DE102019108825A1

DE102019108825A1 - Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen der Leber

Info

Publication number: DE102019108825A1
Application number: DE102019108825.9A
Authority: DE
Inventors: Lusine Danielyan; Gayane Buniatian; Matthias Schwab; Ralf Weiskirchen; Thomas Weiss; Christoph Hermann Gleiter
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2020-10-08
Also published as: WO2020201471A1; EP3946386A1; US20220088130A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Lebererkrankung, wobei die Verbindung ein Amyloid-beta-verwandtes Protein ist, wobei das Amyloid-beta-verwandte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amyloid-beta-Protein, einem davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptid, Amyloid-Vorläuferprotein (APP), einer Verbindung, die an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, oder einer Verbindung, die den Abbau des Amyloid-beta-Proteins oder der davon abgeleiteten Amyloid-Peptide hemmt.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung von Lebererkrankungen sowie auf Verfahren zur Behandlung von Leberkrankungen mittels einer Verbindung, insbesondere zur Behandlung von Leberfibrose oder Leberzirrhose.
Die Leber ist ein Organ, das verschiedene Funktionen erfüllt. Die Leber spielt eine wichtige Rolle bei der Synthese von Proteinen (z.B. Albumin, Gerinnungsfaktoren und Komplement), der Entgiftung und der Speicherung (z.B. Vitamin A). Darüber hinaus ist sie am Stoffwechsel von Lipiden und Kohlenhydraten beteiligt. In den letzten Jahren haben die Entwicklung von Leberkrankheiten und die Zahl der durch Leberkrankheiten verursachten Todesfälle stufenweise zugenommen. Die Leberzirrhose hat viele mögliche Ursachen; manchmal gibt es sogar bei ein und derselben Person mehr als eine Ursache. Weltweit sind 57% der Leberzirrhose entweder auf Hepatitis B (30%) oder Hepatitis C (27%) zurückzuführen. Alkoholkonsum ist eine weitere wichtige Ursache, die etwa 20% der Fälle ausmacht.
Leberfibrose/Zirrhose ist ein Zustand, bei dem die Leber aufgrund von Langzeitschäden nicht richtig funktioniert. Diese Schädigung ist durch den Ersatz von normalem Lebergewebe durch Narbengewebe gekennzeichnet. Typischerweise entwickelt sich die Krankheit langsam über Monate oder Jahre.
Im Allgemeinen bezieht sich die Leberzirrhose auf das Endstadium der Lebererkrankung. Die Hauptursachen der Leberzirrhose sind vielfältig, darunter Hepatitis, Virusinfektionen, Alkoholvergiftung, Störung der Gallensäuresekretion, Drogenabhängigkeit, Allergien und übermäßige Eisenablagerungen.
Die Leberzellen können aufgrund ihrer starken Regenerationsfähigkeit durch Regeneration repariert werden, auch wenn sie bis zu einem gewissen Grad zerstört sind. Nach einem bestimmten Zeitpunkt nach der Zerstörung der Leberzellen werden die zerstörten Zellen jedoch nicht regeneriert, sondern es kommt zu einer Fibrose, die zu einer Leberverhärtung führt. Dieser Zustand, bei dem die Leber durch eine Strukturveränderung so verhärtet ist, dass sie nicht mehr in den ursprünglichen Zustand zurückkehren kann, wird als Leberzirrhose bezeichnet. Daher kann die Leberschädigung durch die Zirrhose nicht rückgängig gemacht werden, aber die Behandlung kann das weitere Fortschreiten stoppen oder verzögern und die Komplikationen verringern.
Die Leberfibrose ist eine Erkrankung, bei der das Lebergewebe in einem chronisch entzündlichen Zustand wiederholt geschädigt und repariert wird, so dass sich Bindegewebe wie Kollagen übermäßig stark im Lebergewebe ablagert und dadurch Narben im Lebergewebe entstehen.
Im Allgemeinen ist die Leberfibrose im Gegensatz zur Leberzirrhose reversibel und besteht aus dünnen Fibrillen ohne Knotenbildung. Sobald die Ursache der Leberschädigung beseitigt ist, kann die Leber wieder in den Normalzustand versetzt werden. Wird der Leberfibrose-Mechanismus jedoch ständig wiederholt, führt die Leberfibrose zu einer irreversiblen Leberzirrhose, bei der die Vernetzung zwischen den Bindegeweben zunimmt und sich dicke Fibrillen anhäufen, und ein Leberläppchen seine normale Struktur verliert, was zur Bildung von Knoten führt.
Lebererkrankungen haben verschiedene Ursachen, aber wenn diese Lebererkrankungen chronisch werden, führen sie unabhängig von den Ursachen häufig zu einer Leberfibrose oder Leberzirrhose. Leberkrankheiten sind im Anfangsstadium asymptomatisch und daher schwierig zu diagnostizieren. Da Leberkrankheiten im Allgemeinen im chronischen Stadium auftreten, sind diese Leberkrankheiten zudem nicht leicht zu behandeln und haben eine hohe Sterblichkeitsrate und stellen somit ein soziales Problem dar. Zudem wurden bisher keine Therapeutika mit ausgezeichneter Wirkung entwickelt.
Aktuelle medikamentöse und zellbasierte Therapien der Leberfibrose/Zirrhose, die unabhängig von ihrer Ätiologie (primär biliäre Zirrhose, nichtalkoholische Steatohepatitis, Alkoholhepatitis) auf eine Reduktion oder sogar Umkehrung der Leberfibrogenese abzielen, Leberzellkarzinom und Virushepatitis) geben Hoffnung für zukünftige Behandlungen von Leberfibrose/Zirrhose, indem sie auf die Aktivierung von Leber-Sterne-Zellen (HSC) abzielen, die das prominenteste Kennzeichen der Leberzirrho-Fibrose ist.
Keiner der Kandidaten (weder Medikamente noch Zellen) ist jedoch in der Lage, komplexe Effekte zu zeigen, die sowohl die Deaktivierung der HSC als auch die Umkehrung der Undurchlässigkeit der sinusoidalen Leberendothelzellen (LSEC) beeinflussen. Die Permeabilität der Blut-Gewebe-Grenzfläche spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Hauptfunktion der Leber zur Entgiftung toxischer Verbindungen, die durch das Blut abgegeben werden.
Gegenwärtig gibt es keine andere Behandlung des Fortschreitens der Entwicklung einer Leberfibrose oder Leberzirrhose als eine antivirale Therapie, die die zugrunde liegende Leberzerstörung verhindert.
Vor diesem Hintergrund ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Überwindung der oben genannten Mängel des Standes der Technik.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Lebererkrankungen, insbesondere der Leberfibrose oder Leberzirrhose.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verhütung/Prävention von Lebererkrankungen, insbesondere der Leberfibrose oder Leberzirrhose.
Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe durch eine Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Lebererkrankung erreicht, wobei die Verbindung ein Amyloid-beta-verwandtes Protein ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Amyloid-beta-Protein, einem davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptid (Aß), einem Amyloid-Vorläuferprotein (APP), einer Verbindung, die an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, oder einer Verbindung, die den Abbau des Amyloid-beta-Proteins oder der davon abgeleiteten Amyloid-Peptide hemmt, besteht.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine eukaryotische Zelle, die auf natürliche Weise, d.h. ohne genetische Veränderung, programmiert ist, hohe Mengen an APP zu produzieren und Aß in geringerem Maße abzubauen als hepatische Sternzellen (HSC), zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Lebererkrankung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die eukaryotische Zelle perivaskulären Ursprungs und somit in der Lage, die aktivierte hepatische Sternzelle (HSC) in der erkrankten Leber, d.h. eine fibrotische/zirrhotische Leber, zu ersetzen. Die geringere Potenz der eukaryotischen Zelle gemäß der Erfindung, Aß abzubauen, als im Vergleich zur HSC, und die erhöhte Expression von APP als Reaktion auf TGF-β und TNF-α, die bei Lebererkrankungen wie der Leberzirrhose hochreguliert sind, wird ihren Gehalt im perivaskulären Raum in der Leber erhöhen und somit zur Deaktivierung des fibrotischen Phänotyps der Leberstellatzellen beitragen sowie die Permeabilität der sinusoidalen Leberendothelzellen erhöhen.
Die eukaryotische Zelle(n) wird (werden) gemäß einer bevorzugten Ausführungsform aus mindestens einem der Folgenden ausgewählt: Astrozyten, iPS- (induzierte pluripotente Stammzelle) abgeleitete Astrozyten D: 30409508), und somatischen Zellen, die direkt zu Astrozyten umprogrammiert werden (PMID: 22308465).
Mit einer erfindungsgemäßen eukaryotischen Zelle, insbesondere Astrozyten, können Lebererkrankungen effizient behandelt werden. In diesem Zusammenhang haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass eine astrogliale Primärkultur Aß weniger stark abbaut als hepatische Sternzellen. Auch aufgrund der Tatsache, dass Astrozyten, wie oben erwähnt, die BACE1-, APP- und β-Sekretaseverarbeitung erhöhen und dass die Produktion von astrozytärem Aß als Reaktion auf pro-inflammatorische Zytokine wie TNF-α und TGF-ß, die während der Leberzirrhose hochreguliert werden, zunimmt, werden die Astrozyten ihre Produktion von APP und - als Folge davon - von Aß erhöhen, sobald sie in die zirrhotische Leber transplantiert werden.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine genetisch modifizierte eukaryotische Zelle zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Lebererkrankung, wobei die genetisch modifizierte eukaryotische Zelle so modifiziert wurde, dass sie das Amyloid-beta-Protein und/oder davon abgeleitete Amyloid-beta-Peptide, APP, BACE1 und/oder Presenilin überexprimiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die genetisch modifizierte eukaryotische Zelle zur Verwendung gemäß der Erfindung aus mindestens einer der folgenden ausgewählt: genetisch modifizierte mesenchymale Stromazelle, genetisch modifizierte Astrozyten, genetisch modifizierte iPS- (induzierte pluripotente Stammzelle) abgeleitete Astrozyten und genetisch modifizierte somatische Zellen, die direkt zu Astrozyten umprogrammiert werden.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Leberkrankheit, insbesondere Leberfibrose oder Zirrhose, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Amyloid-beta-verwandtes Protein umfasst, wobei das Amyloid-beta-verwandte Protein ausgewählt ist aus Amyloid-beta-Protein, einem davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptid, Amyloid-Vorläuferprotein (APP), einem Enzym, das an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, oder ein Inhibitor des Abbaus von Amyloid-beta-Protein oder von davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptiden, und/oder wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine genetisch veränderte eukaryotische Zelle umfasst, die so modifiziert wurde, dass sie Amyloid-beta-Protein, APP, BACE1 und/oder Presenilin überexprimiert.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollständig erfüllt.
Obwohl die Leber das wichtigste periphere Organ ist, das für die Bildung und den Abbau von Amyloid-beta-Peptiden (Aß) verantwortlich ist, ist über die Rolle von Aß in der gesunden und zirrhotischen Leber wenig bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die Bildung und der Abbau von Aß bei der Zirrhose des Menschen und der Nagetiere beeinträchtigt ist, was sich in einem drastischen Rückgang von Aß Fragmenten und von Enzymen, die bei deren Bildung beteiligt sind (BACE1 und Gamma-Sekretase Presenilin), widerspiegelte.
Bei der Alzheimer-Krankheit führt die Belastung von Aß zu einer erhöhten Durchlässigkeit der Hirnkapillaren. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen, dass die große Menge an Aß, die von der Leber unter physiologischen Bedingungen produziert wird, die gleiche Funktion bei der Regulierung der Permeabilität der Lebersinusoide hat. Die Exposition von sinusoidalen Leberendothelzellen gegenüber Aß führt zu einer erhöhten Expression der Leberpermeabilitätsmarker VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor) und eNOS (endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase).
Weiterhin wird mit der vorliegenden Erfindung das bisher unbekannte hohe therapeutische Potenzial von Aß sowie von Enzymen, die für dessen Bildung und Abbau bei der Leberzirrhose entscheidend sind, gezeigt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wirkt Aß aufgrund seiner vielfältigen antifibrogenen Wirkungen den beiden Hauptmerkmalen der Leberfibrose/Zirrhose, d.h. 1) der Aktivierung der Lebersternzellen und 2) der verminderten Permeabilität des Leberendothels, wirksam entgegen.
Diese Feststellung wurde durch den Nachweis der Fähigkeit von Aß belegt, die Marker der HSC-Aktivierung (alpha-SMA, Kollagen Typ 1) herunterzuregulieren und die Marker der sinusoidalen Leberendothelzellpermeabilität VEGF und eNOS hochzuregulieren. Aß hemmt den Hauptakteur der Fibrose/Zirrhose TGF-beta in aktivierter HSC und in menschlichen Leberendothelzellen (hLSEC).
Darüber hinaus zeigen die Daten der vorliegenden Erfindung, dass durch die Behandlung mit Aß die hepatische Expression der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) erhöht werden konnte. Dies konnte in transgenen Mausmodellen von Alzheimer-Krankheiten gezeigt werden, bei denen das Amyloid-Vorläuferprotein überexprimiert und das Presenilin im Gehirn mutiert ist, was zu einer Erhöhung von systemischem Aß führte. Mit einem hohen systemischen und/oder intrahepatischen Level an Aß kann die Entwicklung und/oder das Fortschreiten von Lebererkrankungen, z.B. Leberzirrhose, verhindert oder behandelt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gezeigt, dass ein Inhibitor von Neprilysin (NEP) als amyloid-beta-bezogenes Protein eingesetzt werden kann; Neprilysin ist ein Aß abbauendes Enzym, und bei aktivierter HSC wird der Neprilysinspiegel erhöht, was zu einer raschen Aufnahme und einem raschen Abbau von Aß führt. Daher kann ein Neprilysin-Inhibitor, wie z.B. Sacubitril, erfindungsgemäß schnell zur Behandlung und/oder Prävention von Lebererkrankungen, insbesondere der Leberzirrhose, eingesetzt werden.
Weiterhin, und wie oben erwähnt, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit von Astrozyten, Aß in geringerem Maße als HSC abzubauen, nachgewiesen; aufgrund der Tatsache, dass eukaryotische Zellen wie Astrozyten ihre Fähigkeit zur Produktion von Aß als Reaktion auf TGF-β und TNF-α, die während der Leberzirrhose hochreguliert werden, verbessern, führt die Feststellung der Erfinder zu dem Prinzip, Lebererkrankungen wie Zirrhose/Fibrose mit eukaryotischen Zellen zu behandeln, die auf die Merkmale der Leberzirrhose (TGF-β und TNF-α) mit der Produktion von Aß reagieren, beispielhaft durch Astrozyten.
In diesem Zusammenhang und innerhalb der vorliegenden Erfindung bedeutet „eine Lebererkrankung“ - auch hepatische Erkrankung genannt - eine Art von Schädigung oder Erkrankung der Leber. Vorzugsweise ist die Leberkrankheit eine Leberzirrhose oder -fibrose. Vorzugsweise ist die Leberkrankheit auch eine Hepatitis, einschließlich Virushepatitis, alkoholische Hepatitis, Autoimmunhepatitis, alkoholische Leberkrankheit, Fettleberkrankheit, nichtalkoholische Steatohepatitis, hepatozelluläres Karzinom oder primär biliäre Zirrhose.
In diesem Zusammenhang ist „ein Amyloid-beta-verwandtes Protein“ ein mit dem Amyloid-beta-Protein verwandtes Protein und kann daher ein Protein sein, das durch das Amyloid-beta-Protein repräsentiert wird, oder von dem Amyloid-beta-Protein abgeleitet sein, z.B. ein Fragment davon, insbesondere Fragmente, die 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 oder 43 Aminosäuren des Amyloid-beta-Proteins umfassen, oder es kann ein Protein sein, das an der Bildung/dem Abbau des Amyloid-beta-Proteins beteiligt ist. Das Amyloid-beta-Protein wird auch als Aß oder Abeta bezeichnet. Das/die Amyloid-beta-Protein/Peptide ist/sind von dem Amyloid-Vorläuferprotein (APP) abgeleitet, das durch Beta-Sekretase und Gamma-Sekretase gespalten wird, um Aß zu erhalten. Aß Moleküle können zu flexiblen löslichen Oligomeren aggregieren, die in verschiedenen Formen vorliegen können.
Unter „Amyloid-Vorläuferprotein“ oder „APP“ wird hierin ein integrales Membranprotein verstanden, das in vielen Geweben exprimiert und in den Synapsen von Neuronen konzentriert wird. APP ist bekannt als das Vorläufermolekül, dessen Proteolyse Beta-Amyloid erzeugt (Aß).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das vom Amyloid-beta-Protein abgeleitete Amyloid-beta-Peptid aus der Gruppe ausgewählt, die aus Amyloid-beta 40, Amyloid-beta 42 und Amyloid-beta 38 besteht.
Aß entsteht nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP), einem Transmembranglykoprotein mit unbestimmter Funktion. APP kann durch die proteolytischen Enzyme α-, β- und γ-Sekretase gespalten werden; Aß-Protein wird durch aufeinanderfolgende Wirkung der β- und γ-Sekretasen gebildet. Die γ-Sekretase, die das C-terminale Ende des Aß-Peptids produziert, spaltet innerhalb der Transmembranregion von APP und kann eine Reihe von Isoformen mit einer Länge von 30-51 Aminosäureresten bilden. Einige dieser Isoformen sind das Amyloid beta 40 (Aß40), das Amyloid beta 42 (Aβ42) und das Amyloid beta 38 (Aß38);
Ferner ist in einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform der Verbindung die an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligte Verbindung ein Enzym, das aus alpha-, beta- (BACE1), gamma-Sekretasen, vorzugsweise Presenilin, ausgewählt wird.
Alpha-Sekretasen sind eine Familie von proteolytischen Enzymen, die das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) in seiner Transmembranregion spalten. Der Alpha-Sekretase-Signalweg ist der vorherrschende APP-Verarbeitungsweg. Daher schließt die Alpha-Sekretase-Spaltung die Amyloid-Beta-Bildung aus und wird als Teil des nichtamyloidogenen Weges bei der APP-Verarbeitung angesehen. Nach der Spaltung durch Alpha-Sekretasen gibt APP seine extrazelluläre Domäne - ein Fragment, das als APPsα bekannt ist - in einem als Ektodomänen-Shedding bezeichneten Prozess an die extrazelluläre Umgebung ab.
Die Beta-Sekretase 1 (BACE1), auch bekannt als „beta-site-amyloidprecursor protein cleaving enzyme 1, beta-site-APP cleaving enzyme 1, membraneassociated aspartic protease 2 (membranassoziierte Asparaginsäureprotease 2), memapsin-2 (Memapsin-2), aspartyl protease 2 (Asparaginsäureprotease 2) und ASP2“, ist ein Enzym, das beim Menschen durch das BACE1-Gen kodiert wird. Die extrazelluläre Spaltung von APP durch BACE1 erzeugt ein lösliches extrazelluläres Fragment und ein zellmembrangebundenes Fragment, das als C99 bezeichnet wird. Die Spaltung von C99 innerhalb seiner Transmembrandomäne durch γ-Sekretase setzt die intrazelluläre Domäne von APP frei und bildet Amyloid-β. Da die Gamma-Sekretase APP näher an der Zellmembran spaltet als BACE1, entfernt sie ein Fragment des Amyloid-β-Peptids. Die anfängliche Spaltung von APP durch die α-Sekretase statt durch BACE1 verhindert die Bildung von Amyloid-β.
Die Gamma-Sekretase ist ein Proteasekomplex mit mehreren Untereinheiten, der selbst ein integrales Membranprotein ist, das Transmembranproteine mit einer einzigen Transmembrandomäne an Resten innerhalb der Transmembrandomäne spaltet. Proteasen dieses Typs werden als Intramembran-Proteasen bezeichnet. Das bekannteste Substrat der Gamma-Sekretase ist das Amyloid-Vorläuferprotein, ein großes integrales Membranprotein, das, wenn es sowohl von der Gamma- als auch von der Beta-Sekretase gespalten wird, ein kurzes Peptid mit 42 Aminosäuren produziert, das Amyloid Beta genannt wird. Preseniline sind eine Familie verwandter Transmembranproteine mit mehreren Transmembrandomänen, die die katalytischen Untereinheiten des gamma-Sekretase-Intramembranproteasekomplexes bilden.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindung ist die Verbindung, die den Abbau des Amyloid-beta-Proteins oder davon abgeleiteter Amyloidpeptide hemmt, ein Inhibitor des Enzyms Neprilysin.
Wie oben diskutiert, ist Neprilysin, auch bekannt als Membran-Metallo-Endopeptidase (MME), neutrale Endopeptidase (NEP), „Cluster of Differentiation 10“ (CD10) und das gemeine akute lymphoblastische Leukämie-Antigen (CALLA), ein Enzym, das beim Menschen durch das MME-Gen kodiert wird. Neprilysin ist eine zinkabhängige Metalloprotease, die Peptide an der Aminoseite von hydrophoben Resten spaltet und mehrere Peptidhormone wie Glucagon, Enkephaline, Substanz P, Neurotensin, Oxytocin und Bradykinin inaktiviert. Es baut auch das Amyloid-Beta-Peptid ab. Inhibitoren von Neprilysin wurden mit dem Ziel entwickelt, schmerzstillende und blutdrucksenkende Mittel zu entwickeln, die die Aktivität von Neprilysin gegen Signalpeptide wie Enkephaline, Substanz P, Endothelin und atriales natriuretisches Peptid, verhindern. Bekannte Inhibitoren des Enzyms Neprilysin, die dementsprechend im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind Sacubitril/Valsartan (Entresto/LCZ696), Sacubitril (AHU-377), ein Prodrug, das Bestandteil von Sacubitril/Valsartan ist, Sacubitrilat (LBQ657), die aktive Form von Sacubitril, RB-101, ein Enkephalinase-Inhibitor und UK-414.495 usw.
Wie oben erläutert, ist/wird in einer bevorzugten Ausführungsform die genetisch veränderten eukaryotischen Zelle oder die eukaryotischen Zellen ohne genetische Modifizierung, die auf natürliche Weise zum Abbau von Aß programmiert sind und zwar mit einer geringeren Fähigkeit als hepatische Sternzellen (HSC) in der Leber, welche erfindungsgemäß zur Behandlung von Lebererkrankungen eingesetzt wird/werden, aus einer mesenchymalen Stromazelle, Astrozyten, iPS-abgeleiteten Astrozyten und somatischen Zellen, die direkt zu Astrozyten umprogrammiert werden, ausgewählt.
Mesenchymale Stromazellen (MSC) sind spindelförmige, plastisch haftende Zellen, die aus Knochenmark, Fett und anderen Gewebequellen isoliert werden und in vitro eine multipotentielle Differenzierungskapazität aufweisen.
Astrozyten, die aus iPS-(induzierten pluripotenten Stammzellen) gewonnen werden, sind als solche sowie ihre Generierung im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Perriot S. et al., „Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes Are Differential Activated by Multiple Sclerosis-Associated Cyto-kines", Stem Cell Reports, 2018, 13;11 (5):1199-1210) und können entsprechend gewonnen werden. Dasselbe gilt für die Generierung von Astrozyten durch Reprogrammierung somatischer Zellen (siehe z.B. Lujan E. et al., „Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, 14; 109(7):2527-32).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich dementsprechend auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung einer Lebererkrankung, insbesondere Leberfibrose oder Zirrhose, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Amyloid-beta-verwandtes Protein umfasst, wobei das Amyloid-beta-verwandte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Amyloid-beta-Protein oder davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptiden, dem Amyloid-Vorläuferprotein (APP), einem Enzym, das an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, oder einem Inhibitor des Abbaus von Amyloid-beta-Protein oder von davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptiden, und/oder umfassend eine genetisch modifizierte eukaryotische Zelle, die so modifiziert wurde, dass sie Amyloid-beta-Protein, APP, BACE1 und/oder Presenilin überexprimiert, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Unter einem „pharmazeutisch annehmbaren Träger“ versteht man gegenwärtig und im allgemeinen Verständnis auf dem Gebiet jeden Hilfsstoff, Zusatzstoff oder Träger, der typischerweise auf dem Gebiet der Behandlung der genannten Krankheiten verwendet wird und der die Verabreichung des erfindungsgemäßen Produktes an ein Lebewesen vereinfacht oder ermöglicht und/oder seine Stabilität und/oder Aktivität verbessert. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Bindemittel, Verdünnungsmittel oder Schmiermittel enthalten. Die Auswahl eines pharmazeutischen Trägers oder anderer Zusätze kann auf der Grundlage des vorgesehenen Verabreichungsweges und der üblichen pharmazeutischen Praxis erfolgen. Als pharmazeutisch akzeptable Träger können Lösungsmittel, Extender oder andere flüssige Bindemittel wie Dispergier- oder Suspensionsmittel, Tenside, Isotonika, Spreader oder Emulgatoren, Konservierungsmittel, Verkapselungsmittel, feste Bindemittel verwendet werden, je nachdem, was für das jeweilige Dosierungsregime am besten geeignet ist und ebenfalls mit der erfindungsgemäßen Verbindung kompatibel ist. Eine Übersicht über solche zusätzlichen Inhaltsstoffe findet sich z.B. in Rowe (Hrsg.) et al: Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7. Auflage, 2012, Pharmaceutical Press.
Wie oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer Lebererkrankungen, wobei das Verfahren den Schritt der Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, wie oben beschrieben und wie beansprucht, oder der genetisch modifizierten eukaryotischen Zelle, wie oben beschrieben oder wie beansprucht, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, an eine Person, die diese benötigt, umfasst, wodurch die Leberkrankheit behandelt oder verhindert wird.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der beigefügten Beschreibung und den Abbildungen und Tabellen.
Es versteht sich, dass die oben genannten und die im Folgenden noch zu erläuterenden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder allein verwendbar sind, ohne dass vom Umfang der vorliegenden Erfindung abgewichen wird.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im Folgenden diesbezüglich näher beschrieben.
In den Figuren:

1A-E zeigt die Aß abbauenden Fähigkeiten von aktivierten HSC;
2A und 2B zeigen Western Blots des Vergleichs des Gehalts an NEP in Lysaten von HSC-T6 (2A) und M1-4HSC (2B) mit einer astroglialen Primärkultur (APC). Auch die Immunreaktion von α-SMA in Lysaten von M1-4HSC;
3A-C zeigen den Einfluss von Aß42 und Aß40 auf die Level von α-SMA und TGF-ß in M1-4HSC, wie in Western Blots gezeigt;
4A-D zeigen die Expression von NEP in der Leber von BDL-Ratten und -Mäusen und ihre Korrelation mit α-SMA und GFAP.
5A-D zeigen die doppelte Färbung von BDL- und SO-Rattenleberabschnitten für Markerproteine der HSC-Differenzierung;
6A-C zeigen Western-Blot-Analysen von Proteinen, die an der Bildung und dem Abbau von Aß Peptiden in SO- und BDL-Rattenleber beteiligt sind;
7A-F zeigen die Unterschiede in den Leveln an Aß-assoziierten Proteinen in kranken und normalen menschlichen Leberproben;
8A-E zeigt die Aß Fragmente und eNOS in der zirrhotischen Leber und den in-vitro-Effekt von Aß auf Col-1 und eNOS; und
9 (A-B) zeigt die Hemmung des Abbaus von Aß 40 und 42 durch HSC als Reaktion auf Sacubitrilat (LBQ657).

Beispiele:
Materialien und Methoden:
Menschliche Lebergewebeproben
Menschliches Lebergewebe wurde von 44 Patienten, davon 21 männliche und 23 weibliche, gewonnen (15 Patienten mit normaler Leber, 15 mit Fibrose und 14 mit Zirrhose).
Tierversuche
Für die Gallengangsligatur (BDL) wurden Sprague-Dawley-Ratten und C56BL/6J-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) verwendet. Als Modell für die Alzheimer-Krankheit wurden doppelt transgene Mäuse B603-Tg(APPswe, PSEN 1dE9)85Dbo/J (APP/PS1-Mäuse) von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) gekauft.
Zellkultur
Die M1-4HSC-Zelllinie wurde zur Verfügung gestellt. Ratten-HSC-T6 und die menschliche HSC-Linie wurden bereits beschrieben (Vogel S, Piantedosi R, Frank J et al. „An immortalized rat liver stellate cell line (HSC-T6): a new cell model for the study of retinoid metabolism in vitro", J Lipid Res 2000; 41:882-893, und Xu L, Hui AY, Albanis E et al. „Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX- 2: new tools for analysis of hepatic fibrosis", Gut 2005;54:142-151).
Astroglia-reiche Primärkulturen (APC) wurden aus neugeborenen C57/BL6 (Charles River) Mäusehirnen hergestellt, wie an anderer Stelle beschrieben (Lourhmati A, Buniatian GH, Paul C, et al. „Age-dependent astroglial vulnerability to hypoxia and glutamate: the role for erythropoietin“, PLoS One 2013;8:e77182). Kurz gesagt, die aus 5-7 Gehirnen neugeborener Wurfgeschwister gewonnenen Zellen wurden in DMEM mit 4,5 g/l Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 100 µg/ml Streptomycinsulfat, 100 Einheiten/ml Penicillin G und 1µM) Pyruvat (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) in einer befeuchteten 10%igen CO₂-Atmosphäre bei 37°C mechanisch dissoziiert, zentrifugiert und auf Zellkulturflaschen (1x106 Zellen/75 cm2) plattiert.
HSC-T6 wurden in DMEM mit 4,5 g/l Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 100 µg/ml Streptomycinsulfat, 100 Einheiten/ml Penicillin G und 1 µM Pyruvat in einer befeuchteten 10%igen CO2-Atmosphäre bei 37°C gezüchtet.
M1-4HSC, humane hepatische sinusförmige Endothelzellen-SV40 (HSEC, Applied Biological Materials, Richmond, BC, Kanada) und LX-2-Zellen wurden in DMEM mit 4,5 g/l Glucose hoch gezüchtet, das entweder 2% (für LX-2), 5% (für HSEC) oder 10% fötales Kälberserum (für M14HSC), 1% nicht-essentielle Aminosäuren (nur für M1-HSC), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (nur für HSEC, Gibco, Thermo Fisher, Darmstadt, Deutschland) enthielt. Die Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre gehalten, die entweder 5 % (für M1-4HSC und HSEC) oder 10 % CO₂ (für LX-2) enthielt.
Aß Quantifizierung in Zellkulturen
Für den Vergleich verschiedener Zelltypen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Aß42 zu nutzen, wurden M1- 4HSC, HSC-T6, LX-2 und astrogliale Primärkulturen (APC) mit einem Medium inkubiert, das synthetische Aß enthielt. Adhärente Zellen (50.000 oder 100.000 Zellen/Vertiefung in 24-Well-Platten) wurden mit einem Medium inkubiert, das 1000 pg/ml synthetisches Aß42 enthielt. Nach 24 Stunden wurde der Überstand bei 1500 g für 15 Minuten zentrifugiert und bis zur Analyse bei -80°C eingefroren.
Die Daten zeigten einen signifikanten Verlust (über 50%) von Aß 24-48h nach Inkubation mit Zellkulturmedium in Abwesenheit von Zellen (nicht gezeigt), was auf den natürlichen Abbau, die Adhäsion an die Polystyrolplatten und/oder die spontane Bildung von Aß Oligomeren oder Polymeren (Ahmed M, Davis J, Aucoin D, et al. „Structural conversion of neurotoxic amyloid-beta(1-42) oligomers to fibrils", Nat Struct Mol Biol. 2010;17:561-567) zurückzuführen ist. Daher wurden als Kontrolle für die inhärente Abnahme der Amyloidkonzentrationen Kontrollproben, die nur Kulturmedium, aber keine Zellen („w/o Zellen“) enthielten, mit Aß für die gleiche Zeitdauer inkubiert.
Um die Aß42-Abbaufähigkeit von M1-4HSC-Lysat zu quantifizieren, wurden Zelllysate von M1-4HSC (50.000 Zellen/ml) durch 2 Gefrier-Auftauzyklen bei - 80°C und Zentrifugation für 10 min bei 20.000 g gewonnen. Die Lysate wurden mit DMEM mit 1000 pg/ml synthetischem Aß42 und Aß40 in Anwesenheit oder Abwesenheit von 5mM EGTA für 30 oder 60 Minuten inkubiert.
Aß42 und Aß40 wurden mit dem humanen Aß EZHS-ELISA-Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers gemessen.
Quantifizierung von Aß Peptiden in Leber- und Hirnhomogenaten
Menschliches Lebergewebe wurde in eiskaltem Lysepuffer (300mM NaCI, 50mM Tris, 2mM MgCl₂, enthaltend ‚Mini Complete Protease Inhibitors‘ (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)) homogenisiert. Rattenlebergewebe von BDL- und SO-Ratten wurde in 4 Volumina kaltem 6,25M Guanidin HCl in 50mM Tris-Puffer pH 8,0 homogenisiert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem „Detergens Compatible (DC) Proteinbestimmung“ (Bio-Rad, Herkules, CA) bestimmt. Gewebelysate wurden bei 20.000 g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Die Leberfragmente Aß42/40/42 wurden mit dem V-Plex® Kit (Mesoscale, Rockville, MD) unter Verwendung des Aß Antikörpers (4G8), der Aß40, Aß42 und Aß38 von Mensch und Nagetier erkennt, nachgewiesen. In gesunden und zirrhotischen menschlichen Leberproben wurde Aβ4O auch mit dem EZBrain-ELISA-Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers quantifiziert.
Hirnhomogenate von APP/PS1- und WT-Mäusen wurden mit humanem Amyloid β42 EZBrain-ELISA-Kit nach dem Herstellerprotokoll analysiert.
Statistische Analysen
Alle in dieser Studie präsentierten Daten wurden durch eine Einweg-ANOVA-Analyse mit dem Mehrfachvergleichstest von Bonferroni oder Student's t-Tests für Einzelvergleiche und durch den Einsatz der GraphPad Prism Software (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) analysiert. p<0,05 wurde als signifikant angesehen.
Ergebnisse
Das Aß abbauende Enzym NEP wurde in M1-4HSC- und HSC-T6-Zellen mittels Immunfluoreszenz (1A) und Western Blot (2 A und B) nachgewiesen. Basierend auf dem Western Blot enthielten M1-4HSC (2B) und HSC-T6-Zellen (2 A) mehr NEP als APC. Um die Ähnlichkeiten zwischen HSC und Astrozyten weiter zu erforschen, verglichen wir als nächstes die Fähigkeit von HSC-Zelllinien, Aß aus der mgebung zu eliminieren, mit Astrozyten.
Die Ergebnisse des Versuchs sind in 1A bis 1E dargestellt. 1A zeigt die Doppel-Färbung für NEP und α-SMA von M1-4HSC und HSC-T6 (Tag 2 nach der Passage). Die Zellkerne werden mit DAPI, 4',6-Diamidino-2-phenylindol, gefärbt. 1B: ELISA von Aß42 zeigt eine höhere Kapazität von M1-4HSC und HSC-T6 (n=4 in jeder Gruppe) für die Aß42 Aufnahme gegenüber Kontrollproben (ohne Zellen) und gegenüber APC. 1C zeigt die mit der Anzahl der Zellen (50.000-200.000) erhöhte Aufnahme von Aß42 durch LX-2. 1D und 1E zeigen den Abbau von Aß42 und Aß40 durch M1-4HSC-Lysate (n=5), die mittels ELISA bewertet wurden. Ein nahezu identischer zeitabhängiger Abbau von Aß42 und Aß40 (graue Balken in 1D und 1E) um 50% nach 30 Minuten und um 75% nach 60 Minuten wurde beobachtet. Der Abbau der beiden Aß Fragmente durch M1-4HSC-Lysate wurde in Gegenwart von EGTA drastisch gehemmt (vgl. graue und weiße Balken in 1D und 1E). Die Konzentrationen von Aß42/40 in zellhaltigen Proben wurden auf ihren jeweiligen zeitspezifischen Standard normalisiert (Kontrolle ohne Zellen, schwarze Balken). Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM, *p<0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 dargestellt.
Die Immunofluoreszenz zeigte das Vorhandensein von NEP sowohl in M1-4HSC- als auch in HSC-T6-Zellen (1A). Eine zweifach höhere Aufnahme von Aß42, die sich durch dessen Abnahme im Zellkulturüberstand widerspiegelt, durch M1-4HCS und HSC-T6 gegenüber APC wurde mittels ELISA bestimmt (1B). Von 1000 pg/ml von Aß42, die dem Kulturmedium zugesetzt wurden, wurden nach 48h Inkubation etwa 50% des Peptids auf einem Plastikträger absorbiert. Von dem verbleibenden Teil von Aß, der für Zellen im Kulturmedium zur Verfügung stand, wurden 28%, 55% und 60% des Peptids von Astrozyten, M1-4HSC- bzw. HSC-T6-Zellen internalisiert (1B). Die Menge an Aß42, die von LX-2 internalisiert wurde, wuchs mit zunehmender Anzahl der Zellen in Kultur (1C).
Um zu untersuchen, ob Aß lediglich akkumuliert oder von den Zellen tatsächlich abgebaut wurde, wurde Aß42 (1A) oder Aß40 den Lysaten von M1-4HSC hinzugefügt. Nach 30 bzw. 60 Minuten Inkubation wurde der Anteil von Aß42 und Aß40 auf 50% bzw. 25% reduziert, verglichen mit dem anfänglichen Anteil in Kontrollproben ohne Zelllysate (vgl. graue Balken mit schwarzen Balken in 1D und 1E). Um zu bestätigen, dass das Verschwinden von Aß aus HSC-Lysaten eher auf dessen enzymatischen Abbau als auf den unspezifischen Verlust zurückzuführen ist, der in Zelllysaten auftreten kann, wurde die Aktivität der zinkabhängigen Aß abbauenden Enzyme, die das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) und das Endothelin-Converting-Enzym (ECE) umfassen und von denen bekannt ist, dass sie sowohl in HSC1 als auch in NEP vorhanden sind, durch 5mM EGTA blockiert (weiße Balken in 1D und 1E). Die Inkubation von M1-4HSC-lysaten für 30 und 60 Minuten mit EGTA beseitigte den Abbau von Aß40/42 durch die Zelllysate (vgl. weiße Balken mit grauen Balken in 1A, 1B).
Die in 3A bis C gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von M1-4HSC sowohl mit Aß42 als auch mit Aß40 die Expression von α-SMA (3 A und B) und TGF-ß (3C) reduzierte. Die Unterdrückung der TGF-β-Synthese durch Aß42 war wirksamer als Aß40 (3C).
Die 3A und 3B zeigen die Behandlung von M1-4HSC mit 1000pg/ml Aß42 (3A) und Aß40 (3B). 3C zeigt TGF-ß von unbehandelten M1-4HSC („ctrl.“), sowie von Zellen, die mit Aß40 und Aß42 behandelt wurden. Densitometrische Berechnungen zeigen, dass eine verringerte Intensität, angepasst an die jeweilige GAPDH-Spur („Adj.V0I. INTxmm^2“) der 55 kDa, 44 kDa und 23 kDa Banden in den mit Aß42 behandelten Zellen. Im Gegensatz dazu war Aß40 in der Lage, nur die 44 kDa-Bande zu verringern. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM, *p<0,05, ***p<0,001 dargestellt.
4 zeigt die Expression von NEP in der Leber von BDL-Ratten und - Mäusen und ihre Korrelation mit α-SMA und GFAP. 4A zeigt eine RT-PCR-Analyse mit erhöhter NEP und α-SMA mRNA und verminderter GFAP mRNA in den Lebern von BDL-Ratten (n=5, schwarze Balken) im Vergleich zu entsprechenden scheinoperierten (SO) Kontrollen (weiße Balken, n=5). 4B und C zeigen Western Blots und densitometrische Berechnungen, die eine Hochregulierung der NEP in der BDL-Leber von Ratte (n=3, 4B) und Maus (n=3, 4C) im Vergleich zu den entsprechenden SO-Kontrollen zeigen. 4D zeigt die Ko-Färbung für NEP und GFAP (obere Reihe), für NEP und α-SMA (mittlere Reihe), für NEP und Desmin in (untere Reihe) in SO- und BDL-Rattenleber. Die Zellkerne werden mit DAPI gefärbt. Skalenbalken: für die linke Reihe 200µm, für die rechte Reihe 500µm.
RT-PCR-Analysen der RNA der gesamten Leber zeigten eine signifikante Hochregulation der NEP und α-SMA mRNA bei gleichzeitiger Abnahme der GFAP mRNA in BDL- vs. SO-Rattenleber (4A). Diese Ergebnisse wurden durch Western Blot von NEP in Ratten- (4B) und Maus-BDL (4C) und SO-Leber bestätigt. Auch zeigte sich eine stärkere Reaktion von NEP in Leberabschnitten von BDL der Ratte im Vergleich zu den jeweiligen SO, was durch die Immunfluoreszenz von NEP und α-SMA (obere Reihe in 4C) oder NEP und GFAP (mittlere Reihe in 4C) oder NEP und Desmin (untere Reihe in 4C) gezeigt werden konnte.
Da HSC der Hauptzelltyp sind, der an der BDL-induzierten Zirrhose beteiligt ist, untersuchten die Erfinder zunächst Veränderungen ihres Phänotyps bei BDL vs. SO unter Färbung im Hinblick auf etablierte Markerproteine der HSC: GFAP, α-SMA und Desmin. Die Ergebnisse sind in 5A-D zu sehen.
5A - D zeigt die Doppelfärbung von BDL- und SO-Leberabschnitten der Ratte für Markerproteine der HSC-Differenzierung. 5A und 5B zeigen die Doppelfärbung von Leberabschnitten für GFAP und u-SMA. 5C und 5D zeigen die Doppelfärbung von Leberabschnitten für GFAP und Desmin. GFAP wurde mit FITC-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG visualisiert, während α-SMA und Desmin mit Cy3-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus |gG dargestellt wurden. Der Maßstab in 5A-D beträgt 200µm.
In 5A vs. 5B und 5C vs. 5D ist zu erkennen, dass in der BDL große Bereiche mit Zellen vorhanden waren, die ausschließlich α-SMA oder Desmin exprimieren, sowie Regionen mit Zellen, die GFAP und/oder Desmin exprimieren (5C und 5D).
Die Doppelmarkierung von BDL- und SO-Rattenleberabschnitten mit (α-SMA- und NEP-Antikörpern (obere Reihe von 4D) lokalisierte NEP+-Zellen auf zirrhotische Knoten. Die meisten dieser Zellen exprimierten sowohl α-SMA als auch NEP, die als intensive Gelbfärbung erschienen. Eine große HSC-Population exprimierte ausschließlich α-SMA oder NEP in zirrhotischen Bereichen und in den Regionen um die Knoten herum. Im Gegensatz dazu waren bei SO-Rattenleberabschnitten NEP und α-SMA nur innerhalb der Gefäßwand ko-lokalisiert. In der BDL-Leber der Ratte exprimierten die zirrhotischen Knoten, die mit GFAP-negativen A-HSC angereichert waren, stark NEP (siehe 4D). Die meisten Zellen, die sich zwischen den regenerativen Knoten befanden, waren NEP-negativ und exprimierten ausschließlich GFAP (siehe 4D). Allerdings enthielt die BDL-Leber der Ratte auch Regionen, die mit Zellen angereichert waren, die GFAP und NEP koexprimieren, was höchstwahrscheinlich den Übergangszustand der HSC-Aktivierung widerspiegelt (siehe 5A). Dies steht im Gegensatz zur SO-Rattenleber, bei der NEP ausschließlich in den Membranen der Hepatozyten im gesamten Leberparenchym exprimiert wurde, und das bei den ruhenden HSC, die GFAP stark exprimierten, fehlte (siehe 4D, 5B).
6A-C zeigt die Western-Blot-Analysen von Proteinen, die an der Bildung und dem Abbau von Aß Peptiden in SO- und BDL-Rattenleber beteiligt sind. Muster und densitometrische Berechnungen des APP-Abbaus in BDL (schwarze Balken) und SO (weiße Balken) Rattenleber (n=6) sind in 6A zu sehen. Es zeigte sich eine erhöhte Intensität von 108, 16 und 10-11 kDa APP-Fragmenten bei BDL- gegenüber SO-Ratten. 6B zeigt die BACE-Endoproteolyse bei BDL- und SO-Ratten (n=6). Die Intensität der 55 und 25 kDa Fragmente nahm ab, während das 35 kDa BACE-Fragment bei BDL- vs. SO-Ratten zunahm. 6C zeigt die PS1-Endoproteolyse bei BDL- und SO-Ratten (n=6). es zeigte sich eine verminderte Intensität von 75, 60, 45, 26 und 18 kDa PS1-Fragmenten bei BDL- gegenüber SO-Ratten. Western-Blot-Bilder zeigen 3-4 repräsentative Proben aus jeder Gruppe von n=6. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 dargestellt.
In BDL-Leber von Ratten (siehe 6) war die Menge des nicht-amyloidogenen 108 kDa N-terminalen APP-Fragments höher als die in der Leber von SO-Kontrolltieren nachgewiesene Menge (siehe 6A). Bemerkenswerterweise war auch das 10 kDa APP-Fragment, das ein Produkt der BACE-Reaktion ist, in BDL signifikant höher (siehe 6B). In der BDL-Leber der Ratte war eine allgemeine Abnahme aller BACE-Fragmente zu verzeichnen, mit Ausnahme des 35 kDa-Fragments, das bei BDL-Ratten signifikant erhöht war (siehe 6B). Dieses BACE-Fragment wird in der Leber stark exprimiert. Der Western Blot von PS1 (siehe 6C) in der Rattenleber ergab fünf Hauptfragmente des PS1. Alle waren in der BDL- gegenüber SO-Rattenleber signifikant herunterreguliert, darunter große Massen 75 kDa, unreife 60 kDa, 45 kDa, sowie reife 26 kDa N-terminale und 18 kDa C-terminale PS1-Fragmente.
7 zeigt die Unterschiede in den Mengen der Aß-assoziierten Proteine in kranken und normalen menschlichen Leberproben. 7A zeigt qPCR-Analysen von fibrotischen (hFL, graue Balken, n=10) und zirrhotischen (hCL, schwarze Balken, n=10) gegenüber normalen (hNL, weiße Balken, n=9) menschlichen Lebergeweben, die eine Herunterregulierung der APP mRNA in hFL und hCL gegenüber hNL, der PS1 NEP mRNA in hCL gegenüber hNL und der NEP mRNA in hFL und hCL gegenüber hNL zeigen. 7B-F zeigt densitometrische Berechnungen und Bilder von immunreaktiven Banden in Western Blots von hCL gegenüber hNL (n=6): 7B zeigt die Herunterregulierung von 100, 30 und 10 kDa APP-Fragmenten in hCL, 7C die Hochregulierung von reifen 70 kDa und Herunterregulierung von 37, 27 und 20 kDa BACE-Fragmenten in hCL gegenüber hNL, 7C die Hochregulierung von reifen 70 kDa und Herunterregulierung von 37, 27 und 20 kDa BACE-Fragmenten in hCL gegenüber hNL, 7B-7D die Hochregulierung von reifen 70 kDa und Herunterregulierung von unreifen 55 und 27 kDa PS1-Fragmenten in hCL gegenüber hNL, 7E die Herunterregulierung von NEP in hCL, 7F die Herunterregulierung von Myelin-Basisprotein (MBP) in hCL gegenüber hNL. Die Western-Blots werden als 34 repräsentative Proben von insgesamt 6 Sonden gezeigt, die pro Gruppe analysiert wurden. Bedeutet ± SEM, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Die Ergebnisse der qPCR-Analysen menschlicher Leberspezies zeigten eine Herunterregulierung der APP-mRNA in hFL und hCL im Vergleich zu hNL (7A). Auch die PS1 mRNA war bei hCL im Vergleich zu hNL vermindert. Eine starke Herunterregulierung der NEP-mRNA wurde sowohl bei hFL als auch bei hCL im Vergleich zu hNL beobachtet (7A). Western Blots zeigten eine gleichmäßige Reduktion der 100 kDa, 30 kDa und 10 kDa APP-Fragmente in hCL gegenüber hHL (7B). Im Vergleich zur hNL hCL war die Immunreaktion der reifen 70 kDa BACE-Bande in hCL erhöht, während die BACE-Fragmente mit geringer Masse von 35-37 kDa, 27 kDa und 20 kDa, die als enzymatisch aktive Fragmente bekannt sind, in hCL im Vergleich zur hNL vermindert waren (7D). Diese Daten weisen auf den amyloidogenen Pfad der APP-Proteolyse in hNL hin. Die Densitometrie der immunreaktiven PS1-Banden zeigte eine Hochregulierung des reifen 70 kDa PS1-Fragments auf Kosten des unreifen 55 kDa PS1, gefolgt von einer Abnahme des enzymatisch aktiven 26 kDa PS1-Fragments (7D). Der Western Blot zeigte ebenfalls eine Herabregulation von NEP (7E) und MBP (7F) in hCL im Vergleich zu hNL.
Die 8A-E zeigen Aß Fragmente und eNOS in der zirrhotischen Leber und den in-vitro-Effekt von Aß auf Col-1 und eNOS. 8A zeigt, dass das V-PLEX® Aß Peptid-Panel mit 4G8 Aß Antikörperanalysen eine Herunterregulierung von A1340, Aß42 und Aß38 in hCL (schwarze Balken, n=9) gegenüber hNL (weiße Balken, n=9). 8B zeigt die Herunterregulierung von Aß42 in BDL der Ratte (n=4) und BDL der Maus (n=4) gegenüber der entsprechenden SO (n=4). Western-Blot-Analysen ergaben: verminderte eNOS in hCL gegenüber hNL (n=5) (siehe 8C); eine Verminderung der eNOS in rBDL gegenüber rNL (n=4) (siehe 8D); eine Hochregulierung der eNOS-Synthese durch hSEC und Unterdrückung der Col-1-Produktion in M1-4HSC (n=6) unter Behandlung mit Aß42, dargestellt durch ELISA (siehe 8E und 8F). Mittelwerte ± SEM, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Die V-PLEX®-Analyse zeigte eine etwa 5-, 10- und 160-fache Regulation der Aß40/42/38 Peptide bei hCL vs. hNL (8A), eine etwa 6-fache Reduktion von Aß42 bei BDL-induzierter Ratte (8B) und BDL-induzierter Maus (8C) Zirrhose vs. entsprechende Kontrolllebern. Die Herabregulation von Aß40 bei hCL gegenüber hNL wurde auch mittels ELISA nachgewiesen (nicht gezeigt). Die Western-Blot-Analyse zeigte eine Herabregulation der eNOS beim Menschen ( ) und bei der Ratte ( 8E) im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen. Sowohl bei der CL des Menschen als auch bei der BDL der Ratte wurden keine signifikanten Veränderungen in der Höhe der neuronenspezifischen Isoform der NOS (nNOS) festgestellt (nicht gezeigt). Eine Korrelation zwischen Aß und eNOS wurde auch in den Gehirnen eines doppelt transgenen Modells der Alzheimer-Krankheit, APP/PS1-Mäusen (nicht gezeigt), beobachtet, die durch eine veränderte BHS (Blut-Hirn-Schranke)-Funktion gekennzeichnet sind. Hohe Konzentrationen von Aß in diesen Tieren gingen mit einer Hochregulation von eNOS einher, was eine entgegengesetzte Regulation der Permeabilität in Leber und Hirnkapillare zeigte. Die Behandlung von menschlichen Leberendothelzellen mit Aß führte zu einer erhöhten Synthese von eNOS, einem Stickstoffmonoxid produzierenden Enzym (8E), das für die Permeabilität der Lebersinusoide entscheidend ist. Die Permeabilität der Lebersinusoide hängt auch von der Menge an Kollagen Typ 1 ab, das hauptsächlich durch aktivierte HSC produziert wird und zur Kollagenisierung der Leberkapillaren führt. Daher untersuchten die Erfinder als nächstes, ob Aß die Produktion von Kollagen1 durch M1-4HSC reguliert; es wurde eine mehr als zweifache Abnahme des Col-1-Spiegels in der M1-4HSC-Kultur nach der Behandlung mit Aß42 und nur eine leichte Abnahme, die durch Aß40 beeinflusst wurde, beobachtet (8F).
9 (A-B) zeigte eine Hemmung des Abbaus von Aß 40 und 42 durch HSC als Reaktion auf Sacubitrilat (LBQ657). Primäre murine HSC wurden mit 1000pg/ml Aß40 oder 42 mit und ohne LBQ657 inkubiert. Der Gehalt von Aß im Zellkulturüberstand wurde 48h nach der Inkubation mit Aß40 oder 42 mit und ohne LBQ657 mittels ELISA gemessen. Ein verminderter Abbau von Aß in den mit LBQ657 behandelten HSC spiegelt sich in einem höheren Gehalt an Aß im Zellkulturüberstand wider.
Diskussion
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird erstmals die Herabregulation von Aß-Peptiden bei der Zirrhose von Menschen und Nagetieren gezeigt. Im Gegensatz zur Zirrhose wird bei der gesunden menschlichen Leber APP über eine amyloidogene Proteolyse verarbeitet, wie durch Western-Blots gezeigt wurde:

i) geringe Expression eines N-terminalen APP-Fragments mit großer Masse, das über den Alpha-Sekretase-Weg produziert wird;
ii) erhöhte Reaktion des zuvor in nicht-neuralen Zellen nachgewiesenen enzymatisch aktiven 30-35 kDa BACE-Fragments
iii) höhere Mengen des 10-11 kDa C-terminalen APP-Fragments, das von BACE, einem Enzym, das den ersten Schritt des amylodogenen Abbaus von APP einleitet, erzeugt wird
iv) höhere Mengen von PS1-Derivaten mit geringer Masse, die als enzymatisch aktiv bekannt sind, und schließlich
v) signifikant höhere Konzentrationen von Aß42/40/38 Peptiden, die mit größeren Mengen von kleinen carboxyterminalen 10-11 kDa APP-Fragmenten in hNL vs. hCL korrelieren.

Ferner wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass aktivierte HSC die Aß-Peptide internalisieren und abbauen können, was ihre Rolle bei der aktiven Eliminierung von Aß aus der kranken Leber unterstreicht. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass A-HSC eine höhere Potenz für die Aufnahme von Aß zeigte, und sie enthielten im Vergleich zu Astrozyten größere Mengen an NEP. Der Abbau von Aß40 und Aß42 durch M1-4HSC-Lysate war zeitabhängig und konnte durch EGTA gehemmt werden, was das Vorhandensein eines enzymatisch aktiven NEP, eines zinkabhängigen Aß abbauenden Enzyms, bestätigte. Die Behandlung mit EGTA könnte auch die Aktivität anderer zinkhaltiger Enzyme beeinflussen, z.B. Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) und Endothelin-Converting-Enzym (ECE), die in HSC vorhanden sind. Die Ergebnisse zeigen, dass A-HSC eine starke intrahepatische Senke für amyloidogene Aß Spezies während der Zirrhose bilden.
Aß trägt zur Aufrechterhaltung eines ruhenden Phänotyps der HSC bei, von dem bekannt ist, dass er die normale Leberhomöostase reguliert. Dies wird durch suppressive Effekte von Aß40 und Aß42 auf die α-SMA-Synthese bei aktivierter M1-4HSC belegt, die ein vermindertes α-SMA/GFAP-Verhältnis und die Umkehrung der HSC zu einem Ruhephänotyp zeigen. Bei BDL-induzierter Zirrhose geht die Reduktion von Aß mit einer Herunterregulierung der GFAP-mRNA einher. Ein ähnlicher Effekt von Aß auf die Hochregulation von GFAP wurde nach seiner intra- zerebroventrikulären Injektion in das Gehirn der Maus beobachtet.
Die Aktivierung und Kontraktion der HSC bei der Zirrhose führt zu einer erhöhten extrazellulären Matrixproteinproduktion, die zu einer Kollagenisierung des Perisinusoidalraums und zur Umwandlung der gefensterten Lebersinusoide in kontinuierliche, für die Zirrhose geeignete Kapillaren führt. Diese ultrastrukturellen Veränderungen begrenzen den Blut-Leber-Austausch und den hepatischen Fluss. Die Anti-fibrogenic-Effekte von Aß, die sich in einer verminderten Produktion von TGF-β und Col-1 und in reduzierten Mengen von α-SMA bei HSC widerspiegeln, hemmen die Entwicklung von Zirrhose und die Umgestaltung der Blut-Leber-Grenzfläche. Diese Ergebnisse belegen die Bedeutung von Aß42 für Leber-spezifische Funktionen, die mit der Permeabilität der Lebersinusoide in Verbindung stehen. Interessanterweise induzierte Aß in menschlichen zerebrovaskulären Glattmuskelzellen den Abbau von α-SMA.
Die Leberperfusion wird weitgehend durch Stickstoffmonoxid (NO) reguliert, einem leistungsstarken Vasodilatator, der von eNOS in Hepatozyten und Endothelzellen produziert wird. Die hier gezeigten Aß-induzierten Effekte auf die Synthese von α-SMA, TGF-β und Col-1 durch HSC gelten auch für die in vivo nachgewiesenen NO-Effekte: So blockiert eine auf HSC gerichtete Nanopartikelabgabe von NO Kollagen I, α-SMA und fibrogene Gene in Rattenleber, die von Fibrose und Pfortaderhypertonie betroffen ist, und trägt damit zur Aufrechterhaltung der gefensterte Konstruktion der Leberendothelzellen bei. In vitro wirkt NO als Fänger für reaktive Sauerstoffspezies (ROS), indem es die Akkumulation von Peroxynitrit fördert und die Proliferation von HSC38 hemmt. Die Auswirkungen von NO bei neurologischen Erkrankungen, die durch eine Aß Akkumulation gekennzeichnet sind, werden teilweise auch durch Peroxynitrit vermittelt, das die Permeabilität der BHS erhöht.
Der funktionelle Zusammenhang zwischen Aß und NO kann aus den Experimenten der Erfinder abgeleitet werden, die hohe Werte von Aß und eNOS in der gesunden Leber und deren Reduktion bei Zirrhose zeigen. Diese Ergebnisse werden durch die in vitro-Studien belegt, die eine signifikant erhöhte Produktion von eNOS zeigen, wodurch die Produktion von NO durch Aß42-behandelte hSEC erhöht wird. Die Ergebnisse stimmen mit den in-vitro-Studien überein, die eine Aß-stimulierte Produktion von NO in Astrozyten zeigen.
Während erhöhte NO- und Aß-Spiegel im Gehirn pathologische Veränderungen in hirnspezifischen Funktionen verursachen, kooperieren hohe Spiegel von Aß in der Leber mit NO, um die physiologisch notwendige Permeabilität der Lebersinusoide zu unterstützen. Im Lichte von Studien, die eine durch Aß provozierte Abnahme von Tight Junction-Proteinen in Hirnendothelzellen zeigen, tragen die Spiegel von Aß in der zirrhotischen Leber zum Verlust von Fenestrationen bei und hemmen die Bildung von tight junctions und die Kapillarisierung der Lebersinusoide während der Zirrhose. Es ist verlockend zu spekulieren, dass ein hoher Gehalt an Aß in der gesunden Leber wichtig für die Aufrechterhaltung des gefensterten Aufbaus der Leberkapillaren ist. Darüber hinaus kann ein niedriger Spiegel von Aß in der zirrhotischen Leber die neuronenähnliche Differenzierung der myofibroblastenähnlichen HSC ähnlich wie bei jungen Astrozyten im gesunden Gehirn prädisponieren.
Ein weiteres Schlüsselergebnis der Experimente der Erfinder ist, dass die Zirrhose MBP, den Hauptbestandteil der Myelinscheiden, herunterreguliert, die als Marker für die Integration der hepatischen Parenchymnerven, die während der Zirrhose verschwinden, angesehen werden. Insbesondere können gereinigtes MBP aus dem menschlichen Gehirn und rekombinantes MBP aus dem menschlichen Gehirn Aß40 und Aß42 in vitro abbauen und die Fläche der parenchymalen und zerebralen vaskulären Amyloidablagerungen in Tg2576-Hirnschnitten der Maus reduzieren. In-vitro-Studien zeigten, dass MBP die Auswirkungen von Aß nachahmt, indem es die Produktion von NO über die Aktivierung von iNOS in erwachsenen menschlichen Astrozyten stark stimuliert.
Die hier gezeigten hohen Konzentrationen von MBP, eNOS und Aß in der gesunden Leber im Vergleich zur zirrhotischen Leber zeigen auch deren Synergismus in der Leber. Es wird daher darauf hingewiesen, dass eine Endothelzelldysfunktion während einer Zirrhose, die durch eine geringe Permeabilität der Lebersinusoide gekennzeichnet ist, zumindest teilweise durch verminderte Spiegel von Aß und MBP und eine anschließende Herunterregulierung der eNOS verursacht wird. Die Experimente zeigen verringerte eNOS-Spiegel bei chronischer menschlicher Zirrhose und im BDL-Zirrhose-Modell.
Darüber hinaus zeigen die Experimente eine signifikante Herunterregulierung der NEP-mRNA und des -Proteins bei chronischer menschlicher Zirrhose. Ähnliche Veränderungen in NEP und MBP bei der chronischen Zirrhose weisen auf einen minimalen Beitrag beider Proteine zum Verschwinden von Aß bei der chronischen menschlichen Zirrhose hin. Die Abnahme von MBP und NEP bei der Zirrhose liegt den intrinsischen Schutzmechanismen zugrunde, um zumindest minimale Mengen von Aß zur Aufrechterhaltung der geschwächten Leberfunktionen zu erhalten.
In BDL-Modellen der Ratte ist die Verarbeitung von APP durch die Produktion größerer Mengen von nicht-amyloidogenen 108 kDa sowie amyloidogenen 16 kDa und 10 kDa APP-Fragmenten in BDL im Vergleich zu SO gekennzeichnet. In BDL der Ratte wird eine höhere Menge an funktional reifem 35 kDa BACE-Fragment von einer gleichmäßigen Abnahme aller PS1-Fragmente begleitet, was zu einer Herabregulierung von Aβ führt.
Angesichts der Fähigkeit von NEP, Aß zu degradieren, verstärkt die Hochregulierung von NEP im BDL-Modell der Zirrhose die Schädigung, die bereits durch niedrige PS1- und NO-Spiegel gefördert wird. Der hohe Pfortaderdruck im BDL-Modell der Zirrhose wird hauptsächlich durch erhöhte Angiotensin (Ang) II-Spiegel verursacht, die durch Ang I erzeugt und durch ACE katalysiert werden. Der Beitrag der NEP zu einem erhöhten Pfortaderdruck wurde durch gefäßverengende Effekte von Thiorphan, dem spezifischen Inhibitor der NEP, widerlegt. Es hat sich gezeigt, dass bei BDL NEP zur Bildung von Ang-(1-7) beiträgt, einem Vasorelaxans, das bei BDL erhöht ist und den gefäßverengenden Wirkungen von ACE und Ang II entgegenwirkt.
Die Ergebnisse zeigen das folgende Szenario und die Rolle von Aß bei leberspezifischen Funktionen: In der gesunden Leber produzieren die Hepatozyten große Mengen an APP, BACE1 und PS1, was zur Bildung und Freisetzung von Aß in den extrazellulären Raum führt, in dem Aß verschiedene Aktivitäten zeigt: Es deaktiviert HSC, was durch verminderte Werte von α-SMA, Kollagen und TGF-B veranschaulicht wird. Somit wird der Ruhephänotyp der HSC in der gesunden Leber zumindest teilweise durch Aß unterstützt. Darüber hinaus induziert Aß die Synthese von NO (eNOS) durch hSEC. Somit kann Aß zur Permeabilität der Lebersinusoide durch anti-fibrogene Effekte auf die HSC und durch die Induktion von eNOS in hSEC beitragen. Die Aktivitäten von Aß und eNOS in der gesunden Leber werden wahrscheinlich durch einen hohen Gehalt an MBP unterstützt, einem Protein, das nachweislich die Wirkungen von Aß nachahmt, d.h. die Produktion von NO in Astrozyten erhöht. Weitere Aß-bezogene „Funktionsverlust“-Versuche werden durchgeführt, um den Gesamteinfluss von Aß auf die Permeabilität der Lebersinusoide zu bewerten.
Im Gegensatz dazu führt bei der Zirrhose die verminderte Expression von APP, BACE1 und PS1 zu einer Herabregulation von Aß. Bei der Zirrhose ist auch das MBP vermindert, was nicht nur zu einer Funktionsbeeinträchtigung und Schädigung der Lebernerven, sondern auch zu einer Reduktion von NO führt. Eine verminderte Produktion von Aß und NO bei Zirrhose kann zur Errichtung der Blut-Leber-Schranke beitragen. Darüber hinaus führt die Herabregulation von NEP und MBP in der zirrhotischen menschlichen Leber zu einer verminderten Clearance von Aß, die durch das Blut abgegeben wird. Tatsächlich ist Aß im Plasma von Zirrhose-Patienten hochreguliert.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass der erhöhte systemische Spiegel von Aß während einer Zirrhose durch den gestörten Leberstoffwechsel erklärt werden kann. Die Ergebnisse zeigen auch, dass ein gezieltes Konstrukt von Aß, das spezifisch an HSC bindet, allein oder in Kombination mit einem Target-IFNy und/oder Target-NO-Konstrukt ein potenzieller therapeutischer Ansatz in fortgeschrittenen Stadien der Zirrhose ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung oder der Vorbeugung einer Lebererkrankung, wobei die Verbindung ein Amyloid-beta-verwandtes Protein ist, wobei das Amyloid-beta-verwandte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amyloid-beta-Protein, einem Amyloid-beta-Peptid (Aß), das von dem Amyloid-beta-Protein abgeleitet ist, Amyloid-Vorläuferprotein (APP), einer Verbindung, die an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, oder einer Verbindung, die den Abbau des Amyloid-beta-Proteins oder der davon abgeleiteten Amyloid-Peptide hemmt.
Verbindung zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Amyloid-beta-Peptid, das von dem Amyloid-beta-Protein abgeleitet ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amyloid-beta 40, Amyloid-beta 42 und Amyloid-beta 38.
Verbindung zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung, die an der Generierung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, ein Enzym ist, das aus alpha-, beta (BACE1)-, Gammasekretasen, vorzugsweise Presenilin, ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung, die den Abbau des Amyloid-beta-Proteins oder der davon abgeleiteten Amyloidpeptide hemmt, ein Inhibitor des Enzyms Neprilysin ist.
Verbindung nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor des Enzyms Neprilysin aus Sacubitril ausgewählt ist.
Eukaryotische Zelle, die genetisch nicht modifiziert ist und Aß in geringerem Maße als Leber-Sternzellen in der Leber natürlich abbaut, zur Verwendung bei der Behandlung einer Lebererkrankung.
Eukaryotische Zelle, die genetisch modifiziert ist, zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Leberkrankheit, dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch modifizierte eukaryotische Zelle modifiziert wurde, um das Amyloid-beta-Protein und/oder davon abgeleitete Amyloid-beta-Peptide, APP, BACE1 und/oder Presenilin zu überexprimieren.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 6 oder 7, wobei die eukaryotische Zelle ausgewählt ist aus Astrozyten, iPS- (induzierte pluripotente Stammzelle) - abgeleiteten Astrozyten und somatischen Zellen, die direkt zu Astrozyten umprogrammiert wurden, genetisch modifizierten mesenchymalen Stromazellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung einer Leberkrankheit, insbesondere Leberfibrose oder Zirrhose, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Amyloid-beta-verwandtes Protein umfasst, wobei das Amyloid-beta-verwandte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Amyloid-beta-Protein oder davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptiden, dem Amyloid-Vorläuferprotein (APP), ein Enzym, das an der Bildung eines Amyloid-beta-Peptids aus APP beteiligt ist, oder einen Inhibitor des Abbaus von Amyloid-beta-Protein oder von davon abgeleiteten Amyloid-beta-Peptiden, und/oder umfassend eine genetisch modifizierte eukaryotische Zelle, die so modifiziert wurde, dass sie Amyloid-beta-Protein, APP, BACE1 und/oder Presenilin überexprimiert, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Verbindung nach Anspruch 1, die eukaryotische Zelle nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Lebererkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Leberfibrose oder Leberzirrhose, einschließlich primärer biliärer Zirrhose, nichtalkoholischer Steatohepatitis, Alkoholhepatitis, hepatozellulärem Karzinom und Virushepatitis.
Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Leberkrankheit, wobei das Verfahren den Schritt der Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder der eukaryotischen Zelle nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 an eine Person, die diese benötigt, umfasst, wodurch die Leberkrankheit behandelt oder verhindert wird.