DE102018110072A1 - Optical arrangement for structured illumination for a light microscope and method for this purpose - Google Patents
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Abstract
Eine Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung für ein Lichtmikroskop umfasst: einen Polarisationsstrahlteiler (10), der auftreffendes Licht (2) polarisationsabhängig in Reflexionslicht (12A) und Transmissionslicht (12B) spaltet; und eine Lichtstrukturierungsvorrichtung (30), welche dem Transmissionslicht (12B) und dem Reflexionslicht (12A) voneinander verschiedene Strukturierungen aufprägt. Der Polarisationsstrahlteiler (10) ist so angeordnet, dass er das Transmissionslicht (12B) und das Reflexionslicht (12A), die sich in ihrer Strukturierung und ihrer Polarisation unterscheiden, auf einen gemeinsamen Strahlengang (55) wieder vereint. An optical arrangement for structured illumination for a light microscope comprises: a polarization beam splitter (10) which splits incident light (2) polarization-dependent into reflection light (12A) and transmission light (12B); and a light structuring device (30) which imparts structurings different from each other to the transmission light (12B) and the reflection light (12A). The polarization beam splitter (10) is arranged so that it the transmission light (12B) and the reflection light (12A), which differ in their structuring and their polarization, reunited on a common beam path (55).
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf eine Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung für ein Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The present invention relates in a first aspect to an optical arrangement for structured illumination for a light microscope according to the preamble of
In einem zweiten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung in einem Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 13.In a second aspect, the invention relates to a method for providing a structured illumination in a light microscope according to the preamble of claim 13.
Strukturierte Beleuchtungen werden in der SIM (Structured Illumination Microscopy) zur Auflösungssteigerung eingesetzt. Als Strukturierung kann auch die Lichtstrahlformung beziehungsweise die Manipulation der Punktspreizfunktion (PSF engineering), wie es beispielsweise für STED- oder RESOLFT-Mikroskopieverfahren eingesetzt wird, verstanden werden. Gleiches gilt für Änderungen des Beleuchtungslichts oder Detektionslichts, wie es für weitere Mikroskopieverfahren, wie PALM / STORM oder SOFI (Superresolution Optical Fluctuation Imaging) erfolgt.Structured illuminations are used in SIM (Structured Illumination Microscopy) to increase the resolution. As a structuring, the light beam shaping or the manipulation of the point spread function (PSF engineering), as used for example for STED or RESOLFT microscopy method can be understood. The same applies to changes in the illumination light or detection light, as it is done for other microscopy methods, such as PALM / STORM or SOFI (Super Resolutions Optical Fluctuation Imaging).
Bei der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung wird eine Probe mit Licht beleuchtet, dem eine räumliche Strukturierung aufgeprägt wurde. Beispielsweise kann die Strukturierung in der Probenebene ein Gitter oder Liniengitter darstellen, wobei auch andere Muster mit einer über den Querschnitt variierenden Lichtintensität möglich sind. Es werden mehrere Probenbilder aufgenommen, bei denen unterschiedlich strukturierte Beleuchtungen zum Einsatz kommen. Zum Beispiel können drei unterschiedlich gedrehte Beleuchtungsmuster nacheinander verwendet, wobei jeweils auch beispielsweise drei verschiedene Lichtphasen nacheinander genutzt werden. Häufig werden Bilder zu fünf unterschiedlichen Lichtphasen aufgenommen, um auch in z-Richtung eine Auflösungssteigerung zu erreichen. Die so aufgenommenen Probenbilder mit unterschiedlicher strukturierter Beleuchtung werden anschließend zu einem hochauflösenden Bild verrechnet.In microscopy with structured illumination, a sample is illuminated with light that has been given a spatial structure. For example, the structuring in the sample plane may represent a grid or line grid, although other patterns with a light intensity varying over the cross section are also possible. Several sample images are taken in which differently structured illuminations are used. For example, three differently rotated illumination patterns can be used one after the other, with three different light phases also being used in succession, for example. Frequently, images are taken at five different light phases in order to achieve an increase in resolution in the z-direction. The thus recorded sample images with different structured illumination are then calculated into a high-resolution image.
Eine gattungsgemäße Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung für ein Lichtmikroskop umfasst eine Lichtstrukturierungsvorrichtung, welche auftreffendem Licht eine Strukturierung aufprägt. Zudem umfasst die Optikanordnung einen Polarisationsstrahlteiler, der so angeordnet ist, dass auftreffendes Licht polarisationsabhängig spaltbar ist in Reflexionslicht, welches auf einem ersten Strahlengang in Richtung der Lichtstrukturierungsvorrichtung reflektiert wird, und in Transmissionslicht, das auf einen zweiten Strahlengang geleitet wird.A generic optical arrangement for structured illumination for a light microscope comprises a light structuring device which imparts structuring to incident light. In addition, the optical arrangement comprises a polarization beam splitter, which is arranged so that incident light is polarization-dependent cleavable in reflection light, which is reflected on a first beam path in the direction of the light structuring device, and in transmission light, which is passed to a second beam path.
In entsprechender Weise sind bei einem gattungsgemäßen Verfahren zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung in einem Lichtmikroskop folgende Schritte vorgesehen:
- - Leiten von polarisiertem Licht auf einen Polarisationsstrahlteiler, der das Licht polarisationsabhängig in Reflexionslicht und in Transmissionslicht spaltet, und
- - Leiten des Reflexionslichts vom Polarisationsstrahlteiler auf einem ersten Strahlengang zu einer Lichtstrukturierungsvorrichtung, welche dem Reflexionslicht eine Strukturierung aufprägt.
- - Passing polarized light on a polarization beam splitter, which splits the light polarization dependent in reflection light and in transmission light, and
- - Directing the reflection light from the polarization beam splitter on a first beam path to a Lichtstrukturierungsvorrichtung, which imparts a structuring of the reflection light.
Beim Stand der Technik werden häufig ein oder mehrere Gitter als Lichtstrukturierungsvorrichtung verwendet. Ein Gitter in einer Zwischenbildebene sorgt dafür, dass auftreffendes Licht daran gebeugt wird und als Strukturierung eine Gitterstruktur erhält. In der Probenebene wird dadurch eine Beleuchtung erzeugt, welche der Struktur des Gitters entspricht. Die durch das Gitter definierte Linienstruktur aus abwechselnd hellen und dunklen Bereichen bildet eine Modulationsrichtung, welche senkrecht zu den Beleuchtungslinien steht. Um die unterschiedlichen Orientierungen der strukturierten Beleuchtung zu erzeugen, das heißt um verschiedene Modulationsrichtungen der Beleuchtung zu erzeugen, kann das Gitter gedreht werden oder es werden nacheinander verschieden orientierte Gitter beleuchtet. Auch ist es möglich, einen Bildfelddreher zu verstellen oder in den Strahlengang einzubringen, um unterschiedliche Beleuchtungsorientierungen zu erzeugen. Bei diesen Vorgehensweisen ist der verhältnismäßig große Zeitaufwand nachteilig. Werden alternativ mehrere superponierte, unterschiedlich orientierte Gitter auf einem Substrat verwendet, ist der Verlust an Lichtleistung hoch. Denn nicht verwendete Gitterrichtungen / Beugungsordnungen müssen ausgeblendet werden, damit nur eine Gitterrichtung im Probenraum für ein möglichst gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis verwendet wird. Eine weitere bekannte Alternative sieht vor, eine optische Strahlteilung zum Erzeugen von interferierenden Strahlen vorzusehen. Die Anordnung der interferierenden Strahlen in einer Pupillenebene wird dabei so gewählt, dass sie der Fouriertransformierten des gewünschten Beleuchtungsmusters in der Probenebene entspricht. Solche Ausführungen sind jedoch verhältnismäßig kompliziert und bieten unter Umständen eine unbefriedigende Stabilität.In the prior art, one or more gratings are often used as the light structuring device. A grid in an intermediate image plane ensures that incident light is diffracted and structurally receives a grid structure. In the sample plane, this creates a lighting which corresponds to the structure of the grid. The line structure defined by the grid of alternating light and dark areas forms a modulation direction which is perpendicular to the illumination lines. In order to generate the different orientations of the structured illumination, that is to produce different modulation directions of the illumination, the grid can be rotated or differently oriented gratings are illuminated successively. It is also possible to adjust a picture field rotator or to introduce it into the beam path in order to produce different illumination orientations. In these approaches, the relatively large amount of time is disadvantageous. Alternatively, if multiple superposed, differently oriented gratings are used on a substrate, the loss of light output is high. Because unused grid directions / diffraction orders must be hidden so that only one grid direction in the sample space is used for the best possible signal-to-noise ratio. Another known alternative provides to provide an optical beam splitter for generating interfering beams. The arrangement of the interfering rays in a pupil plane is chosen so that it corresponds to the Fourier transform of the desired illumination pattern in the sample plane. However, such designs are relatively complicated and may provide unsatisfactory stability.
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, eine Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung für ein Lichtmikroskop und ein entsprechendes Verfahren anzugeben, welche verschiedene Modulationsrichtungen der Beleuchtung möglichst einfach und stabil ermöglichen.As an object of the invention can be considered to provide an optical arrangement for structured illumination for a light microscope and a corresponding method, which allow different modulation directions of the lighting as simple and stable.
Diese Aufgabe wird durch die Optikanordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 13 gelöst.This object is achieved by the optical arrangement with the features of
Vorteilhafte Varianten der erfindungsgemäßen Optikanordnung und des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung erläutert.Advantageous variants of the optical arrangement according to the invention and of the method according to the invention are the subject of the dependent claims and are also explained in the following description.
Bei der Optikanordnung der oben genannten Art ist erfindungsgemäß vorm Polarisationsstrahlteiler eine Polarisationsvorrichtung so angeordnet, dass Licht polarisiert zum Polarisationsstrahlteiler geleitet wird und dort mit einer Polarisationsrichtung auftrifft, durch welche das auftreffende Licht weder vollständig reflektiert noch vollständig transmittiert wird. Die Lichtstrukturierungsvorrichtung ist so angeordnet, dass sie vom Polarisationsstrahlteiler kommendem Transmissionslicht eine Strukturierung aufprägt, welche sich von der Strukturierung des Reflexionslichts unterscheidet. Der Polarisationsstrahlteiler ist zudem so angeordnet, dass er das Transmissionslicht und das Reflexionslicht, die sich in ihrer Strukturierung und ihrer Polarisation unterscheiden, auf einen gemeinsamen Strahlengang zusammenführt. Der gemeinsame Strahlengang kann insbesondere in Richtung einer zu untersuchenden Probe führen.In the optical arrangement of the above-mentioned type, a polarization device is arranged according to the invention in front of the polarization beam splitter such that light is conducted polarized to the polarization beam splitter and impinges there with a polarization direction by which the incident light is neither completely reflected nor completely transmitted. The light structuring device is arranged such that it imparts a structuring which differs from the structuring of the reflection light by the transmission light coming from the polarization beam splitter. The polarization beam splitter is also arranged so that it combines the transmission light and the reflection light, which differ in their structuring and their polarization, on a common beam path. The common beam path can lead in particular in the direction of a sample to be examined.
In analoger Weise ist bei dem Verfahren der oben genannten Art erfindungsgemäß die Lichtstrukturierungsvorrichtung so angeordnet, dass sie vom Polarisationsstrahlteiler kommendem Transmissionslicht eine Strukturierung aufprägt, welche sich von der Strukturierung des Reflexionslichts unterscheidet. Der Polarisationsstrahlteiler ist so angeordnet, dass er das Transmissionslicht und das Reflexionslicht, die sich in ihrer Strukturierung und ihrer Polarisation unterscheiden, auf einen gemeinsamen Strahlengang wieder vereint.In an analogous manner, in the method of the abovementioned type, the light-structuring device is arranged according to the invention such that it imparts a structuring on the transmission light coming from the polarization beam splitter, which differs from the structuring of the reflection light. The polarization beam splitter is arranged so that it combines the transmission light and the reflection light, which differ in their structuring and their polarization, on a common beam path.
Durch die Erfindung werden zwei verschiedene Modulationsrichtungen insbesondere gleichzeitig erzeugt. Beim Stand der Technik hingegen wird in einer Probenebene ein Muster, insbesondere ein Linienmuster, erzeugt, welches nur in einer Richtung eine periodisch schwankende Lichtintensität hat. Bei der Erfindung wird es ermöglicht, dass das Beleuchtungsmuster in zwei Richtungen eine periodisch schwankende Intensität haben kann, weil die beiden sich überlagernden Muster eine unterschiedliche Polarisation haben, wodurch in diesem Fall unerwünschte Interferenzen vermieden werden können. Anstelle einer gleichzeitigen Erzeugung der Muster unterschiedlicher Modulationsrichtungen kann auch ein schnell-schaltbarer Polarisationsschalter vorgesehen sein. Durch diesen kann Licht zweier verschiedener Polarisationsrichtungen nacheinander die Optikanordnung durchlaufen. Hierdurch können ebenfalls Geschwindigkeitsvorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren erreicht werden.The invention produces two different modulation directions, in particular simultaneously. In the prior art, however, a pattern, in particular a line pattern, is generated in a sample plane, which only has a periodically fluctuating light intensity in one direction. In the invention, the illumination pattern in two directions is allowed to have a periodically fluctuating intensity because the two overlapping patterns have a different polarization, in which case unwanted interference can be avoided. Instead of simultaneously generating the patterns of different modulation directions, a fast-switching polarization switch can also be provided. By this light of two different polarization directions can successively go through the optics assembly. As a result, speed advantages over conventional methods can also be achieved.
Das Transmissionslicht und das Reflexionslicht bilden jeweils ein Beleuchtungsmuster. In der Probenebene kann es sich jeweils um ein Linienmuster handeln und dementsprechend in einer Pupillenebene jeweils um ein Punktmuster. Dabei können das Transmissionslicht und das Reflexionslicht zueinander senkrecht linear polarisiert sein. Dies ist einerseits wichtig, weil die Polarisationsrichtung geeignet für die Modulationsrichtung gewählt sein sollte. Darüber hinaus sind die senkrecht zueinanderstehenden Polarisationsrichtungen auch wichtig, damit zwischen den beiden sich überlagernden Mustern keine Interferenz eintritt. Im hochfrequenten Modulationsbereich wird dadurch die Signaldynamik besser im Vergleich zu dem Fall, dass keine unterschiedlichen Polarisationsrichtungen verwendet würden.The transmission light and the reflection light each form a lighting pattern. The sample plane may be a line pattern and accordingly one pixel pattern each in a pupil plane. In this case, the transmission light and the reflection light can be mutually perpendicularly linearly polarized. On the one hand, this is important because the polarization direction should be selected appropriately for the direction of modulation. In addition, the perpendicular polarization directions are also important so that no interference occurs between the two overlapping patterns. In the high-frequency modulation range, the signal dynamics are thereby better compared to the case that no different polarization directions would be used.
Bei einer alternativen Gestaltung folgt auf den Polarisationsstrahlteiler, mit dem das Reflexionslicht und das Transmissionslicht zusammengeführt werden, ein Polarisationsfilter. Dieser kann mit seiner Polarisationsachse so angeordnet sein, dass jeweils ein Teil des Transmissions- und Reflexionslichts durchgelassen wird. Beispielsweise kann der Polarisationsfilter in einem Winkel von 45° (oder allgemeiner: 35° bis 55°) zu jeweils der Polarisationsrichtung des Reflexions- und des Transmissionslichts angeordnet sein. Insbesondere bei einer solchen Ausrichtung erreicht der Polarisationsfilter, dass eine Polarisationsrichtung des ausgehenden Lichts diagonal zu den jeweiligen durch das Transmissions- und Reflexionslicht erzeugten Mustern steht. Diese Muster können beispielsweise jeweils in einer Linie angeordnete Beleuchtungspunkte umfassen, wobei die Polarisationsrichtung auf Grund des Polarisationsfilters jeweils diagonal (45°) zu der Linie steht. Dies kann vorteilhaft sein, um eine Auflösungssteigerung durch die strukturierte Beleuchtung auch in Diagonalrichtung zu erreichen. Ansonsten würde eine Auflösungssteigerung zwar in den zwei Modulationsrichtungen erfolgen, nicht aber unbedingt in der Diagonalrichtung.In an alternative design, a polarization filter follows on the polarization beam splitter, with which the reflection light and the transmission light are brought together. This can be arranged with its polarization axis so that in each case a part of the transmission and reflection light is transmitted. For example, the polarizing filter may be disposed at an angle of 45 ° (or, more generally, 35 ° to 55 °) to each of the polarization directions of the reflection and transmission light. Particularly, in such an orientation, the polarizing filter achieves that a polarization direction of the outgoing light is diagonal to the respective patterns generated by the transmission and reflection light. By way of example, these patterns may each comprise illumination points arranged in a line, the polarization direction being in each case diagonal (45 °) to the line due to the polarization filter. This can be advantageous to achieve an increase in resolution by the structured illumination in the diagonal direction. Otherwise, an increase in resolution would indeed take place in the two modulation directions, but not necessarily in the diagonal direction.
Durch die Erfindung ist es daher nicht mehr erforderlich, Beleuchtungsmuster mit zwei verschiedenen Modulationsrichtungen nacheinander auf eine Probe zu strahlen, vielmehr kann dies gleichzeitig erfolgen. Es ist demnach kein schneller Umschalter erforderlich, um zwischen Beleuchtungen unterschiedlicher Modulationsrichtungen zu wechseln.The invention therefore no longer requires that illumination patterns having two different modulation directions be successively irradiated onto a sample; rather, this can be done simultaneously. It is therefore not a fast switch required to switch between lights of different modulation directions.
Um ein hochauflösendes Probenbild zu bestimmen, werden nun mehrere Probenbilder mit unterschiedlicher Phase des Beleuchtungsmusters aufgenommen, und diese Bilder werden sodann miteinander zu einem hochauflösenden Bild verrechnet. Es ist nicht erforderlich, verschieden orientierte Beleuchtungsmuster nacheinander zu erzeugen und in dieser Weise mehrere Probenbilder aufzunehmen. Zwar bedeutet die Verwendung von bloß zwei Modulationsrichtungen im Vergleich zu den üblicherweise drei nacheinander erzeugten Modulationsrichtungen, dass im hohen Frequenzbereich der Signal-Fourier-Raum nicht in alle Richtungen vollständig gefüllt ist; demgegenüber stehen aber die erheblichen Geschwindigkeitsvorteile, die durch die gleichzeitige Erzeugung zweier Modulationsrichtungen resultieren.In order to determine a high-resolution sample image, a plurality of sample images with different phase of the illumination pattern are now taken, and these images are then combined with one another to form a high-resolution image. It is not necessary to generate differently oriented illumination patterns one after the other and in this way to record a plurality of sample images. Although the use of only two modulation directions compared to the usually three successive modulation directions that in the high frequency range of the signal Fourier space is not completely filled in all directions; In contrast, however, there are the considerable speed advantages resulting from the simultaneous generation of two modulation directions.
Der Polarisationsstrahlteiler ist eine Vorrichtung, die auftreffendes Licht abhängig von dessen Polarisation transmittiert oder reflektiert. Insbesondere kann der Polarisationsstrahlteiler durch einen Polarisationsstrahlteilerwürfel gebildet sein.The polarization beam splitter is a device that transmits or reflects incident light depending on its polarization. In particular, the polarization beam splitter can be formed by a polarization beam splitter cube.
Der Polarisationsstrahlteiler, die Lichtstrukturierungsvorrichtung und Strahlumlenkelemente können so angeordnet sind, dass mit dem ersten und dem zweiten Strahlengang zusammen eine geschlossene Schleife gebildet wird, welche vom Transmissionslicht und vom Reflexionslicht in umgekehrter Richtung durchlaufen wird. Das Transmissionslicht trifft demnach, nachdem ihm von der Lichtstrukturierungsvorrichtung eine Struktur aufgeprägt wurde, erneut auf den Polarisationsteiler, allerdings aus derjenigen Richtung, in welche am Polarisationsstrahlteiler das Reflexionslicht abgelenkt wurde. Analog trifft das Reflexionslicht, nachdem ihm von der Lichtstrukturierungsvorrichtung eine Struktur aufgeprägt wurde, erneut auf den Polarisationsteiler, allerdings aus derjenigen Richtung, in welche am Polarisationsstrahlteiler das Transmissionslicht transmittiert wurde. Bei diesem zweiten Auftreffen wird das Transmissionslicht erneut transmittiert und das Reflexionslicht erneut reflektiert, so dass diese beiden auf einem gemeinsamen Strahlengang ausgegeben werden, insbesondere in Richtung einer Probe. Damit Transmissionslicht erneut am Polarisationsstrahlteiler transmittiert wird und Reflexionslicht erneut reflektiert wird, soll sich die Lichtpolarisation beim Durchlaufen der geschlossenen Schleife entweder nicht ändern oder nur vorübergehend ändern, so dass beim zweiten Auftreffen auf den Polarisationsstrahlteiler die Polarisation genauso ist, wie beim erstmaligen Verlassen des Polarisationsstrahlteilers.The polarization beam splitter, the light structuring device and beam deflection elements can be arranged so that together with the first and the second beam path a closed loop is formed, which is traversed by the transmission light and the reflection light in the reverse direction. Accordingly, the transmission light, after having been imparted with a structure by the light structuring device, again strikes the polarization splitter, but from the direction in which the reflection light was deflected at the polarization beam splitter. Analogously, the reflection light, after being imparted with a structure by the light structuring device, again strikes the polarization splitter, but from the direction in which the transmission light was transmitted at the polarization beam splitter. In this second impact, the transmission light is transmitted again and the reflection light is reflected again, so that these two are output on a common beam path, in particular in the direction of a sample. So that transmission light is again transmitted to the polarization beam splitter and reflection light is reflected again, the polarization of the light when passing through the closed loop should either not change or change only temporarily, so that the second impingement on the polarization beam splitter, the polarization is the same as when first leaving the polarization beam splitter.
Die Lichtstrukturierungsvorrichtung ist so gestaltet, dass auftreffendem Licht eine räumliche Struktur aufgeprägt wird. Beispielsweise kann die Lichtstrukturierungsvorrichtung ein transmissives oder reflektives Gitter als strukturiertes Element umfassen. Bei einem reflektiven Gitter kann vorgesehen sein, dass Licht schräg hierauf gestrahlt wird, so dass Eingangs- und Ausgangsrichtung zum reflektiven Gitter unterschiedlich sind; hierdurch wird eine geschlossene Schleife als Strahlengang leichter realisierbar. Alternativ kann die Lichtstrukturierungsvorrichtung auch mit einer Flüssigkristallmatrix gebildet sein, was später näher beschrieben wird.The light structuring device is designed such that a spatial structure is impressed on incident light. For example, the light structuring device may comprise a transmissive or reflective grating as a structured element. In the case of a reflective grating, provision may be made for light to be radiated obliquely thereon so that the input and output directions to the reflective grating are different; This makes it easier to realize a closed loop as a beam path. Alternatively, the light structuring device may also be formed with a liquid crystal matrix, which will be described later.
Wird beispielsweise ein Gitter als strukturiertes Element verwendet und treffen sowohl das Transmissionslicht als auch das Reflexionslicht auf das Gitter, so wird allein hierdurch noch keine unterschiedliche räumliche Strukturierung des Transmissions- und Reflexionslichts erreicht. Diese unterschiedliche Strukturierung kann mit Hilfe eines Bildrotators erreicht werden. Trifft beispielsweise das Transmissionslicht zuerst auf das Gitter und sodann auf den Bildrotator, so erzeugt das Transmissionslicht in einem Probenebene eine aufgrund des Bildrotators gedrehte Gitterstrukturbeleuchtung. Das Reflexionslicht trifft hingegen zuerst auf den Bildrotator und danach auf das Gitter. Die aufgeprägte Gitterstruktur des Reflexionslichts wird in diesem Fall nicht durch den Bildrotator beeinflusst, so dass in einer Probenebene das Reflexionslicht eine nichtgedrehte Gitterstrukturbeleuchtung erzeugt. Selbstverständlich kann auch in umgekehrterweise das Reflexionslicht zuerst auf das Gitter und dann den Bildrotator treffen, während das Transmissionslicht zuerst auf den Bildrotator und dann auf das Gitter trifft.If, for example, a grating is used as the structured element and both the transmission light and the reflection light strike the grating, this alone does not achieve a different spatial structuring of the transmission and reflection light. This different structuring can be achieved with the help of a Bildrotators. For example, if the transmission light strikes first on the grating and then on the image rotator, the transmission light in a sample plane generates a grating structure illumination rotated on the basis of the image rotator. The reflected light hits the image rotator first and then the grating. The impressed lattice structure of the reflection light is not influenced by the image rotator in this case, so that in a sample plane the reflection light produces a non-rotated lattice structure illumination. Of course, in reverse, the reflection light can first hit the grating and then the image rotator, while the transmission light strikes the image rotator first and then the grating.
Der Bildrotator kann auch als Bildfeldrotator oder -dreher bezeichnet werden. Vorzugsweise wird eine Gestaltung eines Bildrotators gewählt, welche die Lichtpolarisation nicht mitgedreht. Alternativ können auch am Bildrotator polarisationsbeeinflussende Mittel vorgesehen sein, welche eine unerwünschte Polarisationsänderung des Bildrotators kompensieren.The image rotator may also be referred to as a field rotator or rotator. Preferably, a design of an image rotator is selected, which does not rotate the Lichtpolarisation. Alternatively, polarization-influencing means, which compensate for an undesired polarization change of the image rotator, can also be provided on the image rotator.
Das strukturierte Element sollte sowohl für das Reflexionslicht als auch das Transmissionslicht in einem Fokus liegen. Allerdings ist aufgrund des Bildrotators die optische Weglänge des Strahlengangs vom Polarisationsstrahlteiler über den Bildrotator bis zum strukturierten Element geändert. Auf dem anderen Strahlengang vom Polarisationsstrahlteiler zum strukturierten Element sollte daher die optische Weglänge in gleicher Weise beeinflusst werden. Dies kann mit einem transparenten Verzögerungselement erfolgen, welches zum Beispiel ein Glasblock sein kann. Alternativ können auch die geometrischen Weglängen für die beiden Strahlengänge vom Polarisationsstrahlteiler zum strukturierten Element gerade so unterschiedlich gewählt sein, dass die optischen Weglängen gleich sind.The structured element should be in focus for both the reflection light and the transmission light. However, due to the image rotator, the optical path length of the beam path is changed from the polarization beam splitter via the image rotator to the structured element. On the other beam path from the polarization beam splitter to the structured element, therefore, the optical path length should be influenced in the same way. This can be done with a transparent retardation element, which can be for example a glass block. Alternatively, the geometrical path lengths for the two beam paths from the polarization beam splitter to the structured element can be selected just as different that the optical path lengths are the same.
Die Lichtstrukturierungsvorrichtung kann eine Gittergruppe umfassen, auf welches Transmissionslicht und Reflexionslicht aus unterschiedlichen Richtungen trifft. Insbesondere kann Transmissionslicht auf eine Vorderseite der Gittergruppe treffen und Reflexionslicht auf eine Rückseite der Gittergruppe, oder umgekehrt. Eine Gittergruppe kann ein oder mehrere Gitter umfassen, wobei bereits ein einziges Gitter genügt, um in erfindungsgemäßer Weise eine strukturierte Beleuchtung mit zwei Modulationsrichtungen bereitzustellen.The light structuring device may comprise a grating group, which is incident on transmission light and reflection light from different directions. In particular, transmission light may strike a front side of the grating group and reflect light onto a back side of the grating group, or vice versa. A grating group may comprise one or more gratings, wherein a single grating is sufficient to provide structured illumination with two modulation directions in accordance with the invention.
Es kann gewünscht sein, dass die beiden sich überlagernden Lichtmuster unterschiedlicher Modulationsrichtung eine möglichst gleiche Lichtintensität haben. Hierzu sollte vom Licht, das auf den Polarisationsstrahlteiler trifft, die Hälfte reflektiert und die Hälfte transmittiert werden. Dies kann erreicht werden, wenn die Polarisationsvorrichtung so angeordnet ist, dass eine Lichtpolarisation des von ihr ausgegebenen Lichts so steht, dass das Licht am Polarisationsstrahlteiler zu gleichen Teilen auf die beiden Strahlengänge aufgeteilt wird. Als Polarisationsvorrichtung kann prinzipiell jede optische Baugruppe verwendet werden, die (linear) polarisiertes Licht ausgibt. Dies kann ein Polarisator sein, der von auftreffendem Licht nur Licht einer bestimmten Polarisationsrichtung weiterleitet. Alternativ kann als Polarisationsvorrichtung oder Teil hiervon auch ein AOTF (acousto-optical tunable filter) eingesetzt werden. Ein AOTF umfasst ein Medium, insbesondere einen Kristall, in dem eine akustische Welle erzeugt wird, was dessen Brechkraft beeinflusst. Dadurch wird Licht einer einstellbaren Wellenlänge in Richtung einer ersten Beugungsordnung abgelenkt. Die Polarisation der ersten Beugungsordnung kann gegenüber der nullten Beugungsordnung um 90° gedreht sein. Der polarisierte Lichtanteil kann zum Polarisationsstrahlteiler weitergeleitet werden. Prinzipiell können auch ein oder mehrere Laser gleichzeitig als Lichtquelle und Polarisationsvorrichtung im Sinne der Erfindung dienen. Zusätzliche Optikkomponenten sind in diesem Fall nicht zwingend für eine Polarisationsvorrichtung erforderlich. It may be desirable for the two overlapping light patterns of different modulation directions to have the same light intensity as possible. For this purpose, half of the light which strikes the polarization beam splitter should be reflected and half transmitted. This can be achieved if the polarization device is arranged so that a light polarization of the light emitted by it is such that the light at the polarization beam splitter is equally divided between the two beam paths. In principle any optical assembly which outputs (linear) polarized light can be used as the polarization device. This can be a polarizer that only transmits light of a specific polarization direction from incident light. Alternatively, an AOTF (acousto-optical tunable filter) can also be used as polarization device or part thereof. An AOTF comprises a medium, in particular a crystal, in which an acoustic wave is generated, which influences its refractive power. As a result, light of an adjustable wavelength is deflected in the direction of a first diffraction order. The polarization of the first diffraction order can be rotated by 90 ° with respect to the zeroth diffraction order. The polarized light component can be forwarded to the polarization beam splitter. In principle, one or more lasers can simultaneously serve as light source and polarization device in the sense of the invention. Additional optical components are not necessarily required in this case for a polarizing device.
Die Lichtstrukturierungsvorrichtung kann auch mindestens eine Flüssigkristallmatrix umfassen, welche mehrere voneinander unabhängig schaltbare Flüssigkristallelemente aufweist. Die Flüssigkristallelemente können in einem zweidimensionalen Muster direkt nebeneinander angeordnet sein. Eine solche Flüssigkristallmatrix wird auch als LCoS oder LCoS-SLM bezeichnet (LCoS: Liquid Crystal on Silicon; SLM: Spatial Light Modulator). An die Flüssigkristallelemente kann jeweils eine einstellbare Spannung angelegt werden. Die Moleküle im Flüssigkristallelement verdrehen sich spannungsabhängig, so dass der optische Weg sich polarisationsabhängig ändert und sich damit auch die optische Phase ändert. Hierdurch kann eine Phase von auftreffendem Licht innerhalb eines Intervalls prinzipiell beliebig geschoben werden, beispielsweise zwischen 0 und 4π. Dabei bestimmt die Polarisationsrichtung des auftreffenden Lichts relativ zur Ausrichtung der Flüssigkristallelemente, ob eine variable Phasenänderung eingestellt werden kann oder nicht. Ist die Lichtpolarisation parallel zu einer Richtung, die nachfolgend als Wirkachse der Flüssigkristallmatrix bezeichnet wird, so kann die Lichtphase variabel verstellt werden, während Licht mit einer Lichtpolarisation senkrecht hierzu unabhängig von einem Schaltzustand der Flüssigkristallmatrix diese durchläuft, an der Rückseite reflektiert wird und wieder zurückläuft, ohne dass eine Phasenänderung variabel einstellbar wäre. Bei verschiedenen Varianten der Erfindung wird eine solche Flüssigkristallmatrix mit reflektiver Rückseite verwendet, wobei diese Ausführungen auch prinzipiell abgewandelt werden können zu einer transmissiven Flüssigkristallmatrix, die nur einmal vom Licht durchlaufen wird.The light structuring device may also include at least one liquid crystal matrix having a plurality of liquid crystal elements independently switchable. The liquid crystal elements may be arranged in a two-dimensional pattern directly next to each other. Such a liquid crystal matrix is also referred to as LCoS or LCoS-SLM (LCoS: Liquid Crystal on Silicon; SLM: Spatial Light Modulator). An adjustable voltage can be applied to each of the liquid crystal elements. The molecules in the liquid crystal element twist depending on the voltage, so that the optical path changes depending on the polarization and thus also changes the optical phase. In this way, a phase of incident light within an interval can in principle be arbitrarily shifted, for example between 0 and 4π. In this case, the polarization direction of the incident light relative to the orientation of the liquid crystal elements determines whether a variable phase change can be set or not. If the polarization of the light is parallel to a direction which is referred to below as the axis of action of the liquid crystal matrix, then the light phase can be variably adjusted, while light with a polarization perpendicular thereto, regardless of a switching state of the liquid crystal matrix, passes through the latter, is reflected at the rear and runs back again, without a phase change would be variably adjustable. In various variants of the invention, such a liquid crystal matrix having a reflective rear side is used, wherein these embodiments can also be modified in principle to form a transmissive liquid crystal matrix which is traversed only once by the light.
Durch eine Flüssigkristallmatrix kann somit bei geeigneter Lichtpolarisation eine Phase eines auftreffenden Lichtstrahls über den Strahlquerschnitt variabel eingestellt werden. Aus diesem Phasengitter soll in der Probenebene ein Amplitudengitter / eine Amplitudenvariation resultieren, welche eine strukturierte Beleuchtung aus hellen und dunklen Bereichen darstellt. Dies wird durch Ausblendung von Lichtanteilen erreicht: Das Phasengitter entspricht beispielsweise in einer Pupillenebene mehreren Beleuchtungsbereichen, von denen die äußeren nun aber nicht über die Optikkomponenten des Lichtmikroskops bis zur Probe geleitet werden. Allein ein mittiger und zwei seitliche Beleuchtungsbereiche / Beleuchtungspunkte, welche einer 0., -1. und +1. Beugungsordnung entsprechen, werden zur Probe weitergeleitet. Hierzu können die Flüssigkristallelemente so eingestellt werden, dass die Flüssigkristallmatrix eine Gitterstruktur mit einer Gitterkonstanten bildet, die so gewählt ist, dass nur Licht, das in einer Pupillenebene einer 0., -1. und +1. Beugungsordnung entspricht, bis zur Probe gelangt. Weiter außen liegende Lichtanteile werden hingegen ausgeblendet und erreichen nicht einen Probenbereich.By means of a liquid crystal matrix, a phase of an incident light beam can thus be variably adjusted via the beam cross section, given suitable polarization of the light. From this phase grating an amplitude grating / an amplitude variation should result in the sample plane, which represents a structured illumination of bright and dark areas. This is achieved by masking out light fractions: The phase grating corresponds, for example, in a pupil plane several illumination areas, of which the outer are now but not passed through the optical components of the light microscope to the sample. Only one central and two lateral illumination areas / illumination points, which is a 0., -1. and +1. Diffraction order correspond are forwarded to the sample. For this purpose, the liquid crystal elements can be adjusted so that the liquid crystal matrix forms a lattice structure with a lattice constant, which is selected so that only light which is in a pupil plane of a 0..1 -1. and +1. Diffraction order corresponds, reaches the sample. On the other hand, external light components are hidden and do not reach a sample area.
Prinzipiell ist es möglich, bei der oben beschriebenen Ausführung mit einem Gitter und einem Bildrotator das Gitter durch eine einzige Flüssigkristallmatrix zu ersetzen. Licht wird hierbei schräg auf die Flüssigkristallmatrix geleitet. Das Transmissions- oder das Reflexionslicht kann nach der Flüssigkristallmatrix auch auf den Bildrotator treffen, so dass sich die Strukturierungen vom Transmissions- und Reflexionslicht unterscheiden.In principle, it is possible to replace the grating by a single liquid crystal matrix in the embodiment described above with a grating and an image rotator. Light is directed obliquely onto the liquid crystal matrix. The transmission or the reflection light can also hit the image rotator after the liquid crystal matrix, so that the structuring differs from the transmission and reflection light.
Es kann bevorzugt sein, zwei verschiedene Flüssigkristallbereiche zu nutzen, wobei einer der beiden Flüssigkristallbereiche das Transmissionslicht beeinflusst und der andere der beiden Flüssigkristallbereiche das Reflexionslicht beeinflusst. Die beiden Flüssigkristallbereiche können zu verschiedenen Flüssigkristallmatrizen gehören. In diesem Fall können die zwei Flüssigkristallmatrizen zueinander um 90° gedrehte Wirkachsen haben, so dass die unterschiedlichen Polarisationsrichtungen des Transmissionslichts und des Reflexionslichts dazu führen, dass jeweils nur eine der beiden Flüssigkristallmatrizen variabel die Phase des auftreffenden Lichts verändert. Allerdings sind Flüssigkristallmatrizen sehr kostspielig, so dass es bevorzugt sein kann, wenn die beiden Flüssigkristallbereiche verschiedene Bereiche derselben Flüssigkristallmatrix sind. Reflexionslicht wird auf dem Strahlengang, der eine geschlossene Schleife ab dem Polarisationsstrahlteiler bildet, zunächst auf den ersten Flüssigkristallbereich und danach auf den zweiten Flüssigkristallbereich geleitet. Dabei soll das Reflexionslicht eine Polarisationsrichtung haben, durch welche die Phase des Reflexionslichts nur von einem der beiden Flüssigkristallbereiche variabel beeinflusst wird. Das Transmissionslicht wird hingegen zunächst auf den zweiten Flüssigkristallbereich und danach auf den ersten Flüssigkristallbereich geleitet, wobei es eine Polarisationsrichtung hat, durch welche die Phase des Transmissionslichts wiederum nur von dem anderen der beiden Flüssigkristallbereiche variabel beeinflusst wird. Dass das Transmissionslicht und das Reflexionslicht jeweils nur von einem der beiden Flüssigkristallbereiche variabel beeinflusst werden, kann erreicht werden, indem die Polarisationsrichtung des Transmissionslichts und des Reflexionslichts in geeigneter Weise gedreht wird, womit kein Bildrotator erforderlich ist:
- Hierzu kann ein Polarisationsdreher zum Drehen der Polarisationsrichtung von auftreffendem
Licht um 90° vorhanden und so angeordnet ist, dass er zweimal durchlaufen wird, nämlich direkt vor und direkt nach Auftreffen auf einen der beiden Flüssigkristallbereiche. Durch das zweimalige Auftreffen ist die Polarisationsrichtung schlussendlich gleich wie zuvor, allerdings ist die Polarisationsrichtung beim Auftreffen auf diesen Flüssigkristallbereich um 90° gedreht. So kann bei dieser Ausführung das Transmissionslicht zunächst auf den Polarisationsdreher, dann auf den zweiten Flüssigkristallbereich, dann auf den Polarisationsdreher und dann auf den ersten Flüssigkristallbereich treffen, während das Reflexionslicht in umgekehrter Reihenfolge auf diese Komponenten trifft. Selbstverständlich kann auch hier die Anordnung so abgewandelt werden, dass das Transmissionslicht in umgekehrter Reihenfolge die oben genannten Komponenten durchläuft, während das Reflexionslicht in der genannten Reihenfolge die Komponenten durchläuft.
- For this purpose, a polarization rotator for rotating the polarization direction of incident light by 90 ° is present and arranged so that it is traversed twice, namely directly before and directly after hitting one of the two liquid crystal regions. Due to the two-time impingement, the polarization direction is ultimately the same as before, however, the polarization direction is rotated by 90 ° when hitting this liquid crystal region. Thus, in this embodiment, the transmission light may first hit the polarization rotator, then the second liquid crystal region, then the polarization rotator, and then the first liquid crystal region, while the reflected light may encounter these components in reverse order. Of course, here too, the arrangement can be modified so that the transmission light in reverse order passes through the above components, while the reflection light in the order listed passes through the components.
Der Polarisationsdreher kann durch ein einziges λ/2-Plättchen gebildet sein oder zwei λ/2-Plättchen umfassen, von denen das eine λ/2-Plättchen vor Auftreffen auf den zweiten Flüssigkristallbereich durchlaufen wird und das andere λ/2-Plättchen nach Auftreffen auf den zweiten Flüssigkristallbereich durchlaufen wird. Die λ/2-Plättchen sind so angeordnet, dass ihre Kristallachsen parallel sind.The polarization rotator can be formed by a single λ / 2 plate or comprise two λ / 2 plates, of which one λ / 2 plate is passed before impinging on the second liquid crystal region and the other λ / 2 plate after hitting is passed through the second liquid crystal region. The λ / 2 plates are arranged so that their crystal axes are parallel.
Es kann bevorzugt sein, wenn das Transmissionslicht und das Reflexionslicht jeweils beim ersten Auftreffen auf einen der beiden Flüssigkristallbereiche unbeeinflusst bleiben und erst beim zweiten Auftreffen beeinflusst werden. Die Flüssigkristallbereiche, die Polarisationsrichtungen des Transmissions- und Reflexionslichts sowie gegebenenfalls die optische Achse des Polarisationsdrehers können entsprechend ausgerichtet sein. Dies ist für eine bessere Strahlqualität förderlich.It may be preferred if the transmission light and the reflection light each remain unaffected on the first impact with one of the two liquid crystal regions and are not influenced until the second impact. The liquid crystal regions, the polarization directions of the transmission and reflection light and optionally the optical axis of the polarization rotator can be aligned accordingly. This is conducive to better beam quality.
Mit der Flüssigkristallmatrix kann ein Beleuchtungsmuster erzeugt werden, das in der Probenebene zwei verschiedene Modulationsrichtungen gleichzeitig hat. Dadurch müssen nicht nacheinander verschiedene Probenbilder mit unterschiedlichen Modulationsrichtungen aufgenommen werden. Gleichwohl sollen mehrere Probenbilder nacheinander mit unterschiedlicher Phase aufgenommen werden. Dies kann erfolgen, indem mit der Lichtstrukturierungsvorrichtung unterschiedliche Phasenmodulationen eingestellt werden. Als ein Vorteil müssen keine Komponenten verschoben oder gekippt werden, um eine Phasenänderung zu bewirken, womit Stabilitäts- und Geschwindigkeitsvorteile erreicht werden können.With the liquid crystal matrix, a lighting pattern can be generated which has two different modulation directions in the sample plane at the same time. As a result, it is not necessary to record different sample images with different modulation directions in succession. Nevertheless, several sample images should be taken in succession with different phase. This can be done by setting different phase modulations with the light structuring device. As an advantage, no components need to be displaced or tilted to effect a phase change, which can provide stability and speed advantages.
Wird anstelle der Flüssigkristallmatrix ein Gitter als strukturiertes Element verwendet, so kann eine Phasenschiebung des Beleuchtungslichts durch eine insbesondere piezogetriebene Bewegung des Gitters / des strukturierten Elements erfolgen. Alternativ können auch eine oder mehrere Wackelplatten eingesetzt werden, welche für verschiedene Bildaufnahmen verstellt werden, beispielsweise durch Galvo-Scanner. Die mindestens eine Wackelplatte kann insbesondere in einer Zwischenbildebene angeordnet sein.If, instead of the liquid-crystal matrix, a grid is used as the structured element, then a phase shift of the illumination light can take place by means of an especially piezotriven movement of the grid / of the structured element. Alternatively, one or more wobble plates can be used, which are adjusted for different images, for example by galvo scanners. The at least one wobble plate can in particular be arranged in an intermediate image plane.
In einer Abwandlung der oben beschriebenen Ausführungen wird durch die beiden Flüssigkristallbereiche eine Amplitudenmodulation bewirkt. Ein Flüssigkristallbereich alleine kann eine Phasenschiebung und dadurch eine Polarisationsdrehung oder -änderung bewirken. Je nach Polarisationsänderung kann ein Verhältnis zwischen Reflexion und Transmission am Polarisationsstrahlteiler, der das Transmissions- und Reflexionslicht zusammenführt, variabel eingestellt werden. Der weitergenutzte Lichtanteil ist dadurch in seiner Amplitude / Intensität moduliert. Bei dieser Ausführung wird keine geschlossene Schleife als Strahlengang ab dem Polarisationsstrahlteiler gebildet. Vielmehr werden das Reflexions- und Transmissionslicht auf unterschiedliche Flüssigkristallbereiche vorzugsweise derselben Flüssigkristallmatrix geleitet und sodann auf dem jeweils selben Weg wieder zurück zum Polarisationsstrahlteiler gelenkt. Dabei können das Reflexions- und Transmissionslicht jeweils senkrecht auf die Flüssigkristallbereiche geleitet werden. Damit sie vom Polarisationsstrahlteiler auf einen gemeinsamen Strahlengang vereint werden, muss das strukturierte Transmissionslicht am Polarisationsstrahlteiler reflektiert werden und das strukturierte Reflexionslicht muss transmittiert werden. Dies kann erreicht werden, indem durch die Flüssigkristallbereiche eine Polarisationsänderung bewirkt wird. Hierbei durchlaufen das Transmissions- und Reflexionslicht zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und dem Flüssigkristallbereich jeweils einen Polarisationsdreher. Dieser kann zweimal durchlaufen werden, nämlich sowohl auf dem Hinweg zum Flüssigkristallbereich als auch auf dem Rückweg von diesem. Durch die Flüssigkristallbereiche und den Polarisationsdreher kann die Polarisationsrichtung auf dem Rückweg zum Polarisationsstrahlteiler um 90° gedreht sein. Es kann derselbe Polarisationsdreher oder unterschiedliche Polarisationsdreher für das Transmissions- und das Reflexionslicht verwendet werden. Der Polarisationsdreher kann ein λ/2-Plättchen sein, dessen optische Achse in einem Winkel von 22,5° zum Transmissions- oder Reflexionslicht und entsprechend in einem Winkel von 67,5° zum anderen des Transmissions- oder Reflexionslichts stehen kann. Eine Ausrichtung der Flüssigkristallmatrix steht in einem Winkel von 45° zur ursprünglichen Polarisationsrichtung von sowohl dem Transmissionslicht als auch dem Reflexionslicht, und in einem Winkel von 22,5° zur optischen Achse des λ/2-Plättchen. Hierdurch kann die Flüssigkristallmatrix die Polarisationsrichtung des auftreffenden Lichts drehen, insbesondere um 90°, oder zu zirkularer / elliptischer Polarisation ändern. Bei erneutem Durchgang durch das λ/2-Plättchen ist so die Polarisationsrichtung des Transmissionslichts und des Reflexionslichts gegenüber der anfänglichen Polarisation um 90° gedreht oder ist zirkulär / elliptisch polarisiert. Dadurch kann eingestellt werden, zu welchen Anteilen das Reflexions- und Transmissionslicht jeweils am zusammenführenden Polarisationsstrahlteiler reflektiert und transmittiert werden.In a modification of the embodiments described above, an amplitude modulation is effected by the two liquid crystal regions. A liquid crystal region alone may cause a phase shift and thereby a polarization rotation or change. Depending on the change in polarity, a ratio between reflection and transmission at the polarization beam splitter, which brings together the transmission and reflection light, can be variably adjusted. The further used light component is thereby modulated in its amplitude / intensity. In this embodiment, no closed loop is formed as a beam path from the polarization beam splitter. Rather, the reflection and transmission light are directed to different liquid crystal regions, preferably the same liquid crystal matrix, and then redirected back to the polarization beam splitter on the same path. In this case, the reflection and transmission light can each be directed perpendicular to the liquid crystal regions. So that they are combined by the polarization beam splitter on a common beam path, the structured transmission light on the polarization beam splitter must be reflected and the structured reflection light must be transmitted. This can be achieved by a through the liquid crystal regions Polarization change is effected. In this case, the transmission and reflection light between the polarization beam splitter and the liquid crystal region each pass through a polarization rotator. This can be run twice, namely both on the way to the liquid crystal region as well as on the way back from this. Due to the liquid crystal regions and the polarization rotator, the polarization direction can be rotated by 90 ° on the way back to the polarization beam splitter. The same polarization rotator or different polarization rotators can be used for the transmission and reflection light. The polarization rotator can be a λ / 2 plate whose optical axis can be at an angle of 22.5 ° to the transmission or reflection light and correspondingly at an angle of 67.5 ° to the other of the transmission or reflection light. Alignment of the liquid crystal array is at an angle of 45 ° to the original polarization direction of both the transmitted and reflected light, and at an angle of 22.5 ° to the optical axis of the λ / 2 plate. This allows the liquid crystal matrix to rotate the polarization direction of the incident light, in particular by 90 °, or to change to circular / elliptical polarization. On renewed passage through the λ / 2-plate so the polarization direction of the transmission light and the reflection light against the initial polarization is rotated by 90 ° or is circularly / elliptically polarized. As a result, it can be adjusted to what proportions the reflection and transmission light are respectively reflected and transmitted at the merging polarization beam splitter.
Die Flüssigkristallbereiche können in einer Pupillenebene oder einer Zwischenbildebene angeordnet sein. Bei einer Anordnung in einer Pupillenebene führt eine hier aufgeprägte Phasengitterstruktur dazu, dass das Licht in der Probenebene eine Amplitudengitterstruktur hat. Um eine gewünschte Amplitudengitterstruktur, das heißt eine gewünschte gitterförmige Intensitätsverteilung in der Probenebene, bereitzustellen, kann über einen IFTA (iterativen Fourier-Transformationsalgorithmus) ein geeignetes Phasenmuster für die Pupillenebene berechnet werden. Eine Steuereinheit kann dazu eingerichtet sein, für eine vorgegebene gewünschte Amplitudengitterstruktur über einen IFTA eine Phasengitterstruktur zu ermitteln, auf welche die Steuereinheit die Flüssigkristallmatrix sodann einstellt.The liquid crystal regions may be arranged in a pupil plane or an intermediate image plane. In an arrangement in a pupil plane, a phase grating structure impressed here leads to the light in the sample plane having an amplitude grating structure. In order to provide a desired amplitude lattice structure, that is to say a desired lattice intensity distribution in the sample plane, an appropriate phase pattern for the pupil plane can be calculated via an IFTA (iterative Fourier transformation algorithm). A control unit may be configured to determine a phase grating structure for a given desired amplitude grating structure via an IFTA, to which the control unit then adjusts the liquid crystal matrix.
Die Erfindung betrifft auch ein Lichtmikroskop mit einer Optikanordnung, die wie hier beschrieben gestaltet sein kann. Das Lichtmikroskop umfasst einen Lichtquellenanschluss. An diesen kann eine Lichtquelle angekoppelt sein, beispielsweise ein oder mehrere Laser. Der Lichtquellenanschluss ist so gestaltet, dass bei Anschluss einer Lichtquelle deren Licht den hier beschriebenen Strahlengang durchläuft. Zudem kann das Lichtmikroskop einen Detektoranschluss umfassen, an welchen ein Lichtdetektor angeschlossen sein kann. Dieser kann als räumlich auflösende Kamera gestaltet sein. Eine polarisationsabhängige Strahlaufteilung ist im Detektionsstrahlengang nicht erforderlich. Wird beispielsweise durch die strukturierte Beleuchtung eine Probe zur Fluoreszenz angeregt, so ist das nachzuweisende Fluoreszenzlicht im Wesentlichen nicht polarisiert.The invention also relates to a light microscope with an optical arrangement, which can be designed as described here. The light microscope comprises a light source connection. At this a light source can be coupled, for example, one or more lasers. The light source connection is designed so that when connecting a light source whose light passes through the beam path described here. In addition, the light microscope may include a detector terminal to which a light detector may be connected. This can be designed as a spatially resolving camera. A polarization-dependent beam splitting is not required in the detection beam path. If, for example, a sample is excited to fluorescence by the structured illumination, then the fluorescent light to be detected is essentially not polarized.
Die als zusätzlichen Optikanordnungsmerkmale beschriebenen Eigenschaften der Erfindung ergeben bei bestimmungsgemäßem Gebrauch auch Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens. Umgekehrt können die beschriebenen Komponenten der Optikanordnung auch dazu eingerichtet sein, die Verfahrensvarianten auszuführen.The properties of the invention described as additional optical arrangement features also result in variants of the method according to the invention when used as intended. Conversely, the described components of the optical arrangement can also be set up to carry out the method variants.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben. Hierin zeigen:
-
1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einem Gitter als strukturiertem Element; -
2 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einer Flüssigkristallmatrix als strukturiertem Element; und -
3 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Optikanordnung mit einer Flüssigkristallmatrix als strukturiertem Element.
-
1 a schematic representation of an embodiment of a light microscope according to the invention with a grid as a structured element; -
2 a schematic representation of an embodiment of a light microscope according to the invention with a liquid crystal matrix as a structured element; and -
3 a schematic representation of an embodiment of an optical arrangement according to the invention with a liquid crystal matrix as a structured element.
Gleiche und gleich wirkende Bestandteile sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.Identical and identically acting components are generally identified by the same reference numerals in the figures.
Eine hier nicht näher dargestellte Lichtquelle
Die Optikanordnung
Licht, das von einer Probe im Probenbereich
Beim Stand der Technik wird häufig als Beleuchtungsmuster in der Probenebene eine Liniengitterbeleuchtung erzeugt. Diese hat genau eine Modulationsrichtung, in welcher eine Lichtintensität moduliert ist. Werden nun mehrere Probenbilder aufgenommen, die sich in der Lichtphase unterscheiden, kann aus diesen Probenbildern ein Bild berechnet werden, das in der Modulationsrichtung eine erhöhte Auflösung hat. Damit nicht nur in dieser Richtung die Auflösung erhöht ist, werden üblicherweise auch mehrere Probenbilder mit anderer Modulationsrichtung des Beleuchtungsmusters aufgenommen, welche sich untereinander in der Phase unterscheiden. Beim Stand der Technik wird daher eine verhältnismäßig hohe Anzahl an Probenbildern nacheinander aufgenommen.In the prior art, a line grid illumination is often generated as a lighting pattern in the sample plane. This has exactly one modulation direction, in which a light intensity is modulated. If now several sample images are taken which differ in the light phase, an image can be calculated from these sample images, which has an increased resolution in the direction of modulation. So that not only in this direction the resolution is increased, usually also a plurality of sample images are recorded with a different modulation direction of the illumination pattern, which differ from each other in phase. In the prior art, therefore, a relatively large number of sample images are taken in succession.
Durch die Erfindung kann unter Umständen die Anzahl erforderlicher Probenbilder reduziert werden. Hierzu wird ein Beleuchtungsmuster erzeugt, das in der Probenebene nicht nur eine, sondern zwei Modulationsrichtungen hat. Nun können mehrere, beispielsweise drei oder mehr, Probenbilder unterschiedlicher Phase aufgenommen werden und zu einem hochauflösenden Bild verrechnet werden. Ein Beleuchtungsmuster mit nur einer Modulationsrichtung in der Probenebene entspricht in einer Pupillenebene einem Punktmuster, wobei die Beleuchtungspunkte in einer Linie / Geraden angeordnet sind. Erfindungsgemäß wird eine strukturierte Beleuchtung erzeugt, welche in einer Pupillenebene
Die Optikanordnung
Beleuchtungslicht 2 wird durch eine Polarisationsvorrichtung5 linear polarisiert. Im dargestellten Beispiel ist oder umfasst diePolarisationsvorrichtung 5 einen AOTF. Mit diesem kann gleichzeitig eine Beleuchtungswellenlänge ausgewählt werden.
-
illumination light 2 is through apolarizing device 5 linearly polarized. In the example shown, the polarization device is or comprises5 an AOTF. With this an illumination wavelength can be selected at the same time.
Das linear polarisierte Licht wird nun über einen Kollimator zu einem Polarisationsstrahlteiler
Das Transmissionslicht
Der Strahlengang bildet somit ab dem Polarisationsstrahlteiler
Auf dem gemeinsamen Strahlengang
Das Transmissionslicht
Das Punktmuster aus den Beleuchtungspunkten
Die Optikkomponenten
Durch den Bildrotator
Als erster Strahlengang
Fakultativ kann auf die Strahlumlenkelemente
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in
Im Beispiel von
Im dargestellten Beispiel trifft das Reflexionslicht
Nach dem zweiten Auftreffen auf die Flüssigkristallmatrix
Beim ersten Auftreffen trifft das Reflexionslicht auf einen ersten Flüssigkristallbereich
Das Transmissionslicht
Das Reflexionslicht
Die Flüssigkristallelemente des ersten und zweiten Flüssigkristallbereichs
In einer Pupillenebene
Durch die Flüssigkristallmatrix
Bei der Ausführung von
In einer Abwandlung des Beispiels von
Bei einer weiteren Abwandlung kann die dargestellte Flüssigkristallmatrix
In einer anderen Abwandlung der Ausführung von
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- 11
- Lichtquellelight source
- 22
- Beleuchtungslichtillumination light
- 55
- Polarisationsvorrichtung, AOTFPolarization device, AOTF
- 1010
- PolarisationsstrahlteilerPolarization beam splitter
- 11A11A
- erster Strahlengangfirst ray path
- 11 B11 B
- zweiter Strahlengangsecond beam path
- 12A12A
- Reflexionslichtreflection light
- 12B12B
- Transmissionslichttransmission light
- 16, 17, 1816, 17, 18
- Umlenkelementedeflecting
- 2828
- PolarisationsdreherThe rotator
- 3030
- Strukturierungsvorrichtungstructuring device
- 3535
- Flüssigkristallmatrixliquid crystal matrix
- 35A35A
- erster Bereich der Flüssigkristallmatrixfirst area of the liquid crystal matrix
- 35B35B
- zweiter Bereich der Flüssigkristallmatrixsecond region of the liquid crystal matrix
- 3939
- strukturiertes Elementstructured element
- 39A39A
- Gittergrid
- 4949
- Verzögerungselementdelay element
- 5050
- Bildrotatorimage rotator
- 5252
- strukturiertes Beleuchtungslichtstructured illumination light
- 5555
- gemeinsamer Strahlengangcommon beam path
- 6060
- Pupillenebenepupil plane
- 6161
- (Beleuchtungs-)Punktmuster(Lighting) dot pattern
- 62-6662-66
- Beleuchtungspunktelighting points
- 8080
- Optikkomponentenoptical components
- 8282
- Probenlichtsample light
- 8383
- Probenbereichsample area
- 9090
- Strahlteilerbeamsplitter
- 9595
- Detektordetector
- 100100
- Optikanordnungoptics assembly
- 110110
- Lichtmikroskoplight microscope
Claims (16)
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