DE102018210710A1

DE102018210710A1 - Microfluidic device and method for the detection of a target protein of a biological sample

Info

Publication number: DE102018210710A1
Application number: DE102018210710.6A
Authority: DE
Inventors: Katrin Luckert
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-01-02
Also published as: WO2020002396A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (100), insbesondere mikrofluidische Vorrichtung (100), und ein Verfahren (500) zum Nachweis eines Zielproteins (10) einer biologischen Probe umfassend eine Probenkammer(111) zur Aufnahme der biologischen Probe, einen ersten Antikörper (121) und einen zweiten Antikörper (122), wobei der erste Antikörper (121) und der zweite Antikörper (122) ausgebildet sind, an das Zielprotein (10) an unterschiedlichen Stellen zu binden und wobei der erste Antikörper (121) ein vorgegebenes erstes Nukleinsäurefragment (151) und der zweite Antikörper (122) ein vorgegebenes zweites Nukleinsäurefragment (152) aufweisen, ferner umfassend eine mit der Probenkammer (111) fluidisch verbundene Nachweiskammer (105) für einen Nachweis eines dritten Nukleinsäurefragments (153) als Nachweis des Zielproteins (10), wobei das dritte Nukleinsäurefragment (153) bei einer Bindung des ersten Nukleinsäurefragments (151) mit dem zweiten Nukleinsäurefragment (152) bei Bindung des ersten Antikörpers (121) und des zweiten Antikörpers (122) an das Zielprotein (10) unter Zugabe von Ligase (128) oder Polymerase (128) und unter Anwesenheit von ungebundenen Nukleotiden (125) in der Probe gebildet wird.The invention relates to a device (100), in particular a microfluidic device (100), and a method (500) for detecting a target protein (10) of a biological sample, comprising a sample chamber (111) for receiving the biological sample, a first antibody (121) and a second antibody (122), the first antibody (121) and the second antibody (122) being designed to bind to the target protein (10) at different locations, and wherein the first antibody (121) is a predetermined first nucleic acid fragment (151 ) and the second antibody (122) have a predetermined second nucleic acid fragment (152), further comprising a detection chamber (105) fluidly connected to the sample chamber (111) for the detection of a third nucleic acid fragment (153) as detection of the target protein (10), wherein the third nucleic acid fragment (153) when the first nucleic acid fragment (151) is bound to the second nucleic acid fragment (152) in Bindu ng of the first antibody (121) and the second antibody (122) to the target protein (10) with the addition of ligase (128) or polymerase (128) and in the presence of unbound nucleotides (125) in the sample.

Description

Stand der TechnikState of the art

Der Atem enthält über 3000 unterschiedliche Bestandteile unterschiedlicher chemischer Natur. Neben Gasen und Feuchte enthält der Atem nicht gasförmige Aerosole als Träger für nicht-gasförmige Bestandteile wie beispielsweise Proteine, Metabolite und Nukleinsäuren, welche als krankheitsspezifische Biomarker Rückschlüsse auf eine Krankheit oder einen Therapieerfolg erlauben. Gemäß dem Stand der Wissenschaft entstammen die Aerosole beziehungsweise deren Inhaltstoffe dem Lungen-auskleidenden Flüssigkeitsfilm, so dass eine Analyse der gesammelten Aerosole folglich eine nicht-invasive Analyse-Methode eröffnet.The breath contains over 3000 different components of different chemical nature. In addition to gases and moisture, the breath contains non-gaseous aerosols as carriers for non-gaseous components such as proteins, metabolites and nucleic acids, which, as disease-specific biomarkers, allow conclusions to be drawn about a disease or a successful therapy. According to the state of the art, the aerosols or their constituents originate from the liquid film lining the lungs, so that analysis of the collected aerosols consequently opens up a non-invasive analysis method.

Ein Nachweis dieser Biomarker, insbesondere der Proteine, kann dabei über eine Analyse des Atemgaskondensats erfolgen. In Gullberg und Andersson, Nature Methods 7, (2010) doi:10.1038/nmeth.f.306 ist beispielsweise ein sensitiver Protein-Nachweis in Form eines Protein-Ligation-Assays beschrieben.These biomarkers, in particular the proteins, can be detected by analyzing the breathing gas condensate. Gullberg and Andersson, Nature Methods 7, (2010) doi: 10.1038 / nmeth.f.306, for example, describe sensitive protein detection in the form of a protein ligation assay.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis eines Zielproteins in einer biologischen Probe. Die Vorrichtung umfasst eine Probenkammer zur Aufnahme der biologischen Probe sowie einen ersten Antikörper und einen zweiten Antikörper. Der erste Antikörper und der zweite Antikörper sind dabei ausgebildet, an das Zielprotein an unterschiedlichen Stellen zu binden. Ferner weist der erste Antikörper ein vorgegebenes erstes Nukleinsäurefragment und der zweite Antikörper ein vorgegebenes zweites Nukleinsäurefragment auf. Die Vorrichtung umfasst außerdem eine mit der Probenkammer fluidisch verbundene Nachweiskammer für einen Nachweis eines dritten Nukleinsäurefragments als Nachweis des Zielproteins, wobei das dritte Nukleinsäurefragment bei einer Bindung des ersten Nukleinsäurefragments mit dem zweiten Nukleinsäurefragment bei Bindung des ersten Antikörpers und des zweiten Antikörpers an das Zielprotein unter Zugabe einer Ligase oder einer Polymerase und unter Anwesenheit von ungebundenen Nukleotiden in der Probe gebildet wird.Against this background, the invention relates to a device for the detection of a target protein in a biological sample. The device comprises a sample chamber for receiving the biological sample as well as a first antibody and a second antibody. The first antibody and the second antibody are designed to bind to the target protein at different locations. Furthermore, the first antibody has a predetermined first nucleic acid fragment and the second antibody has a predetermined second nucleic acid fragment. The device also comprises a detection chamber which is fluidly connected to the sample chamber for detection of a third nucleic acid fragment as detection of the target protein, the third nucleic acid fragment when the first nucleic acid fragment is bound to the second nucleic acid fragment when the first antibody and the second antibody are bound to the target protein with addition a ligase or a polymerase and in the presence of unbound nucleotides in the sample.

Unter der Vorrichtung ist insbesondere eine mikrofluidische Vorrichtung zu verstehen, auch Lab-on-a-Chip genannt. Bei dem Zielprotein kann es sich um ein Protein einer vorgegebenen Art oder eines vorgegebenen Typs oder einer vorgegebenen Sorte handeln, insbesondere um ein Protein, dessen Vorkommen in der Probe auf eine Infektion oder Krankheit des Probengebers hinweist. Bei dem ersten Antikörper und dem zweiten Antikörper kann es sich insbesondere um zwei verschiedene Arten, Typen oder Sorten von Antikörpern handeln. Insbesondere weist der erste Antikörper eine erste Bindungsstelle und der zweite Antikörper eine zweite Bindungsstelle für die Bindung an das Zielprotein auf, wobei sich die erste Bindungsstelle von der zweiten Bindungsstelle unterscheidet, so dass der erste Antikörper und der zweite Antikörper an unterschiedlichen Stellen an das Zielprotein binden. Insbesonders ist die erste Bindungsstelle Teil des ersten Nukleinsäurefragments und die zweite Bindungsstelle Teil des zweiten Nukleinsäurefragments. Die Vorrichtung umfasst dabei vorzugsweise eine Mehrzahl der ersten Antikörper und eine Mehrzahl der zweiten Antikörper. Unter einem ersten Antikörper beziehungsweise unter einem zweiten Antikörper sind somit insbesondere eine Vielzahl von ersten Antikörpern beziehungsweise zweiten Antikörpern zu verstehen. Unter einem Nukleinsäurefragment ist insbesondere ein Teil einer Nukleinsäure, beispielsweise ein Teil einer DNA oder RNA. Unter dem ersten Nukleinsäurefragment und dem zweiten Nukleinsäurefragment sind insbesondere zwei verschiedene Nukleinsäurefragmente zu verstehen. Unter der Zugabe einer Ligase oder einer Polymerase ist insbesondere die Zugabe mehrerer Ligaseenzyme beziehungsweise Polymeraseenzyme zu verstehen.The device is to be understood in particular as a microfluidic device, also called a lab-on-a-chip. The target protein can be a protein of a specified type or of a specified type or of a specified type, in particular a protein whose occurrence in the sample indicates an infection or disease of the sampler. The first antibody and the second antibody can in particular be two different types, types or types of antibodies. In particular, the first antibody has a first binding site and the second antibody has a second binding site for binding to the target protein, the first binding site differing from the second binding site, so that the first antibody and the second antibody bind to the target protein at different sites , In particular, the first binding site is part of the first nucleic acid fragment and the second binding site is part of the second nucleic acid fragment. The device preferably comprises a plurality of the first antibodies and a plurality of the second antibodies. A first antibody or a second antibody is therefore to be understood in particular as a multiplicity of first antibodies or second antibodies. A nucleic acid fragment includes, in particular, part of a nucleic acid, for example part of a DNA or RNA. The first nucleic acid fragment and the second nucleic acid fragment are to be understood in particular as two different nucleic acid fragments. The addition of a ligase or a polymerase means in particular the addition of several ligase enzymes or polymerase enzymes.

Die Erfindung ermöglicht es vorteilhafterweise, dass ein Protein-Nachweis, insbesondere in Form eines Protein-Ligation-Assays oder eines Protein-Extension-Assays, in einer insbesondere mikrofluidischen Vorrichtung wohldefiniert und zuverlässig erfolgen kann. Ferner erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung vorteilhafterweise einen unkomplizierten Nachweis der gebildeten dritten Nukleinsäurefragmente in der Nachweiskammer. Dazu kann die Nachweiskammer beispielsweise ein Mikroarray für eine Hybridisierung der dritten Nukleinsäurefragmente an das Mikroarray aufweisen. Alternativ kann eine optische Auslese über eine optische Schnittstelle der Nachweiskammer erfolgen, insbesondere unter Zuhilfenahme einer Fluoreszenzspektroskopie. Der Erfindung ermöglicht somit vorteilhafterweise einen parallelen, insbesondere multiplexen Nachweis mehrerer Zielproteine.The invention advantageously makes it possible for protein detection, in particular in the form of a protein ligation assay or a protein extension assay, to be carried out in a well-defined and reliable manner in a particularly microfluidic device. Furthermore, the device according to the invention advantageously allows uncomplicated detection of the third nucleic acid fragments formed in the detection chamber. For this purpose, the detection chamber can have, for example, a microarray for hybridization of the third nucleic acid fragments to the microarray. Alternatively, optical readout can be carried out via an optical interface of the detection chamber, in particular with the aid of fluorescence spectroscopy. The invention thus advantageously enables parallel, in particular multiplex, detection of several target proteins.

Vorzugsweise ist die Vorrichtung, insbesondere die Nachweiskammer oder die erste Kammer, für die Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (kurz PCR) der dritten Nukleinsäurefragmente eingerichtet und umfasst dafür beispielsweise den genannten Mikroarray für einen Nachweis der über die PCR vervielfältigten dritten Nukleinsäurefragmente. Dies hat den Vorteil, dass auch sehr niedrige Konzentrationen von Zielproteinen in der Probe effektiv nachgewiesen werden können, was insbesondere bei Proteinen in einer Probe umfassend Atemgaskondensat der Fall sein kann. Die Nutzung einer solchen PCR-basierten Auslesevorrichtung hat den Vorteil der Signal-Amplifikation, das heißt wenige Bindungsvorgänge von Antikörpern und Zielprotein können durch Multipliklation einer Nukleotidsequenz (PCR) vervielfältigt werden und lassen damit vorteilhafterweise eine sehr sensitive Nachweisreaktion zu. Alternativ ist die Vorrichtung, insbesondere die Nachweiskammer oder die erste Kammer, für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR (kurz qPCR) eingerichtet und umfasst dazu die oben beschriebene optische Schnittstelle für einen optischen Nachweis der über die Echtzeit-PCR vervielfältigten dritten Nukleinsäurefragmente in Echtzeit.The device, in particular the detection chamber or the first chamber, is preferably set up to carry out a polymerase chain reaction (PCR for short) of the third nucleic acid fragments and, for this purpose, comprises, for example, the aforementioned microarray for detecting the third nucleic acid fragments reproduced via the PCR. This has the advantage that even very low concentrations of target proteins can be effectively detected in the sample, which is particularly the case with proteins in a sample comprising breathing gas condensate may be the case. The use of such a PCR-based read-out device has the advantage of signal amplification, ie few binding processes of antibodies and target protein can be multiplied by multiplication of a nucleotide sequence (PCR) and thus advantageously allow a very sensitive detection reaction. Alternatively, the device, in particular the detection chamber or the first chamber, is set up for carrying out a quantitative real-time PCR (abbreviated to qPCR) and for this purpose comprises the optical interface described above for optical detection of the third nucleic acid fragments reproduced in real time by the real-time PCR.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weist das erste Nukleinsäurefragment eine erste Nukleotidsequenz auf, welche komplementär zu einer zweiten Nukleotidsequenz des zweites Nukleinsäurefragments ist. Insbesondere sind die erste Nukleotidsequenz des ersten Nukleinsäurefragements und die zweite Nukleotidsequenz des zweiten Nukleinsäurefragements frei zugänglich, vorzugsweise indem die Nukleotidsequenzen an einem Ende des ersten beziehungsweise des zweiten Nukleinsäurefragments angeordnet sind. Dies ermöglicht es auf einfache Weise, ein Protein-Extension-Assay mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchzuführen.According to an advantageous development of the invention, the first nucleic acid fragment has a first nucleotide sequence which is complementary to a second nucleotide sequence of the second nucleic acid fragment. In particular, the first nucleotide sequence of the first nucleic acid fragment and the second nucleotide sequence of the second nucleic acid fragment are freely accessible, preferably by arranging the nucleotide sequences at one end of the first and the second nucleic acid fragment. This enables a protein extension assay to be carried out in a simple manner with the device according to the invention.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind die erste Nukleotidsequenz und die zweite Nukleotidsequenz an jeweils zwei Stellen komplementär zu zwei weiteren vorgegebenen Nukleotidsquenzen. Dies hat den Vorteil, dass mit der Vorrichtung ein Protein Ligation Assay durchgeführt werden kann, wobei die weiteren Nukleotidsequenzen in ungebundener Form zu den Antikörpern und dem Zielprotein für eine kreisförmige PCR-Amplifikation hinzugegeben werden können.According to a further advantageous development of the invention, the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence are complementary to two further predetermined nucleotide sequences at two locations each. This has the advantage that a protein ligation assay can be carried out with the device, it being possible to add the further nucleotide sequences in unbound form to the antibodies and the target protein for a circular PCR amplification.

Vorzugsweise ist der erste Antikörper in der Probenkammer oder in einer ersten Kammer der Vorrichtung immobilisiert. Darunter ist insbesondere zu verstehen, dass die ersten Antikörper an einer Festphase der Probenkammer beziehungsweise der ersten Kammer gebunden sind. Bei der Festphase kann es sich insbesondere um eine Fläche, beispielsweise eine Oberfläche eines Bodens, der Kammer oder um eine Mikrosphäre wie beispielsweise um in der Kammer vorliegende Partikel oder Beads handeln, welche für Immobilisierungen in mikrofluidischen Systemen üblicherweise eingesetzt werden, beispielsweise Dynabeads®. Bei den Partikeln oder Beads handelt es sich vorzugweise um magnetische oder magnetisierbare Partikel beziehungsweise Beads, so dass diese mit einem Magneten auf einfache Weise in einer gewünschten Kammer gehalten werden können. Durch die Immobilisierung der ersten Antikörper können vorteilhafterweise die Zielproteine über die Bindung an die ersten Antikörper ebenfalls in der ersten Kammer immobilisiert und somit an wohldefinierter Stelle gehalten werden. Dies erleichtert insbesondere eine oder mehrere Spülungen oder Waschschritte zur Entfernung unerwünschter Komponenten. Die Immobilisierung kann dabei vorzugsweise über eine kovalente Bindung der ersten Antikörper, insbesondere über eine Peptidbindung ausgebildet durch COOH-Gruppen der Festphase mit Aminogruppen der Antikörper realisiert sein. Alternativ kann eine indirekte Bindung der ersten Antikörper an die Festphase über ein Protein erfolgenin Form einer Protein-Protein-Bindung , beispielsweise über das aus der Zellwand des Bakteriums Staphylococcus aureus bekannte Protein A. Bei dem Protein kann es sich ferner ebenfalls um einen Antikörper handeln, beispielsweise um einen spezies-spezifischen Antikörper, beispielsweise isoliert aus einem Säugetier wie der Maus.The first antibody is preferably immobilized in the sample chamber or in a first chamber of the device. This means in particular that the first antibodies are bound to a solid phase of the sample chamber or the first chamber. The solid phase can in particular be a surface, for example a surface of a floor, the chamber or a microsphere such as, for example, particles or beads present in the chamber, which are usually used for immobilization in microfluidic systems, for example Dynabeads®. The particles or beads are preferably magnetic or magnetizable particles or beads, so that they can be easily held in a desired chamber with a magnet. By immobilizing the first antibodies, the target proteins can advantageously also be immobilized in the first chamber via the binding to the first antibodies and thus kept in a well-defined position. This particularly facilitates one or more rinses or washing steps to remove unwanted components. The immobilization can preferably be carried out via a covalent bond of the first antibodies, in particular via a peptide bond formed by COOH groups of the solid phase with amino groups of the antibodies. Alternatively, the first antibodies can be indirectly bound to the solid phase via a protein in the form of a protein-protein binding, for example via the protein A known from the cell wall of the bacterium Staphylococcus aureus. The protein can also be an antibody, for example a species-specific antibody, for example isolated from a mammal such as the mouse.

Der erste Antikörper kann wie ausgeführt statt in der ersten Kammer auch in der Probenkammer oder der Nachweiskammer immobilisiert vorliegen, insbesondere für eine Immobilisierung des Zielproteins am Ort des Nachweises. Mit anderen Worten ist in diesem Fall die erste Kammer mit der Probenkammer beziehungsweise der Nachweiskammer identisch, so dass der Proteinnachweis in der Probenkammer beziehungsweise in der Nachweiskammer abläuft. Alternativ ist die erste Kammer mit der Probenkammer fluidisch verbunden, um die in die Vorrichtung aufgenommenen Zielproteine gemeinsam mit der Probe in die erste Kammer zu befördern. Die erste Kammer kann in diesem Fall über die Probenkammer oder direkt mit der Nachweiskammer fluidisch verbunden sein.As stated, the first antibody can also be immobilized in the sample chamber or the detection chamber instead of in the first chamber, in particular for immobilizing the target protein at the location of the detection. In other words, in this case the first chamber is identical to the sample chamber or the detection chamber, so that the protein detection takes place in the sample chamber or in the detection chamber. Alternatively, the first chamber is fluidly connected to the sample chamber in order to convey the target proteins incorporated into the device together with the sample into the first chamber. In this case, the first chamber can be fluidly connected via the sample chamber or directly to the detection chamber.

In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist der zweite Antikörper in einer zweiten Kammer der Vorrichtung vorgelagert, beispielsweise in einer dafür eingerichteten Vorlagerungskammer. Die Vorlagerungskammer und/oder die anderen Kammern, in welchen die Antikörper vorgelagert sein können, können eine biokompatible Beschichtung für eine zuverlässige Lagerung aufweisen. Die Antikörper können dabei als Feststoff lyophilisiert oder in Lösung gelagert sein, wobei bei trockener Lagerung ein Lösen des Antikörpers mittels mikrofluidischer Ansteuerung erreicht werden kann. Vorzugsweise werden die Antikörper gemeinsam mit physiologischen Puffersalze für eine stabile Lagerung vorgelagert. Diese Weiterbildung hat den Vorteil, dass die zweiten Antikörper getrennt von den ersten Antikörpern gelagert und insbesondere erst nach einer Bindung der Zielproteine an die ersten Antikörper zugeben werden können. Somit wird eine vorzeitige Bildung der dritten Nukleinsäurefragmente verhindert.In a particularly advantageous development of the invention, the second antibody is upstream in a second chamber of the device, for example in a pre-storage chamber set up for this purpose. The storage chamber and / or the other chambers in which the antibodies can be stored can have a biocompatible coating for reliable storage. The antibodies can be lyophilized as a solid or stored in solution, and when stored dry, the antibody can be dissolved by means of microfluidic control. The antibodies are preferably stored together with physiological buffer salts for stable storage. This development has the advantage that the second antibodies can be stored separately from the first antibodies and in particular can only be added after the target proteins have bound to the first antibodies. This prevents premature formation of the third nucleic acid fragments.

In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung umfasst die Vorrichtung die ungebundenen Nukleotide sowie vorzugsweise Primer und Enzyme für die Bildung der dritten Nukleinsäurefragmente. Diese können dabei vorzugsweise ebenfalls in einer Kammer vorgelagert sein, insbesondere in der zweiten Kammer oder in einer dritten Kammer.In a particularly preferred development of the invention, the device comprises the unbound nucleotides and preferably primers and enzymes for the formation of the third nucleic acid fragments. These can preferably also be upstream in one chamber, in particular in the second chamber or in a third chamber.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung umfasst die Vorrichtung Reaktionskomponenten für die Enzym-Funktionen der Ligase und/oder der Polymerase. Bei diesen Reaktionskomponenten handelt es sich insbesondere um physiologische Puffer und Co-Faktoren sowie freie Nukleotide. Die Reaktionskomponenten können dabei vorzugsweise ebenfalls in einer Kammer, insbesondere in der zweiten oder dritten Kammer oder in einer vierten Kammer, vorgelagert sein. Die Ligase und/oder Polymerase können beispielsweise in der zweiten Kammer oder separat in einer fünften Kammer vorgelagert sein.According to a particularly advantageous development of the invention, the device comprises reaction components for the enzyme functions of the ligase and / or the polymerase. These reaction components are in particular physiological buffers and co-factors as well as free nucleotides. The reaction components can preferably also be upstream in one chamber, in particular in the second or third chamber or in a fourth chamber. The ligase and / or polymerase can be upstream, for example, in the second chamber or separately in a fifth chamber.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis eines Zielproteins einer biologischen Probe mit einer Vorrichtung, insbesondere mit einer mikrofluidischen Vorrichtung. In einem ersten Schritt des Verfahrens wird die biologische Probe in eine Probenkammer der Vorrichtung aufgenommen. In einem zweiten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Kontaktierung der Probe mit einem ersten Antikörper und mit einem zweiten Antikörper, wobei der erste Antikörper und der zweite Antikörper ausgebildet sind, an das Zielprotein an unterschiedlichen Stellen zu binden und wobei der erste Antikörper ein vorgegebenes erstes Nukleinsäurefragment und der zweite Antikörper ein vorgegebenes zweites Nukleinsäurefragment aufweisen. In einem dritten Schritt erfolgt eine Zugabe einer Ligase oder einer Polymerase, welche bei Bindung des ersten Antikörpers und des zweiten Antikörpers an das Zielprotein und unter Anwesenheit von ungebundenen Nukleotiden unter Bildung eines dritten Nukleinsäurefragments eine Bindung des ersten Nukleinsäurefragments mit dem zweiten Nukleinsäurefragment bewirkt. In einem vierten Schritt erfolgt ein Nachweis des gebildeten dritten Nukleinsäurefragments als Nachweis des Zielproteins in einer Nachweiskammer der Vorrichtung, vorzugsweise nach einer Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung des dritten Nu kleinsäu refragments.The invention also relates to a method for the detection of a target protein of a biological sample with a device, in particular with a microfluidic device. In a first step of the method, the biological sample is taken up in a sample chamber of the device. In a second step of the method, the sample is contacted with a first antibody and with a second antibody, the first antibody and the second antibody being designed to bind to the target protein at different sites and the first antibody having a predetermined first nucleic acid fragment and the second antibody has a predetermined second nucleic acid fragment. In a third step, a ligase or a polymerase is added which, when the first antibody and the second antibody bind to the target protein and in the presence of unbound nucleotides to form a third nucleic acid fragment, causes the first nucleic acid fragment to bind to the second nucleic acid fragment. In a fourth step, the third nucleic acid fragment formed is detected as a detection of the target protein in a detection chamber of the device, preferably after a polymerase chain reaction for duplicating the third nucleic acid fragment.

Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf die oben ausgeführten korrespondierenden Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwiesen.Regarding the advantages of the method according to the invention, reference is made to the corresponding advantages of the device according to the invention explained above.

Figurenlistelist of figures

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.Exemplary embodiments of the invention are shown schematically in the drawings and are explained in more detail in the description below. The same reference numerals are used for the elements shown in the various figures and acting in a similar manner, and the elements are not repeated.

Es zeigen

1 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
2a und b eine schematische Darstellung des Protein-Extension Assaya beziehungsweise Protein-Ligation-Assay im Kontext der Erfindung und
3 ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Show it

1 an embodiment of the device according to the invention,
2a and b is a schematic representation of the protein extension assaya or protein ligation assay in the context of the invention and
3 an embodiment of the method according to the invention.

Ausführungsformen der ErfindungEmbodiments of the invention

1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 in Form einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Nachweis eines oder mehrerer Zielproteine. Die Vorrichtung 100 weist eine über eine erste Öffnung 110 zugängliche Probenkammer 111 auf, welche fluidisch mit einer ersten Kammer 101 verbunden ist. Die erste Kammer 101 umfasst erste Antikörper 121, welche auf einer festen Phase 131, beispielsweise Beads 131, immobilisiert sind. Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung 100 dabei einen Magneten 140, welcher für eine Bewegung oder Fixierung der Beads 131 nahe der ersten Kammer 101 angeordnet ist. Die Bindung der ersten Antikörper 121 an die feste Phase 131 kann dabei vorzugsweise über eine kovalente Bindung der ersten Antikörper, insbesondere über COOH-Gruppen realisiert sein. Alternativ kann eine indirekte Bindung der ersten Antikörper 121 an die Festphase 131 über jeweils ein Protein 132 erfolgen, beispielsweise eine Protein-Protein-Bindung. Bei dem Protein 132 kann es sich ferner ebenfalls um einen Antikörper handeln, beispielsweise um einen spezies-spezifischen Antikörper. 1 shows an embodiment of the device according to the invention 100 in the form of a microfluidic device 100 for the detection of one or more target proteins. The device 100 has one over a first opening 110 accessible sample chamber 111 on which is fluid with a first chamber 101 connected is. The first chamber 101 includes first antibodies 121 which is on a solid phase 131 , for example beads 131 , are immobilized. The device preferably comprises 100 a magnet 140 which is used to move or fix the beads 131 near the first chamber 101 is arranged. Binding of the first antibodies 121 to the solid phase 131 can preferably be realized via a covalent bond of the first antibodies, in particular via COOH groups. Alternatively, an indirect binding of the first antibody 121 to the solid phase 131 one protein each 132 take place, for example a protein-protein binding. With the protein 132 it can also be an antibody, for example a species-specific antibody.

Die erste Kammer 101 ist fluidisch mit einer zweiten Kammer 102 der Vorrichtung 100 verbunden, wobei in der zweiten Kammer 102 zweite Antikörper 122 vorgelagert sind. Ferner umfasst die zweite Kammer 102 Primer 127, insbesondere für die Durchführung eines Protein-Ligation-Assays oder eines Protein-Extension-Assays. Eine dritte Kammer 103 der Vorrichtung 100 ist mit der zweiten Kammer 102 fluidisch verbunden und kann neben einer Ligase 128 oder Polymerase 128 Nukleotide 125 und/oder Reaktionskomponenten 129 für die Enzym-Funktionen einer Ligase und/oder einer Polymerase umfassen, insbesondere Puffer und Co-Faktoren. Alternativ können die Reaktionskomponenten auch getrennt in separaten Kammern 107, 108, 109 vorgelagert sein, um insbesonders eine stabile Lagerung zu ermöglichen und eine vorzeitige Vermischung zu verhindern. Die separaten Kammern 107, 108, 109 sind dabei beispielsweise mit der ersten Kammer 101 fluidisch verbunden und vorzugsweise über Ventile verschließbar.The first chamber 101 is fluid with a second chamber 102 the device 100 connected, being in the second chamber 102 second antibody 122 are upstream. The second chamber also comprises 102 primer 127 , in particular for performing a protein ligation assay or a protein extension assay. A third chamber 103 the device 100 is with the second chamber 102 fluidly connected and can in addition to a ligase 128 or polymerase 128 nucleotides 125 and / or reaction components 129 for the enzyme functions of a ligase and / or a polymerase include, in particular buffers and co-factors. Alternatively, the reaction components can also be separated in separate chambers 107 . 108 . 109 be upstream, in particular to enable stable storage and to prevent premature mixing. The separate chambers 107 . 108 . 109 are, for example, with the first chamber 101 fluidly connected and preferably closable via valves.

Die Vorrichtung 100 umfasst auch eine mit der ersten Kammer 101 fluidisch verbundenen Nachweiskammer 105 mit vorzugsweise einem Microarray 106 für den Nachweis von über PCR vervielfältigten Nukleotidsequenzen. Die Nachweiskammer 105 kann dabei für eine optische Auslese oder einen weiteren Zugang oder Auslass mit einer zweiten Öffnung 130 oder einer integrierten Optik 130 in die Vorrichtung 100 verbunden sein. Für eine Beförderung der an die Beads 131 gebundenen Zielproteine in die Nachweiskammer 105 kann der Magnet 140 auch beweglich zwischen der ersten Kammer 101 und der Nachweiskammer 105 angeordnet sein. Alternativ kann die Beförderung durch eine Spülung der Beads 131 in die Nachweiskammer 105 erfolgen. Ferner kann die Nachweiskammer 105 mit einer weiteren Kammer 104 zum Vorhalten von Nachweisreagenzien verbunden sein.
2a zeigt beispielhaft ein Zielprotein 10, an welches ein erster Antikörper 121 und ein zweiter Antikörper 122 an unterschiedlichen Stellen des Zielproteins 10 gebunden sind. Der erste Antikörper 121 weist ein vorgegebenes erstes Nukleinsäurefragment 151 und der zweite Antikörper 122 ein vorgegebenes zweites Nukleinsäurefragment 152 auf. Das erste Nukleinsäurefragment 151 ist dabei unter Anwesenheit von Ligase, Polymerase und Nukleotiden und unter Bildung des dritten Nukleinsäurefragments 153 mit dem zweiten Nukleinsäurefragment 152 verbunden, gemäß einem Ablauf bei einem Protein Extension Assay. In 2b ist im Unterschied zu 2a die Situation bei einem Protein Ligation Assay dargestellt, bei welchem das erste Nukleinsäurefragment 151 unter Anwesenheit von Polymerase und zwei ungebundenen Nukleotidsträngen 10, 11 und unter Bildung des dritten Nukleinsäurefragments 153 mit dem zweiten Nukleinsäurefragment 152 über die beiden ungebundenen Nukleotidstränge 10, 11 eine Bindung eingeht.The device 100 also includes one with the first chamber 101 fluidically connected detection chamber 105 with preferably a microarray 106 for the detection of nucleotide sequences amplified by PCR. The detection chamber 105 can be used for an optical readout or a further access or outlet with a second opening 130 or an integrated optic 130 into the device 100 be connected. For a transport of the beads 131 bound target proteins in the detection chamber 105 can the magnet 140 also movable between the first chamber 101 and the detection chamber 105 be arranged. Alternatively, the carriage can be carried out by rinsing the beads 131 into the detection chamber 105 respectively. Furthermore, the detection chamber 105 with another chamber 104 connected to the provision of detection reagents.
2a shows an example of a target protein 10 to which a first antibody 121 and a second antibody 122 at different locations on the target protein 10 are bound. The first antibody 121 has a predetermined first nucleic acid fragment 151 and the second antibody 122 a predetermined second nucleic acid fragment 152 on. The first nucleic acid fragment 151 is in the presence of ligase, polymerase and nucleotides and with the formation of the third nucleic acid fragment 153 with the second nucleic acid fragment 152 connected, according to a procedure in a protein extension assay. In 2 B is different from 2a the situation is shown in a protein ligation assay, in which the first nucleic acid fragment 151 in the presence of polymerase and two unbound nucleotide strands 10 . 11 and forming the third nucleic acid fragment 153 with the second nucleic acid fragment 152 over the two unbound nucleotide strands 10 . 11 binds.

3 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 500, welches beispielsweise mit dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 durchgeführt werden kann. 3 shows a flow diagram of an embodiment of the method according to the invention 500 which, for example, with the embodiment of the device according to the invention described above 100 can be carried out.

In einem ersten Schritt 501 des Verfahrens 500 wird die biologische Probe in die Probenkammer 111 der Vorrichtung 100 aufgenommen. In einem zweiten Schritt 502 erfolgt eine Kontaktierung der Probe mit einem ersten Antikörpers 121 und mit einem zweiten Antikörper 122, wobei der erste Antikörper 121 und der zweite Antikörper 122 ausgebildet sind, an das Zielprotein an unterschiedlichen Stellen zu binden und wobei der erste Antikörper 121 ein vorgegebenes erstes Nukleinsäurefragment und der zweite Antikörper 122 ein vorgegebenes zweites Nukleinsäurefragment aufweisen. Für die Bindung der Zielproteine in der Probe mit dem ersten Antikörper 121 kann die Probe zunächst in die erste Kammer 101 befördert werden, beispielsweise unter Zuhilfenahme des Magneten 140 oder üblicher mikrofluidischer Pumpen, beispielsweise Membranpumpen. Dazu können die Beads 131 mit den daran gebundenen ersten Antikörpern 121 auch in der Probenkammer 111 vorgelagert sein, um die Beförderung in die erste Kammer 101 zu erleichtern. Hierzu ist der Magnet 140 vorzugsweise zwischen der Probenkammer 111 und der ersten Kammer 101 bewegbar. Anschließend kann eine Weiterbeförderung der Probe in die zweite Kammer für eine Bindung der zweiten Antikörper 122 mit den Zielproteinen der Probe erfolgen. Alternativ können die durch die Bindung an die ersten Antikörper 121 an die Festphase, hier an die Beads, immobilisierten Zielproteine auch in der ersten Kammer 101 gehalten werden, während die zweiten Antikörper 122 über fluidische Prozesse, insbesondere durch Aktuation von Pumpen in der Vorrichtung 100 in die erste Kammer 101 für die Bindung mit den Zielproteinen befördert werden. Die Immobilisierung erleichtert ferner eine Aufreinigung oder Spülung der Zielproteine zur Entfernung unerwünschter Komponenten. In einem dritten Schritt 503 erfolgt eine Zugabe einer Ligase 128 oder einer Polymerase 128, welche bei Bindung des ersten Antikörpers 121 und des zweiten Antikörpers 122 an das Zielprotein und unter Anwesenheit von ungebundenen Nukleotiden 125 unter Bildung eines dritten Nukleinsäurefragments eine Bindung des ersten Nukleinsäurefragments mit dem zweiten Nukleinsäurefragment bewirkt. Dafür können die beispielsweise in der dritten Kammer 103 vorgelagerte Ligase 128 beziehungsweise die vorgelagerte Polymerase 128 sowie die vorgelagerten ungebundenen Nukleotide 125 gemeinsam mit den ebenfalls in der dritten Kammer vorgelagerten Reaktionskomponenten 129 aus der dritten Kammer 103 in die zweite Kammer 102 oder in die erste Kammer 101 befördert werden. Wenn die Reaktionskomponenten 129 in separaten Kammern 107, 108, 109 vorgelagert sind, können sie aus diesen Kammern herausbefördert werden. Die zweite Kammer 102 kann ferner die für Ligase-Reaktion oder für die Polymerse-Reaktion erforderlichen Primer 127 umfassen. In einem vierten Schritt 504 erfolgt ein Nachweis des gebildeten dritten Nukleinsäurefragments als Nachweis des Zielproteins in der Nachweiskammer 105 der Vorrichtung 100, vorzugsweise nach einer Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung des dritten Nukleinsäurefragments. Der Nachweis kann dabei vorzugsweise über eine Beförderung der vervielfältigten dritten Nukleinsäurefragmente in die Nachweiskammer 105 über das dort angeordnete Mikroarray 106 erfolgen.In a first step 501 of the procedure 500 the biological sample is placed in the sample chamber 111 the device 100 added. In a second step 502 the sample is contacted with a first antibody 121 and with a second antibody 122 , the first antibody 121 and the second antibody 122 are designed to bind to the target protein at different locations and being the first antibody 121 a predetermined first nucleic acid fragment and the second antibody 122 have a predetermined second nucleic acid fragment. For the binding of the target proteins in the sample with the first antibody 121 the sample can be placed in the first chamber 101 are transported, for example with the aid of the magnet 140 or conventional microfluidic pumps, for example membrane pumps. The beads 131 with the first antibodies bound to it 121 also in the sample chamber 111 be upstream to the carriage to the first chamber 101 to facilitate. This is the magnet 140 preferably between the sample chamber 111 and the first chamber 101 movable. Subsequently, the sample can be forwarded to the second chamber for binding of the second antibody 122 with the target proteins of the sample. Alternatively, by binding to the first antibody 121 on the solid phase, here on the beads, immobilized target proteins also in the first chamber 101 are held while the second antibody 122 about fluidic processes, in particular through actuation of pumps in the device 100 in the first chamber 101 are promoted for binding with the target proteins. Immobilization also facilitates purification or rinsing of the target proteins to remove unwanted components. In a third step 503 a ligase is added 128 or a polymerase 128 , which occurs when the first antibody is bound 121 and the second antibody 122 to the target protein and in the presence of unbound nucleotides 125 causing a binding of the first nucleic acid fragment with the second nucleic acid fragment to form a third nucleic acid fragment. You can do this, for example, in the third chamber 103 upstream ligase 128 or the upstream polymerase 128 as well as the upstream unbound nucleotides 125 together with the reaction components also upstream in the third chamber 129 from the third chamber 103 to the second chamber 102 or in the first chamber 101 to get promoted. If the reaction components 129 in separate chambers 107 . 108 . 109 are upstream, they can be transported out of these chambers. The second chamber 102 can furthermore be the primers required for ligase reaction or for the polymer reaction 127 include. In a fourth step 504 the third nucleic acid fragment formed is detected as detection of the target protein in the detection chamber 105 the device 100 , preferably after a polymerase chain reaction to amplify the third nucleic acid fragment. The detection can preferably be carried out by conveying the reproduced third nucleic acid fragments into the detection chamber 105 via the microarray arranged there 106 respectively.

Alternativ kann auch die Polymerase-Kettenreaktion bereits in der Nachweiskammer 105 durchgeführt werden. In einer weiteren Variante erfolgen die Vervielfältigung und der Nachweis der Zielproteine über eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion, wobei das Ergebnis der Echtzeit-PCR über die Öffnung oder Optik 130 der Nachweiskammer 105 in Echtzeit verfolgt werden kann.Alternatively, the polymerase chain reaction can already take place in the detection chamber 105 be performed. In a further variant, the duplication and the detection of the target proteins take place via a quantitative real-time polymerase chain reaction, the result of the real-time PCR via the opening or optics 130 the detection chamber 105 can be tracked in real time.

Claims

Device (100), in particular microfluidic device (100), for detecting a target protein (10) of a biological sample, comprising a sample chamber (111) for receiving the biological sample, a first antibody (121) and a second antibody (122), the the first antibody (121) and the second antibody (122) are designed to bind to the target protein (10) at different locations and the first antibody (121) is a predetermined first nucleic acid fragment (151) and the second antibody (122) is a predetermined one have a second nucleic acid fragment (152), further comprising a detection chamber (105) fluidly connected to the sample chamber (111) for detection of a third nucleic acid fragment (153) as detection of the target protein (10), the third nucleic acid fragment (153) upon binding of the first nucleic acid fragment (151) with the second nucleic acid fragment (152) upon binding of the first antibody (121) and the second An antibody (122) to the target protein (10) with the addition of ligase (128) or polymerase (128) and in the presence of unbound nucleotides (125) in the sample.

Device (100) after Claim 1 , wherein the first antibody (121) is immobilized in the sample chamber (111) or a first chamber (101) of the device (100).

Device (100) after Claim 2 , wherein the first antibody (121) is bound to a solid phase (131), in particular to magnetizable or magnetic particles (131) or beads (131).

Device (100) after Claim 3 , wherein the first antibody (121) is bound to the solid phase (131) via a protein (132), in particular via a further antibody (132).

Device (100) according to one of the Claims 2 to 4 , wherein the first chamber (101) is fluidly connected to the sample chamber (111).

Device (100) according to one of the preceding claims, wherein the first nucleic acid fragment has a first nucleotide sequence which is complementary to a second nucleotide sequence of the second nucleic acid fragment.

Device (100) according to one of the preceding claims, wherein the first nucleotide sequence and the second nucleotide sequence are complementary to two further predetermined nucleotide sequences at two locations each.

Device (100) after Claim 7 , wherein the further predetermined nucleotide sequences are upstream in a chamber (101, 111) of the device (100), in particular in the sample chamber (111) or the first chamber (101).

Device (100) according to one of the preceding claims, wherein the device (100), in particular the first chamber (101) or the detection chamber (105), is set up to carry out a polymerase chain reaction of the third nucleic acid fragments (153).

Device (100) according to one of the preceding claims, wherein the second antibody (122) is upstream in a second chamber (102) of the device (100).

Device (100) according to one of the preceding claims, wherein the device (100) comprises the unbound nucleotides (125) and preferably primers (127) and enzymes (128) for the formation of the third nucleic acid fragment (153).

Device (100) according to one of the preceding claims, wherein the device (100) comprises reaction components (129) for the enzyme functions of the ligase (128) and / or the polymerase (128).

Method (500) for the detection of a target protein (10) of a biological sample with a device (100), in particular with a microfluidic device (100), comprising the steps: • Recording (501) the biological sample in a sample chamber (111) of the device (100). • Contacting (502) the sample with a first antibody (121) and with a second antibody (122), the first antibody (121) and the second antibody (122) being formed, to the target protein (10) at different locations bind and wherein the first antibody (121) has a predetermined first nucleic acid fragment (151) and the second antibody (122) has a predetermined second nucleic acid fragment (152). • Addition (503) of a ligase (128) or a polymerase (128) which forms upon binding of the first antibody (121) and the second antibody (122) to the target protein (10) and in the presence of unbound nucleotides (125) a third nucleic acid fragment (153) binds the first nucleic acid fragment (151) to the second nucleic acid fragment (152). • Detection (504) of the third nucleic acid fragment (153) as detection of the target protein (10) in a detection chamber (105) or in the first chamber (101) of the device (100), preferably after a polymerase chain reaction to amplify the third nucleic acid fragment (153).