt werden. Alternativ kann der Schwellwert von allen erfassten Messwerten subtrahiert werden. Allen dabei erhaltenen negativen Subtraktionsergebnisse wird ein Wert von Null zugewiesen. Letztere Vorgehensweise lässt sich technisch einfach umsetzen.
  • Im Ergebnis sind die beiden Vorgehensweise vergleichbar. Bei einem typischen Hintergrundrauschen treten beispielsweise bei einer 16-bit-Auflösung Grauwerte kleiner 100 auf. Die Intensitätswerte erfasster Photonen beträgt dagegen etwa 5000. Das heißt, dass eine Reduktion dieser Intensitätswerte um beispielsweise 100 kaum relevant ist.
  • Nachdem die unterhalb des Schwellwerts Sw liegenden Messwerte des Objekts von der weiteren Signalauswertung ausgenommen sind, können die verbliebenen Messwerte (4) ohne weitere Korrekturen einer Auswertung, insbesondere einer Korrelationsanalyse, unterworfen werden.
  • Infolge der erfindungsgemäßen Korrektur der Hintergrundsignale liegen in einem Datensatz erfasster Messwerte des Objekts neben einigen erfassten Photonen sehr viele auf Null gesetzte Messwerte vor. Um Speicherkapazitäten effektiv zu nutzen und um eine Datenverarbeitung zu erleichtern, können die Datensätze mittels Datenkompressionsverfahren in bekannter Weise komprimiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als Kennwerte der Mittelwert erfasster Hintergrundsignale sowie ein Vielfaches seiner Standardabweichung verwendet. Als vorteilhaft hat sich beispielsweise erwiesen, die ermittelte Standardabweichung mit einem Faktor von wenigstens 2, vorteilhaft 4 beziehungsweise 5, insbesondere mit einem Faktor von oder mehr 6 zu multiplizieren und zu dem Mittelwert zu addieren (Berechnungsvorschrift). Die Berechnungsvorschrift kann beispielsweise als Schwellwert Sw = Mittelwert + n x Standardabweichung, mit n ausgewählt aus einem Bereich n ≥ 2 bis ≥ 6, angegeben werden, wobei n eine reelle Zahl ist. Auf diese Weise ist erreicht, dass selbst bei deutlich fluktuierenden Messwerten ein Schwellwert gefunden wird, der eine zuverlässige Trennung von Hintergrundrauschen und Erfassungen von Photonen ermöglicht. Die Berechnungen der Kennwerte erfolgen vorteilhaft auf der Grundlage der digitalisierten Messwerte. Eine unmittelbare Nutzung der analogen Daten ist möglich, aber aufwändiger.
  • Wie bereits oben angesprochen, werden unter dem Begriff des Hintergrundrauschens Wirkungen einer Mehrzahl physikalischer Einflüsse verstanden. Es ist in einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, lediglich Dunkelsignale des Detektors als Hintergrundsignale zu erfassen. Dazu kann der Probenraum abgedunkelt oder ein Strahlengang vor dem Detektor geschlossen werden, sodass auftretende Messwerte lediglich infolge des Dunkelstroms des Detektors bewirkt sind.
  • Vorteilhaft bietet die Erfindung eine Möglichkeit, unter Berücksichtigung der Eigenschaften der jeweiligen Messwerte einen Schwellwert in einer nachvollziehbaren, insbesondere standardisierten, Weise festlegen zu können. Eine Standardisierung ist insbesondere in Hinblick auf die Vergleichbarkeit und Publikationsfähigkeit der Ergebnisse von Vorteil.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf einzelne analoge Detektoren oder auf einzelne Kanäle eines Detektors angewendet werden. Wird ein analog arbeitendes Detektorarray beziehungsweise ein Multikanal-Detektor (siehe zum Beispiel 8) wie der Airyscan-Detektor verwendet, kann vorteilhaft für jeden der Kanäle individuell eine Korrektur der Hintergrundsignale vorgenommen werden. Im Falle des Multikanal-Detektors kann für jeden der vorhandenen Einzeldetektoren (= Kanäle) eine individuelle Korrektur der Hintergrundsignale erfolgen.
  • Um einem unerwünschten Verwerfen von Signalen erfasster Photonen entgegenzuwirken, können Einstellungen und Betriebsparameter des verwendeten Detektors angepasst werden. Beispielsweise kann eine elektrische Spannung am Detektorelement eines Detektors variiert werden, bis eine optimierte Abstimmung mit einem Arbeitsbereich eines dem Detektor nachgeschaltetem Analog-Digital-Wandlers (ADC) erreicht ist. Insbesondere kann eine Konfiguration gesucht werden, bei der erfasste Photonen zu möglichst ausgeprägten Signalen und hohen Messwerten führen, aber ein Dynamikbereich des Analog-Digital-Wandlers nicht verlassen wird. Eine derartige Optimierung kann auch für jeden einzelnen Kanal eines Detektors beziehungsweise für jedes Detektorelement eines Arrays vorgenommen werden. Dabei kann ein Algorithmus angewendet werden, der die jeweiligen Spannungen systematisch variiert und die dabei jeweils erzielten Effekte mit einem vorgegebenen Sollwert beziehungsweise mit einem vorgegebenen Soll-Wertebereich vergleicht. Ist eine optimierter Spannungswert gefunden, wird der Detektor beziehungsweise das Detektorelement mit diesem Spannungswert betrieben. Eine erneute Optimierung kann manuell oder automatisiert ausgelöst werden.
  • Nachfolgend werden Effekte des erfindungsgemäßen Verfahrens in den 5 bis 7 anhand von FCS-Daten von Rh123 in Wasser beispielhaft dargestellt. In der 5 sind nochmals die zu 1 gezeigten Daten aufgetragen (Volllinie, „Photonenzählmodus“). Zusätzlich ist die Funktion der Korrelationsamplituden von Messwerten gezeigt (unterbrochene Volllinie; „analoger Modus korrigiert“), deren Hintergrundrauschen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens korrigiert wurde, indem der Schwellwert als Sw = Mittelwert + 6x Standardabweichung festgelegt wurde. Es sind keine signifikanten oder systematischen Abweichungen beider Funktionen festzustellen.
  • Es zeigte sich zudem, dass das erfindungsgemäße Verfahren weitgehend insensitiv gegenüber dem Schwellwert Sw ist. Die 6 veranschaulicht, dass ein beispielhaft um 200 Grauwerte erhöhter Schwellwert Sw zu einer Funktion der Korrelationsamplitude führt, die nahezu deckungsgleich mit der Ausgangsfunktion des ursprünglichen Schwellwerts ist.
  • Demgegenüber führt bei der von Scipioni et al. (2018) vorgeschlagenen Korrekturmethode eine Erhöhung des Hintergrundrauschens um lediglich 10 Grauwerte bereits zu deutlichen Abweichungen zwischen den Funktionen (7).
  • Ein zum Führen von einer zu erfassenden Strahlung 2 dienender Detektionsstrahlengang D einer Anordnung (8), insbesondere eines Mikroskops M, zur FCS-Messung umfasst optische Elemente 1 (lediglich symbolisch dargestellt), durch deren Wirkung die von einem Objekt O kommende und zu erfassende Strahlung 2 geführt, geformt und auf Detektorelemente 3.m eines analogen Detektors 3, insbesondere eines Array-Detektors 3, gelenkt ist beziehungsweise gelenkt werden kann. Erfasste Messwerte des Detektors 3 werden als elektrische Signale an einen Analog-Digital-Wandler 4 übermittelt. Die mittels des Analog-Digital-Wandlers 4 digitalisierten Messwerte werden an eine Auswerteeinheit 5 übertragen, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens konfiguriert ist. Die Auswerteeinheit 5 dient in diesem Sinne als ein Filter der erfassten Messwerte. Die Messwerte mit dem korrigierten Hintergrundrauschen können einer weiteren Auswertung und Verarbeitung bereitgestellt und/oder gespeichert werden.
  • Bezugszeichen
    • 1
    optisches Element
    2
    Strahlung
    3
    Detektor
    3.m
    Detektorelement; mit m = 1, 2,..., n
    4
    Analog-Digital-Wandler
    5
    Auswerteeinheit
    M
    Mikroskop
    D
    Detektionsstrahlengang
    O
    Objekt
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Scipioni et al. (L. Scipioni, L. Lanzanò, A. Diaspro, and E. Gratton, 2018, Comprehensive correlation analysis for superresolution dynamic fingerprinting of cellular compartments using the Zeiss Airyscan detector; Nature Communications 9:5120 [0003]
    • E. Slenders, M. Castello, M. Buttafava, F. Villa, A. Tosi, L. Lanzanö S.V. Koho and G Vicidomini, 2021, Confocal-based fluorescence fluctuation spectroscopy with a SPAD array detector; Light: Science & Applications 10:31 [0004]

Claims (10)

  1. Verfahren zur Korrektur von Hintergrundsignalen in erfassten Messwerten analoger Detektoren (3), wobei - über einen Referenzzeitraum erfasste Messwerte eines Objektes (O) analysiert und Kennwerte erfasster Hintergrundsignale ermittelt werden, dadurch gekennzeichnet, dass - anhand wenigstens eines der Kennwerte und unter Anwendung einer Berechnungsvorschrift ein Schwellwert (Sw) ermittelt wird; - der Schwellwert (Sw) auf erfasste Messwerte eines analogen Detektors (3) angewendet wird und - lediglich diejenigen Messwerte für eine nachfolgende Signalauswertung verwendet werden, die größer als der oder gleich dem Schwellwert (Sw) sind.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die über den Referenzzeitraum erfassten Messwerte in eine digitalisierte Form überführt werden und die für die Ermittlung des Schwellwerts (Sw) verwendeten Kennwerte auf Grundlage der digitalisierten Messwerte ermittelt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass entweder - alle erfassten Messwerte, die kleiner als der Schwellwert (Sw) sind, auf einen Wert von Null gesetzt werden; oder - der Schwellwert (Sw) von allen erfassten Messwerten subtrahiert wird und alle negativen Subtraktionsergebnisse auf einen Wert von Null gesetzt werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Kennwerte der Mittelwert erfasster Hintergrundsignale sowie ein Vielfaches seiner Standardabweichung verwendet werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Berechnungsvorschrift: Sw = Mittelwert der erfassten Messwerte der Hintergrundsignale + n (Standardabweichung der erfassten Messwerte der Hintergrundsignale); verwendet wird, wobei n eine reelle Zahl und aus einem Bereich n ≥ 2 bis ≥ 6 ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Dunkelsignale des Detektors (3) als Hintergrundsignale erfasst werden.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als analoger Detektor (3) ein Multikanal-Detektor verwendet wird und für jeden der Kanäle beziehungsweise Detektorelemente (3.m) individuell eine Korrektur der Hintergrundsignale vorgenommen wird.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine elektrische Spannung des Detektors (3) beziehungsweise der jeweiligen Detektorelemente (3.m) variiert wird, bis eine optimierte Abstimmung mit einem Arbeitsbereich eines dem Detektor (3) nachgeschaltetem Analog-Digital-Wandlers (5) erreicht ist.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Datensätze umfassend Messwerte, die größer als Null sind, und Messwerte, die auf Null gesetzt wurden, mittels eines Datenkompressionsverfahrens komprimiert werden.
  10. Mikroskops M, umfassend einen Detektionsstrahlengang D zur Führung einer zu erfassenden Strahlung 2, aufweisend optische Elemente 1 zum Führen und Formen der Strahlung 2 sowie zum Lenken der zu erfassenden Strahlung 2 auf Detektorelemente 3.m eines analogen Detektors 3, insbesondere eines Array-Detektors 3, sowie einen Analog-Digital-Wandler 4 und eine Auswerteeinheit 5, wobei erfasste Messwerte des Detektors 3 als elektrische Signale an den Analog-Digital-Wandler 4 übermittelt werden und die mittels des Analog-Digital-Wandlers 4 digitalisierten Messwerte an die Auswerteeinheit 5 übertragen werden, wobei die Auswerteinheit 5 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 konfiguriert ist.
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