DE102021128556A1

DE102021128556A1 - STED microscope

Info

Publication number: DE102021128556A1
Application number: DE102021128556.9A
Authority: DE
Inventors: Andreas Popp; Torsten Mans
Original assignee: Trumpf Lasertechnik GmbH; Amphos GmbH
Current assignee: Trumpf Lasertechnik GmbH; Amphos GmbH
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2023-05-04
Also published as: WO2023078732A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein STED-Mikroskop (1) mit einem Ultrakurzpulslaser (2) zur Erzeugung eines gepulsten Laserstrahls (3), einer gasgefüllten optischen Hohlkernfaser (4), in die der gepulste Laserstrahl (3) einenends eingekoppelt wird und die derart ausgebildet ist, dass die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls (3) bei der Propagation durch die gasgefüllte optische Hohlkernfaser (4) über nichtlineare optische Effekte spektral erweitert werden, einem wellenlängenselektiven Schalter (5) zur Erzeugung eines gepulsten Anregungslaserstrahls (6) und eines gepulsten Abregungslaserstrahls (7) aus dem anderenends aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser (4) ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls (8) und mindestens einer optischen Transportfaser (9) zum Transport des gepulsten Anregungslaserstrahls (6) und des gepulsten Abregungslaserstrahls (7).The invention relates to a STED microscope (1) with an ultra-short pulse laser (2) for generating a pulsed laser beam (3), a gas-filled optical hollow-core fiber (4) into which the pulsed laser beam (3) is coupled at one end and which is designed in such a way that the laser pulses of the pulsed laser beam (3) are spectrally expanded during propagation through the gas-filled optical hollow-core fiber (4) via non-linear optical effects, a wavelength-selective switch (5) for generating a pulsed excitation laser beam (6) and a pulsed depletion laser beam (7). the other end of the pulsed laser beam (8) coupled out of the gas-filled optical hollow-core fiber (4) and at least one optical transport fiber (9) for transporting the pulsed excitation laser beam (6) and the pulsed depletion laser beam (7).

Description

Die Erfindung betrifft ein STED-Mikroskop. Bei STED-Mikroskopen handelt es sich um spezielle Lichtmikroskope, deren Auflösung nicht beugungsbegrenzt ist. Genauer stellt die STED-Mikroskopie eine spezielle Form der Fluoreszenzmikroskopie dar. Charakteristisch für die STED-Mikroskopie ist der Einsatz zweier Laserstrahlen, eines sogenannten Anregungslaserstrahls und eines sogenannten Abregungslaserstrahls. Diese zwei Laserstrahlen werden fokussiert in eine abzubildende Probe eingestrahlt, wobei ihre Fokusse räumlich überlappen. Der Fokus des Abregungslaserstrahls zeichnet sich dabei durch eine zentrale Nullstelle in der räumlichen Intensitätsverteilung aus. Ein Fokus mit dieser Eigenschaft wird im Folgenden als Abregungsfokus bezeichnet. Beispielsweise kann ein Abregungsfokus näherungsweise ringförmig sein.The invention relates to a STED microscope. STED microscopes are special light microscopes whose resolution is not diffraction limited. To be more precise, STED microscopy is a special form of fluorescence microscopy. The use of two laser beams, a so-called excitation laser beam and a so-called depletion laser beam, is characteristic of STED microscopy. These two laser beams are radiated into a sample to be imaged in a focused manner, with their foci spatially overlapping. The focus of the depletion laser beam is characterized by a central zero point in the spatial intensity distribution. A focus with this property is referred to below as a de-excitation focus. For example, a de-excitation focus can be approximately ring-shaped.

Die Abbildung erfolgt nun mittels Detektion von Fluoreszenzlicht, das beim Rastern der Probe mit dem Anregungs- und Abregungslaserstrahl emittiert wird. Die dabei ablaufenden Prozesse können wie folgt umrissen werden: In Folge der Einstrahlung des Anregungslaserstahls werden Fluoreszenzmoleküle in der Probe im Fokus des Anregungslaserstrahls aus dem Grundzustand angeregt. Die angeregten Fluoreszenzmoleküle können über spontane Emission, also unter Aussendung von Fluoreszenzlicht, in den Grundzustand zurückkehren. Noch bevor es zur spontanen Emission kommt, werden die Fluoreszenzmoleküle im Abregungsfokus allerdings über stimulierte Emission abgeregt. Die Emission des Fluoreszenzlichts ist damit auf einen zentralen Bereich um die Nullstelle des Abregungsfokus begrenzt, der (bei hinreichender Intensität des Abregungslaserstrahls) wesentlich kleiner ist als der Fokus des Anregungslaserstrahls. Dies begründet die erhöhte Auflösung des Verfahrens, die in der idealisierten Theorie, unter der Annahme beliebig hoher Abregungsintensitäten, unbegrenzt ist. Praktische Grenzen sind unter anderem dadurch bedingt, dass die Intensität im Zentrum des Abregungsfokus nur näherungsweise auf null abfällt.The imaging is now performed by detecting fluorescent light that is emitted when the sample is scanned with the excitation and deactivation laser beam. The processes that take place can be outlined as follows: As a result of the irradiation of the excitation laser beam, fluorescence molecules in the sample are excited from the ground state in the focus of the excitation laser beam. The excited fluorescent molecules can return to their ground state via spontaneous emission, i.e. by emitting fluorescent light. Even before spontaneous emission occurs, however, the fluorescence molecules in the depletion focus are de-excited via stimulated emission. The emission of the fluorescent light is thus limited to a central area around the zero point of the deactivation focus, which (if the deactivation laser beam is of sufficient intensity) is significantly smaller than the focus of the excitation laser beam. This explains the increased resolution of the method, which is unlimited in the idealized theory, assuming arbitrarily high de-excitation intensities. Practical limits are due, among other things, to the fact that the intensity in the center of the de-excitation focus only falls approximately to zero.

In vielen Fällen handelt es sich bei dem Anregungslaserstrahl und dem Abregungslaserstrahl um gepulste Laserstrahlen, was den Vorteil einer geringeren mittleren Intensität mit sich bringt.In many cases, the excitation laser beam and the depletion laser beam are pulsed laser beams, which has the advantage of a lower average intensity.

In der DE 11 2015 001 640 T5 ist eine STED-Mikroskopvorrichtung mit einer STED-Lichtquelle und einer Anregungslichtquelle beschrieben. Ein räumlicher Lichtmodulator dient zum Formen des STED-Lichts in Ringform durch Phasenmodulation. Mittels eines optischen Systems wird eine Region eines Beobachtungsobjekts mit dem Anregungslicht sowie dem STED-Licht nach der Phasenmodulation bestrahlt. Ein Detektor dient zur Erfassung der von der Region emittierten Fluoreszenz.In the DE 11 2015 001 640 T5 describes a STED microscope device with a STED light source and an excitation light source. A spatial light modulator is used to shape the STED light into a ring shape by phase modulation. A region of an observation object is irradiated with the excitation light and the STED light after the phase modulation by means of an optical system. A detector is used to detect the fluorescence emitted from the region.

Der Anregungslaserstrahl und der Abregungslaserstrahl eines STED-Mikroskops können grundsätzlich auch in einer gemeinsamen optischen Faser, aber dennoch getrennt voneinander geführt werden. Ein entsprechendes optisches System für die STED-Mikroskopie mit einer Anregungsstrahlungsquelle, einer Abregungsstrahlungsquelle und einer polarisationserhaltenden optischen Faser ist beispielsweise aus der WO 2019/169368 bekannt. Die polarisationserhaltende optische Faser weist eine zentrale Mode auf, in der die Anregungsstrahlung propagiert. Ferner weist sie eine oder mehrere äußere Moden auf, in denen die Abregungsstrahlung propagiert. Vor dem Einkoppeln in die optische Faser trifft die Abregungsstrahlung auf einen räumlichen Lichtmodulator, welcher dazu dient, dem Strahl die Form einer Hermite-Gauss-Mode (TEM₁₀) zu geben. In einem Mach-Zehnder-Interferometer wird das Strahlprofil in einem der Arme um 90° rotiert und anschließend mit dem nicht-rotierten Anteil und der Anregungsstrahlung überlagert. Die aus der optischen Faser ausgekoppelte Anregungs- und Abregungsstrahlung wird mittels eines ersten Objektivs kollimiert und mittels eines zweiten Objektivs in die Probe eingestrahlt.In principle, the excitation laser beam and the deactivation laser beam of a STED microscope can also be guided in a common optical fiber, but still separately from one another. A corresponding optical system for STED microscopy with an excitation radiation source, a deactivation radiation source and a polarization-maintaining optical fiber is, for example, from WO 2019/169368 known. The polarization-maintaining optical fiber has a central mode in which the excitation radiation propagates. Furthermore, it has one or more external modes in which the depletion radiation propagates. Before being coupled into the optical fiber, the depletion radiation impinges on a spatial light modulator which serves to shape the beam into a Hermite-Gaussian mode (TEM ₁₀ ). In a Mach-Zehnder interferometer, the beam profile is rotated by 90° in one of the arms and then superimposed with the non-rotated portion and the excitation radiation. The excitation and de-excitation radiation coupled out of the optical fiber is collimated by means of a first objective and radiated into the sample by means of a second objective.

Ein STED-Mikroskopie-System mit zwei Lichtquellen und einer optischen Faser mit einer Kernregion, in der das Anregungslicht propagiert, und einer Ringregion, in der das Abregungslicht propagiert, ist außerdem in der WO 2017/210679 beschrieben.A STED microscopy system with two light sources and an optical fiber having a core region in which the excitation light propagates and a ring region in which the de-excitation light propagates is also disclosed in US Pat WO 2017/210679 described.

Aus der DE 10 2007 048 135 B4 ist ferner ein Fluoreszenzmikroskop bekannt, in dem Licht unterschiedlicher Wellenlänge zur Verfügung steht, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe von einem Zustand in einen anderen Zustand zu überführen. Konkret umfasst das Fluoreszenzmikroskop eine Anregungslichtquelle, die Anregungslicht zur Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs bereitstellt. Weiter dient Abregungslicht dazu, den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb eines interessierenden Messpunkts durch stimulierte Emission wieder abzuregen. Zur Bildung des Abregungslichts umfasst das Fluoreszenzmikroskop einen Laser, der Licht emittiert, das in eine Lichtleiterfaser eingekoppelt wird. In der Lichtleiterfaser führt stimulierte Raman-Streuung zur Ausbildung mehrerer rotverschobener Stokes-Linien. Eine der Stokes-Linien wird mit einem wellenlängenselektiven Element selektiert und bildet das Abregungslicht aus. Bevorzugt handelt es sich bei der Lichtleiterfaser um eine konventionelle, verjüngungsfreie Single Mode Faser. In einer Ausführungsform ist die Lichtleiterfaser dagegen eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern.From the DE 10 2007 048 135 B4 a fluorescence microscope is also known in which light of different wavelengths is available in order to convert different fluorescent dyes from one state into another state. Specifically, the fluorescence microscope includes an excitation light source that provides excitation light for exciting a fluorescent dye. Furthermore, de-excitation light is used to de-excite the fluorescent dye again outside of a measuring point of interest by stimulated emission. To form the de-excitation light, the fluorescence microscope includes a laser that emits light that is coupled into an optical fiber. In the optical fiber, stimulated Raman scattering leads to the formation of several red-shifted Stokes lines. One of the Stokes lines is selected with a wavelength-selective element and forms the depletion light. The optical fiber is preferably a conventional, non-tapered single-mode fiber. In one embodiment, however, the optical fiber is a microstructured fiber with a gas-filled hollow core.

Bei STED-Mikroskopen mit zwei voneinander getrennten gepulsten Lichtquellen, also einer gepulsten Anregungslichtquelle und einer davon getrennten gepulsten Abregungslichtquelle, müssen diese synchronisiert werden. Eine solche Synchronisierung ist aufwendig.In the case of STED microscopes with two separate pulsed light sources, ie a pulsed excitation light source and a separate pulsed deactivation light source, these must be synchronized. Such synchronization is expensive.

Aus dem Stand der Technik sind allerdings auch STED-Mikroskope mit einer gemeinsamen gepulsten Lichtquelle bekannt. In der WO 2014/029978 ist beispielsweise ein STED-Mikroskop beschrieben, das einen Titan-Saphir-Laser aufweist, der einen gepulsten Laserstrahl emittiert. Der gepulste Laserstrahl wird auf einen Anregungsstrahlengang und einen Abregungsstrahlengang aufgeteilt. Im Anregungsstrahlengang ist eine Photonischer-Kristall-Faser angeordnet, an deren Ausgang ein Weißlichtspektrum vorliegt. Ein akustooptisch durchstimmbarer Filter dient zur Wellenlängenselektion ausgehend von diesem Weißlichtspektrum. Im Abregungsstrahlengang ist ferner ein Lichtmodulator angeordnet, der als Phasenmaske dient und eine Aberrationskorrektur ermöglicht.However, STED microscopes with a common pulsed light source are also known from the prior art. In the WO 2014/029978 For example, a STED microscope is described that includes a titanium-sapphire laser that emits a pulsed laser beam. The pulsed laser beam is divided into an excitation beam path and a deactivation beam path. A photonic crystal fiber is arranged in the excitation beam path, at the output of which there is a white light spectrum. An acousto-optic tunable filter is used for wavelength selection based on this white light spectrum. A light modulator, which serves as a phase mask and enables aberration correction, is also arranged in the deactivation beam path.

Ein STED-Mikroskop mit einem Titan-Saphir-Laser, einem Anregungsstrahlengang, einem Abregungsstrahlengang und einer Photonischer-Kristall-Faser im Anregungsstrahlengang ist außerdem in der WO 2013/167479 beschrieben.A STED microscope with a titanium sapphire laser, an excitation beam path, a deactivation beam path and a photonic crystal fiber in the excitation beam path is also in the WO 2013/167479 described.

Der Erfindung lag demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein STED-Mikroskop bereitzustellen, das sich durch eine hohe Flexibilität, insbesondere im Hinblick auf den Einsatz unterschiedlicher Fluoreszenzmoleküle, auszeichnet und das gleichzeitig einen besonders einfachen und kostengünstigen Aufbau aufweist.In contrast, the invention was based on the object of providing a STED microscope which is characterized by a high degree of flexibility, in particular with regard to the use of different fluorescence molecules, and which at the same time has a particularly simple and cost-effective structure.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein STED-Mikroskop, umfassend einen Ultrakurzpulslaser zur Erzeugung eines gepulsten Laserstrahls, eine gasgefüllte optische Hohlkernfaser, in die der gepulste Laserstrahl einenends eingekoppelt wird und die derart ausgebildet ist, dass die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls bei der Propagation durch die gasgefüllte optische Hohlkernfaser über nichtlineare optische Effekte spektral erweitert werden, einen wellenlängenselektiven Schalter zur Erzeugung eines gepulsten Anregungslaserstrahls und eines gepulsten Abregungslaserstrahls aus dem anderenends aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls, mindestens eine optische Transportfaser zum Transport des gepulsten Anregungslaserstrahl und des gepulsten Abregungslaserstrahls, wobei entweder das STED-Mikroskop eine Phasenmodulationseinrichtung zur Modulation der Phase des aus der mindestens einen optischen Transportfaser ausgekoppelten, gepulsten Abregungslaserstrahls umfasst, die dergestalt ausgebildet ist, dass eine Fokussierung des phasenmodulierten, gepulsten Abregungslaserstrahls in einem Abregungsfokus resultiert, oder es sich bei der mindestens einen optischen Transportfaser um genau eine optische Transportfaser handelt, die eine zentrale Mode für die Propagation des gepulsten Anregungslaserstrahls und mindestens eine höhere Mode für die Propagation des gepulsten Abregungslaserstrahls aufweist, ein Objektiv zur gemeinsamen Fokussierung des ausgekoppelten, gepulsten Anregungslaserstrahls und des phasenmodulierten beziehungsweise des aus der optischen Transportfaser ausgekoppelten, gepulsten Abregungslaserstrahls in eine Probe und zum Sammeln von Fluoreszenzlicht, das von der Probe emittiert wird, sowie eine Detektionseinrichtung zur Detektion des gesammelten Fluoreszenzlichts.This object is achieved by a STED microscope, comprising an ultrashort pulsed laser for generating a pulsed laser beam, a gas-filled optical hollow-core fiber into which the pulsed laser beam is coupled at one end and which is designed in such a way that the laser pulses of the pulsed laser beam during propagation through the gas-filled optical hollow-core fibers are spectrally expanded via non-linear optical effects, a wavelength-selective switch for generating a pulsed excitation laser beam and a pulsed depletion laser beam from the other end of the pulsed laser beam decoupled from the gas-filled optical hollow-core fiber, at least one optical transport fiber for transporting the pulsed excitation laser beam and the pulsed depletion laser beam, wherein either the STED microscope comprises a phase modulation device for modulating the phase of the pulsed depletion laser beam coupled out of the at least one optical transport fiber, which is designed in such a way that the phase-modulated, pulsed depletion laser beam is focused in a depletion focus, or the at least one optical transport fiber is exactly one optical transport fiber which has a central mode for the propagation of the pulsed excitation laser beam and at least one higher mode for the propagation of the pulsed deactivation laser beam, a lens for joint focusing of the decoupled, pulsed excitation laser beam and the phase-modulated one or the one from the optical transport fiber coupled-out, pulsed depletion laser beam into a sample and for collecting fluorescent light emitted from the sample, and detection means for detecting the collected fluorescent light.

Ultrakurzpulslaser sind Laser, die Laserlicht in Form von Laserpulsen mit Pulsdauern im Piko- oder Femtosekundenbereich oder darunter emittieren. Beispiele für Ultrakurzpulslaser sind modengekoppelte Faserlaser oder Hybridlaser, bei welchen ein modengekoppelter Faserlaser in Kombination mit einem Festkörperverstärker zum Einsatz kommt.Ultrafast lasers are lasers that emit laser light in the form of laser pulses with pulse durations in the picosecond or femtosecond range or less. Examples of ultrashort pulse lasers are mode-locked fiber lasers or hybrid lasers, in which a mode-locked fiber laser is used in combination with a solid-state amplifier.

Optische Hohlkernfasern sind optische Fasern, die sich durch einen hohlen Faserkern auszeichnen. Beispiele für optische Hohlkernfasern sind entsprechende Photonischer-Kristall Fasern (engl. Hollow-Core Photonic Crystal Fibers), Revolver-Hohlkernfasern (engl. auch Tubular Lattice Fibers), Nested-Tube-Fasern und Kagome-Fasern. Revolver-Hohlkernfasen zeichnen sich durch eine Mehrzahl von Ringen im Querschnitt aus, die bevorzugt diskret rotationssymmetrisch um den Mittelpunkt der optischen Hohlkernfaser angeordnet sind, deren Anordnung anschaulich also im Wesentlichen der Anordnung von Patronen in der Trommel eines Revolvers entspricht. Nested-Tube-Fasern zeichnen sich durch verschachtelte Ringe im Querschnitt der Faser aus. Der Mechanismus der Lichtleitung kann z.B. auf einer photonischen Bandlücke oder der Diskriminierung der Kopplung in Moden höherer Ordnung beruhen. Bei der Propagation der Laserpulse des gepulsten Laserstrahls durch die gasgefüllte optische Hohlkernfaser kommt es durch nichtlineare optische Effekte zu einer spektralen Erweiterung. Die nichtlinearen optischen Effekte umfassen den Kerr-Effekt, der zu einer Selbstphasenmodulation führt, sowie die stimulierte Raman-Streuung. Ferner spielen die Dispersionseigenschaften der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser eine wesentliche Rolle. Die spektrale Erweiterung ist dabei so zu verstehen, dass sich neue spektrale Anteile bilden, welche die in die optische Hohlkernfaser eingekoppelten Laserpulse nicht aufweisen. Insbesondere kann eine spektrale Erweiterung im Sinne einer Verbreiterung des Spektrums erzielt werden.Hollow-core optical fibers are optical fibers that are characterized by a hollow fiber core. Examples of hollow-core optical fibers are corresponding photonic crystal fibers (hollow-core photonic crystal fibers), revolver hollow-core fibers (also tubular lattice fibers), nested-tube fibers and kagome fibers. Revolver hollow-core bevels are characterized by a plurality of rings in cross section, which are preferably arranged discretely rotationally symmetrically around the center point of the optical hollow-core fiber, the arrangement of which clearly corresponds to the arrangement of cartridges in the barrel of a revolver. Nested tube fibers are characterized by nested rings in the cross section of the fiber. The mechanism of light guiding can be based, for example, on a photonic band gap or the discrimination of the coupling in higher-order modes. During the propagation of the laser pulses of the pulsed laser beam through the gas-filled optical hollow-core fiber, non-linear optical effects result in a spectral expansion. The nonlinear optical effects include the Kerr effect, which leads to self-phase modulation, and stimulated Raman scattering. Furthermore, the dispersion properties of the gas-filled hollow-core optical fiber play an important role. The spectral expansion is to be understood in such a way that new spectral components are formed which the laser pulses coupled into the optical hollow-core fiber do not have. In particular, a spectral expansion in the sense of a broadening of the spectrum can be achieved.

Vorteile der Verwendung von gasgefüllten optischen Hohlkernfasern liegen unter anderem darin, dass durch den Einschluss auf einen kleinen Strahlquerschnitt und relativ lange Propagationslängen relativ geringe Teilchendichten für die Anregung der nichtlinearen optischen Effekte ausreichen. Durch die Wahl der eingesetzten Gase (z.B. atomar Ne, Ar, Kr, Xe oder molekular H₂, N₂, N₂O, C₂H₂F₄, C₂H₄F₂) oder Gasgemische (insbesondere aus einem oder mehreren der genannten Gase), den Gasdruck und die Parameter der gepulsten Laserlichtquelle kann außerdem eine Vielzahl von Spektren kontrolliert erzeugt werden. Im Vergleich zu Festkörpern, die seit langem als nichtlinear-optische Medien eingesetzt werden, ist in gasgefüllten optischen Hohlkernfasern die unerwünschte Absorption deutlich reduziert, und die Zerstörungsschwellen liegen wesentlich höher.Advantages of using gas-filled optical hollow-core fibers include the fact that relatively low particle densities are sufficient to excite the non-linear optical effects due to the confinement to a small beam cross-section and relatively long propagation lengths. By choosing the gases used (e.g. atomic Ne, Ar, Kr, Xe or molecular H ₂ , N ₂ , N ₂ O, C ₂ H ₂ F ₄ , C ₂ H ₄ F ₂ ) or gas mixtures (in particular from one or more of the gases mentioned), the gas pressure and the parameters of the pulsed laser light source, a large number of spectra can also be generated in a controlled manner. Compared to solids, which have long been used as non-linear optical media, the undesired absorption in gas-filled hollow-core optical fibers is significantly reduced and the destruction thresholds are much higher.

Ein wesentlicher Zweck der spektralen Erweiterung bzw. spektralen Verbreiterung ist es, eine Vielzahl an möglichen Zentralwellenlängen für den gepulsten Anregungslaserstrahl und den gepulsten Abregungslaserstrahl bereitzustellen. Ausgehend von den Laserpulsen des Ultrakurzpulslasers, die eine bestimmte Zentralwellenlänge aufweisen, sind nach der spektralen Verbreiterung Laserpulse mit einer aus einem großen Wellenlängenbereich selektierbaren Zentralwellenlänge erzeugbar. Im Ergebnis können sowohl die Zentralwellenlänge des Anregungslaserstrahls als auch die Zentralwellenlänge des Abregungslaserstrahls flexibel an unterschiedliche Fluoreszenzmoleküle angepasst werden.An essential purpose of the spectral expansion or spectral broadening is to provide a large number of possible central wavelengths for the pulsed excitation laser beam and the pulsed depletion laser beam. Starting from the laser pulses of the ultra-short pulse laser, which have a specific central wavelength, laser pulses with a central wavelength that can be selected from a large wavelength range can be generated after spectral broadening. As a result, both the central wavelength of the excitation laser beam and the central wavelength of the depletion laser beam can be flexibly adapted to different fluorescence molecules.

Ein wellenlängenselektiver Schalter ist eine Einrichtung zum wellenlängenabhängigen Schalten von Licht. Über einen Eingang eintretendes Licht wird in seine Wellenlängenkomponenten aufgeteilt, die anschließend parallel und unabhängig voneinander beeinflusst und gezielt über einen oder mehrere Ausgänge ausgegeben werden können. Für das vorliegende STED-Mikroskop eignen sich insbesondere wellenlängenselektive Schalter mit einem ein oder zwei Ausgängen. Aus dem spektral erweiterten Spektrum werden geeignete Wellenlängenkomponenten für den gepulsten Anregungslaserstrahl und den gepulsten Abregungslaserstrahl selektiert und gemeinsam über den einen Ausgang oder getrennt voneinander über die zwei Ausgänge ausgegeben. Durch die Erzeugung des gepulsten Anregungslaserstrahls und des gepulsten Abregungslaserstrahls aus einer gemeinsamen Quelle entfällt die im Fall zweier unterschiedlicher Laserquellen notwendige, aufwendige Synchronisation. Der Aufbau ist in der Folge einfacher und kostengünstiger.A wavelength-selective switch is a device for wavelength-dependent switching of light. Light entering via an input is divided into its wavelength components, which can then be influenced in parallel and independently of one another and output in a targeted manner via one or more outputs. Wavelength-selective switches with one or two outputs are particularly suitable for the present STED microscope. Suitable wavelength components for the pulsed excitation laser beam and the pulsed depletion laser beam are selected from the spectrally expanded spectrum and output together via one output or separately from one another via the two outputs. Generating the pulsed excitation laser beam and the pulsed deactivation laser beam from a common source eliminates the complex synchronization that is necessary in the case of two different laser sources. As a result, the structure is simpler and cheaper.

Mittels der mindestens einen optischen Transportfaser können der gepulste Anregungslaserstrahl und der gepulste Abregungslaserstrahl auf einfache Weise an einen gewünschten Ort zugeführt werden. Dies ermöglicht eine räumliche Trennung zwischen dem Ort der Abbildung, an dem sich die Probe und das Objektiv (und ggfs. der eigentliche Mikroskopkörper) befinden, und den anderen Komponenten des STED-Mikroskops, insbesondere dem Ultrakurzpulslaser. Im Ergebnis erzielt man eine besonders hohe Flexibilität in der Anwendung. Beispielsweise kann am Ort der Abbildung zusätzlicher Platz für die Probenvorbereitung zur Verfügung stehen. Verglichen mit der Zuführung des gepulsten Anregungs- bzw. Abregungslaserstrahls über ein oder mehrere Spiegel, beispielsweise dielektrische Spiegel, kann ferner auf einen komplexen Aufbau und eine aufwendige Justage des Strahlengangs verzichtet werden. Schließlich wird der Einsatz in Anwendungen, in denen die Zugänglichkeit stark eingeschränkt ist, beispielsweise der Einsatz an lebenden Tieren oder in großen Anlagen in industrieller Umgebung, damit erst ermöglicht.The pulsed excitation laser beam and the pulsed depletion laser beam can be supplied to a desired location in a simple manner by means of the at least one optical transport fiber. This enables a spatial separation between the location of the image, where the sample and the lens (and possibly the actual microscope body) are located, and the other components of the STED microscope, in particular the ultrashort pulse laser. The result is a particularly high level of flexibility in use. For example, additional space for sample preparation can be available at the location of the image. Compared to the supply of the pulsed excitation or deactivation laser beam via one or more mirrors, for example dielectric mirrors, a complex structure and an expensive adjustment of the beam path can also be dispensed with. After all, this is what makes it possible to use it in applications in which accessibility is severely restricted, for example use on living animals or in large systems in an industrial environment.

Mittels der Phasenmodulationseinrichtung wird die Phase des gepulsten Abregungslaserstrahls räumlich so beeinflusst, dass man bei einer Fokussierung einen Abregungsfokus erhält, also dass die Intensität im Zentrum des Fokus auf null beziehungsweise näherungsweise auf null abfällt. Die Phasenmodulationseinrichtung kann statisch oder dynamisch sein. Im ersteren Fall kann es sich bei der Phasenmodulationseinrichtung beispielsweise um eine Phasenmaske, insbesondere eine Phasenmaske mit einem spiralförmigen Profil, oder ein diffraktives optisches Element (DOE) handeln. Im letzteren Fall kann es sich bei der Phasenmodulationseinrichtung beispielsweise um einen räumlichen Lichtmodulator handeln.The phase of the pulsed deactivation laser beam is spatially influenced by means of the phase modulation device in such a way that a deactivation focus is obtained when focusing, that is to say that the intensity in the center of the focus falls to zero or approximately to zero. The phase modulator can be static or dynamic. In the first case, the phase modulation device can be, for example, a phase mask, in particular a phase mask with a spiral profile, or a diffractive optical element (DOE). In the latter case, the phase modulation device can be a spatial light modulator, for example.

Im Fall der Propagation des gepulsten Anregungslaserstrahls in einer zentralen Mode und des gepulsten Abregungslaserstrahls in mindestens einer höheren Mode der optischen Transportfaser ist der wellenlängenselektive Schalter bevorzugt ausgebildet, den gepulsten Anregungslaserstrahl und den gepulsten Abregungslaserstrahl in die entsprechenden Moden einzukoppeln. Um die Einkopplung des gepulsten Abregungslaserstrahls in die mindestens eine höhere Mode zu erleichtern, kann der wellenlängenselektive Schalter eine Einrichtung zur Beeinflussung des räumlichen Intensitätsprofils des gepulsten Abregungslaserstrahls umfassen. Bevorzugt ist die optische Transportfaser so ausgebildet, dass die zentrale Mode und die mindestens eine höhere Mode einen geringen Intensitätsüberlapp aufweisen.In the case of propagation of the pulsed excitation laser beam in a central mode and the pulsed depletion laser beam in at least one higher mode of the optical transport fiber, the wavelength-selective switch is preferably designed to couple the pulsed excitation laser beam and the pulsed depletion laser beam into the corresponding modes. In order to facilitate the coupling of the pulsed depletion laser beam into the at least one higher mode, the wavelength-selective switch can include a device for influencing the spatial intensity profile of the pulsed depletion laser beam. The optical transport fiber is preferably designed in such a way that the central mode and the at least one higher mode have a low intensity overlap.

Propagiert der gepulste Anregungslaserstrahl in einer zentralen Mode und der gepulste Abregungslaserstrahl in mindestens einer höheren Mode der optischen Transportfaser, entfällt ferner die Phasenmodulationseinrichtung, die in diesem Fall zur Erzielung des Abregungsfokus nicht notwendig ist. Vor der gemeinsamen Fokussierung mittels des Objektivs werden der aus der optischen Transportfaser ausgekoppelte, gepulste Anregungs- und Abregungslaserstrahl bevorzugt mittels eines weiteren optischen Elements, beispielsweise einer Linse oder einer Anordnung mehrerer Linsen, kollimiert.If the pulsed excitation laser beam propagates in a central mode and the pulsed depletion laser beam in at least one higher mode of the optical transport fiber, the phase modulation device that is present in this case is not necessary to achieve the deactivation focus. Before being focused together by means of the objective, the pulsed excitation and deactivation laser beam coupled out of the optical transport fiber are preferably collimated by means of a further optical element, for example a lens or an arrangement of a plurality of lenses.

In einer Ausführungsform ist mittels des wellenlängenselektiven Schalters mindestens eine Pulseigenschaft, insbesondere eine Pulsdauer, der Laserpulse des gepulsten Anregungslaserstrahls und/oder der Laserpulse des gepulsten Abregungslaserstrahls über eine Modulation der spektralen Phase und/oder der spektralen Amplitude des aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls einstellbar. Neben der Zentralwellenlänge sind mittels des wellenlängenselektiven Schalters bevorzugt auch andere Pulseigenschaften einzelpulsgenau einstellbar, insbesondere wenn dieser neben der Modulation der spektralen Amplitude auch eine Modulation der spektralen Phase erlaubt. Die Pulseigenschaften umfassen insbesondere auch die Pulsform. Die Pulseigenschaften der Laserpulse des gepulsten Anregungslaserstrahls und des gepulsten Abregungslaserstrahls sind bevorzugt an die spezifischen Anforderungen der Anregung beziehungsweise Abregung der eingesetzten Fluoreszenzmoleküle anpassbar. Typischerweise resultiert dies in unterschiedlichen Pulseigenschaften der Laserpulse des gepulsten Anregungslaserstrahls und des gepulsten Abregungslaserstrahls. Beispielsweise können diese unterschiedliche Pulsdauern aufweisen. Die Pulsdauer der Laserpulse des Anregungs- und/oder Abregungslaserstrahls ist bevorzugt innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer einstellbar. Die Kontrolle der Pulsdauer steigert die Flexibilität und erweitert die mikroskopischen Möglichkeiten. Über eine geeignete Einstellung der Pulseigenschaften kann ferner zum Beispiel eine Pulsverbreiterung durch Dispersion aufgrund einer Propagation des gepulsten Ausgangslaserstrahls durch ein oder mehrere im Strahlengang nachfolgende optische Elemente kompensiert werden.In one embodiment, at least one pulse property, in particular a pulse duration, of the laser pulses of the pulsed excitation laser beam and/or the laser pulses of the pulsed depletion laser beam is controlled by means of the wavelength-selective switch via a modulation of the spectral phase and/or the spectral amplitude of the pulsed output from the gas-filled hollow-core optical fiber Adjustable laser beam. In addition to the central wavelength, the wavelength-selective switch can also be used to set other pulse properties with individual pulse precision, in particular if this allows modulation of the spectral phase in addition to modulation of the spectral amplitude. In particular, the pulse properties also include the pulse shape. The pulse properties of the laser pulses of the pulsed excitation laser beam and the pulsed deactivation laser beam can preferably be adapted to the specific requirements of the excitation or deactivation of the fluorescence molecules used. Typically, this results in different pulse properties of the laser pulses of the excitation pulsed laser beam and the depletion pulsed laser beam. For example, they can have different pulse durations. The pulse duration of the laser pulses of the excitation and/or deactivation laser beam can preferably be adjusted within the fluorescence lifetime. Controlling the pulse duration increases flexibility and expands the microscopic possibilities. A suitable setting of the pulse properties can also be used, for example, to compensate for pulse broadening due to dispersion due to propagation of the pulsed output laser beam through one or more optical elements that follow in the beam path.

Der wellenlängenselektive Schalter erlaubt insbesondere auch eine Einstellung der zeitlichen Struktur, insbesondere der Pulswiederholfrequenz und/oder der zeitlichen Abfolge, der Laserpulse des Anregungslaserstrahls und des Abregungslaserstrahls im Bereich von Piko- oder Femtosekunden durch geeignete Modulation der spektralen Phase. Damit können beispielsweise die Laserpulse des Anregungslaserstrahls und des Abregungslaserstrahls auch zeitlich aufeinander abgestimmt werden um die Fluoreszenzbedingungen in der Probe optimal auszunutzen. Der wellenlängenselektive Schalter kann damit auch als transienter wellenlängenselektiver Schalter bezeichnet werden.In particular, the wavelength-selective switch also allows the temporal structure, in particular the pulse repetition frequency and/or the temporal sequence, of the laser pulses of the excitation laser beam and the depletion laser beam to be adjusted in the picosecond or femtosecond range by suitable modulation of the spectral phase. In this way, for example, the laser pulses of the excitation laser beam and the deactivation laser beam can also be coordinated in terms of time in order to optimally utilize the fluorescence conditions in the sample. The wavelength-selective switch can thus also be referred to as a transient wavelength-selective switch.

Die zeitliche Struktur der Laserpulse des Anregungslaserstrahls und des Abregungslaserstrahls kann außerdem alternativ oder zusätzlich bereits im Ultrakurzpulslaser eingestellt werden. Die Laserpulse des Anregungslaserstrahls und des Abregungslaserstrahls können dabei im Takt der Oszillatorfrequenz des Laseroszillators gesteuert werden. Insbesondere kann eine zeitliche Struktur im Bereich von Nanosekunden bereits in einem Treiber-Laser mittels Pulspicker aufgeprägt werden. Eine entsprechende Vorgehensweise ist beispielsweise üblich zur Erzeugung von Puls-Bursts im Bereich der Materialbearbeitung von Gläsern.The temporal structure of the laser pulses of the excitation laser beam and the depletion laser beam can alternatively or additionally already be set in the ultrashort pulse laser. The laser pulses of the excitation laser beam and the deactivation laser beam can be controlled in time with the oscillator frequency of the laser oscillator. In particular, a temporal structure in the nanosecond range can already be impressed in a driver laser using a pulse picker. A corresponding procedure is common, for example, for generating pulse bursts in the field of material processing of glasses.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das STED-Mikroskop die Phasenmodulationseinrichtung und einen dichroitischen Spiegel und bei der mindestens einen optischen Transportfaser handelt es sich um genau eine optische Transportfaser, wobei der aus der optischen Transportfaser ausgekoppelte, gepulste Abregungslaserstrahl vor der Phasenmodulationseinrichtung mittels des dichroitischen Spiegels von dem ausgekoppelten, gepulsten Anregungslaserstrahl trennbar ist. Propagieren sowohl der gepulste Anregungslaserstrahl als auch der gepulste Abregungslaserstrahl überlagert, also eben nicht in unterschiedlichen Moden, durch genau eine optische Transportfaser, so sind diese nach dem Auskoppeln aus der optischen Transportfaser voneinander zu trennen. Diese Trennung erfolgt bevorzugt über die voneinander abweichenden Zentralwellenlängen der Laserpulse mittels des dichroitischen Spiegels. Bei einem dichroitischen Spiegel handelt es sich um ein optisches Element, das Licht wellenlängenabhängig reflektiert oder transmittiert. Beispielsweise kann der dichroitische Spiegel den gepulsten Abregungslaserstrahl reflektieren und den gepulsten Anregungslaserstrahl transmittieren. Lediglich der von dem gepulsten Anregungslaserstrahl getrennte, gepulste Abregungslaserstrahl tritt anschließend durch die Phasenmodulationseinrichtung hindurch.In a further embodiment, the STED microscope comprises the phase modulation device and a dichroic mirror and the at least one optical transport fiber is exactly one optical transport fiber, the pulsed depletion laser beam decoupled from the optical transport fiber being deflected from the phase modulation device by means of the dichroic mirror decoupled, pulsed excitation laser beam is separable. If both the pulsed excitation laser beam and the pulsed deactivation laser beam propagate in a superimposed manner, ie not in different modes, through exactly one optical transport fiber, these must be separated from one another after being coupled out of the optical transport fiber. This separation preferably takes place via the central wavelengths of the laser pulses, which differ from one another, by means of the dichroic mirror. A dichroic mirror is an optical element that reflects or transmits light depending on the wavelength. For example, the dichroic mirror may reflect the depletion pulsed laser beam and transmit the excitation pulsed laser beam. Only the pulsed depletion laser beam separated from the pulsed excitation laser beam subsequently passes through the phase modulation device.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das STED-Mikroskop die Phasenmodulationseinrichtung und bei der mindestens einen optischen Transportfaser handelt es sich um zwei optische Transportfasern, wobei der wellenlängenselektive Schalter ausgebildet ist, den gepulsten Anregungslaserstrahl in die erste optische Transportfaser und den gepulsten Abregungslaserstrahl in die zweite optische Transportfaser einzukoppeln. Die Phasenmodulationseinrichtung ist dabei so angeordnet, dass lediglich der aus der zweiten optischen Transportfaser ausgekoppelte, gepulste Abregungslaserstrahl durch die Phasenmodulationseinrichtung hindurchtritt.In a further embodiment, the STED microscope comprises the phase modulation device and the at least one optical transport fiber is two optical transport fibers, the wavelength-selective switch being designed to direct the pulsed excitation laser beam into the first optical transport fiber and the pulsed depletion laser beam into the second optical transport fiber to couple. The phase modulation device is arranged in such a way that only the pulsed depletion laser beam coupled out of the second optical transport fiber passes through the phase modulation device.

In einer weiteren Ausführungsform ist die mindestens eine optische Transportfaser eine optische Hohlkernfaser, bevorzugt eine Kagome-Faser, Revolver-Hohlkernfaser oder Nested-Tube-Faser.In a further embodiment, the at least one optical transport fiber is an opti cal hollow core fiber, preferably a Kagome fiber, revolver hollow core fiber or nested tube fiber.

Wesentliche Vorteile des Einsatzes einer optischen Hohlkernfaser als Transportfaser liegen in der geringen Absorption über einen großen Spektralbereich, auch im Ultraviolett-, Infrarot- und fernen Infrarotbereich, hohen Zerstörungsschwellen, der schwachen Ausprägung von nichtlinearen Effekten und der im Vergleich zu konventionellen optischen Fasern schwachen beziehungsweise einstellbaren Dispersion.The main advantages of using an optical hollow-core fiber as a transport fiber are the low absorption over a large spectral range, including in the ultraviolet, infrared and far infrared ranges, high destruction thresholds, the weak development of non-linear effects and the weak or adjustable compared to conventional optical fibers dispersion.

Kagome-Fasern sind spezielle optische Hohlkernfasern, die in ihrem Querschnitt eine Kagome-Struktur aufweisen. Der Einsatz von Kagome-Fasern ist besonders vorteilhaft, da diese das Laserlicht besonders gut im Hohlkern konzentrieren und damit besonders hohe Laserleistungen zulassen.Kagome fibers are special hollow-core optical fibers that have a kagome structure in their cross-section. The use of Kagome fibers is particularly advantageous because they concentrate the laser light particularly well in the hollow core and thus allow particularly high laser power.

In einer Weiterbildung treten in der mindestens einen optischen Transportfaser keine oder nur schwache nichtlineare optische Effekte auf, wobei bevorzugt in der mindestens einen optischen Transportfaser ein Vakuum oder ein Druck von weniger als 200 mbar, besonders bevorzugt weniger als 100 mbar, insbesondere weniger als 10 mbar vorherrscht und/oder die mindestens eine optische Transportfaser mit einem Gas mit einer besonders niedrigen Nichtlinearität, insbesondere mit He, oder einer Gasmischung umfassend He gefüllt ist. Der Druck in der mindestens einen optischen Transportfaser ist dann typischerweise geringer als in der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser. Unter schwachen nichtlinearen optischen Effekten werden insbesondere solche verstanden, die zu einer Verlängerung der Pulsdauer von weniger als 50 fs oder einem B-Integral von weniger als 0,1 rad führen.In a further development, no or only weak nonlinear optical effects occur in the at least one optical transport fiber, with a vacuum or a pressure of less than 200 mbar, particularly preferably less than 100 mbar, in particular less than 10 mbar, preferably in the at least one optical transport fiber prevails and/or the at least one optical transport fiber is filled with a gas with a particularly low non-linearity, in particular with He, or a gas mixture comprising He. The pressure in the at least one transport optical fiber is then typically lower than in the gas-filled hollow-core optical fiber. Weak non-linear optical effects are understood to mean in particular those which lead to an increase in the pulse duration of less than 50 fs or a B integral of less than 0.1 rad.

In einer weiteren Ausführungsform ist die gasgefüllte optische Hohlkernfaser eine gasgefüllte Kagome-Faser, eine gasgefüllte Revolver-Hohlkernfaser oder eine gasgefüllte Nested-Tube-Faser.In another embodiment, the gas-filled hollow-core optical fiber is a Kagome gas-filled fiber, a revolver hollow-core gas-filled fiber, or a nested-tube gas-filled fiber.

In einer weiteren Ausführungsform ist die gasgefüllte optische Hohlkernfaser ausgebildet, die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls spektral zu einem Superkontinuum zu erweitern.In a further embodiment, the gas-filled hollow-core optical fiber is designed to spectrally expand the laser pulses of the pulsed laser beam to form a supercontinuum.

In einer weiteren Ausführungsform ist die gasgefüllte optische Hohlkernfaser ausgebildet, die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls spektral zu einem Raman-Kamm zu erweitern. Der Raman-Kamm entsteht in Folge von stimulierter Raman-Streuung in der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser. Der Raman-Kamm umfasst dabei Spektrallinien zu beiden Seiten der Wellenlänge des gepulsten Laserstrahls, sogenannte Stokes-Linien bzw. Anti-Stokes-Linien. Typischerweise handelt es sich um eine Vielzahl von Spektrallinien, die dicht beieinanderliegen. Die Anregungs- und Abregungswellenlänge können individuell auf den jeweiligen Fluoreszenzmarker eingestellt werden. Aufgrund der spektralen Breite des Kamms können viele unterschiedliche Fluoreszenzmarker eingesetzt werden, ohne den Laser oder das STED-Mikroskop verändern zu müssen. Ob ein Raman-Kamm oder ein kontinuierliches, verbreitertes Spektrum entsteht, ist dabei abhängig vom Gasdruck und den Eigenschaften des gepulsten Laserstrahls. Mittels einer Variation der Pulsdauer der Laserpulse des gepulsten Laserstrahls ist beispielsweise auch ein flexibles, kontinuierliches Umschalten zwischen einem Superkontinuum und einem Raman-Kamm möglich.In a further embodiment, the gas-filled hollow-core optical fiber is designed to spectrally expand the laser pulses of the pulsed laser beam to form a Raman comb. The Raman ridge arises as a result of stimulated Raman scattering in the gas-filled hollow-core optical fiber. The Raman comb includes spectral lines on both sides of the wavelength of the pulsed laser beam, so-called Stokes lines or anti-Stokes lines. Typically, there are a large number of spectral lines that are close together. The excitation and de-excitation wavelengths can be adjusted individually to the respective fluorescence marker. Due to the spectral width of the comb, many different fluorescent markers can be used without having to modify the laser or the STED microscope. Whether a Raman comb or a continuous, broadened spectrum is created depends on the gas pressure and the properties of the pulsed laser beam. A flexible, continuous switching between a supercontinuum and a Raman comb is also possible, for example, by varying the pulse duration of the laser pulses of the pulsed laser beam.

Ein Vorteil eines Raman-Kamms im Vergleich zu einem kontinuierlichen, verbreiterten Spektrum liegt darin, dass im ersteren Fall ein wesentlicher Teil der Leistung auf die Spektrallinien entfällt. Damit ist bei gleicher Leistung des Ultrakurzpulslasers die spektrale Leistungsdichte der Spektrallinien des Raman-Kamms wesentlich höher als die spektrale Leistungsdichte eines kontinuierlich verbreiterten Spektrums. Für die Anregung bzw. Abregung stehen bezogen auf die relevanten schmalen Wellenlängenbereiche damit höhere Intensitäten zur Verfügung.An advantage of a Raman comb compared to a continuous, broadened spectrum is that in the former case, a significant part of the power goes to the spectral lines. With the same power of the ultrashort pulse laser, the spectral power density of the spectral lines of the Raman comb is significantly higher than the spectral power density of a continuously broadened spectrum. Relative to the relevant narrow wavelength ranges, higher intensities are therefore available for excitation and de-excitation.

In einer weiteren Ausführungsform ist die gasgefüllte optische Hohlkernfaser mit einem Gas aus einer ersten Gruppe, umfassend: Ne, Ar, Kr, Xe, oder einem Gas aus einer zweiten Gruppe, umfassend: H₂, N₂, N₂O, C₂H₂F₄, C₂H₄F₂, oder mit einer Gasmischung, umfassend zwei oder mehrere der Gase aus der ersten und/oder der zweiten Gruppe, gefüllt.In another embodiment, the gas-filled hollow-core optical fiber is filled with a gas from a first group comprising: Ne, Ar, Kr, Xe, or a gas from a second group comprising: H ₂ , N ₂ , N ₂ O, C ₂ H ₂ F ₄ , C ₂ H ₄ F ₂ , or with a gas mixture comprising two or more of the gases from the first and/or the second group.

In einer weiteren Ausführungsform weist der wellenlängenselektive Schalter mindestens ein dispersives optisches Element und eine Einrichtung zur ortsabhängigen Phasen- und/oder Amplitudenmodulation auf. In diesem Fall wird eine Modulation der spektralen Phase und/oder der spektralen Amplitude darüber erzielt, dass die verschiedenen Wellenlängenkomponenten des aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls zunächst mittels des dispersiven optischen Elements oder eines der dispersiven optischen Elemente räumlich aufgetrennt und anschließend mittels der Einrichtung zur ortsabhängigen Phasen- und/oder Amplitudenmodulation in Phase und/oder Amplitude gezielt beeinflusst werden. Die so beeinflussten Wellenlängenkomponenten können anschließend mittels desselben dispersiven optischen Elements oder eines anderen der dispersiven optischen Elemente wieder zusammengeführt werden, worauf sie in die mindestens eine optische Transportfaser eingekoppelt werden. Die Wellenlängenkomponenten des gepulsten Anregungslaserstrahls und des gepulsten Abregungslaserstrahls können dabei am selben Ort oder räumlich voneinander getrennt zusammengeführt werden. Im letzteren Fall ist die Einkopplung des gepulsten Anregungslaserstrahls und des gepulsten Abregungslaserstrahls in jeweils eine eigene optische Transportfaser möglich.In a further embodiment, the wavelength-selective switch has at least one dispersive optical element and a device for location-dependent phase and/or amplitude modulation. In this case, a modulation of the spectral phase and/or the spectral amplitude is achieved in that the different wavelength components of the pulsed laser beam coupled out of the gas-filled hollow-core optical fiber are first spatially separated by means of the dispersive optical element or one of the dispersive optical elements and then by means of the Device for location-dependent phase and / or amplitude modulation in phase and / or amplitude are influenced. The wavelength components influenced in this way can then be recombined using the same dispersive optical element or another of the dispersive optical elements, whereupon they are coupled into the at least one optical transport fiber. The wavelength components of the pulsed excitation laserst rahl and the pulsed depletion laser beam can be brought together at the same location or at different locations. In the latter case, the pulsed excitation laser beam and the pulsed depletion laser beam can each be coupled into their own optical transport fiber.

Das mindestens eine dispersive optische Element ist beispielsweise mindestens ein Prisma. Die Aufteilung beziehungsweise Zusammenführung der verschiedenen Wellenlängenkomponenten ergibt sich in diesem Fall aus der Wellenlängenabhängigkeit der Brechungswinkel, welche eine Konsequenz der Wellenlängenabhängigkeit des Brechungsindexes des Prismas ist.The at least one dispersive optical element is at least one prism, for example. In this case, the division or combination of the different wavelength components results from the wavelength dependency of the refraction angles, which is a consequence of the wavelength dependency of the refractive index of the prism.

Alternativ kann es sich bei dem mindestens einen dispersiven optischen Element auch um mindestens ein Beugungsgitter handeln. Die Aufteilung beziehungsweise Zusammenführung der verschiedenen Wellenlängenkomponenten ergibt sich in diesem Fall aus der Wellenlängenabhängigkeit der zur Beugung führenden Interferenzeffekte. Es können auch Beugungsgitter, bei welchen das Licht nahezu vollständig in eine bestimmte Beugungsordnung gebeugt wird, beispielsweise Blazegitter, eingesetzt werden.Alternatively, the at least one dispersive optical element can also be at least one diffraction grating. In this case, the division or combination of the different wavelength components results from the wavelength dependency of the interference effects leading to diffraction. It is also possible to use diffraction gratings in which the light is almost completely diffracted into a specific diffraction order, for example blaze gratings.

Die Einrichtung zur ortsabhängigen Phasen- und/oder Amplitudenmodulation basiert beispielsweise auf einem räumlichen Lichtmodulator, gemeinhin als SLM bezeichnet. Räumliche Lichtmodulatoren weisen häufig eine dünne Flüssigkristallschicht auf. Die ortsabhängige Phasen- und/oder Amplitudenmodulation wird in diesem Fall über die einstellbare Ausrichtung der Flüssigkristalle in einem Pixelarray erzielt.The device for location-dependent phase and/or amplitude modulation is based, for example, on a spatial light modulator, commonly referred to as an SLM. Spatial light modulators often have a thin liquid crystal layer. In this case, the location-dependent phase and/or amplitude modulation is achieved via the adjustable alignment of the liquid crystals in a pixel array.

Vorzugsweise weist die Einrichtung zur ortsabhängigen Phasen- und/oder Amplitudenmodulation ein Liquid-Crystal-on-Silicon Element auf. Liquid-Crystal-on-Silicon Elemente sind spezielle räumliche Lichtmodulatoren, die für die Benutzung in Reflexion gebaut sind. Diese Bauweise hat gegenüber anderen räumlichen Lichtmodulatoren den Vorteil, dass die Platzierung von Leiterbahnen im Strahlengang vermieden werden kann. Bei Liquid-Crystal-on-Silicon Elementen ist eine dünne Flüssigkristallschicht auf ein Siliziumsubstrat aufgebracht. Die Flüssigkristallschicht dient zur Modulation des reflektierten Lichts, während auf dem Siliziumsubstrat in CMOS-Technologie eine Ansteuerungselektronik realisiert ist. In einem Pixel-Array kann nun ein elektrisches Feld in der Flüssigkristallschicht eingestellt werden. Damit kann die Ausrichtung der Flüssigkristalle in der Flüssigkristallschicht und damit die Phasendifferenz des reflektierten Lichts für jedes Pixel unabhängig kontrolliert werden.The device for location-dependent phase and/or amplitude modulation preferably has a liquid-crystal-on-silicon element. Liquid-Crystal-on-Silicon elements are special spatial light modulators built for use in reflection. This design has the advantage over other spatial light modulators that the placement of conductor tracks in the beam path can be avoided. With liquid-crystal-on-silicon elements, a thin liquid crystal layer is applied to a silicon substrate. The liquid crystal layer is used to modulate the reflected light, while control electronics are implemented on the silicon substrate using CMOS technology. An electric field can now be set in the liquid crystal layer in a pixel array. With this, the alignment of the liquid crystals in the liquid crystal layer and thus the phase difference of the reflected light can be controlled independently for each pixel.

Bevorzugt erlaubt der wellenlängenselektive Schalter die gleichzeitige und unabhängige Modulation von sowohl der spektralen Phase und als auch der spektralen Amplitude. Eine solche wird beispielsweise durch die Verwendung eines Liquid-Crystal-on-Silicon Elements mit einem zweidimensionalen Pixelarray in Kombination mit einer Einkopplung des vom Liquid-Crystal-on-Silicon Element reflektierten Lichts in mindestens eine optische Faser, beispielsweise die mindestens eine optische Transportfaser, erreicht. Eine Achse des zweidimensionalen Pixelarrays ist entlang der räumlichen Aufspaltungsrichtung der verschiedenen Wellenlängenkomponenten ausgerichtet. Die spektrale Phase ist über die Einstellung einer Phasendifferenz entlang dieser Achse modulierbar. Zusätzlich kann jetzt über das Liquid-Crystal-on-Silicon Element wellenlängenabhängig die Einkoppeleffizienz in die mindestens eine optische Transportfaser eingestellt werden, beispielsweise indem dieses als Beugungsgitter fungiert, womit die spektrale Amplitude modulierbar ist.Preferably, the wavelength selective switch allows simultaneous and independent modulation of both spectral phase and spectral amplitude. Such is achieved, for example, by using a liquid-crystal-on-silicon element with a two-dimensional pixel array in combination with coupling the light reflected from the liquid-crystal-on-silicon element into at least one optical fiber, for example the at least one optical transport fiber, reached. An axis of the two-dimensional pixel array is aligned along the spatial splitting direction of the different wavelength components. The spectral phase can be modulated by setting a phase difference along this axis. In addition, the coupling efficiency into the at least one optical transport fiber can now be adjusted as a function of the wavelength via the liquid-crystal-on-silicon element, for example by this acting as a diffraction grating, with which the spectral amplitude can be modulated.

Der wellenlängenselektive Schalter kann allerdings auch ohne dispersives optisches Element realisiert werden. Ein entsprechender wellenlängenselektiver Schalter kann beispielsweise auf einem programmierbaren akusto-optischen Filter (AOPDF) basieren, mittels dem die Manipulation sowohl der spektralen Phase als auch der spektralen Amplitude möglich ist. Hierbei erfolgt die Beugung an einer akusto-optischen Welle mit unterschiedlichen Effizienzen und an unterschiedlichen Orten entlang der Propagationsrichtung (von Laserpuls und akustischer Welle).However, the wavelength-selective switch can also be implemented without a dispersive optical element. A corresponding wavelength-selective switch can be based, for example, on a programmable acousto-optical filter (AOPDF), by means of which the manipulation of both the spectral phase and the spectral amplitude is possible. Here, the diffraction of an acousto-optical wave takes place with different efficiencies and at different locations along the propagation direction (of laser pulse and acoustic wave).

Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der Zeichnung. Ebenso können die vorstehend genannten und die noch weiter ausgeführten Merkmale erfindungsgemäß jeweils einzeln für sich oder zu mehreren in beliebigen Kombinationen Verwendung finden. Die gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen sind nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern haben vielmehr beispielhaften Charakter für die Schilderung der Erfindung.Further advantages of the invention result from the description and the drawing. Likewise, the features mentioned above and those detailed below can be used according to the invention individually or collectively in any combination. The embodiments shown and described are not to be understood as an exhaustive list, but rather have an exemplary character for the description of the invention.

Die Erfindung ist in den Zeichnungen dargestellt und wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen STED-Mikroskops mit genau einer optischen Transportfaser,
2 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen STED-Mikroskops mit zwei optischen Transportfasern,
3 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen STED-Mikroskops mit genau einer optischen Transportfaser, wobei ein gepulster Anregungslaserstrahl in einer zentralen Mode und ein gepulster Abregungslaserstrahl in mindestens einer höheren Mode der optischen Transportfaser propagiert, sowie
4 eine schematische Detailansicht eines wellenlängenselektiven Schalters des in der 1 gezeigten STED-Mikroskops.

The invention is illustrated in the drawings and is explained in more detail using exemplary embodiments. Show it:

1 a schematic representation of an embodiment of a STED microscope according to the invention with exactly one optical transport fiber,
2 a schematic representation of an embodiment of a STED microscope according to the invention with two optical transport fibers,
3 a schematic representation of an embodiment of an inventive ßen STED microscope with exactly one optical transport fiber, with a pulsed excitation laser beam propagating in a central mode and a pulsed depletion laser beam in at least one higher mode of the optical transport fiber, and
4 a schematic detailed view of a wavelength-selective switch in the 1 shown STED microscope.

In der folgenden Beschreibung der Zeichnungen werden für gleiche bzw. funktionsgleiche Bauteile identische Bezugszeichen verwendet.In the following description of the drawings, identical reference symbols are used for identical or functionally identical components.

Die 1 bis 3 zeigen jeweils ein Beispiel eines STED-Mikroskops 1 mit einem Ultrakurzpulslaser 2 zur Erzeugung eines gepulsten Laserstrahls 3, einer gasgefüllten optischen Hohlkernfaser 4, in die der gepulste Laserstrahl 3 einenends eingekoppelt wird und die derart ausgebildet ist, dass die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls 3 bei der Propagation durch die gasgefüllte optische Hohlkernfaser 4 über nichtlineare optische Effekte spektral erweitert werden, einem wellenlängenselektiven Schalter 5 zur Erzeugung eines gepulsten Anregungslaserstrahls 6 und eines gepulsten Abregungslaserstrahls 7 aus dem anderenends aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser 4 ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls 8 und mindestens einer optischen Transportfaser 9,9',10 zum Transport des gepulsten Anregungslaserstrahls 6 und des gepulsten Abregungslaserstrahls 7.The 1 until 3 each show an example of a STED microscope 1 with an ultrashort pulse laser 2 for generating a pulsed laser beam 3, a gas-filled optical hollow-core fiber 4 into which the pulsed laser beam 3 is coupled at one end and which is designed in such a way that the laser pulses of the pulsed laser beam 3 propagation through the gas-filled hollow-core optical fiber 4 via non-linear optical effects, a wavelength-selective switch 5 for generating a pulsed excitation laser beam 6 and a pulsed depletion laser beam 7 from the other end of the gas-filled hollow-core optical fiber 4 coupled pulsed laser beam 8 and at least one optical transport fiber 9 ,9',10 for transporting the pulsed excitation laser beam 6 and the pulsed depletion laser beam 7.

Bei dem in der 1 gezeigten STED-Mikroskop 1 handelt es sich bei der mindestens einen optischen Transportfaser 9 um genau eine optische Transportfaser. Ferner umfasst das in 1 gezeigte STED-Mikroskop 1 zusätzlich eine Phasenmodulationseinrichtung 11 in Form einer Phasenmaske und einen dichroitischen Spiegel 12. Abweichend davon kann die Phasenmodulationseinrichtung 11 auch anders ausgebildet sein. Beispielsweise kann es sich bei der Phasenmodulationseinrichtung 11 um einen räumlichen Lichtmodulator handeln. Die optische Transportfaser 9 ist hier beispielhaft eine Kagome-Faser, es kann sich dabei aber auch um eine andere optische Hohlkernfaser oder eine andere optische Faser handeln. In der optischen Transportfaser 9 herrscht hier ein Druck von weniger als 10 mbar vor, es kann in der optischen Transportfaser 9 aber auch ein höherer Druck, beispielweise ein Druck von weniger als 200 mbar oder weniger als 100 mbar, oder ein Vakuum vorherrschen. Auch kann die optische Transportfaser 9 mit einem Gas mit einer besonders niedrigen Nichtlinearität, insbesondere mit He oder einer Gasmischung umfassend He, gefüllt sein.At the in the 1 STED microscope 1 shown, the at least one optical transport fiber 9 is exactly one optical transport fiber. Furthermore, the in 1 The STED microscope 1 shown additionally has a phase modulation device 11 in the form of a phase mask and a dichroic mirror 12. Deviating from this, the phase modulation device 11 can also be designed differently. For example, the phase modulation device 11 can be a spatial light modulator. The optical transport fiber 9 is a Kagome fiber here, for example, but it can also be another hollow-core optical fiber or another optical fiber. A pressure of less than 10 mbar prevails in the optical transport fiber 9, but a higher pressure, for example a pressure of less than 200 mbar or less than 100 mbar, or a vacuum can also prevail in the optical transport fiber 9. The optical transport fiber 9 can also be filled with a gas with a particularly low non-linearity, in particular with He or a gas mixture comprising He.

Der aus der optischen Transportfaser 9 ausgekoppelte, gepulste Abregungslaserstrahl 7' wird mittels des dichroitischen Spiegels 12 von dem aus der optischen Transportfaser 9 ausgekoppelten, gepulsten Anregungslaserstrahl 6' getrennt. Im dargestellten Beispiel, aber nicht notwendigerweise, wird der ausgekoppelte, gepulste Abregungslaserstrahl 7` reflektiert, während der ausgekoppelte, gepulste Anregungslaserstrahl 6` transmittiert wird. Über einen Spiegel 13 trifft der ausgekoppelte, gepulste Abregungslaserlaserstrahl 7' anschließend auf die Phasenmodulationseinrichtung 11 und tritt durch diese hindurch. Dies führt zu einer Modulation seiner Phase dergestalt, dass eine Fokussierung des phasenmodulierten, gepulsten Abregungslaserstrahls 7" in einem Abregungsfokus resultiert. Anschließend wird der phasenmodulierte, gepulste Abregungslaserstrahl 7" mit dem ausgekoppelten, gepulsten Anregungslaserstrahl 6', der im dargestellten Beispiel zuvor noch von einem weiteren Spiegel 14 abgelenkt wird, über einen weiteren dichroitischen Spiegel 15 überlagert.The pulsed deactivation laser beam 7' coupled out of the optical transport fiber 9 is separated by means of the dichroic mirror 12 from the pulsed excitation laser beam 6' decoupled from the optical transport fiber 9. In the example shown, but not necessarily, the decoupled, pulsed depletion laser beam 7' is reflected, while the decoupled, pulsed excitation laser beam 6' is transmitted. The decoupled, pulsed depletion laser beam 7′ then strikes the phase modulation device 11 via a mirror 13 and passes through it. This leads to a modulation of its phase in such a way that the phase-modulated, pulsed depletion laser beam 7" is focused in a depletion focus another mirror 14 is deflected, superimposed on another dichroic mirror 15.

Bei dem in der 2 gezeigten STED-Mikroskop 1 handelt es sich bei der mindestens einen optischen Transportfaser 9,10 um zwei optische Transportfasern. Der wellenlängenselektive Schalter 5 ist hier ausgebildet, den gepulsten Anregungslaserstrahl 6 in die erste optische Transportfaser 9 und den gepulsten Abregungslaserstrahl 7 in die zweite optische Transportfaser 10 einzukoppeln. Der in der 1 dargestellte dichroitische Spiegel 12 zur Trennung des ausgekoppelten Anregungslaserstrahls 6' und ausgekoppelten Abregungslaserstrahls 7' entfällt hier.At the in the 2 STED microscope 1 shown, the at least one optical transport fiber 9,10 is two optical transport fibers. The wavelength-selective switch 5 is designed here to couple the pulsed excitation laser beam 6 into the first optical transport fiber 9 and the pulsed depletion laser beam 7 into the second optical transport fiber 10 . The Indian 1 The dichroic mirror 12 shown for separating the decoupled excitation laser beam 6' and the decoupled deactivation laser beam 7' is omitted here.

Der aus der zweiten optischen Transportfaser 10 ausgekoppelte Abregungslaserstrahl 7` trifft auf die Phasenmodulationseinrichtung 11 und tritt durch diese hindurch, wobei die Phase so moduliert wird, dass eine Fokussierung des phasenmodulierten, gepulsten Abregungslaserstrahls 7" in einem Abregungsfokus resultiert. Der phasenmodulierte, gepulste Abregungslaserstrahl 7" wird von einem Spiegel 16 abgelenkt und anschließend mittels eines dichroitischen Spiegels 15 mit dem aus der ersten optischen Transportfaser 9 ausgekoppelten, gepulsten Anregungslaserstrahl 6` überlagert.The depletion laser beam 7` coupled out of the second optical transport fiber 10 strikes the phase modulation device 11 and passes through it, the phase being modulated in such a way that the phase-modulated, pulsed depletion laser beam 7" is focused in a depletion focus. The phase-modulated, pulsed depletion laser beam 7 " is deflected by a mirror 16 and then superimposed by means of a dichroic mirror 15 with the pulsed excitation laser beam 6` coupled out of the first optical transport fiber 9.

Bei den in 1 und 2 dargestellten STED-Mikroskopen 1 werden der ausgekoppelte Anregungslaserstrahl 6' und der damit überlagerte phasenmodulierte, gepulste Abregungslaserstrahl 7" mittels eines Objektivs 17 in eine abzubildende Probe 18 fokussiert.At the in 1 and 2 In the STED microscopes 1 shown, the decoupled excitation laser beam 6′ and the phase-modulated, pulsed depletion laser beam 7″ superimposed thereon are focused by means of an objective 17 into a sample 18 to be imaged.

Bei dem in der 3 gezeigten STED-Mikroskop 1 handelt es sich bei der mindestens einen optischen Transportfaser 9' um genau eine optische Transportfaser, die eine zentrale Mode für die Propagation des gepulsten Anregungslaserstrahls 6 und mindestens eine höhere Mode für die Propagation des gepulsten Abregungslaserstrahls 7 aufweist. Der wellenlängenselektive Schalter 5 ist hier dazu ausgebildet, den gepulsten Anregungslaserstrahl 6 in die zentrale Mode und den gepulsten Abregungslaserstrahl 7 in die mindestens eine höhere Mode einzukoppeln. Die räumliche Intensitätsverteilung der mindestens einen höheren Mode weist bevorzugt eine Ringform mit einer zentralen Nullstelle auf. Der aus der optischen Transportfaser 9' ausgekoppelte Anregungslaserstrahl 6' und der aus der optischen Transportfaser 9' ausgekoppelte Abregungslaserstrahl 7` werden mittels eines Objektivs 17 in eine abzubildende Probe 18 fokussiert.At the in the 3 In the STED microscope 1 shown, the at least one optical transport fiber 9' is exactly one optical transport fiber which has a central mode for the propagation of the pulsed excitation laser beam 6 and at least one higher mode for the propagation of the pulsed depletion laser beam 7 has. The wavelength-selective switch 5 is designed here to couple the pulsed excitation laser beam 6 into the central mode and the pulsed depletion laser beam 7 into the at least one higher mode. The spatial intensity distribution of the at least one higher mode preferably has a ring shape with a central zero point. The excitation laser beam 6' coupled out of the optical transport fiber 9' and the depletion laser beam 7' coupled out of the optical transport fiber 9' are focused into a sample 18 to be imaged by means of a lens 17.

Bei den in den 1 bis 3 gezeigten STED-Mikroskopen 1 ist die gasgefüllte optische Hohlkernfaser 4 beispielhaft eine gasgefüllte Kagome-Faser. Abweichend davon kann es dabei aber auch um eine andere gasgefüllte optische Hohlkernfaser handeln. Ferner ist die gasgefüllte optische Hohlkernfaser 4 hier beispielhaft ausgebildet, die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls 3 spektral zu einem Raman-Kamm zu erweitern. Die Propagation der Laserpulse des gepulsten Laserstrahls 3 in der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser 4 kann aber auch zu einer andersartigen spektralen Erweiterung führen. Beispielsweise kann die gasgefüllte optische Hohlkernfaser 4 auch ausgebildet sein, die Laserpulse des gepulsten Laserstrahls 3 zu einem Superkontinuum zu erweitern.At the in the 1 until 3 In the STED microscopes 1 shown, the gas-filled hollow-core optical fiber 4 is, for example, a gas-filled Kagome fiber. Deviating from this, however, it can also be another gas-filled hollow-core optical fiber. Furthermore, the gas-filled hollow-core optical fiber 4 is designed here, for example, to spectrally expand the laser pulses of the pulsed laser beam 3 to form a Raman comb. However, the propagation of the laser pulses of the pulsed laser beam 3 in the gas-filled optical hollow-core fiber 4 can also lead to a different type of spectral expansion. For example, the gas-filled hollow-core optical fiber 4 can also be designed to expand the laser pulses of the pulsed laser beam 3 into a supercontinuum.

Die gasgefüllte optische Hohlkernfaser 4 ist hier ferner beispielhaft mit Helium gefüllt. Abweichend davon kann die gasgefüllte optische Hohlkernfaser 4 auch mit einem anderen Gas aus einer ersten Gruppe, umfassend Ne, Ar, Kr, Xe, oder einem Gas aus einer zweiten Gruppe, umfassend H₂, N₂, N₂O, C₂H₄, C₂H₂F₄, C₂H₄F₂, oder mit einer Gasmischung, umfassend zwei oder mehrere Gase aus der ersten und/oder der zweiten Gruppe, gefüllt sein.The gas-filled hollow-core optical fiber 4 is also filled with helium here, for example. Deviating from this, the gas-filled hollow-core optical fiber 4 can also be filled with another gas from a first group, comprising Ne, Ar, Kr, Xe, or a gas from a second group, comprising H ₂ , N ₂ , N ₂ O, C ₂ H ₄ , C ₂ H ₂ F ₄ , C ₂ H ₄ F ₂ , or with a gas mixture comprising two or more gases from the first and/or the second group.

Das Objektiv 17 dient außerdem zum Sammeln von Fluoreszenzlicht 19, das von der Probe 18 emittiert wird. Zur Trennung des gesammelten Fluoreszenzlichts 19 vom restlichen Strahlengang umfassen die STED-Mikroskope 1 hier beispielhaft einen weiteren dichroitischen Spiegel 20. Das gesammelte Fluoreszenzlicht 19 wird anschließend mittels einer Detektionseinrichtung 21 detektiert. Die Detektionseinrichtung 21 umfasst beispielhaft eine hier nicht dargestellte Avalanche-Photodiode. Abweichend davon kann die Detektionseinrichtung 21 auch anders ausgebildet sein, beispielsweise ein Spektrometer oder einen Monochromator umfassen.The objective 17 is also used to collect fluorescent light 19 emitted by the sample 18 . To separate the collected fluorescent light 19 from the rest of the beam path, the STED microscopes 1 include a further dichroic mirror 20 here, for example. The collected fluorescent light 19 is then detected by means of a detection device 21 . The detection device 21 comprises an avalanche photodiode, not shown here, by way of example. Deviating from this, the detection device 21 can also be designed differently, for example it can comprise a spectrometer or a monochromator.

Zur Abbildung der Probe 18 wird diese typischerweise abgerastert. Das STED-Mikroskop 1 kann hierzu eine hier nicht dargestellte entsprechende Einrichtung, beispielsweise einen Scannerkopf auf Basis von Galvanometer-Spiegeln oder akustoopischen Deflektoren, umfassen. Alternativ oder zusätzlich kann die Probe 18 auch beispielsweise mittels Piezoaktuatoren verfahren werden.To image the sample 18, it is typically scanned. For this purpose, the STED microscope 1 can comprise a corresponding device, not shown here, for example a scanner head based on galvanometer mirrors or acousto-optical deflectors. Alternatively or additionally, the sample 18 can also be moved by means of piezo actuators, for example.

Die 4 zeigt eine schematische Detaildarstellung des wellenlängenselektiven Schalters 5 des in der 1 dargestellten STED-Mikroskops 1. Der wellenlängenselektive Schalter 5 weist ein dispersives optisches Element 22 in Form eines Beugungsgitters, einen zylindrischen Spiegel 23 und eine Einrichtung 24 zur ortsabhängigen Phasen- und Amplitudenmodulation mit einem Liquid-Crystal-on-Silicon Element 25 auf.The 4 shows a schematic detailed representation of the wavelength-selective switch 5 in the 1 STED microscope 1 shown. The wavelength-selective switch 5 has a dispersive optical element 22 in the form of a diffraction grating, a cylindrical mirror 23 and a device 24 for location-dependent phase and amplitude modulation with a liquid-crystal-on-silicon element 25 .

Der aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser 4 ausgekoppelte, gepulste Laserstrahl 8 trifft über den zylindrischen Spiegel 23 auf das Beugungsgitter 22 und wird in seine Wellenlängenkomponenten 8', 8" aufgespaltet. Die Zylinderachse des zylindrischen Spiegels 23 steht senkrecht zur Aufspaltungsrichtung der unterschiedlichen Wellenlängenkomponenten 8', 8". Die unterschiedlichen Wellenlängenkomponenten 8', 8" treffen über den zylindrischen Spiegel 23 auf das Liquid-Crystal-on-Silicon Element 25 und werden daran reflektiert. Das Liquid-Crystal-on-Silicon-Element 25 weist ein zweidimensionales Pixelarray auf, wobei die Phasendifferenz, die den unterschiedlichen Wellenlängenkomponenten 8', 8" aufgeprägt wird, für jedes Pixel einzeln einstellbar ist.The pulsed laser beam 8 decoupled from the gas-filled optical hollow-core fiber 4 strikes the diffraction grating 22 via the cylindrical mirror 23 and is split into its wavelength components 8', 8". The cylinder axis of the cylindrical mirror 23 is perpendicular to the splitting direction of the different wavelength components 8', 8th". The different wavelength components 8′, 8″ strike the liquid-crystal-on-silicon element 25 via the cylindrical mirror 23 and are reflected thereon. The liquid-crystal-on-silicon element 25 has a two-dimensional pixel array, the phase difference , which is impressed on the different wavelength components 8', 8", can be set individually for each pixel.

Die so modulierten Wellenlängenkomponenten 26', 26" treffen nun über den zylindrischen Spiegel 23 erneut auf das dispersive optische Element 22 und werden als gepulster Anregungslaserstrahl 6 und gepulster Abregungslaserstrahl 7 zusammengeführt. Der gepulste Anregungslaserstrahl 6 und der gepulste Abregungslaserstrahl 7 werden anschließend über den zylindrischen Spiegel 23 in die optische Transportfaser 9 eingekoppelt.The wavelength components 26', 26" modulated in this way now strike the dispersive optical element 22 again via the cylindrical mirror 23 and are combined as a pulsed excitation laser beam 6 and a pulsed deactivation laser beam 7. The pulsed excitation laser beam 6 and the pulsed deactivation laser beam 7 are then transmitted via the cylindrical mirror 23 coupled into the optical transport fiber 9.

Im dargestellten Beispiel ist eine Achse des zweidimensionalen Pixelarrays des Liquid-Crystal-on-Silicon Elements 25 entlang der räumlichen Aufspaltungsrichtung der unterschiedlichen Wellenlängenkomponenten 8', 8" ausgerichtet. Über die Einstellung der Phasendifferenz entlang dieser Achse ist die spektrale Phase des aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser 4 ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls 8 modulierbar. Zusätzlich ist über die mit dem Liquid-Crystal-on-Silicon Element 25 aufgeprägte, für jedes Pixel einzeln einstellbare Phasendifferenz wellenlängenabhängig die Einkoppeleffizienz in die optische Transportfaser 9 einstellbar. In the example shown, an axis of the two-dimensional pixel array of the liquid-crystal-on-silicon element 25 is aligned along the spatial splitting direction of the different wavelength components 8', 8". Adjusting the phase difference along this axis is the spectral phase of the gas-filled optical Hollow core fiber 4 decoupled, pulsed laser beam 8. In addition, the coupling efficiency into the optical transport fiber 9 can be adjusted as a function of wavelength via the phase difference impressed with the liquid-crystal-on-silicon element 25 and individually adjustable for each pixel.

Damit ist auch die spektrale Amplitude des aus der gasgefüllten optischen Hohlkernfaser 4 ausgekoppelten, gepulsten Laserstrahls 8 modulierbar. Im Ergebnis ist hier beispielhaft mittels des wellenlängenselektiven Schalters 5 mindestens eine Pulseigenschaft, insbesondere eine Pulsdauer der Laserpulse des gepulsten Anregungslaserstrahls 6 und/oder der Laserpulse des gepulsten Abregungslaserstrahls 7 einstellbar.In this way, the spectral amplitude of the pulsed laser beam 8 coupled out of the gas-filled optical hollow-core fiber 4 can also be modulated. As a result, at least one pul property, in particular a pulse duration of the laser pulses of the pulsed excitation laser beam 6 and/or the laser pulses of the pulsed depletion laser beam 7 can be adjusted.

Abweichend vom hier dargestellten Fall muss das dispersive optische Element 22 kein Beugungsgitter sein. Beispielsweise kann es sich dabei auch um ein Prisma handeln. Auch kann der wellenlängenselektive Schalter 5 keine, zwei oder auch mehr als zwei dispersive optische Elemente und/oder keinen zylindrischen Spiegel umfassen. Die Einrichtung 24 zur ortsabhängigen Phasen- und/oder Amplitudenmodulation muss ferner kein Liquid-Crystal-on-Silicon-Element aufweisen. Beispielsweise kann diese auch ein Array von verstellbaren Spiegel in Form eines mikroelektromechanischen Systems (MEMS) umfassen.Deviating from the case presented here, the dispersive optical element 22 does not have to be a diffraction grating. For example, it can also be a prism. The wavelength-selective switch 5 can also have no, two or even more than two dispersive optical elements and/or no cylindrical mirror. Furthermore, the device 24 for location-dependent phase and/or amplitude modulation does not have to have a liquid-crystal-on-silicon element. For example, this can also include an array of adjustable mirrors in the form of a microelectromechanical system (MEMS).

Um wie in der 2 gezeigt, den gepulsten Anregungslaserstrahl 6 in die erste optische Transportfaser 9 und den gepulsten Abregungslaserstrahl 7 in die zweite optische Transportfaser 10 einzukoppeln, kann der in der 4 dargestellte wellenlängenselektive Schalter 5 entsprechend modifiziert werden. Hierzu können die Endfacetten der ersten optischen Transportfaser 9 und der zweiten optischen Transportfaser 10 räumlich eng benachbart angeordnet werden. Über das zweidimensionale Pixelarray des Liquid-Crystal-on-Silicon Elements 25 können dann wellenlängenabhängig die Einkoppeleffizienzen in die erste optische Transportfaser 9 und die zweite optische Transportfaser 10 über eine wellenlängenabhängige Variation von Ort und Winkel eingestellt werden, analog zur weiter oben beschriebenen Einstellung der Einkoppeleffizienz in die eine optische Transportfaser 9.To like in the 2 shown to couple the pulsed excitation laser beam 6 in the first optical transport fiber 9 and the pulsed depletion laser beam 7 in the second optical transport fiber 10, the in the 4 wavelength-selective switch 5 shown can be modified accordingly. For this purpose, the end facets of the first optical transport fiber 9 and the second optical transport fiber 10 can be arranged spatially close together. Using the two-dimensional pixel array of the liquid-crystal-on-silicon element 25, the in-coupling efficiencies in the first optical transport fiber 9 and the second optical transport fiber 10 can then be adjusted as a function of wavelength via a wavelength-dependent variation of location and angle, analogously to the adjustment of the in-coupling efficiency described above into the one optical transport fiber 9.

Um entsprechend dem in der 3 gezeigten Fall den gepulsten Anregungslaserstrahl 6 in die zentrale Mode und den gepulsten Abregungslaserstrahl 7 in die mindestens eine höhere Mode einer geeigneten optischen Transportfaser 9' einzukoppeln, kann analog vorgegangen werden. Bereits kleine Variationen von Ort und Winkel sind hier ausreichend um eine Einkopplung in eine höhere Mode anstatt in die zentrale Mode oder umgekehrt zu erzielen.To correspond to that in the 3 In the case shown, the pulsed excitation laser beam 6 can be coupled into the central mode and the pulsed depletion laser beam 7 into the at least one higher mode of a suitable optical transport fiber 9′. Even small variations in location and angle are sufficient here to achieve coupling into a higher mode instead of into the central mode or vice versa.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDED IN DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of documents cited by the applicant was generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturPatent Literature Cited

DE 112015001640 T5 [0004]
WO 2019/169368 [0005]
WO 2017/210679 [0006]
DE 102007048135 B4 [0007]
WO 2014/029978 [0009]
WO 2013/167479 [0010]

Claims

STED microscope (1) comprising - an ultra-short pulse laser (2) for generating a pulsed laser beam (3), - a gas-filled hollow-core optical fiber (4) into which the pulsed laser beam (3) is coupled at one end and which is designed in such a way that the laser pulses of the pulsed laser beam (3) produce non-linear optical effects during propagation through the gas-filled hollow-core optical fiber (4). be spectrally expanded, - a wavelength-selective switch (5) for generating a pulsed excitation laser beam (6) and a pulsed depletion laser beam (7) from the other end of the gas-filled hollow-core optical fiber (4) decoupled, pulsed laser beam (8), - at least one optical transport fiber (9,9', 10) for transporting the pulsed excitation laser beam (6) and the pulsed depletion laser beam (7), either the STED microscope (1) having a phase modulation device (11) for modulating the phase of the at least one optical transport fiber (9, 10) coupled out, pulsed deactivation laser beam (7'), which is designed in such a way that a focusing of the phase-modulated, pulsed deactivation laser beam (7") results in a deactivation focus, or the at least one optical transport fiber (9') is exactly one optical transport fiber which has a central mode for the propagation of the pulsed excitation laser beam (6) and at least one higher mode for the propagation of the pulsed depletion laser beam (7), - an objective (17) for joint focusing of the decoupled, pulsed excitation laser beam (6') and the phase-modulated or the pulsed deactivation laser beam (7',7") decoupled from the optical transport fiber (9') in a sample (18) and for collecting fluorescent light (19) emitted by the sample (18), and - A detection device (21) for detecting the collected fluorescent light (19).

STED microscope after claim 1 , characterized in that by means of the wavelength-selective switch (5) at least one pulse property, in particular a pulse duration, of the laser pulses of the pulsed excitation laser beam (6) and/or the laser pulses of the pulsed deactivation laser beam (7) is changed via a modulation of the spectral phase and/or the spectral The amplitude of the gas-filled hollow-core optical fiber (4) coupled out, pulsed laser beam (8) is adjustable.

STED microscope after claim 1 or 2 , characterized in that it comprises the phase modulation device (11) and a dichroic mirror (12) and the at least one optical transport fiber (9) is exactly one optical transport fiber, the pulsed signal coupled out of the optical transport fiber (9). The deactivation laser beam (7') can be separated from the decoupled, pulsed excitation laser beam (6') before the phase modulation device (11) by means of the dichroic mirror (12).

STED microscope after claim 1 or 2 , characterized in that it comprises the phase modulation device (11), and the at least one optical transport fiber (9, 10) is two optical transport fibers, the wavelength-selective switch (5) being designed to transmit the pulsed excitation laser beam (6) in to couple the first transport optical fiber (9) and the pulsed depletion laser beam (7) into the second transport optical fiber (10).

STED microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the at least one optical transport fiber (9, 9', 10) is an optical hollow core fiber, preferably a Kagome fiber, revolver hollow core fiber or nested tube fiber.

STED microscope after claim 5 , characterized in that no or only weak non-linear optical effects occur in the at least one optical transport fiber (9,9', 10), a vacuum or a pressure of preferably in the at least one optical transport fiber (9,9', 10). less than 200 mbar, particularly preferably less than 100 mbar, in particular less than 10 mbar, and/or the at least one optical transport fiber (9, 9', 10) with a gas with a particularly low non-linearity, in particular with He or a gas mixture comprising He, is filled.

STED microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the gas-filled hollow-core optical fiber (4) is a gas-filled Kagome fiber, a gas-filled hollow-core revolver fiber or a gas-filled nested-tube fiber.

STED microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the gas-filled hollow-core optical fiber (4) is designed to spectrally expand the laser pulses of the pulsed laser beam (3) to form a supercontinuum.

STED microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the gas-filled hollow-core optical fiber (4) is designed to spectrally expand the laser pulses of the pulsed laser beam (3) to form a Raman comb.

STED microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the gas-filled hollow-core optical fiber (4) is filled with a gas from a first group comprising: Ne, Ar, Kr, Xe, or a gas from a second group comprising: H ₂ , N ₂ , N ₂ O, C ₂ H ₂ F ₄ , C ₂ H ₄ F ₂ , or with a gas mixture comprising two or more of the gases from the first and/or the second group.

STED microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the wavelength-selective switch (5) has at least one dispersive optical element (22) and a device (24) for location-dependent phase and/or amplitude modulation.

STED microscope after claim 11 , characterized in that the device (24) for location-dependent phase and / or amplitude modulation has a liquid-crystal-on-silicon element (25).