DE102022204638A1 - Method and microfluidic device for denaturing a nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Denaturierung einer Nukleinsäure. Dieses weist ein Bereitstellen einer Lösung (21) der Nukleinsäure, eine Denaturierung der Nukleinsäure durch Zugabe mindestens einer Base (23) zu der Lösung (21), und ein Einstellen eines pH-Werts der Lösung auf einen Wert von weniger als 7 durch Zugabe mindestens einer Säure (24) zu der Lösung (21) auf. Die Säure weist einen pKS-Wert im Bereich von 1,0 bis 5,0 auf. Eine mikrofluidische Vorrichtung (10), in welcher in separaten Kammern (11 - 15) mindestens eine Base (23) und mindestens eine Säure (24) mit einem pKS-Wert im Bereich von 1,0 bis 5,0 vorgelagert sind, ist eingerichtet, um das Verfahren durchzuführen.The invention relates to a method for denaturing a nucleic acid. This includes providing a solution (21) of the nucleic acid, denaturing the nucleic acid by adding at least one base (23) to the solution (21), and adjusting a pH of the solution to a value of less than 7 by adding at least an acid (24) to the solution (21). The acid has a pKa value in the range of 1.0 to 5.0. A microfluidic device (10), in which at least one base (23) and at least one acid (24) with a pKa value in the range from 1.0 to 5.0 are stored in separate chambers (11 - 15), is set up to carry out the procedure.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Denaturierung einer Nukleinsäure. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, die eingerichtet ist, um das Verfahren durchzuführen.The present invention relates to a method for denaturing a nucleic acid. Furthermore, the present invention relates to a microfluidic device that is set up to carry out the method.
Stand der TechnikState of the art
Die Methylierung von Cytosinen am 5'C-Atom ist eine epigenetische Markierung, die wichtige regulatorische Funktionen erfüllt. Sie kommt so gut wie ausschließlich in CpG-Kontext vor. Diese Markierung spielt unter anderem eine Rolle bei der Regulation der Genexpression, der embryonalen Entwicklung sowie bei der Zelldifferenzierung. Abweichungen im Methylierungsmuster sind mit einer Vielzahl von Krankheiten assoziiert.Methylation of cytosines at the 5'C atom is an epigenetic mark that fulfills important regulatory functions. It occurs almost exclusively in a CpG context. This marking plays, among other things, a role in the regulation of gene expression, embryonic development and cell differentiation. Deviations in methylation patterns are associated with a variety of diseases.
Eine Analyse von DNA-Methylierungen kann mittels der Bisulfitkonvertierung erfolgen. Da sich methylierte DNA-Sequenzen nicht in ihrem Hybridisierungsverhalten von unmethylierten DNA-Sequenzen unterscheiden und somit keine Array- oder PCR-basierten Methoden in Frage kommen, muss die epigenetische Information zunächst durch chemische Reaktion in eine genetische Information umgewandelt werden. Im Anschluss steht diese nach einer Aufreinigung und optionalen Desulfonierung für weitere molekularbiologische Methoden zur Verfügung. Für eine erfolgreiche Bisulfitkonvertierung ist es entscheidend, dass die DNA denaturiert wird, da die Bisulfitkonvertierung optimal an einzelsträngigen DNA-Molekülen abläuft.Analysis of DNA methylations can be done using bisulfite conversion. Since methylated DNA sequences do not differ in their hybridization behavior from unmethylated DNA sequences and array or PCR-based methods are therefore not possible, the epigenetic information must first be converted into genetic information through a chemical reaction. After purification and optional desulfonation, this is then available for further molecular biological methods. For successful bisulfite conversion, it is crucial that the DNA is denatured, as bisulfite conversion occurs optimally on single-stranded DNA molecules.
Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention
Das Verfahren zur Denaturierung einer Nukleinsäure, insbesondere von DNA, weist die folgenden Schritte auf:
- - Bereitstellen einer Lösung der Nukleinsäure,
- - Denaturierung der Nukleinsäure durch Zugabe mindestens einer Base zu der Lösung und
- - Einstellen eines pH-Werts der Lösung auf einen Wert von weniger als 7 durch Zugabe mindestens einer Säure zu der Lösung, wobei die Säure einen pKS-Wert im Bereich von 1,0 bis 5,0 aufweist.
- - Providing a solution of the nucleic acid,
- - Denaturation of the nucleic acid by adding at least one base to the solution and
- - Adjusting a pH value of the solution to a value of less than 7 by adding at least one acid to the solution, the acid having a pKa value in the range from 1.0 to 5.0.
Dieses Verfahren ist insbesondere zur Durchführung in einer mikrofluidischen Vorrichtung geeignet. Bei dieser Anwendung ist die Verwendung einer Base als Denaturierungsmittel besonders vorteilhaft. Eine Denaturierung einer Nukleinsäure könnte auch durch Inkubation bei hohen Temperaturen von bis zu 98°C erreicht werden. Bei einem solchen Vorgehen wird üblicherweise auch bei der späteren Bisulfitkonvertierung nochmals auf hohe Denaturierungstemperaturen von bis zu 98°C aufgeheizt, um eine Ausbildung von DNA-Doppelsträngen zu vermeiden. Ein großes Problem dieser hohen Temperaturen ist allerdings ein hoher Ausbeuteverlust an Nukleinsäure, während der Bisulfitkonvertierung und der anschließenden Aufreinigung, da die Nukleinsäure oftmals zu stark degradiert wird. Außerdem stellt die Bisulfitkonvertierung immer einen Kompromiss zwischen der vollständigen Konvertierung von Cytosinen zur Vermeidung von falschen positiven Ergebnissen und der Vermeidung der Umwandlung von methylierten Cytosinen dar, welche zu falschen negativen Ergebnissen führen würde. In der Regel führen längere Bisulfitkonvertierungen unter höheren Temperaturen zu vollständigeren Umwandlungen von Cytosinen, allerdings auch zu mehr ungewollten Umwandlungen von methylierten Cytosinen.This method is particularly suitable for implementation in a microfluidic device. In this application, the use of a base as a denaturant is particularly advantageous. Denaturation of a nucleic acid could also be achieved by incubation at high temperatures of up to 98°C. With such a procedure, the subsequent bisulfite conversion is usually heated again to high denaturation temperatures of up to 98 ° C in order to avoid the formation of DNA double strands. A major problem with these high temperatures, however, is a high loss of nucleic acid yield during bisulfite conversion and subsequent purification, as the nucleic acid is often too severely degraded. Furthermore, bisulfite conversion always represents a compromise between fully converting cytosines to avoid false positives and avoiding converting methylated cytosines, which would lead to false negatives. As a rule, longer bisulfite conversions at higher temperatures lead to more complete conversions of cytosines, but also to more unwanted conversions of methylated cytosines.
Neben diesen grundsätzlichen Problemen einer Denaturierung mittels hoher Temperaturen, ist deren Integration in mikrofluidischen Vorrichtungen dadurch problematisch, dass in diesen nur begrenzte Temperaturen erreicht werden können. Dies ist zum einen durch die begrenzte Temperaturbeständigkeit der verwendeten Kunststoffkomponenten und zum anderen durch eine limitierte Heizleistung, insbesondere in großen Kompartimenten, in welchen größere Volumina behandelt werden müssen, wie dies beispielsweise bei der Bisulfitkonvertierung erforderlich ist, begründet.In addition to these fundamental problems of denaturation using high temperatures, their integration into microfluidic devices is problematic because only limited temperatures can be achieved in them. This is due, on the one hand, to the limited temperature resistance of the plastic components used and, on the other hand, to a limited heating output, especially in large compartments in which larger volumes have to be treated, as is required, for example, in bisulfite conversion.
Die chemische Denaturierung der Nukleinsäure durch Zugabe mindestens einer Base kann allerdings bei niedrigeren Temperaturen von beispielsweise 37°C durchgeführt werden. Unter einer Zugabe wird dabei im Sinne dieses Verfahrens das Zusammenführen der Lösung der Nukleinsäure mit einer weiteren Substanz verstanden. Unter einer Zugabe soll also insbesondere nicht nur verstanden werden, dass die Base in die Lösung der Nukleinsäure eingeleitet wird, sondern auch, dass die Lösung der Nukleinsäure in die Base eingeleitet wird.However, the chemical denaturation of the nucleic acid by adding at least one base can be carried out at lower temperatures, for example 37 ° C. For the purposes of this method, an addition means combining the solution of the nucleic acid with another substance. An addition should therefore in particular not only be understood as meaning that the base is introduced into the solution of the nucleic acid, but also that the solution of the nucleic acid is introduced into the base.
Mit Abschluss der Denaturierung weist die Lösung einen alkalischen pH-Wert von mehr als 7 auf. Da eine Bisulfitkonvertierung unter sauren Bedingungen abläuft, ist das anschließende Einstellen des pH-Werts der Lösung auf einen Wert von weniger als 7 vorgesehen. Grundsätzlich könnte zum Einstellen des pH-Werts eine starke Säure, wie beispielsweise Salzsäure, verwendet werden. Diese könnte als konzentrierte wässrige Säure zugefügt werden oder in Form eines Salzes, wie Ammoniumchlorid, welches Chlorwasserstoff durch Dissoziation freisetzt. Derartige starke Säuren würden allerdings die Kunststoffkomponenten einer mikrofluidischen Vorrichtung schädigen und sind deshalb in dem Verfahren nicht vorgesehen. Eine Säure mit einem pKS-Wert im Bereich von 1,0 bis 5,0, vorzugsweise im Bereich von 3,0 bis 5,0, ist hingegen für die Verwendung in dem Verfahren geeignet.When denaturation is complete, the solution has an alkaline pH of more than 7. Since bisulfite conversion occurs under acidic conditions, subsequent adjustment of the pH of the solution to a value of less than 7 is intended. In principle, a strong acid, such as hydrochloric acid, could be used to adjust the pH. This could be added as a concentrated aqueous acid or in the form of a salt, such as ammonium chloride, which releases hydrogen chloride by dissociation. However, such strong acids would damage the plastic components of a microfluidic device and are therefore not provided for in the method. However, an acid with a pKa value in the range from 1.0 to 5.0, preferably in the range from 3.0 to 5.0, is suitable for use in the process.
Die Base ist vorzugsweise eine Lösung von Natriumhydroxid und/oder von Natriumhydrogencarbonat. Diese Basen sind zur Denaturierung von Nukleinsäuren geeignet. Während Natriumhydroxid eine starke Base ist, mittels derer eine besonders schnelle Denaturierung der Nukleinsäure erreicht werden kann, kann das schwächer basische Natriumhydrogencarbonat unter Sicherheitsaspekten vorteilhaft sein.The base is preferably a solution of sodium hydroxide and/or sodium bicarbonate. These bases are suitable for denaturing nucleic acids. While sodium hydroxide is a strong base that can be used to achieve particularly rapid denaturation of the nucleic acid, the weaker basic sodium hydrogen carbonate can be advantageous from a safety perspective.
Grundsätzlich kann es sich bei der Säure um eine anorganische Säure handeln. Diese ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Orthophosporsäure und Metaphosporsäure. Außerdem kann es sich bei der Säure um ein Anhydrid einer anorganischen Säure handeln, insbesondere um Phosphorpentoxid. Vorzugsweise handelt es sich bei der Säure jedoch um eine organische Säure.In principle, the acid can be an inorganic acid. This is in particular selected from the group consisting of orthophosporic acid and metaphosporic acid. In addition, the acid can be an anhydride of an inorganic acid, in particular phosphorus pentoxide. However, the acid is preferably an organic acid.
Organische Säuren beziehungsweise Carbonsäuren dissoziieren in Kontakt mit Wasser nicht vollständig und weisen daher üblicherweise die für das Verfahren vorteilhaften hohen pKS-Werte auf. Geeignete organische Säuren sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxalsäure, Glyoxylsäure, Essigsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Fumarsäure, Acrylsäure, Zitronensäure und Gallussäure. Giftige organische Säuren, wie beispielsweise Chloressigsäure oder Ameisensäure, werden aus Sicherheitsgründen vorzugsweise nicht verwendet.Organic acids or carboxylic acids do not completely dissociate in contact with water and therefore usually have the high pKa values that are advantageous for the process. Suitable organic acids are in particular selected from the group consisting of oxalic acid, glyoxylic acid, acetic acid, pyruvic acid, malonic acid, maleic acid, succinic acid, ascorbic acid, fumaric acid, acrylic acid, citric acid and gallic acid. Toxic organic acids, such as chloroacetic acid or formic acid, are preferably not used for safety reasons.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die organische Säure eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Solche organischen Säuren fungieren zugleich als Reduktionsmittel. Da sie bei einer an das Einstellen des pH-Werts anschließenden Bisulfitkonvertierung in der Lösung der Nukleinsäure verbleiben, können sie darin eine Nukleinsäure-Degradierung nach der Bisulfitreaktion verhindern. Für das Verfahren geeignete organische Säuren mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Maleinsäure, Fumarsäure, Acrylsäure und Ascorbinsäure.Furthermore, it is preferred that the organic acid contains a carbon-carbon double bond. Such organic acids also act as reducing agents. Since they remain in the nucleic acid solution during a bisulfite conversion following adjustment of the pH value, they can prevent nucleic acid degradation after the bisulfite reaction. Organic acids with a carbon-carbon double bond suitable for the process are in particular selected from the group consisting of maleic acid, fumaric acid, acrylic acid and ascorbic acid.
Des Weiteren ist es bevorzugt, dass die organische Säure einen Schmelzpunkt von mindestens 40°C aufweist. Da die Denaturierung der Nukleinsäure durch Zugabe der Base bei einer Temperatur von weniger als 40°C durchgeführt werden kann, liegen solche Säuren in einer mikrofluidischen Vorrichtung als Feststoffe vor. Weil die Bisulfitkonvertierung volumenabhängig ist und von der Einhaltung der Volumenverhältnisse der verwendeten Reagenzien sowie der zu konvertierenden Nukleinsäurelösung abhängt, ist es vorteilhaft, wenn die verwendete organische Säure keinen großen Volumenanteil des Reaktionsgemisches einnimmt. Eine feste Säure kann dabei als Feststoff vorgelagert werden und beansprucht somit wenig Volumen. Neben einigen organischen Säuren weisen auch die bevorzugten anorganischen Säuren Orthophosphorsäure und Metaphosphorsäure derart hohe Schmelzpunkte auf. Das Zusammenführen der Nukleinsäurelösung und der Säure erfolgt bei Verwendung einer festen Säure vorzugsweise, indem die Lösung der Nukleinsäure in eine Reaktionskammer geleitet wird, welche die feste Säure enthält. Hierdurch ist ein Einstellen des pH-Werts der Lösung möglich, ohne dass dieser weitere Flüssigkeit hinzugefügt werden muss.Furthermore, it is preferred that the organic acid has a melting point of at least 40°C. Since the denaturation of the nucleic acid can be carried out by adding the base at a temperature of less than 40 ° C, such acids are present as solids in a microfluidic device. Because the bisulfite conversion is volume-dependent and depends on compliance with the volume ratios of the reagents used and the nucleic acid solution to be converted, it is advantageous if the organic acid used does not take up a large proportion of the volume of the reaction mixture. A solid acid can be stored as a solid and therefore takes up little volume. In addition to some organic acids, the preferred inorganic acids orthophosphoric acid and metaphosphoric acid also have such high melting points. When using a solid acid, the nucleic acid solution and the acid are preferably brought together by passing the nucleic acid solution into a reaction chamber which contains the solid acid. This makes it possible to adjust the pH value of the solution without having to add any additional liquid.
Wenn die Säure hingegen als wässrige Lösung mit der Nukleinsäurelösung zusammengeführt werden soll, dann ist es bevorzugt, dass sie als wässrige Lösung mit einer Konzentration im Bereich von 0,001 mol/l bis 0,100 mol/l in eine Reaktionskammer geleitet wird, welche die Lösung der Nukleinsäure enthält. In diesem Konzentrationsbereich ist ein Einstellen des pH-Werts der Lösung auf einen Wert von weniger als 7 möglich, ohne hierbei das Volumen der Lösung unnötig stark zu vergrößern.If, on the other hand, the acid is to be combined with the nucleic acid solution as an aqueous solution, then it is preferred that it is passed as an aqueous solution with a concentration in the range from 0.001 mol/l to 0.100 mol/l into a reaction chamber which contains the solution of the nucleic acid contains. In this concentration range, it is possible to adjust the pH value of the solution to a value of less than 7 without unnecessarily increasing the volume of the solution.
Polyurethan (PU) und Polycarbonat (PC) sind gängige Kunststoffkomponenten mikrofluidischer Vorrichtungen, die mit den darin zirkulierenden Chemikalien in Kontakt geraten. Polyurethan weist Amid-Bindungen auf, die bei niedrigen pH-Werten hydrolysiert werden können. Polycarbonat weist Ester-Bindungen auf, die bei niedrigen pH-Werten hydrolysiert werden können. Es ist deshalb bevorzugt, dass der pH-Wert der Lösung auf einen Wert von mehr als 3 eingestellt wird.Polyurethane (PU) and polycarbonate (PC) are common plastic components of microfluidic devices that come into contact with the chemicals circulating within them. Polyurethane has amide bonds that can be hydrolyzed at low pH values. Polycarbonate has ester bonds that can be hydrolyzed at low pH values. It is therefore preferred that the pH of the solution be adjusted to a value of more than 3.
Im Anschluss an das Einstellen des pH-Werts wird insbesondere eine Bisulfitkonvertierung der Nukleinsäure durchgeführt. Diese kann insbesondere in derselben mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, wie die Denaturierung der Nukleinsäure.Following the adjustment of the pH value, a bisulfite conversion of the nucleic acid is carried out. In particular, this can take place in the same microfluidic device as the denaturation of the nucleic acid.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, in welcher in separaten Kammern mindestens eine Base und mindestens eine Säure mit einem pKS-Wert im Bereich von 1,0 bis 5,0 vorgelagert sind. Die mikrofluidische Vorrichtung, die auch als Lab-on-Chip bezeichnet werden kann, ist eingerichtet, um das Verfahren durchzuführen.In a further aspect, the invention relates to a microfluidic device in which at least one base and at least one acid with a pKa value in the range from 1.0 to 5.0 are stored in separate chambers. The microfluidic device, which can also be referred to as a lab-on-chip, is set up to carry out the method.
Kurze Beschreibung der ZeichnungenBrief description of the drawings
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
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1 zeigt einen Teilbereich einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. -
2 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. -
3 zeigt einen Teilbereich einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung.
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1 shows a portion of a microfluidic device according to an embodiment of the invention. -
2 shows a flowchart of a method according to an exemplary embodiment of the invention. -
3 shows a portion of a microfluidic device according to another embodiment of the invention.
Ausführungsbeispiele der ErfindungEmbodiments of the invention
Eine mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist dazu eingerichtet, um eine DNA enthaltende Probenlösung mittels Bisulfitkonvertierung zu untersuchen. Hierdurch können beispielsweise Promotorhypermethylierungen von Tumorsuppressoren als Methylierungsmarker erkannt werden, die auf eine Krebserkrankung hinweisen. Wie in
- Nach dem Start 30 des Verfahrens erfolgt ein Bereitstellten 31 einer Lösung 21 der Nukleinsäure DNA in der ersten Kammer 11. Um die Nukleinsäure zu denaturieren, erfolgt ein Pumpen 32 der Lösung 21 in die zweite Kammer 12. Diese fungiert als Reaktionskammer. In einer dritten Kammer 13 ist Natronlauge mit einer Konzentration von 3 mol/l als Base 23 vorgelagert. Eine Denaturierung 33 der Nukleinsäure erfolgt, indem die Base 23 von der dritten Kammer 13 in die zweite Kammer 12 gepumpt wird und dort mit der Nukleinsäure bei einer Temperatur von 37°C zur Reaktion gebracht wird. Die Natronlauge weist einen pH-Wert von 13,5 auf, welcher bei der Denaturierungsreaktion nur unwesentlich gesenkt wird. Dieser pH-Wert wird im nächsten Schritt 34 auf einen Wert von 5 abgesenkt, indem eine Säure 24 in die zweite Kammer 12 gepumpt wird. Bei dieser Säure 24 handelt es sich um 96 %ige Essigsäure, die in der vierten Kammer 14 vorgelagert ist. Nach dem Einstellen 34 des pH-Werts wird das Reaktionsgemisch aus der zweiten Kammer 12 in die fünfte Kammer 15 gepumpt. In dieser fünften Kammer 15 ist ein Gemisch von Reagenzien 25 zur Durchführung einer Bisulfitkonvertierung 35 vorgelagert. Der chemische Ablauf der Bisulfitkonvertierung ist im Folgenden dargestellt:
- After the start 30 of the method, a solution 21 of the nucleic acid DNA is provided 31 in the first chamber 11. In order to denature the nucleic acid, the solution 21 is pumped 32 into the second chamber 12. This functions as a reaction chamber. Sodium hydroxide with a concentration of 3 mol/l is stored as base 23 in a third chamber 13. The nucleic acid is denatured 33 by pumping the base 23 from the third chamber 13 into the second chamber 12 and reacting there with the nucleic acid at a temperature of 37 ° C. The sodium hydroxide solution has a pH value of 13.5, which is only slightly reduced during the denaturation reaction. This pH value is reduced to a value of 5 in the next step 34 by pumping an acid 24 into the second chamber 12. This acid 24 is 96% acetic acid, which is stored in the fourth chamber 14. After adjusting 34 the pH value, the reaction mixture is pumped from the second chamber 12 into the fifth chamber 15. In this fifth chamber 15, a mixture of reagents 25 for carrying out a bisulfite conversion 35 is stored upstream. The chemical process of bisulfite conversion is shown below:
Im Reaktionsschritt I erfolgt eine Sulfonierung eines Cytosins des denaturierten DNA-Strangs an der C6-Position. Im Reaktionsschritt II schließt sich eine irreversible hydrolytische Deaminierung an der C4-Position an, wodurch ein 6-Sulfonyl-Uracil entsteht. Anschließend erfolgt ein Einleiten einer weiteren nicht dargestellten Base in die fünfte Kammer 15, sodass in einem dritten Reaktionsschritt III eine alkalische Desulfonierung erfolgt. Nicht methyliertes Cytosin wird auf diese Weise in Uracil umgewandelt. Eine Methylierung an der C5-Position des Cytosins verhindert hingegen, die Sulfonierung an der C6-Position im Reaktionsschritt I, sodass das Methylcytosin in der Bisulfitkonvertierung unverändert bleibt. Auf diese Weise ermöglicht die Bisulfitkonvertierung es, in einem DNA-Strang Cytosin und Methylcytosin voneinander zu unterscheiden.In reaction step I, a cytosine of the denatured DNA strand is sulfonated at the C6 position. In reaction step II, an irreversible hydrolytic deamination occurs at the C4 position, resulting in a 6-sulfonyl-uracil. A further base, not shown, is then introduced into the
Nach Durchführung der Bisulfitkonvertierung erfolgt ein Beenden 36 des Verfahrens. Weitere Aufreinigungsschritte und Analysenschritte können sich in anderen nicht dargestellten Teilen der mikrofluidischen Vorrichtung anschließen.After the bisulfite conversion has been carried out, the process is ended 36. Further purification steps and analysis steps can follow in other parts of the microfluidic device, not shown.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung 10, welches in
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