DE102018100844A1

DE102018100844A1 - A method of freezing a sample cell containing biological cells and / or tissue

Info

Publication number: DE102018100844A1
Application number: DE102018100844.9A
Authority: DE
Inventors: Tim Rittinghaus; Birgit Glasmacher; Marc Müller
Original assignee: Leibniz Universitaet Hannover
Current assignee: Leibniz Universitaet Hannover
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2019-07-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren einer biologische Zellen und/oder Gewebe, insbesondere einen Blutbestandteil, enthaltenden Probenflüssigkeit (10), mit den Schritten: a) Bereitstellen einer mit der Probenflüssigkeit (10) nicht mischbaren Trägerflüssigkeit (20), b) Aufbringen der Probenflüssigkeit (10) auf die Trägerflüssigkeit (20), so dass die Probenflüssigkeit (10) sich auf einer Aufbring-Oberfläche (21) der Trägerflüssigkeit zu einem Probenfilm (12) verteilt und c) Kühlen des Probenfilmes (12), so dass eine gefrorene Festprobe (13) entsteht.

The invention relates to a method for freezing a sample cell (10) containing biological cells and / or tissue, in particular a blood component, comprising the steps of: a) providing a carrier liquid (20) immiscible with the sample liquid (10), b) applying the sample Sample liquid (10) on the carrier liquid (20), so that the sample liquid (10) on a deposition surface (21) of the carrier liquid to a sample film (12) distributed and c) cooling the sample film (12), so that a frozen Festprobe (13) arises.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren einer biologische Zellen und/oder Gewebe, insbesondere einen Blutbestandteil, enthaltenden Probenflüssigkeit.The invention relates to a method for freezing a sample cell containing biological cells and / or tissue, in particular a blood component.

Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt die Konservierung von Blut und Blutbestandteilen dar. Für medizinische Zwecke müssen große Mengen an Vollblut und Blutbestandteilen bevorratet werden und im Notfall schnell verfügbar sein. Bluttransfusionen mit Erythrozyten-Konzentraten, also mit aus roten Blutzellen bestehende Blutkonserven, werden routinemäßig bei medizinischen Eingriffen und bei einer Vielzahl von Verletzungen verwendet, um die Abgabekapazität des Sauerstoffs und das Kreislaufvolumen von Patienten zu erhöhen.A preferred field of application of the method according to the invention is the preservation of blood and blood components. For medical purposes, large quantities of whole blood and blood components must be stored and quickly available in an emergency. Blood transfusions with red blood cell concentrates, that is, red blood cell-containing blood, are routinely used in medical procedures and a variety of injuries to increase the oxygen delivery capacity and circulatory volume of patients.

Es ist üblich, Erythrozyten-Konzentrate nach der Blutabnahme von einem Blutspender bei einer Lagertemperatur von 4°C zu lagern, bis diese für eine Bluttransfusion eingesetzt werden. So kann das Erythrozyten-Konzentrat bis zu 49 Tage ab Blutabnahme verwendet werden. Aufgrund physikalischer Degradation der Erythrozyten hat eine Transfusion mit länger gelagertem Erythrozyten-Konzentrat jedoch nicht mehr die gewünschte Wirkung.It is customary to store red blood cell concentrates after blood sampling from a blood donor at a storage temperature of 4 ° C until they are used for a blood transfusion. Thus, the erythrocyte concentrate can be used for up to 49 days from blood collection. Due to physical degradation of the erythrocytes, however, transfusion with a longer stored erythrocyte concentrate no longer has the desired effect.

Für eine längere Lagerung von Erythrozyten-Konzentraten ist es deshalb bekannt, das Erythrozyten-Konzentrat einzufrieren, denn bei Temperaturen unterhalb von - 80°C kommen die Stoffwechselvorgänge zum Stillstand. Im Resultat bleiben die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Zellen unverändert erhalten. Etabliert hat sich das Verfahren der Kryokonservierung, bei der das Erythrozyten-Konzentrat mittels flüssigen Stickstoffes schockgefroren wird. Kryokonservierte Erythrozyten-Konzentrate können bis zu 10 Jahre gelagert und verwendet werden.For a longer storage of erythrocyte concentrates, it is therefore known to freeze the erythrocyte concentrate, because at temperatures below - 80 ° C, the metabolic processes come to a standstill. As a result, the physico-chemical properties of the cells remain unchanged. The process of cryopreservation has been established, in which the erythrocyte concentrate is flash-frozen by means of liquid nitrogen. Cryopreserved red blood cell concentrates can be stored and used for up to 10 years.

Nachteilig an der Kryokonservierung ist jedoch, dass es bei dem Einfrieren der Zellen zu Gefrierschäden kommen kann. Abhängig von der Temperaturkinetik sind dies eine raumfordernde Bildung von Eiskristallen, eine Dehydrierung der Zellen und eine Konzentrationserhöhung von gelösten Stoffen. Diese Schädigungsmechanismen können den Zellen Schäden zufügen, die keine Wiederherstellung der physiologischen Vorgänge nach dem Auftauen erlauben. Deshalb ist es bekannt, Kryoprotektiva (Gefrierschutzmittel) beizumischen, die die Zellen vor entsprechenden Schäden schützen. Als Kryoprotektiva werden beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Hydroxyethylstärke (HES) und Glycerin eingesetzt. Kryoprotektiva weisen jedoch ihrerseits unerwünschte Eigenschaften auf. Beispielsweise wirkt DMSO in höheren Mengen toxisch.A disadvantage of the cryopreservation, however, is that there may be freezing damage when the cells freeze. Depending on the temperature kinetics these are a space-consuming formation of ice crystals, a dehydration of the cells and an increase in the concentration of solutes. These damage mechanisms can cause damage to the cells that does not allow the physiological processes to be restored after thawing. Therefore, it is known to mix cryoprotectants (antifreeze), which protect the cells from damage. For example, dimethyl sulfoxide (DMSO), hydroxyethyl starch (HES) and glycerol are used as cryoprotectants. However, cryoprotectants themselves have undesirable properties. For example, DMSO is toxic in higher amounts.

Vor einer Bluttransfusion ist es daher zumeist erforderlich oder wünschenswert, das in der gelagerten Blutkonserve enthaltene Kryoprotektiv herauszuwaschen. Dies wiederum ist kosten- und zeitintensiv. Noch immer werden die meisten Bluttransfusionen daher bei 4°C gelagert, weshalb eine Vielzahl von Blutkonserven nach Ablauf ihrer maximalen Lagerzeit weggeworfen wird. Für Blutkonserven mit seltenen Faktortypen ist eine Kryokonservierung meist unverzichtbar.Before a blood transfusion, it is therefore usually necessary or desirable to wash out the cryoprotective contained in the stored blood conserve. This in turn is costly and time consuming. Therefore, most blood transfusions are still stored at 4 ° C, which is why a large number of blood products are thrown away after their maximum storage time. Cryopreservation is usually indispensable for conserved blood with rare factor types.

Die WO 2007/054160 A2 betrifft ein Verfahren zur Kryokonservierung von Vollblut, bei dem eine Probe des Vollblutes mit einem verdünnten, wässrigen Kryoprotektiv im Verhältnis von 1:2 bis 2:1 zu einer Kryo-Vormischung vermischt wird. Die so erhaltene Kryo-Vormischung wird anschließend in einem Gefrierschrank bei Temperaturen zwischen -65°C und -100°C gefroren.The WO 2007/054160 A2 relates to a method of cryopreserving whole blood in which a sample of the whole blood is mixed with a dilute aqueous cryoprotectant in the ratio of 1: 2 to 2: 1 to form a cryogenic premix. The resulting cryogenic premix is then frozen in a freezer at temperatures between -65 ° C and -100 ° C.

Aus der DE 10 2010 053 461 A1 ist ein Verfahren zur Kryokonservierung mittels Elektrosprayings in flüssigen Stickstoff bekannt.From the DE 10 2010 053 461 A1 a method for cryopreserving by electrospray in liquid nitrogen is known.

Aus der WO 2004/017732 ist ein Verfahren zur Kryokonservierung biologischer Proben bekannt, bei der eine flüssige Probe mittels eines Tropfengenerators bereitgestellt, mittels eines gas- oder dampfförmigen Kühlmediums in einer Kühleinrichtung abgekühlt und anschließend in einer Aufnahmeeinrichtung gesammelt wird.From the WO 2004/017732 a method for cryopreserving biological samples is known in which a liquid sample is provided by means of a drop generator, cooled by means of a gaseous or vaporous cooling medium in a cooling device and then collected in a receiving device.

Aus der US 5,780,295 B ist eine Vorrichtung mit einem Zerstäuber zur Erzeugung von Mikrotropfen einer Suspension eines biologischen Materials, einer intern gekühlten tiefgekühlten Oberfläche zur Kühlung der Mikrotropfen sowie einem Kollektor und einem Probenhalter für die gekühlten Mikrotropfen bekannt.From the US 5,780,295 B is an apparatus with a nebulizer for generating microdrops of a suspension of a biological material, an internally cooled deep-frozen surface for cooling the microdroplets and a collector and a sample holder for the cooled microdroplets known.

Wünschenswert ist ein kostengünstiges Verfahren zum Einfrieren biologischer Zellen, das ohne oder nur mit geringen Mengen an Kryoprotektiva auskommt und die biologischen Zellen beim Einfrieren nicht schädigt.It is desirable to have a cost-effective method for freezing biological cells that works without or only with small amounts of cryoprotectants and does not damage the biological cells during freezing.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, Nachteile im Stand der Technik zu vermindern.The object of the invention is to reduce disadvantages in the prior art.

Die Erfindung löst das Problem durch ein Verfahren zum Einfrieren einer biologische Zellen und/oder Gewebe, insbesondere einen Blutbestandteil, enthaltenden Probenflüssigkeit mit den Schritten: a) Bereitstellen einer mit der Probenflüssigkeit nicht mischbaren Trägerflüssigkeit, b) Aufbringen der Probenflüssigkeit auf die Trägerflüssigkeit, so dass die Probenflüssigkeit sich auf einer Aufbring-Oberfläche der Trägerflüssigkeit zu einem Probenfilm verteilt und c) Kühlen des Probenfilmes, so dass eine gefrorene Festprobe entsteht.The invention solves the problem by a method for freezing a sample cell containing biological cells and / or tissue, in particular a blood component, comprising the steps of: a) providing a carrier liquid immiscible with the sample liquid, b) applying the sample liquid to the carrier liquid so that the sample liquid is distributed on a application surface of the carrier liquid to a sample film and c) cooling the sample film, so that a frozen solid sample is formed.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Oberflächen-Volumen-Verhältnis der Probenflüssigkeit Vergrößert, um höhere Kühlraten zu erzielen. Die hohe Kühlrate ermöglicht es, den Anteil an Kryoprotektiv zu reduzieren oder kein Kryoprotektiv einzusetzen, ohne dass hierdurch eine nennenswerte oder lediglich eine vertretbare Schädigung der Zellen eintritt. In the method according to the invention, the surface-to-volume ratio of the sample liquid is increased in order to achieve higher cooling rates. The high cooling rate makes it possible to reduce the proportion of cryoprotective or to use no cryoprotective, without this causing a significant or only a justifiable damage to the cells.

Bevorzugt ist die Trägerflüssigkeit hydrophob und wasserunlöslich. Wasserunlöslich bedeutet insbesondere, dass die Trägerflüssigkeit zumindest schwer löslich und insbesondere praktisch (nahezu) unlöslich gemäß der Definition im Europäischen Arzneibuch (Stand 01.01.2018) ist.The carrier liquid is preferably hydrophobic and water-insoluble. In particular, water-insoluble means that the carrier liquid is at least sparingly soluble and in particular practically (almost) insoluble as defined in the European Pharmacopoeia (as of 01.01.2018).

Weiter bevorzugt ist die Trägerflüssigkeit chemisch inert. Dies bedeutet insbesondere, dass die Trägerflüssigkeit nicht oder nur in verschwindend geringem Maße mit der Probenflüssigkeit und den darin enthaltenden biologischen Zellen und/oder Geweben reagiert.More preferably, the carrier liquid is chemically inert. This means, in particular, that the carrier liquid does not react or reacts only to a negligible extent with the sample liquid and the biological cells and / or tissues contained therein.

Bevorzugt ist die Dichte der Trägerflüssigkeit, insbesondere bei Standardbedingungen, höher als die Dichte der Probenflüssigkeit. Insbesondere beträgt die Dichte der Trägerflüssigkeit zumindest das 1,2-fache und besonders bevorzugt zumindest das 1,5-fache der Dichte der Probenflüssigkeit. So wird sichergestellt, dass die Probenflüssigkeit auf der Trägerflüssigkeit schwimmt.The density of the carrier liquid, in particular under standard conditions, is preferably higher than the density of the sample liquid. In particular, the density of the carrier liquid is at least 1.2 times and more preferably at least 1.5 times the density of the sample liquid. This ensures that the sample fluid floats on the carrier fluid.

Als Probenflüssigkeiten für das erfindungsgemäße Verfahren können insbesondere Konzentrate mit Blutbestandteilen, wie beispielsweise Erythrozyten-Konzentrate, verwendet werden. Die Probenflüssigkeit wird bevorzugt bei einer Temperatur der Probenflüssigkeit zwischen 1 und 20°C, insbesondere zwischen 2 und 10°C und ganz besonders bevorzugt zwischen 3 und 6°C auf die Trägerflüssigkeit aufgebracht. Dies stellt sicher, dass die Probenflüssigkeit sich auf der Aufbring-Oberfläche der Trägerflüssigkeit schnell zu einem möglichst gleichmäßigen Probenfilm verteilt.Concentrates with blood constituents, such as, for example, erythrocyte concentrates, can be used in particular as sample liquids for the method according to the invention. The sample liquid is preferably applied to the carrier liquid at a temperature of the sample liquid between 1 and 20 ° C., in particular between 2 and 10 ° C., and very particularly preferably between 3 and 6 ° C. This ensures that the sample liquid spreads quickly on the application surface of the carrier liquid to a sample film as uniform as possible.

Bevorzugt sind zumindest zwei Temperaturzonen der Trägerflüssigkeit vorgesehen. Eine Aufbringzone beinhaltet die Aufbring-Oberfläche, die wie vorstehend erläutert temperiert wird. Eine Kühlzone beinhaltet eine Kühl-Oberfläche, auf der der Probenfilm zu der Festprobe gefroren wird. In der Kühlzone kann die Trägerflüssigkeit beispielsweise eine Temperatur zwischen -2°C bis -50°C aufweisen. Die Aufbringzone und Kühlzone sind vorzugsweise zumindest teilweise thermisch voneinander isoliert, beispielsweise mittels einer Wand oder jeweils unterschiedlicher Behältnisse für die Trägerflüssigkeit. Es können zudem Temperaturzonen zwischen der Aufbringzone und der Kühlzone mit Temperaturen zwischen den Temperaturen der Aufbring- und Kühlzone ausgebildet sein.Preferably, at least two temperature zones of the carrier liquid are provided. An application zone includes the application surface, which is tempered as explained above. A cooling zone includes a cooling surface on which the sample film is frozen to the solid sample. In the cooling zone, the carrier liquid, for example, a temperature between -2 ° C to -50 ° C have. The application zone and cooling zone are preferably at least partially thermally insulated from one another, for example by means of a wall or in each case different containers for the carrier liquid. In addition, temperature zones between the application zone and the cooling zone can be formed with temperatures between the temperatures of the application and cooling zones.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung liegt der Pourpoint der Trägerflüssigkeit unterhalb eines Gefrierpunktes der Probenflüssigkeit, bevorzugt bei weniger als -10°C. Der Pourpoint bezeichnet die Temperatur der Trägerflüssigkeit, bei der die Trägerflüssigkeit bei Abkühlung gerade noch fließt. Die Bestimmung des Pourpoints erfolgt gemäß der Norm DIN ISO 3016. Dies ermöglicht, dass wenn die Probenflüssigkeit gefriert, die Trägerflüssigkeit noch immer fließen kann.According to one embodiment of the invention, the pour point of the carrier liquid is below a freezing point of the sample liquid, preferably at less than -10 ° C. The pour point refers to the temperature of the carrier liquid at which the carrier liquid just flows on cooling. The pour point is determined in accordance with standard DIN ISO 3016. This allows that when the sample liquid freezes, the carrier liquid can still flow.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung besteht die Trägerflüssigkeit zumindest teilweise aus Perfluorcarbon, bevorzugt Perfluortributylamin (C₁₂F₂₇N). Bevorzugt besteht die Trägerflüssigkeit überwiegend oder im Wesentlichen vollständig aus dem Perfluorcarbon, bevorzugt Perfluortributylamin, welches auch unter den Bezeichnungen PFTBA, FC-43, Heptacosafluortri-n-butylamin und Tris(perfluorbutyl)amin bekannt ist.According to one embodiment of the invention, the carrier liquid consists at least partially of perfluorocarbon, preferably perfluorotributylamine (C ₁₂ F ₂₇ N). The carrier liquid preferably consists predominantly or substantially completely of the perfluorocarbon, preferably perfluorotributylamine, which is also known under the designations PFTBA, FC- 43 , Heptacosafluoretri-n-butylamine and tris (perfluorobutyl) amine.

PFTBA ist besonders für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, weil es eine bei Raumtemperatur wasserunlösliche und chemisch inerte Flüssigkeit mit einem Schmelzpunkt von -52°C ist. Perfluorcarbone lösen Sauerstoff und Kohlendioxid sehr gut, sie können daher als Blutersatzmittel zur Sauerstoffversorgung eingesetzt werden, wenn geeignetes Spenderblut nicht verfügbar ist. Etwaige Rückstände von Perfluorcarbonen in der gefrorenen Probe sind im Gegensatz zu vielen Kryoprotektiva deshalb unbedenklich.PFTBA is particularly suitable for the process of the invention because it is a room temperature water insoluble and chemically inert liquid having a melting point of -52 ° C. Perfluorocarbons dissolve oxygen and carbon dioxide very well, so they can be used as blood substitutes for oxygenation if suitable donor blood is not available. Any residues of perfluorocarbons in the frozen sample are therefore harmless, unlike many cryoprotectants.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung enthält die Probenflüssigkeit ein Kryoprotektiv, wobei vorzugsweise die Massenkonzentration des Kryoprotektivs in dem dadurch erhaltenen Gemisch höchstens 40%, bevorzugt höchstens 20% beträgt. Als Kryoprotektiv können beispielsweise DMSO, HES, Glycerin, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Dextran oder eine Mischung der vorgenannten Kryoprotektiva verwendet werden. Dem Fachmann ist darüber hinaus eine Vielzahl weiterer Kryoprotektiva bekannt. Die Zugabe des Kryoprotektivs ermöglicht es, selbst geringfügige Gefrierschäden der Zellen weitgehend zu vermeiden.According to one embodiment of the invention, the sample liquid contains a cryoprotectant, wherein preferably the mass concentration of the cryoprotective in the resulting mixture is at most 40%, preferably at most 20%. As cryoprotective, for example, DMSO, HES, glycerol, polyvinylpyrrolidone (PVP), dextran or a mixture of the aforementioned cryoprotectants can be used. The skilled person is also known a variety of other cryoprotectants. The addition of the cryoprotectant makes it possible to largely avoid even slight freezing damage to the cells.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung wird zum Kühlen des Probenfilmes und/oder der Festprobe die Trägerflüssigkeit auf eine Temperatur unterhalb des Gefrierpunktes der Probenflüssigkeit, insbesondere unterhalb von - 10°C gekühlt und/oder Flüssiggas in thermischen Kontakt mit dem Probenfilm und/oder der Festprobe gebracht. Gemäß der ersten Variante wird die Probenflüssigkeit durch den unmittelbaren Kontakt mit der kalten Trägerflüssigkeit gekühlt und dabei eingefroren.According to a development of the invention, the carrier liquid is cooled to a temperature below the freezing point of the sample liquid, in particular below -10 ° C., and / or brought into thermal contact with the sample film and / or the solid sample for cooling the sample film and / or the solid sample , According to the first variant, the sample liquid is cooled by the direct contact with the cold carrier liquid and thereby frozen.

Gemäß der zweiten Variante wird die Probenflüssigkeit durch einen thermischen Kontakt mit dem Flüssiggas gekühlt. Als Flüssiggase kommen beispielsweise Flüssigkohlendioxid und insbesondere Flüssigstickstoff aufgrund seines Siedepunktes bei -196°C unter Normaldruck in Betracht. Thermischer Kontakt meint dabei entweder einen direkten Kontakt der Probenflüssigkeit mit dem Flüssiggas oder einen indirekten Kontakt über einen Wärmeleiter. Als Wärmeleiter kann beispielsweise zumindest eine Metallplatte fungieren. Als Metallplatten bevorzugt werden zumindest zwei Kupferplatten, die aus einem hohen, bevorzugt überwiegenden oder im Wesentlichen vollständigen Anteil an Kupfer bestehen und oberhalb und unterhalb des Probenfilmes und/oder der Festprobe angeordnet werden. Durch einen direkten Kontakt der Metallplatten mit der Probenflüssigkeit geben die Metallplatten beispielsweise direkt ihre Kälte an den Probenfilm und/oder die Festprobe ab. Alternativ kann es vorgesehen sein, dass die Metallplatten den Probenfilm und/oder die Festprobe nicht kontaktieren, sondern ein Gas in der Atmosphäre, beispielsweise Luft, kühlen und über das Gas indirekt den Probenfilm und/oder die Festprobe kühlen. According to the second variant, the sample liquid is cooled by thermal contact with the liquid gas. Liquid gases include, for example, liquid carbon dioxide and, in particular, liquid nitrogen, because of its boiling point at -196 ° C. under normal pressure. Thermal contact means either a direct contact of the sample liquid with the liquid gas or an indirect contact via a heat conductor. As a heat conductor, for example, at least one metal plate can act. Preferred metal plates are at least two copper plates which consist of a high, preferably predominant or substantially complete, amount of copper and are arranged above and below the sample film and / or the solid sample. By direct contact of the metal plates with the sample liquid, for example, the metal plates directly release their cold to the sample film and / or the solid sample. Alternatively, it may be provided that the metal plates do not contact the sample film and / or the solid sample, but instead cool a gas in the atmosphere, for example air, and indirectly cool the sample film and / or the solid sample via the gas.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann der Probenfilm auf der Aufbring-Oberfläche der Trägerflüssigkeit zu der gefrorenen Festprobe mit einer Temperatur von beispielsweise -2°C bis -20°C oder auf sehr tiefe Lagertemperaturen von beispielsweise -80°C und darunter gekühlt werden. Die Festprobe kann anschließend entnommen werden und das Verfahren erneut durchgeführt werden.According to one embodiment of the invention, the sample film on the application surface of the carrier liquid may be cooled to the frozen solid sample at a temperature of, for example, -2 ° C to -20 ° C or to very low storage temperatures of, for example, -80 ° C and below. The solid sample can then be removed and the process carried out again.

Zum Abkühlen der Probenflüssigkeit auf Lagertemperatur ist jedoch auch ein Vorgehen in zwei Schritten möglich, bei dem die Festprobe nach einem ersten Kühlschritt von der Trägerflüssigkeit gelöst wird. Im ersten Kühlschritt wird der Probenfilm auf der Trägerflüssigkeit auf eine Temperatur gekühlt, die oberhalb der gewünschten Lagertemperatur aber unterhalb der Gefriertemperatur der Probenflüssigkeit liegt. Dann wird eine gefrorene Festprobe bei beispielsweise -2°C bis -10°C oder darunter erhalten. Im zweiten Schritt wird die Festprobe von der Trägerflüssigkeit entnommen und durchläuft an einem anderen Ort, beispielsweise in einer Lagerungsbox, eine Tiefkühlung auf eine Lagertemperatur von beispielsweise -80°C bis -135°C und darunter. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass die Trägerflüssigkeit nicht fest wird, wenn die Festprobe auf eine Lagertemperatur gekühlt wird, bei der die Trägerflüssigkeit sich verfestigen würde.For cooling the sample liquid to storage temperature, however, a procedure in two steps is possible, in which the solid sample is dissolved after a first cooling step of the carrier liquid. In the first cooling step, the sample film on the carrier liquid is cooled to a temperature which is above the desired storage temperature but below the freezing temperature of the sample liquid. Then, a frozen solid sample is obtained at, for example, -2 ° C to -10 ° C or below. In the second step, the solid sample is removed from the carrier liquid and passes through another location, for example in a storage box, a deep freezing to a storage temperature of for example -80 ° C to -135 ° C and below. This approach has the advantage that the carrier liquid does not solidify when the solid sample is cooled to a storage temperature at which the carrier liquid would solidify.

Bevorzugt weist das Verfahren den Schritt auf: Transportieren des Probenfilmes und/oder der Festprobe zumindest teilweise entlang einer Oberfläche der Trägerflüssigkeit, wobei der Probenfilm und/oder die Festprobe a) während des Transportierens gekühlt wird und/oder b) auf einer von der Aufbring-Oberfläche entfernten Kühl-Oberfläche, zu der der Probenfilm und/oder die Festprobe transportiert wurde und die bevorzugt durch die Trägerflüssigkeit gebildet wird, gekühlt wird.Preferably, the method comprises the step of transporting the sample film and / or the solid sample at least partially along a surface of the carrier liquid, wherein the sample film and / or the solid sample a) is cooled during transport and / or b) on one of the application Surface remote cooling surface to which the sample film and / or the solid sample has been transported and which is preferably formed by the carrier liquid is cooled.

Gemäß der ersten Variante werden der Probenfilm und/oder die Festprobe während des Transportierens gekühlt. Gemäß der zweiten Variante wird der Probenfilm auf der Aufbring-Oberfläche nicht gekühlt, so dass dieser sich schnell und gleichmäßig verteilen kann. Erst auf einer von der Aufbring-Oberfläche entfernten Kühl-Oberfläche, auf die der Probenfilm transportiert wird, erfolgt dann eine Kühlung. So wird eine zumindest teilweise thermische Trennung zwischen der Aufbring-Oberfläche und der Kühl-Oberfläche erreicht. Beide Varianten ermöglichen ein besonders schnelles Verfahren mit hohen Durchsätzen.According to the first variant, the sample film and / or the solid sample are cooled during transportation. According to the second variant, the sample film is not cooled on the application surface, so that it can spread quickly and evenly. Only on a remote from the application surface cooling surface on which the sample film is transported, then carried out a cooling. Thus, at least partial thermal separation between the application surface and the cooling surface is achieved. Both variants allow a particularly fast process with high throughputs.

Die Trägerflüssigkeit kann in einer einzigen oder in mehreren Behältnissen, wie beispielsweise Wannen oder Kammern, bereitgestellt werden. Bevorzugt sind mehrere Behältnisse miteinander gekoppelt, so dass die Trägerflüssigkeit von dem einen Behältnis in das andere und umgekehrt gelangen kann, sich insbesondere eine gemeinsame Oberfläche auf den Behältnissen teilt, entlang derer die Probenflüssigkeit und/oder Festprobe transportiert werden kann. Die Trägerflüssigkeit kann durch den Behältnissen zugeordnete Heiz- und/oder Kühlaggregate bevorzugt unterschiedlich temperiert werden, so dass die Behältnisse unterschiedliche Temperaturzonen ausbilden. Beispielsweise kann die Aufbring-Oberfläche eines ersten Behältnisses auf einer Temperatur zwischen 2 und 10°C gehalten werden, damit sich der Probenfilm gleichmäßig verteilt. Die Kühl-Oberfläche eines zweiten Behältnisses kann beispielsweise auf einer Temperatur von -10°C bis -40°C gehalten werden, damit der Probenfilm hier zu einer festen Probe abgekühlt wird, während er sich auf der Kühl-Oberfläche befindet.The carrier liquid may be provided in a single or multiple containers, such as tubs or chambers. Preferably, a plurality of containers are coupled to one another so that the carrier liquid can pass from one container into the other and vice versa, in particular shares a common surface on the containers, along which the sample liquid and / or solid sample can be transported. The carrier liquid can preferably be tempered differently by the containers associated heating and / or cooling units, so that the containers form different temperature zones. For example, the application surface of a first container can be maintained at a temperature between 2 and 10 ° C, so that the sample film evenly distributed. For example, the cooling surface of a second container may be maintained at a temperature of -10 ° C to -40 ° C to cool the sample film to a solid sample while it is on the cooling surface.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung erfolgt das Transportieren des Probenfilmes und/oder der Festprobe a) mittels einer in der Trägerflüssigkeit erzeugten Strömung, b) mittels eines über den Probenfilm und/oder die Festprobe strömenden Gases und/oder c) mittels zumindest eines Förderbandes und/oder d) innerhalb eines den Probenfilm und/oder die Festprobe umschließenden Rahmens.According to a development of the invention, the transport of the sample film and / or the solid sample is carried out a) by means of a flow generated in the carrier liquid, b) by means of a gas flowing over the sample film and / or the solid sample and / or c) by means of at least one conveyor belt and / or or d) within a frame enclosing the sample film and / or the solid sample.

Bevorzugt sind bei der ersten Variante Propeller innerhalb der Trägerflüssigkeit angeordnet, die die gewünschte Strömung mit Richtung und Geschwindigkeit erzeugen, die die Trägerflüssigkeit und somit auch den darauf befindlichen Probenfilm und/oder die Festprobe transportiert.In the first variant, propellers are preferably arranged within the carrier liquid, which produce the desired flow with direction and speed, which transports the carrier liquid and thus also the sample film and / or the solid sample located thereon.

Bei der zweiten Variante kann ein Ventilator einen Gasstrom aus Luft erzeugen, der zumindest teilweise in Transportrichtung strömt. Außerdem kann kühlendes Flüssiggas als Gasstrom genutzt werden, das schräg auf den Probenfilm und/oder die Festprobe gerichtet und ausgestoßen wird. Dies ermöglicht eine Kombination aus Transportieren und Kühlen.In the second variant, a fan can generate a gas flow of air, the at least partially flows in the transport direction. In addition, cooling liquefied gas can be used as a gas stream which is directed and ejected obliquely onto the sample film and / or the solid sample. This allows a combination of transporting and cooling.

Bei der dritten Variante ist zumindest ein Förderband oder eine Rolle derart angeordnet, dass sie in Eingriff mit der gekühlten Festprobe gelangt und diese transportiert. Bevorzugt ist je ein Förderband seitlich in Transportrichtung so angeordnet, dass sie die Festprobe transportieren.In the third variant, at least one conveyor belt or a roller is arranged such that it comes into engagement with the cooled solid sample and transported. Preferably, a conveyor belt is arranged laterally in the transport direction so that they transport the solid sample.

Bei der vierten Variante können die Seiten des Probenfilmes und/oder der Festprobe von einem Rahmen, beispielsweise einem metallischen Rahmen oder einem Kunststoffrahmen, umschlossen und innerhalb diesem transportiert werden. Die Entnahme der Festprobe erfolgt dann gemeinsam mit dem Rahmen. Der Antrieb für den Transport des Rahmens kann nach einer der vorstehenden Varianten erfolgen.In the fourth variant, the sides of the sample film and / or the solid sample of a frame, such as a metallic frame or a plastic frame, enclosed and transported within it. The extraction of the solid sample is then carried out together with the frame. The drive for the transport of the frame can take place according to one of the preceding variants.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung wird die Probenflüssigkeit kontinuierlich auf die Trägerflüssigkeit aufgebracht und/oder der Probenfilm und/oder die Festprobe in einzelne Teilproben getrennt. Das Trennen in einzelne Teilproben ermöglicht eine einfache Lagerung bei einem kontinuierlichen Probenflüssigkeitsfluss.According to one development of the invention, the sample liquid is applied continuously to the carrier liquid and / or the sample film and / or the solid sample are separated into individual subsamples. The separation into individual subsamples allows easy storage with a continuous sample liquid flow.

Erfindungsgemäß ist zudem eine Vorrichtung zum Einfrieren einer biologische Zellen und/oder Gewebe, insbesondere Blutbestandteile, enthaltenden Probenflüssigkeit mit a) einer mit der Probenflüssigkeit nicht mischbaren Trägerflüssigkeit und b) einer Aufbringeinrichtung zum Aufbringen der Probenflüssigkeit auf die Trägerflüssigkeit, die ausgebildet ist zum Verteilen der Probenflüssigkeit auf einer Aufbring-Oberfläche der Trägerflüssigkeit, so dass die Probenflüssigkeit sich zu einem Probenfilm verteilt und c) einer Kühleinrichtung zum Kühlen des Probenfilmes zu einer gefrorenen Festprobe.According to the invention, there is also a device for freezing a sample cell containing biological cells and / or tissues, in particular blood components, with a) a carrier liquid immiscible with the sample liquid and b) an application device for applying the sample liquid to the carrier liquid, which is designed to disperse the sample liquid on an application surface of the carrier liquid, so that the sample liquid is distributed to a sample film and c) a cooling device for cooling the sample film into a frozen solid sample.

Erfindungsgemäß ist weiterhin eine Festprobe, die biologische Zellen und/oder Gewebe, insbesondere Blutbestandteile enthält, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.According to the invention is also a solid sample containing biological cells and / or tissue, in particular blood components, obtained by the method according to the invention.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand der nachstehenden Figuren erläutert. Die Figuren sind schematisch gezeichnet. Es zeigen:

1 a, b Aufbringen der Probenflüssigkeit auf die Trägerflüssigkeit,
2 a - d Transportieren des Probenfilmes und/oder der Festprobe auf der Trägerflüssigkeit,
3 a, b Kühlen des Probenfilmes und/oder der Festprobe und
4 a - c Entnehmen der Festprobe von der Trägerflüssigkeit und Lagern der Festprobe.

Embodiments of the invention will be explained with reference to the following figures. The figures are drawn schematically. Show it:

1 a, b Applying the sample liquid to the carrier liquid,
2 a - d Transporting the sample film and / or the solid sample on the carrier liquid,
3 a, b Cooling the sample film and / or the solid sample and
4 a - c Remove the solid sample from the carrier liquid and store the solid sample.

In 1a ist in einer Seitansicht gezeigt, wie eine biologische Zellen und/oder Gewebe enthaltende Probenflüssigkeit 10, die in einem Probenflüssigkeitsbehältnis 11 enthalten ist, mittels einer manuell betätigbaren Pipette 30 in eine Kammer 40 gegeben wird. Die Kammer 40 ist in einem oberen Abschnitt geöffnet, so dass sie auch als Wanne bezeichnet werden könnte, und beinhaltet eine Trägerflüssigkeit 20. Von oberhalb der Kammer 40 wird mittels der Pipette 30 Probenflüssigkeit 10 auf eine Aufbring-Oberfläche 21 der Trägerflüssigkeit 20 aufgebracht. Die Probenflüssigkeit 10 verteilt sich auf der Aufbring-Oberfläche 21 zu einem Probenfilm 12, ohne sich mit der Trägerflüssigkeit 20 zu vermischen. Die Kammer 40 ist zusammen mit Probenfilm 12 und Trägerflüssigkeit 20 hier nur abschnittsweise bis zu einer Trennlinie abgebildet.In 1a is shown in a side view, such as a sample cell containing biological cells and / or tissue 10 in a sample fluid container 11 is contained by means of a manually operable pipette 30 in a chamber 40 is given. The chamber 40 is open in an upper portion, so that it could also be called a tub, and includes a carrier liquid 20 , From above the chamber 40 is done by means of the pipette 30 sample liquid 10 on an application surface 21 the carrier liquid 20 applied. The sample liquid 10 spreads on the application surface 21 to a sample film 12 without interfering with the carrier liquid 20 to mix. The chamber 40 is together with sample film 12 and carrier liquid 20 here only partially shown up to a dividing line.

In 1b ist in einer Seitenansicht eine Variante des Aufbringens der Probenflüssigkeit auf die Trägerflüssigkeit gezeigt, bei der anstelle einer Pipette 30 als Aufbringeinrichtung eine Pumpe 31 verwendet wird. Die Pumpe 31 ist mit dem Probenflüssigkeitsbehältnis 11 und der Kammer 40 verbunden. Die Pumpe 31 befördert Probenflüssigkeit 10 aus dem Probenflüssigkeitsbehältnis 11 in Transportrichtung T, angedeutet durch den Pfeil an der Trennlinie, in die Kammer 40 und auf die Trägerflüssigkeit 20, so dass sich diese zu einem Probenfilm 12 verteilt. In dieser Darstellung befindet sich der Einlass der Pumpe 31 in die Kammer 40 seitlich der Kammer 40, wodurch die Probenflüssigkeit 10 entlang der Trägerflüssigkeit 20 gefördert wird. Alternativ ist möglich, dass der Einlass der Pumpe 31 in die Kammer 40 von oben angeordnet ist. Die Pumpe 31 kann diskontinuierlich und/oder kontinuierlich betrieben werden.In 1b is a side view of a variant of the application of the sample liquid is shown on the carrier liquid, in which instead of a pipette 30 as applicator a pump 31 is used. The pump 31 is with the sample fluid container 11 and the chamber 40 connected. The pump 31 conveys sample liquid 10 from the sample liquid container 11 in the transport direction T , indicated by the arrow on the dividing line, into the chamber 40 and on the carrier liquid 20 so that these become a sample film 12 distributed. This illustration shows the inlet of the pump 31 in the chamber 40 at the side of the chamber 40 , whereby the sample liquid 10 along the carrier liquid 20 is encouraged. Alternatively it is possible that the inlet of the pump 31 in the chamber 40 is arranged from above. The pump 31 can be operated discontinuously and / or continuously.

2a zeigt eine Seitenansicht eines Ausschnittes der Kammer 40, in der die Probenflüssigkeit 10 nach einer Variante der Erfindung auf der Trägerflüssigkeit 20 transportiert wird. Der Ausschnitt der Kammer 40 wird durch zwei Trennlinien begrenzt, wobei die linke Trennlinie an die Trennlinie der 1a und 1b angesetzt werden kann, um die dort erfolgten Schritte des Verfahrens fortzuführen. Von der Kammer 40 sind in diesem Ausschnitt eine untere Kammerwand 40.1 und eine obere Kammerwand 40.2 zu erkennen. Der Probenfilm 12 wird auf der Trägerflüssigkeit 20 innerhalb der Kammer 40 in Transportrichtung T transportiert. Alternativ kann der Probenfilm 12 an dieser Stelle bereits beispielsweise durch eine nicht dargestellte Kühlung der Trägerflüssigkeit 20 oder der Kammer 40 im Ganzen zu einer Festprobe 13 gefroren sein und transportiert werden. Es kann auch ein Zustand vorliegen, in dem sowohl ein Probenfilm 12 und eine hiermit ggf. verbundene Festprobe 13 sich auf der Trägerflüssigkeit 20 befindet. 2a shows a side view of a section of the chamber 40 in which the sample liquid 10 according to a variant of the invention on the carrier liquid 20 is transported. The section of the chamber 40 is bounded by two dividing lines, the left dividing line being at the dividing line of the 1a and 1b can be used to continue the steps taken there of the process. From the chamber 40 are in this section a lower chamber wall 40.1 and an upper chamber wall 40.2 to recognize. The sample film 12 is on the carrier liquid 20 inside the chamber 40 in the transport direction T transported. Alternatively, the sample film 12 at this point, for example, by a cooling of the carrier liquid, not shown 20 or the chamber 40 as a whole to a festive season 13 be frozen and transported. There may also be a condition in which both a sample film 12 and a possibly attached solid sample 13 on the carrier liquid 20 located.

Der Transport des Probenfilmes 12 erfolgt in der 2a mittels einer Strömung innerhalb der Trägerflüssigkeit 20, dessen Strömungsrichtungen S₁ und S₂ durch zwei Pfeile in der Trägerflüssigkeit 20 angedeutet ist. Die Strömung wird durch zwei in entgegengesetzte Richtungen arbeitende Propeller 41.1 und 41.2 erzeugt, die sich in Transportrichtung T des Probenfilmes und/oder der Festprobe gegenüber liegen. Der Propeller 41.2 befindet sich in einer größeren Tiefe innerhalb der Trägerflüssigkeit 20 als der Propeller 41.1. So wird eine umlaufende Strömung in der Trägerflüssigkeit 20 erzeugt. Anzahl und Position der Propeller 41.1 und 41.2 sind lediglich beispielhaft gewählt. Es können auch nur ein oder mehr als zwei Propeller 41.1 und 41.2 eingesetzt werden.The transport of the sample film 12 done in the 2a by means of a flow within the carrier liquid 20 , its flow directions S ₁ and S ₂ by two arrows in the carrier liquid 20 is indicated. The flow is through two propellers working in opposite directions 41.1 and 41.2 generated in the transport direction T the sample film and / or the solid sample lie opposite. The propeller 41.2 is located at a greater depth within the carrier liquid 20 as the propeller 41.1 , Thus, a circulating flow in the carrier liquid 20 generated. Number and position of the propellers 41.1 and 41.2 are chosen only by way of example. It can only have one or more than two propellers 41.1 and 41.2 be used.

In 2b ist eine Variante des Transportes des Probenfilmes 12 oder der Festprobe 13 in einer Seitenansicht gezeigt, in der Gasströme 50.1 bis 50.3 in den durch Pfeile angedeuteten Strömungsrichtungen S₁ , S₂ , S₃ durch Kammeröffnungen innerhalb der oberen Kammerwand 40.2 treten. Die Strömungsrichtungen S₁ , S₂ , S₃ liegen schräg zur Transportrichtung T, so dass die Gasströme 50.1 bis 50.3 den Probenfilm 12 und/oder die Festprobe 13 transportieren.In 2 B is a variant of the transport of the sample film 12 or the festive season 13 shown in a side view, in the gas streams 50.1 to 50.3 in the directions indicated by arrows flow directions S ₁ . S ₂ . S ₃ through chamber openings within the upper chamber wall 40.2 to step. The flow directions S ₁ . S ₂ . S ₃ lie obliquely to the transport direction T so that the gas flows 50.1 to 50.3 the sample film 12 and / or the festive season 13 transport.

Die Gasströme 50.1 bis 50.3 können ein Flüssiggas 51 wie Flüssigkohlendioxid oder Flüssigstickstoff beinhalten oder im Wesentlichen vollständig aus diesen bestehen, so dass der Probenfilm 12 zur Festprobe 13 schockgefriert oder eine bereits gefrorene Festprobe 13 auf der Trägerflüssigkeit 20 auf eine niedrigere Temperatur, beispielsweise die gewünschte Lagertemperatur der Festprobe 13, herabgekühlt wird. Die Anzahl und der Eintrittswinkel der Gasströme 50.1 bis 50.3, die Anzahl der Kammeröffnungen und ihre Position in der Kammer 40 sind hier lediglich beispielhaft dargestellt. Es können auch ein, zwei oder mehr als drei Gasströme 50 eingesetzt und auf eine beliebige Anzahl an Kammeröffnungen verteilt werden.The gas flows 50.1 to 50.3 can be a liquefied gas 51 such as liquid carbon dioxide or liquid nitrogen or consist essentially completely of these, so that the sample film 12 to the festive season 13 shock-frozen or a frozen sample 13 on the carrier liquid 20 to a lower temperature, for example, the desired storage temperature of the solid sample 13 , is cooled down. The number and the entrance angle of the gas streams 50.1 to 50.3 , the number of chamber openings and their position in the chamber 40 are shown here only as an example. It can also have one, two or more than three gas streams 50 used and distributed to any number of chamber openings.

In 2c ist eine weitere Variante des Transportes der Festprobe 13 in einer Draufsicht gezeigt. Bei Verwendung eines Behältnisses für die Trägerflüssigkeit 20 wie einer Kammer 40 kann sich das Problem ergeben, dass der Probenfilm 12 beim Abkühlen an seitlichen Kammerwänden 40.3 und 40.4 der Kammer 40 festfriert, was einen Transport und das Lösen der Festprobe 13 von der Trägerflüssigkeit 20 erschweren kann.In 2c is another variant of the transport of the solid sample 13 shown in a plan view. When using a container for the carrier liquid 20 like a chamber 40 the problem may arise that the sample film 12 on cooling on lateral chamber walls 40.3 and 40.4 the chamber 40 freezes, causing a transport and solving the solid sample 13 from the carrier liquid 20 can complicate.

Gemäß dem Ausführungsbeispiel nach 2c sind zwei Förderbänder 14.1 und 14.2 an den seitlichen Kammerwänden 40.3 und 40.4 angeordnet, die die gefrorene Festprobe 13 transportieren. Alternativ können die Kammerwände 40.3 und 40.4 selbst beweglich, also beispielsweise in der Gestalt von Förderbändern, gebildet sein, um einen Transport der Festprobe 13 zu ermöglichen. Die Förderbänder 42.1 und 42.2 werden in diesem Ausführungsbeispiel jeweils durch zwei Umlenkrollen und ein Band gebildet. Die Förderbänder 42.1 und 42.2 können mittels Motoren angetrieben werden und somit die Festprobe 13 transportieren. Alternativ können die Förderbänder 42.1 und 42.2 durch den Kontakt mit der Festprobe 13 und eine Bewegung der Festprobe 13 in Transportrichtung T angetrieben werden. Diese Bewegung kann beispielsweise wie vorstehend erläutert mittels eines Gasstromes oder einer Strömung bewirkt werden. Allgemein können unterschiedliche Transportvarianten miteinander kombiniert werden.According to the embodiment according to 2c are two conveyor belts 14.1 and 14.2 at the lateral chamber walls 40.3 and 40.4 arranged the frozen festive sample 13 transport. Alternatively, the chamber walls 40.3 and 40.4 itself movable, so for example in the form of conveyor belts, be formed to transport the solid sample 13 to enable. The conveyor belts 42.1 and 42.2 are formed in this embodiment in each case by two pulleys and a belt. The conveyor belts 42.1 and 42.2 can be driven by motors and thus the solid sample 13 transport. Alternatively, the conveyor belts 42.1 and 42.2 through contact with the festive test 13 and a movement of the trial 13 in the transport direction T are driven. This movement can be effected, for example, as explained above by means of a gas flow or a flow. In general, different types of transport can be combined with each other.

In 2d ist eine weitere Variante des Transportes des Probenfilmes 12 und/oder der Festprobe 13 in einer Draufsicht gezeigt. Die Aufbring-Oberfläche 21 wurde hierbei durch einen Rahmen 23 umgrenzt. Die Probenflüssigkeit 10 hat sich innerhalb der vom Rahmen 23 eingerahmten Fläche verteilt und wird innerhalb des Rahmens 23 transportiert. Auch dies verhindert ein Festfrieren des Probenfilmes 12 an der Kammer 40. Die gefrorene Festprobe 13 kann mitsamt des Rahmens 23 entnommen und gelagert werden. Alternativ kann die Festprobe 13 zum Zwecke der Lagerung nach Entnahme von dem Rahmen 23 gelöst werden. Der Transport kann ansonsten gemäß der beschriebenen Varianten, also mittels eines Gasstromes, einer Strömung in der Trägerflüssigkeit oder eines Förderbandes erfolgen. Alternativ kann der Rahmen 23 beispielsweise mittels eines nicht dargestellten Seilzuges gezogen werden.In 2d is another variant of the transport of the sample film 12 and / or the trial 13 shown in a plan view. The application surface 21 was here by a frame 23 circumscribed. The sample liquid 10 got within the frame 23 framed area is distributed and inside the frame 23 transported. This also prevents freezing of the sample film 12 at the chamber 40 , The frozen festival trial 13 can complete with the frame 23 be removed and stored. Alternatively, the solid sample 13 for the purpose of storage after removal from the frame 23 be solved. The transport can otherwise take place according to the variants described, that is to say by means of a gas flow, a flow in the carrier liquid or a conveyor belt. Alternatively, the frame 23 be pulled for example by means of a cable, not shown.

Die 3a zeigt ein Ausführungsbeispiel für das Kühlen der Festprobe 13 mittels eines Flüssiggases 51 in einer Seitenansicht. Der Probenfilm 12 wurde dabei bereits nach dem Transport entlang der Oberfläche der Trägerflüssigkeit 20 gemäß der 2a bis 2d zu einer Festprobe 13 gefroren und wird nun in einem weiteren Schritt für die Langzeitlagerung auf sehr tiefe Lagertemperaturen von -80°C und darunter gekühlt. Hierzu wurde die Festprobe 13 von der Trägerflüssigkeit 20 auf eine Rollenbahn 14 transportiert, was nicht gezeigt ist. Dies kann erforderlich sein, wenn die Trägerflüssigkeit 20 bei den geringen Temperaturen des Flüssiggases 51 ansonsten fest werden würde.The 3a shows an embodiment for the cooling of the solid sample 13 by means of a liquefied gas 51 in a side view. The sample film 12 was already after transport along the surface of the carrier liquid 20 according to the 2a to 2d to a festive season 13 frozen and is then cooled in a further step for long-term storage to very low storage temperatures of -80 ° C and below. This was the festive test 13 from the carrier liquid 20 on a roller conveyor 14 transported, which is not shown. This may be necessary if the carrier liquid 20 at the low temperatures of the liquefied gas 51 otherwise it would become stuck.

Das Flüssiggas 51 wird im Ausführungsbeispiel der 3a mit sechs Flüssiggasströmen 51.1, 51.2, 51.3, 51.4, 51.5 und 51.6 in Strömungsrichtungen S₁ bis S₆ quer zur Transportrichtung T von oben auf die Festprobe 13 und von unten und durch die Rollenbahn 14 auf die Festprobe 13 aufgebracht. Als Flüssiggas 51 kann beispielsweise Flüssigkohlendioxid oder Flüssigstickstoff verwendet werden. Das Flüssiggas kontaktiert die Festprobe 13 direkt. Alternativ kann ein guter thermischer Kontakt des Flüssiggases 51 mit der Festprobe 13 auch ohne direkten Kontakt des Flüssiggases 51 mit der Festprobe 13 hergestellt werden. Eine solche Variante ist in 3b in einer Seitenansicht gezeigt.The liquefied gas 51 is in the embodiment of 3a with six liquefied gas streams 51.1 . 51.2 . 51.3 . 51.4 . 51.5 and 51.6 in flow directions S ₁ to S ₆ transverse to the transport direction T from the top to the festive season 13 and from below and through the roller conveyor 14 to the festive season 13 applied. As liquefied gas 51 can, for example Liquid carbon dioxide or liquid nitrogen can be used. The liquefied gas contacts the solid sample 13 directly. Alternatively, good thermal contact of the liquefied gas 51 with the festive season 13 even without direct contact of the liquefied gas 51 with the festive season 13 getting produced. Such a variant is in 3b shown in a side view.

In 3b kommen zwei Metallplatten 52.1 und 52.2, vorzugsweise Kupferplatten, in der Kammer 40 zum Einsatz. Die Metallplatten 52.1 und 52.2 bilden jeweils mit der unteren Kammerwand 40.1 und der oberen Kammerwand 40.2 einen Raum für Flüssiggasströme 51.1 und 51.2 aus, die vorliegend entgegen der Transportrichtung T der Festprobe 13 in Strömungsrichtungen S₁ und S₂ strömen. Die Metallplatten 52.1 und 52.2 kühlen wegen ihrer hohen Wärmeleitfähigkeit den zwischen ihnen eingeschlossenen Raum bzw. die darin enthaltene Atmosphäre und somit die Festprobe 13 auf die gewünschte Lagertemperatur.In 3b come two metal plates 52.1 and 52.2 , preferably copper plates, in the chamber 40 for use. The metal plates 52.1 and 52.2 form each with the lower chamber wall 40.1 and the upper chamber wall 40.2 a space for liquefied gas streams 51.1 and 51.2 from, in the present case opposite to the transport direction T the festive season 13 in flow directions S ₁ and S ₂ stream. The metal plates 52.1 and 52.2 cool because of their high thermal conductivity between them enclosed space or the atmosphere contained therein and thus the solid sample 13 to the desired storage temperature.

In den 4a, 4b und 4c sind Varianten der Entnahme sowie der Lagerung der Festprobe 13 aus der Kammer 40 gezeigt.In the 4a . 4b and 4c are variants of the removal and storage of the solid sample 13 out of the chamber 40 shown.

In der Seitenansicht der 4a ist gezeigt, wie eine Festprobe 13 am Ende einer Kammer 40 und auf der Trägerflüssigkeit 20 transportiert durch eine Öffnung einer seitlichen Kammerwand hindurchgeht, wobei ein Rollensystem 43 die Festprobe 13 aus der Kammer 40 hinausbefördert. Das Rollensystem 43 besteht aus zwei Rollen, die die Festprobe 13 von unten und oben kontaktieren. Optional können die Rollen motorisch angetrieben sein. Es können auch nur eine oder mehr als zwei Rollen verwendet werden.In the side view of 4a is shown as a celebration 13 at the end of a chamber 40 and on the carrier liquid 20 transported through an opening of a lateral chamber wall passes, wherein a roller system 43 the festive season 13 out of the chamber 40 also promoted. The roller system 43 consists of two rolls, which are the festive season 13 contact from below and above. Optionally, the rollers can be driven by a motor. Only one or more than two rolls can be used.

In der 4b ist eine gemischte Ansicht aus Draufsicht und Seitenansicht gezeigt. In der Draufsicht links ist ein Ausschnitt eines Rahmens 23 gezeigt, der eine Festprobe 13 beinhaltet. In der Seitenansicht rechts ist eine Lagerungsbox 60 für Rahmen 23 gezeigt. Die Lagerungsbox 60 hat sechs Lagerfächer 61.1 bis 61.6 für die Rahmen 23, in denen diese gelagert werden können. Die Lagerfächer 61.1 bis 61.6 können Durchlässe aufweisen. Ein weiterer Kühlschritt mit Flüssiggasströmen 51.1 bis 51.6 kann wie in 4b gezeigt auch in der Lagerungsbox 60 stattfinden. Hierfür weist die Lagerungsbox 60 ihrerseits Öffnungen für die Flüssiggasströme 51.1 bis 51.6 auf.In the 4b is shown a mixed view from top view and side view. In the top view on the left is a section of a frame 23 shown a festive season 13 includes. In the right side view is a storage box 60 for frame 23 shown. The storage box 60 has six storage compartments 61.1 to 61.6 for the frame 23 in which they can be stored. The storage compartments 61.1 to 61.6 may have passages. Another cooling step with liquefied gas streams 51.1 to 51.6 can be like in 4b also shown in the storage box 60 occur. For this purpose, the storage box 60 in turn openings for the liquefied gas streams 51.1 to 51.6 on.

In der 4c ist eine Seitenansicht der Entnahme eines Rahmens 23 mit in dieser Darstellung nicht sichtbaren Festprobe 13 am Ende der Kammer 40 gezeigt. Die Entnahme erfolgt mittels eines Greifers 70. Alternativ kann der Greifer 70 auch eine Festprobe 13 ohne Rahmen 22 entnehmen. Beispielsweise kann der Greifer 70 als Vakuum-Sauggreifer ausgebildet sein.In the 4c is a side view of the removal of a frame 23 with solid sample not visible in this representation 13 at the end of the chamber 40 shown. The removal takes place by means of a gripper 70 , Alternatively, the gripper 70 also a festive test 13 without frame 22 remove. For example, the gripper 70 be designed as a vacuum suction pads.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

S₁ bis S₆ S ₁ to S ₆: Strömungsrichtungenflow directions
TT: Transportrichtung transport direction
1010: Probenflüssigkeitsample liquid
1111: ProbenflüssigkeitsbehältnisSample liquid container
1212: Probenfilmsample film
1313: Festprobe fixed sample
2020: Trägerflüssigkeitcarrier fluid
2121: Aufbring-OberflächeApplicatory surface
2222: Kühl-OberflächeCooling surface
2323: Rahmen frame
3030: Pipettepipette
3131: Pumpe pump
4040: Kammerchamber
40.1 bis 40.440.1 to 40.4: Kammerwändechamber walls
41.1, 41.241.1, 41.2: Propellerpropeller
42.1, 42.242.1, 42.2: Förderbänderconveyor belts
4343: Rollensystem roller system
50.1 bis 50.350.1 to 50.3: Gasströmegas flows
5151: FlüssiggasLPG
51.1 bis 51.651.1 to 51.6: Flüssiggasströme LPG streams
6060: Lagerungsboxstorage box
61.1 bis 61.661.1 to 61.6: Lagerfächer storage compartments
7070: Greifergrab

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2007/054160 A2 [0007]
DE 102010053461 A1 [0008]
WO 2004/017732 [0009]
US Pat. No. 5,780,295 [0010]

Claims

Method for freezing a sample liquid (10) containing biological cells and / or tissue, in particular a blood component, comprising the steps: a) providing a carrier liquid (20) which is immiscible with the sample liquid (10), b) applying the sample liquid (10) to the carrier liquid (20) so that the sample liquid (10) is distributed on an application surface (21) of the carrier liquid to a sample film (12) and c) cooling the sample film (12) to form a frozen solid sample (13).

Method according to Claim 1 , characterized in that the pour point of the carrier liquid (20) is below a freezing point of the sample liquid (10), preferably at less than -10 ° C.

Method according to Claim 1 or 2 , characterized in that the carrier liquid (20) consists at least partially of perfluorocarbon, preferably perfluorotributylamine.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the sample liquid (10) contains a cryoprotectant, wherein preferably the mass concentration of the cryoprotective in the sample mixture thereby obtained is at most 40%.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that for cooling the sample film (12) and / or the solid sample (13) a) the carrier liquid (20) to a temperature below the freezing point of the sample liquid (10), in particular below -10 Is cooled and / or b) liquid gas or cryogenic vapor (51) is brought into thermal contact with the sample film (12) and / or the solid sample (13).

Method according to one of the preceding claims, characterized by the step: transporting the sample film (12) and / or the solid sample (13) at least partially along a surface of the carrier liquid (20), wherein the sample film (12) and / or the solid sample (13 a) is cooled during transportation and / or b) on a cooling surface (22) remote from the application surface (21) to which the sample film (12) and / or the solid sample (13) has been transported and is preferably formed by the carrier liquid (20), is cooled.

Method according to Claim 6 , characterized in that the transporting of the sample film (12) and / or the solid sample (13) a) by means of at least one flow generated in the carrier liquid (20), b) by means of at least one of the sample film (12) and / or the solid sample (13) flowing gas stream (50.1, 50.2, 50.3), c) by means of at least one conveyor belt (42.1, 42.2) and / or d) within a sample film (12) and / or the solid sample (13) enclosing frame (23) ,

Method according to one of the preceding claims, characterized in that a) the sample liquid (10) is continuously applied to the carrier liquid (20) and / or b) the sample film (12) and / or the solid sample (13) is separated into individual subsamples ,

Device for freezing a sample cell (10) containing biological cells and / or tissues, in particular blood components a) one with the sample liquid (10) immiscible carrier liquid (20) and b) an application device (30, 31) for applying the sample liquid (10) to the carrier liquid (20), which is designed to distribute the sample liquid (10) on an application surface (21) of the carrier liquid (20), so that the Sample liquid (10) is distributed to a sample film (12), and c) a cooling device for cooling the sample film (12) to a frozen solid sample (13).

Frozen solid sample (13) containing biological cells and / or tissues, especially blood components, obtained by a method of the preceding claims.