DE102018102804A1

DE102018102804A1 - Detection of infections in joints

Info

Publication number: DE102018102804A1
Application number: DE102018102804.0A
Authority: DE
Inventors: Tim Patrick Kaminski
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2019-08-08
Also published as: WO2019154783A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Infektionen in Gelenken sowie eine Vorrichtung zur Durchführung eines entsprechenden Verfahrens.The present invention relates to a method for the detection of infections in joints as well as a device for carrying out a corresponding method.

Description

Infektionen in Gelenken stellen ein zunehmendes Problem dar. Insbesondere nach einem teilweisen oder vollständigen Gelenkersatz oder nach sonstigen Operationen im Bereich der entsprechenden Gelenke kann es zu einer Infektion kommen. Bei Voll- oder Teilprothesen bei Gelenken führt eine septische Infektion gegebenenfalls zu der Notwendigkeit einer Revision der Prothese. Das Risiko, dass es bei einer Operation zu einer Infektion kommt, ist umso höher, je höher das Alter des jeweiligen Patienten ist.Infections in joints are an increasing problem. In particular after a partial or complete joint replacement or after other operations in the area of the corresponding joints, an infection can occur. For full or partial prostheses in joints, septic infection may result in the need for revision of the prosthesis. The higher the age of the patient, the higher the risk of infection during surgery.

Bisher werden zum Nachweis von Infektionen Proben aus dem Gelenk entnommen beziehungsweise Abstriche vorgenommen. Die zugehörigen mikrobiologischen Testungen benötigen dann mehrere Tage.To date, samples have been taken from the joint to detect infections or smears have been made. The associated microbiological tests then take several days.

Gerade bei der Frage, ob eine Revision aufgrund eines septischen oder eines aseptischen Problems durchgeführt werden muss, ist es jedoch wünschenswert, möglichst rasch zu erfahren, ob eine Infektion vorliegt oder nicht.However, it is desirable to know as soon as possible whether an infection is present or not, especially when it comes to the question of whether a revision must be carried out because of a septic or an aseptic problem.

Im Stand der Technik sind nun Messverfahren beschrieben, in denen die Detektionsregionen an einen Biomarker anbinden und weiterhin einen Kontrollbereich vorsehen und benötigen. Die Detektion von Biomarkern ist beispielsweise in WO 2013/112216 A1 oder US 7,598,080 beschrieben.The prior art now describes measuring methods in which the detection regions bind to a biomarker and furthermore provide and require a control region. The detection of biomarkers is for example in WO 2013/112216 A1 or US 7,598,080 described.

Mit den hier offenbarten Verfahren ist eine dynamische Messung jedoch nicht möglich. Diese Nachteile aus dem Stand der Technik zu vermeiden ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung.However, with the methods disclosed herein, dynamic measurement is not possible. To avoid these disadvantages of the prior art is an object of the present invention.

Weiterhin ist es bekannt Biomarker beispielsweise mittels ELISA (Enzymelinked Immunsorbent Assay) quantitativ nachzuweisen. Entsprechende Nachweise sind jedoch zeitaufwändig und benötigen etwa 60 bis 200 Minuten. Hierbei wird zuerst der Biomarker mit einem Capturing-Antikörper in einer Microwellplatte gebunden. Die Bindungsreaktion vom Biomarker an den Antikörper ist eine Gleichgewichtsreaktion. Der zeitliche Verlauf der Reaktion wird durch folgende Gleichung beschrieben: $Y = 1 - e^{(- k_{o b s * t})}$

Furthermore, it is known to quantitatively detect biomarkers, for example by means of ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). However, such evidence is time consuming and takes about 60 to 200 minutes. Here, the biomarker is first bound with a capturing antibody in a microwell plate. The binding reaction from the biomarker to the antibody is an equilibrium reaction. The time course of the reaction is described by the following equation:

Y = 1 - e^{(- k_{O b s * t})}

Y beschreibt hierbei die Sättigung der Reaktion und k_obs die Rate dieser Reaktion. k_obs hängt wiederum von der Assoziations-(k_on), Dissoziationsrate(k_off) als auch der Konzentration des Reaktanden (hier der Biomarker, (C_BM) ab: $k_{o b s} = k_{o n} C_{B M} + k_{o f f}$

Y describes the saturation of the reaction and k _obs the rate of this reaction. k _obs in turn depends on the association (k _on ), dissociation rate (k _off ) and the concentration of the reactant (here the biomarker, (C _BM ):

k_{O b s} = k_{O n} C_{B M} + k_{O f f}

Gleichzeitig wird die Halbsättigung K_d der Reaktion bei $K_{d} = \frac{k_{o f f}}{k_{o n}}$

erreicht.At the same time, the half-saturation K _{d of} the reaction is added

K_{d} = \frac{k_{O f f}}{k_{O n}}

reached.

Die Assoziationsrate kon von typischen ELISA-Antikörpern ist sehr nahe am sogenannten Diffusionslimit von 10⁶M^-1s^-1. Möchte man jetzt eine hohe Sensitivität d.h. eine kleine K_d um noch niedrige Konzentrationen vom Biomarker nachweisen zu können bleibt einem nur die Möglichkeit die Dissoziationsrate k_off zu verringern. Damit erhöht sich aber auch die Zeit die benötigt wird, damit die Bindungsreaktion das Reaktionsgleichgewicht erreicht. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Bindungsreaktion für Antikörper mit verschieden Halbsättigungskonzentrationen. Für die Assoziationsrate wurde das Diffusionslimit von 10⁶M^-1s^-1 angenommen und eine Biomarkerkonzentration C_BM von InM.The association rate of typical ELISA antibodies is very close to the so-called diffusion limit of 10 ⁶ M ^-1 s ^-1 . If one now wants to be able to detect a high sensitivity, ie a small K _d, by still low concentrations of the biomarker, one only has the possibility of reducing the dissociation rate k _off . But this also increases the time required for the binding reaction to reach the reaction equilibrium. 1 shows the time course of the binding reaction for antibodies with different half-saturation concentrations. For the association rate, the diffusion limit of 10 ⁶ M ^-1 s ^{-1 was} assumed and a biomarker concentration C _BM of InM.

2 zeigt die Verteilung der Halbsättigungskonzentrationen von kommerziellen Antikörpern. Da man für einen ELISA in der Regel erst den Biomarker an eine Mikrotiterplatte bindet und danach den gebunden Biomarker mit einem Detektionsantikörper detektiert, ergeben sich erhebliche Inkubationszeiten bis ein ELISA durchgeführt ist. Für diagnostische Verfahren, die möglichst während einer OP durchgeführt werden sollen, um den weiteren OP-Verlauf zu entscheiden, sind solche Inkubationszeiten nicht akzeptabel. 2 shows the distribution of half saturation concentrations of commercial antibodies. Since, for an ELISA, the biomarker is usually first bound to a microtiter plate and then the bound biomarker is detected with a detection antibody, considerable incubation times are achieved until an ELISA is carried out. For diagnostic procedures that should be performed during an operation if possible, in order to decide the further course of the operation, such incubation times are not acceptable.

Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, dass die Bindung von Biomarkern an Aptamere geeignet ist, um Infektionen in Gelenken nachweisen zu können.Surprisingly, it has now been shown that the binding of biomarkers to aptamers is suitable for detecting infections in joints.

Liegt eine Infektion in einem Gelenk vor, so bilden sich in der Synovialflüssigkeit, also der in dem Gelenk vorhandenen Flüssigkeit, unterschiedliche Verbindungen, insbesondere Proteine, aus, die in der Synovialflüssigkeit ansonsten nicht oder in veränderter Konzentration vorliegen. Diese Verbindungen, deren Anwesenheit oder Konzentrationsänderung auf das Vorliegen einer Infektion hindeuten, werden in der vorliegenden Anmeldung als Biomarker bezeichnet. Die hier beschriebene Erfindung ist geeignet um zum einen das Vorhandensein eines Biomarkers größer einer bestimmten Grenzwertkonzentration zu bestimmen, als auch die Konzentration von einem oder mehreren Biomarkern zu bestimmen. Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren wie zum Beispiel ELISA zeichnet sich die Erfindung durch eine kurze Durchführungszeit aus.If there is an infection in a joint, different compounds, in particular proteins, form in the synovial fluid, ie the fluid present in the joint, which otherwise are not present in the synovial fluid or in altered concentration. These compounds, whose presence or change in concentration indicates the presence of infection, are referred to in the present application as biomarkers. The invention described herein is suitable firstly to determine the presence of a biomarker greater than a certain threshold concentration, and to determine the concentration of one or more biomarkers. Compared to conventional methods such as ELISA, the invention is characterized by a short execution time.

Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, dass diese Biomarker selektiv an Aptamere anbinden und eine Sonde mit der Kombination aus Aptamer und Biomarker in Kontakt gebracht werden kann, wobei die Sonde selektiv in die Bindung zwischen Aptamer und Biomarker anbindet. Dieses neue Verfahren ermöglicht eine rasche und dynamische Messung und damit einen raschen Nachweis von eventuell vorhandenen Infektionen. Surprisingly, it has now been shown that these biomarkers can bind selectively to aptamers and a probe can be brought into contact with the combination of aptamer and biomarker, wherein the probe binds selectively in the binding between aptamer and biomarker. This new method allows rapid and dynamic measurement and thus rapid detection of any existing infections.

In einer ersten Ausführungsform wird die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Infektionen in Gelenken von Säugetieren, umfassend

a) Bereitstellen von Synovialflüssigkeit,
b) In-Kontakt-Bringen der Synovialflüssigkeit mit wenigstens einem Aptamer, wobei an das Aptamer selektiv ein Biomarker anbindet, wobei der Biomarker bei Infektionen in Gelenken in der Synovialflüssigkeit enthalten ist, und
c) In-Kontakt-Bringen einer Sonde mit dem Aptamer zur qualitativen oder quantitativen Analyse des Biomarkers.

In a first embodiment, the object underlying the present invention is achieved by a method for the detection of infections in joints of mammals, comprising

a) providing synovial fluid,
b) contacting the synovial fluid with at least one aptamer, wherein the aptamer selectively binds a biomarker, wherein the biomarker is contained in infections in joints in the synovial fluid, and
c) contacting a probe with the aptamer for qualitative or quantitative analysis of the biomarker.

Infektionen im Sinne der vorliegenden Erfindung können alle bakteriellen oder viralen Infektionen sein. Insbesondere bakterielle Infektionen der Gelenke sind im Sinne der vorliegenden Erfindung hierunter zu verstehen.Infections within the meaning of the present invention may be all bacterial or viral infections. In particular, bacterial infections of the joints are to be understood in the sense of the present invention.

Säugetiere im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Säugetiere im biologischen Sinne. Hierzu gehören neben den entsprechenden Tieren auch Menschen. Insbesondere handelt es sich bei dem Säugetier im Sinne der vorliegenden Erfindung um Menschen.Mammals in the sense of the present invention are mammals in the biological sense. These include humans as well as animals. In particular, the mammal according to the present invention is humans.

Von Infektionen betroffene Gelenke können alle Gelenke sein, wie beispielsweise Kniegelenke, Hüftgelenke, Schultergelenke, Ellenbogen oder Sprunggelenk, unabhängig davon, ob bereits eine Teil- oder Vollprothese des Gelenks vorliegt oder nicht.Joint affected joints can be all joints, such as knee joints, hip joints, shoulder joints, elbows or ankles, regardless of whether a partial or full prosthesis of the joint already exists or not.

Aptamere sind einzelsträngige (ss) DNA-, RNA-Moleküle, 2'F-RNA, 2'-O-Me-RNA, L-RNA, L-DNA, PNA, bis-PNA, gamma-PNA, Oligopetide oder Chimere aus den vorgenannenten Bestandteilen, die aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur und der Fähigkeit zur Ausbildung von starken Wechselwirkungen Zielmoleküle mit hoher Affinität und Spezifität binden. Aptamere werden üblicherweise aus einer kombinatorischen Nukleinsäure-Bibliothek isoliert. Entsprechend können Aptamere spezifisch gegen praktisch jede Zielstruktur erhalten werden, und so auch gegen spezifische Biomarker.Aptamers are single-stranded (ss) DNA, RNA molecules, 2'F RNA, 2'-O-Me RNA, L-RNA, L-DNA, PNA, bis-PNA, gamma-PNA, oligopeptides or chimeras the above-mentioned components which, because of their three-dimensional structure and the ability to form strong interactions, bind target molecules with high affinity and specificity. Aptamers are usually isolated from a combinatorial nucleic acid library. Accordingly, aptamers can be specifically obtained against virtually any target structure, as well as against specific biomarkers.

Im Gegensatz zur zeitlichen und ökonomisch sehr aufwendigen konventionellen Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe, wie beispielsweise synthetischen Agonisten für bestimmte Rezeptoren, lassen sich Aptamere in wenigen Wochen bis Monaten erhalten. Außerdem besitzen Aptamere im Vergleich zu beispielsweise monoklonalen Antikörpern in der Regel deutlich höhere Affinitäten.In contrast to the time-consuming and economically very costly conventional development of low molecular weight drugs, such as synthetic agonists for certain receptors, aptamers can be obtained in a few weeks to months. In addition, aptamers usually have significantly higher affinities than, for example, monoclonal antibodies.

Zudem werden Aptamere in-vitro hergestellt, so dass auf die für die Antikörperentwicklung nötigen Tierversuche Abhängigkeiten von in-vivo-Bedingungen verzichtet werden kann. Ein weiterer Vorteil, der sich hieraus ergibt, ist die Chargenunabhängigkeit, da Aptamere reproduzierbar chemisch synthetisiert werden können.In addition, aptamers are produced in vitro, so that the animal experiments necessary for the antibody development can be dispensed with dependencies of in vivo conditions. Another advantage that results is batch independence, since aptamers can be reproducibly chemically synthesized.

Das in der vorliegenden Erfindung genutzte wenigstens eine Aptamer ist dabei so designt, dass es selektiv an einen Biomarker anbindet. Dieser Biomarker entsteht dabei selektiv bei Vorliegen von einer Infektion in Gelenken in der Synovialflüssigkeit oder liegt in dieser in geändert Konzentration vor.The at least one aptamer used in the present invention is designed such that it binds selectively to a biomarker. This biomarker arises selectively in the presence of an infection in joints in the synovial fluid or is present in this changed concentration.

Bringt man nun die Synovialflüssigkeit mit dem wenigstens einen Aptamer in Kontakt, so erfolgt eine Bindung zwischen dem Aptamer und dem entsprechenden Biomarker. Im Anschluss daran oder gleichzeitig wird eine Sonde mit dem Aptamer in Kontakt gebracht. Das Zusammenbringen von Sonde, Aptamer und Synovialflüssigkeit kann sowohl gleichzeitig, als auch sequentiell geschehen. Das erfindungsgemäße Verfahren basiert im Wesentlichen auf einer Verdrängungsreaktion zwischen Biomarker und Sonde.If the synovial fluid is then brought into contact with the at least one aptamer, binding takes place between the aptamer and the corresponding biomarker. Following or simultaneously a probe is contacted with the aptamer. The probe, aptamer and synovial fluid can be brought together both simultaneously and sequentially. The inventive method is based essentially on a displacement reaction between biomarker and probe.

Die Sonde ist dabei so gestaltet, dass sie selektiv an die Bindung zwischen Aptamer und Biomarker anbindet. Die Sonde ist bevorzugt so gestaltet, dass sie eine höhere Dissoziationsrate vom Aptamer besitzt als der Biomarker. Bringt man jetzt die Sonde zuerst mit dem Aptamer in Kontakt und wartet bis sich ein Gleichgewicht eingestellt hat und gibt anschließend die Probe mit dem Biomarker dazu entscheidet die Dissoziationsrate von Sonde-Aptamer über die Geschwindigkeit der Kompetitionsreaktion. Damit das so ist, muss die Sonde allerdings in einer so hohen Konzentration vorliegen, dass sie das Aptamer annähernd zu hundert Prozent sättigt. Gleiches gilt für den Biomarker.The probe is designed so that it binds selectively to the binding between aptamer and biomarker. The probe is preferably designed to have a higher dissociation rate from the aptamer than the biomarker. Now bring the probe first in contact with the aptamer and wait until it has equilibrated and then gives the sample with the biomarker to decide the dissociation rate of probe aptamer on the speed of the competition reaction. For this to be so, however, the probe must be present in such a high concentration that it saturates the aptamer approximately one hundred percent. The same applies to the biomarker.

Nach Zugabe des Biomarkers besteht für jedes Aptamer, das von der Sonde dissoziiert, die Möglichkeit von einer Sonde oder einem Biomarker gebunden zu werden. Die Wahrscheinlichkeit welche Bindung eintritt (Sonde-Aptamer vs. Sonde-Biomarker) ist vom Verhältnis von C_Sondek_on(Sonde) vs. C_Bmk_on(BM) abhängig. 3 zeigt den Reaktionsverlauf über die Zeit von der Verdrängungsreaktion und vom ELISA. Die Affinitätssonde (Aptamer oder Antikörper) haben dabei jeweils die gleiche Affinität. Dabei ist zu beachten, dass im Falle des ELISA die Reaktion zweimal durchgeführt werden muss.Upon addition of the biomarker, each aptamer that dissociates from the probe has the potential of being bound by a probe or biomarker. The likelihood of binding (probe aptamer vs. probe biomarker) is the ratio of C _probe k _{on (probe)} vs. C _Bm k _{on (BM)} dependent. 3 shows the course of the reaction over time from the displacement reaction and ELISA. The affinity probe (aptamer or antibody) each have the same affinity. It is note that in the case of the ELISA, the reaction must be carried out twice.

Dabei ist für die Verdrängungsreaktion austauschbar wer wen verdrängt: der Biomarker die Sonde oder die Sonde den Biomarker. Allerdings muss man aus der Verdrängungsreaktion noch ein nutzbares Signal generieren. Das kann dadurch geschehen, dass Sonde und Aptamer ein FRET-Signal geben, oder Sonde und Aptamer zum Beispiel an einer Oberfläche lokalisiert sind. Wenn Sonde und Aptamer aneinander gebunden sind, wird in diesem Fall die Fluoreszenz des einen gelöscht.At the same time it is interchangeable with the displacement reaction who is displaced whom: the biomarker a probe or a probe a biomarker. However, one has to generate a usable signal from the displacement reaction. This can be done by giving the probe and aptamer a FRET signal or by locating the probe and aptamer on a surface, for example. If the probe and aptamer are bound together, the fluorescence of one is deleted.

Die Geschwindigkeit der Verdrängungsreaktion ist wie bereits erwähnt auch vom Verhältnis C_Sondek_on(Sonde) vs. C_BMk_on(BM) abhängig. Führt man die gleiche Reaktion mit unterschiedlichen Verdünnungen der Biomarker enthaltenen Probe durch, kann man daraus die Konzentration des Biomarkers in der Probe berechnen. Die Analyse kann somit qualitativ oder quantitativ erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Analyse quantitativ.The speed of the displacement reaction is, as already mentioned, also the ratio C _probe k _{on (probe)} . C _BM k _{on (BM)} dependent. If one carries out the same reaction with different dilutions of the biomarker contained sample, one can calculate from it the concentration of the biomarker in the sample. The analysis can thus be qualitative or quantitative. Preferably, the analysis is quantitative.

Die quantitative Analyse hat dabei den Vorteil, dass nicht nur das Vorliegen einer Infektion an sich detektiert werden kann. Auch der Erfolg einer medikamentösen Behandlung kann so kontrolliert werden. Bei einer bakteriellen Infektion kann so der Erfolg einer antibiotischen Behandlung kontrolliert werden.The quantitative analysis has the advantage that not only the presence of an infection can be detected per se. Also, the success of a drug treatment can be controlled. In case of a bacterial infection, the success of an antibiotic treatment can be controlled.

Die Analyse kann beispielsweise mit optischen Methoden erfolgen. Dabei kann die Sonde beispielsweise an einem Ende ein fluoreszentes Molekül aufweisen. Dieses kann dann beispielsweise mittels Spektroskopie oder Mikroskopie qualitativ oder quantitativ nachgewiesen werden. Einer quantitativen Analyse ist eine Referenzkurve vonnöten, die jedoch ohne größere Probleme einmalig erstellt und dann für alle weiteren Messungen verwendet werden kann oder für jede Bestimmung neu erstellt wirdThe analysis can be done for example by optical methods. The probe may have, for example, at one end a fluorescent molecule. This can then be detected qualitatively or quantitatively, for example by means of spectroscopy or microscopy. A quantitative analysis requires a reference curve, which however can be created once without major problems and then used for all further measurements or recreated for each determination

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist somit, dass der Nachweis der Infektion über eine Sonde erfolgt, die selektiv die Bindung zwischen Aptamer und Biomarker anzeigt. D.h., nur wenn Aptamer und Biomarker aneinander binden, erfolgt eine positive Reaktion der Sonde. Weiterhin kann die Sonde auch so gestaltet sein, dass sie nur an nicht von Biomarkern gebundene Aptamere binden kann. Dies ermöglicht eine hohe Selektivität im Hinblick auf den Nachweis von Infektionen. Aufgrund der hohen Affinität der Aptamere gegenüber den entsprechenden Biomarkern weißt das erfindungsgemäße Verfahren insgesamt eine hohe Selektivität aber auch eine hohe Sensitivität auf.The advantage of the method according to the invention over methods known from the prior art is thus that the detection of the infection takes place via a probe which selectively indicates the binding between aptamer and biomarker. That is, only when aptamer and biomarker bind to each other does a positive reaction of the probe occur. Furthermore, the probe may also be designed so that it can only bind to aptamers not bound by biomarkers. This allows a high selectivity with regard to the detection of infections. Due to the high affinity of the aptamers for the corresponding biomarkers, the process according to the invention as a whole has high selectivity but also high sensitivity.

Geeignete Biomarker, welche bei Infektionen in Gelenken in der Synovialflüssigkeit auftreten und an Aptamere anbinden können, sind beispielsweise IL-1α (Interleukin 1-alpha), IL-1β (Interleukin 1-beta), IL-1ra (Interleukin 1 receptor antagonist), IL-4 (Interleukin 4), IL-5 (Interleukin 5), IL-6 (Interleukin 6), IL-8 (Interleukin 8), IL-10 (Interleukin 10), IL-17 (Interleukin 17), Defensine, ENA-78 (Epithelial cell-derived neutrophil- activating peptide 78), FGF-Basic (Fibroblast growth factor basic), G-CSF (Granulocyte colonystimulating factor), GM-CSF (Granulocyte monocyte colony- stimulating factor), IFN-g (Interferon gamma), MCP- 1 (Monocyte chemotactic protein 1), MIP-1α (Macrophage inflammatory protein 1 -alpha), MIP-1ß (Macrophage inflammatory protein 1 -beta), Rantes (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), TNF-α (Tumor necrosis factor alpha), Tpo (Thrombopoietin), VEGF (Vascular endothelial growth factor), SKALP (Skin derived antileukoproteinase), SLP-1 (Secretory leukocyte peptidase inhibitor), CRP (C -Reactive Protein), α-2M (Alpha-2-macroglobulin), LE (Leucocyte Esterase), PCT (Procalcitonin), LBP (Liposaccaride binding protein), CGRP (Calictonin gene-related peptide), insbesondere bevorzugt sind Defensine, ELA-2, BPI, NGAL, Resiston, Thrombospondin, Lactoferrin, IL-1β , IL-8, CRP, TNF-α, IL-6, HNE, a2M, VGEF, FGF2, SKALP, IP-10, LMP, Orsomucoid und Mischungen aus diesen.Suitable biomarkers which occur in infections in joints in the synovial fluid and can bind to aptamers are, for example, IL-1α (interleukin 1-alpha), IL-1β (interleukin 1-beta), IL-1ra (interleukin 1 receptor antagonist), IL-4 (interleukin 4), IL-5 (interleukin 5), IL-6 (interleukin 6), IL-8 (interleukin 8), IL-10 (interleukin 10), IL-17 (interleukin 17), defensins, ENA-78 (epithelial cell-derived neutrophil activating peptide 78), FGF-Basic (fibroblast growth factor basic), G-CSF (granulocyte colonystimulating factor), GM-CSF (granulocyte monocyte colony-stimulating factor), IFN-g ( Interferon gamma), MCP-1 (monocyte chemotactic protein 1), MIP-1α (Macrophage inflammatory protein 1 -alpha), MIP-1β (Macrophage inflammatory protein 1-beta), Rantes (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and secreted), TNF-α (tumor necrosis factor alpha), Tpo (thrombopoietin), VEGF (vascular endothelial growth factor), SKALP (skin derived antileukoproteinas e), SLP-1 (Secretory leukocyte peptidase inhibitor), CRP (C-reactive protein), α-2M (alpha-2-macroglobulin), LE (leucocyte esterase), PCT (procalcitonin), LBP (liposaccharide binding protein), CGRP (calictonin gene-related peptides), particularly preferred are defensins, ELA-2, BPI, NGAL, resiston, thrombospondin, lactoferrin, IL-1β, IL-8, CRP, TNF-α, IL-6, HNE, a2M, VGEF, FGF2, SKALP, IP-10, LMP, orsomucoid and mixtures of these.

Erfindungsgemäß kann das Verfahren umfassen, dass ein, zwei, drei oder mehr Aptamere bereit gestellt werden. Werden zwei, drei oder mehr Aptamere bereit gestellt, so können diese erfindungsgemäß alle gegen den gleichen Biomarker gerichtet sein, also den gleichen Biomarker anbinden. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass diese unterschiedliche Biomarker anbinden können, so dass hierüber eine Absicherung besteht, sollte nur ein spezifischer Biomarker vorhanden sein.According to the invention, the method may include providing one, two, three or more aptamers. If two, three or more aptamers are provided, then according to the invention they can all be directed against the same biomarker, ie bind the same biomarker. According to the invention it is also possible that these can bind different biomarkers, so that there is a hedge, should only a specific biomarker be present.

Es hat sich jedoch gezeigt, dass bei Infektionen insbesondere Defensine in der Synovialflüssigkeit vorhanden sind. Bevorzugt umfasst das Verfahren daher, das Aptamere, an welche Defensine und insbesondere α₁-Defensin selektiv anbinden bereitgestellt werden. Bevorzugt wird ein Aptamer bereitgestellt.However, it has been shown that in particular defensins are present in the synovial fluid in infections. Preferably, the method therefore comprises providing the aptamers to which defensins and in particular α ₁ -defensin are selectively attached. Preferably, an aptamer is provided.

Die genannten Biomarker treten sowohl bei Infektionen in Gelenken ohne Vorerkrankungen, aber auch in Gelenken mit einer teilweisen oder vollständigen Prothese auf. Besonders bevorzugt ist der Biomarker ausgewählt aus α-Defensinen, insbesondere ist er α₁-Defensin. Es hat sich gezeigt, dass entsprechende Defensine besonders gut an Aptamere anbinden und so eine hohe Selektivität und Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht wird.The mentioned biomarkers occur both in infections in joints without pre-existing diseases, but also in joints with a partial or complete prosthesis. The biomarker is particularly preferably selected from α-defensins, in particular it is α ₁ -defensin. It has been shown that corresponding defensins bind particularly well to aptamers and thus a high selectivity and sensitivity of the method according to the invention is made possible.

Geeignete Aptamere weisen beispielsweise Einzelstrangregionen von mindestens 4 Nukleotiden der DNS, RNS, LNS oder PNS auf. Die Nukleotide werden dabei durch die Base dfiniert. Hierbei kann es sich um Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) oder Cytosin (C) handeln. Ein geeignetes Aptamer kann aus beliebiger Kombination der Nukleotide gewonnen werden und wird so gewählt, dass es an den gewählten Biomarker bindet. Das Aptamer kann natürlich auch Einzelstrangregionen mit mehr als 4 Nukleotiden, beispielsweise 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr, insbesondere bis zu 30 Nukleotide, insbesondere 25 Nukleotide oder weniger, vorzugsweise 20 oder weniger, insbesondere 15 oder weniger aufweisen. Das Aptamer selbst kann deutliche mehr Nukleotide aufweisen, typischerweise bis zu 150. Relevant für die vorliegende Erfindung ist, dass das Apatamer eine Einzelstrangregion mit wenigstens 4 Nukleotiden aufweist. Aptamere mit einer Einzelstrangregion mit nur 3 Nukleotiden können im vorliegenden Verfahren nicht eingesetzt werden. Suitable aptamers have, for example, single-stranded regions of at least 4 nucleotides of DNA, RNA, LNS or PNS. The nucleotides are thereby dfiniert by the base. These may be adenine (A), guanine (G), thymine (T) or cytosine (C). A suitable aptamer can be obtained from any combination of nucleotides and is chosen to bind to the selected biomarker. The aptamer can of course also single-stranded regions with more than 4 nucleotides, for example, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more, in particular up to 30 nucleotides, in particular 25 nucleotides or less, preferably 20 or less, in particular 15 or less. The aptamer itself may have significantly more nucleotides, typically up to 150. What is relevant to the present invention is that the apatamer has a single stranded region of at least 4 nucleotides. Aptamers with a single stranded region of only 3 nucleotides can not be used in the present process.

PNS ist eine Peptidnukleinsäure und stellt ein Analogon der Nukleinsäuren RNS und DNS dar, in welchem das Zucker-Phosphat-Rückgrat durch ein Pseudopeptid ersetzt ist. Das Rückgrat besteht bei PNS oft aus Aminoethylglycin-Einheiten, die über neutrale Amid-Bindungen miteinander Verbunden sind. Bei der DNS (Desoxyribionukleinsäure) und der RNS (Ribonukleinsäure) besteht das Rückgrat aus Phospohat-(desoxy)ribose-Bausteinen. Es ist also geladen, während das Rückrad der PNS neutral nicht geladen ist. Dies kann bei der Wahl der Aptamere von Vorteil sein. LNS oder LNA (engl. locked nucleic acid) ist ein modifiziertes RNA-Nukleotid. Die Ribose-Einheit von einem LNA Nukleotid ist mit einer zusätzlichen Brücke zwischen dem 2'-Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff verknüpft.PNS is a peptide nucleic acid and is an analog of the nucleic acids RNA and DNA in which the sugar-phosphate backbone is replaced by a pseudopeptide. The backbone of PNA often consists of aminoethylglycine units linked by neutral amide bonds. In DNA (deoxyribionucleic acid) and RNA (ribonucleic acid), the backbone consists of phosphosate (deoxy) ribose building blocks. So it's loaded while the back wheel of the PNS is not charged neutral. This can be advantageous in the choice of aptamers. LNS or LNA (locked nucleic acid) is a modified RNA nucleotide. The ribose unit of one LNA nucleotide is linked to an additional bridge between the 2'-oxygen and 4'-carbon.

Ein häufig vorkommendes Strukturmotiv von nukleotidbasierten Aptameren sind sogenannte G-quadruplexe. Diese sind häufig wichtig für die Bindung des Aptamers an das Zielprotein. Oligonukleotide die komplementär zur G-quadruplex Sequenz sind, können mit diesem Strukturmotiv inteferrieren und somit mit der Bindung an das Zielprotein kompetieren.A common structural motif of nucleotide-based aptamers are so-called G-quadruplexes. These are often important for the binding of the aptamer to the target protein. Oligonucleotides which are complementary to the G-quadruplex sequence can integrate with this structural motif and thus compete with the binding to the target protein.

Geeignete Sonden sind so gewählt, dass sie besonders gut an die Bindung zwischen Aptamer und Biomarker, insbesondere zwischen Aptamer und α-Defensin binden.Suitable probes are chosen so that they bind particularly well to the binding between aptamer and biomarker, in particular between aptamer and α-defensin.

Erfindungsgemäß kann die Synovialflüssigkeit unmittelbar mit dem Aptamer in Kontakt gebracht werden. Es ist erfindungsgemäß jedoch auch möglich, dass die Synovialflüssigkeit zunächst mit einer anderen Flüssigkeit, wie beispielsweise einem Puffer, verdünnt wird und die dann verdünnte Synovialflüssigkeit mit dem Aptamer in Kontakt gebracht wird. Geeignete Puffer sind vorzugsweise Goods-Puffer ( Good, Norman E.; Winget, G. Douglas; Winter, Wilhelmina; Connolly, Thomas N.; Izawa, Seikichi; Singh, Raizada M. M. (1966 ). „Hydrogen Ion Buffers for Biological Research“. Biochemistry. 5 (2): 467-477.) Weiterhin können den Puffern Inhibitoren für Nukleasen, als auch Peptidasen zugesetzt sein.According to the invention, the synovial fluid can be brought into direct contact with the aptamer. However, it is also possible according to the invention that the synovial fluid is first diluted with another fluid, such as a buffer, and the then diluted synovial fluid is brought into contact with the aptamer. Suitable buffers are preferably goods buffers ( Good, Norman E .; Winget, G. Douglas; Winter, Wilhelmina; Connolly, Thomas N .; Izawa, Seikichi; Singh, Raizada MM (1966 ). "Hydrogen Ion Buffers for Biological Research". Biochemistry. 5 (2): 467-477.) Furthermore, inhibitors of nucleases, as well as peptidases may be added to the buffers.

In der Synovialflüssigkeit sind neben den zuvor beschriebenen Biomarkern auch andere Proteine und Inhaltsstoffe enthalten. Ein dominierender Bestandteil der Synovialflüssigkeit ist beispielsweise Hyaluronsäure. Weder die Hyaluronsäure noch andere Bestandteile der Synovialflüssigkeit wirken sich jedoch nachteilig auf das erfindungsgemäße Verfahren aus. Auch hierfür ist die hohe Affinität der Aptamere gegenüber dem Zielmolekül, also vorliegend den Biomarkern, verantwortlich. Genau dies unterscheidet auch das erfindungsgemäße Verfahren von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren.In the synovial fluid, other proteins and ingredients are included in addition to the biomarkers described above. A dominant component of the synovial fluid is, for example, hyaluronic acid. However, neither the hyaluronic acid nor other constituents of the synovial fluid have a disadvantageous effect on the method according to the invention. Again, the high affinity of the aptamers over the target molecule, in this case the biomarkers, responsible. This is exactly what distinguishes the method according to the invention from methods known from the prior art.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei wird auf einem Träger wenigstens ein Aptamer oder die Sonde bereitgestellt. Anschließend wird die Synovialflüssigkeit mit dem Träger in Kontakt gebracht. Zudem wird die Sonde auf den Träger aufgebracht. Sonde, Biomarker und Aptamer können auch so gestaltet sein, dass sie nicht auf einen Träger aufgebracht werden müssen.In a further embodiment, the present invention relates to a device for carrying out a method according to the invention. At least one aptamer or the probe is provided on a support. Subsequently, the synovial fluid is brought into contact with the carrier. In addition, the probe is applied to the carrier. Probe, biomarker and aptamer may also be designed so that they do not need to be applied to a support.

Der Träger kann dabei ein fester, saugfähiger Träger sein, wie beispielsweise ein Papier oder Celluloseträger. Der Träger kann jedoch auch eine Mikrotiterplatte sein, die dann spektroskopische analysiert wird. Bevorzugt ist der Träger transparent. Daher kann zu Beginn nicht nur das Aptamer auf dem Träger aufgebracht sein, sondern auch die Sonde. Die Sonde bindet dabei erst an das Aptamer, sobald eine Bindung zu dem gewünschten Biomarker besteht. Weiterhin kann die Sonde auch so gestaltet sein, dass sie nur Aptamere bindet, die nicht an einen Biomarker gebunden sind.The carrier can be a solid, absorbent carrier, such as a paper or cellulose carrier. However, the carrier may also be a microtiter plate, which is then analyzed spectroscopically. Preferably, the carrier is transparent. Therefore, not only the aptamer can be applied to the carrier at the beginning, but also the probe. The probe first binds to the aptamer as soon as it binds to the desired biomarker. Furthermore, the probe may also be designed to bind only aptamers that are not bound to a biomarker.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin umfassen, dass nach dem In-Kontakt-Bringen der Synovialflüssigkeit mit dem Träger ein Spül- oder Waschschritt erfolgt. Hierbei wird dann überschüssige Synovialflüssigkeit vom Träger entfernt. Auch nach dem Aufbringen der Sonde auf den Träger kann ein Spül- oder Waschschritt vorgesehen sein, um überschüssige Sonde zu entfernen.The inventive method may further comprise that after contacting the synovial fluid with the carrier, a rinsing or washing step takes place. In this case, excess synovial fluid is removed from the carrier. Also, after applying the probe to the carrier, a rinsing or washing step may be provided to remove excess probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit den Nachweis von Infektionen in Gelenken, ohne dass langwierige Analysen notwendig sind. Immunoassays, wie beispielsweise ELISA oder andere, werden hierdurch entbehrlich. Kontrollregionen, wie in WO 2013/112216 A1 benötigt werden, entfallen erfindungsgemäß. Auch die im Stand der Technik beschriebenen Aggrecane sind vorliegend nicht relevant. Nimmt man Aggrecans als Standard, kann ein verfälschtes Ergebnis vorliegen, da Aggrecanasen bei Entzündungsreaktionen vermehrt in die Synovialflüssigkeit sezerniert wird.The method according to the invention thus makes it possible to detect infections in joints, without lengthy analyzes being necessary. Immunoassays, such as ELISA or others, are thereby dispensable. Control regions, as in WO 2013/112216 A1 be needed omitted according to the invention. Also, the aggrecans described in the prior art are not relevant in the present case. Taking aggrecan as a standard, there may be a falsified result, since aggrecanases in inflammatory reactions is increasingly secreted into the synovial fluid.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2013/112216 A1 [0005, 0044]
US 7598080 [0005]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Good, Norman E .; Winget, G. Douglas; Winter, Wilhelmina; Connolly, Thomas N .; Izawa, Seikichi; Singh, Raizada M.M. (1966)

Claims

A method for the detection of infections in joints of mammals, comprising a) providing synovial fluid, b) contacting the synovial fluid with at least one aptamer, wherein the aptamer selectively binds a biomarker, wherein the biomarker is contained in infections in joints in the synovial fluid, and c) contacting a probe with the aptamer for qualitative or quantitative analysis of the biomarker.

Method according to Claim 1 , characterized in that the analysis in step c) is quantitative.

Method according to Claim 1 or 2 characterized in that the biomarker is selected from defensins, ELA-2, BPI, NGAL, resiston, thrombospondin, lactoferrin, IL-1β, IL-8, CRP, TNFα, IL-6, HNE, α2M, VGEF, FGF2, SKALP, IP-10, LMP, orsomucoid and mixtures of these.

Method according to one of Claims 1 to 3 , characterized in that the biomarker is selected from α-defensins, in particular α ₁ -defensin.

Method according to one of Claims 1 to 4 , characterized in that the aptamer is a single-stranded region of DNA, RNA, LNS or PNS of at least 4 nucleotides.

Method according to one of Claims 1 to 5 , characterized in that the aptamer contains a G-quadruplex.

Apparatus for carrying out a method according to one of Claims 1 to 6 comprising a support on which at least one aptamer is provided and contacted with the synovial fluid and subsequently with the probe.

Device after Claim 7 , characterized in that the carrier is a microtiter plate or a solid, absorbent carrier.