DE102017112012A1

DE102017112012A1 - Bioorthogonal 3D in situ hydrogels in the form of a carrier immobilized network for biosensors and method for their preparation

Info

Publication number: DE102017112012A1
Application number: DE102017112012.2A
Authority: DE
Inventors: Rainer Haag; Lena Kaufmann; Uwe Schedler
Original assignee: Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2017-11-30

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Netzwerk zum Nachweis von Analyten, gebildet mittels Reaktion aus den drei Komponenten Netzwerkknoten, Verbindungsstücken und den zu analysierenden Gastmolekülen, wobei a) die Netzwerkknoten jeweils ein funktionalisiertes, dendritisches oder ein sternenförmiges Polymer sind, b) die Verbindungsstücke jeweils ein lineares, polymeres bifunktionelles Molekül sind, c) sich das Gastmolekül in den von Netzwerkknoten und Verbindungsstücken gebildeten Maschen befindet, und d) das Netzwerk auf einem Substrat immobilisiert als Hydrogel vorliegt, sowie ein Verfahren zur Herstellung des auf einem Träger immobilisierten NetzwerkesThe invention relates to a network for the detection of analytes, formed by reaction of the three components network nodes, connectors and the guest molecules to be analyzed, wherein a) the network nodes are each a functionalized, dendritic or a star-shaped polymer, b) the connectors each have a linear, polymeric bifunctional molecule, c) the guest molecule is located in the meshes formed by network nodes and connectors, and d) the network is immobilized on a substrate as a hydrogel, as well as a process for the preparation of the network immobilized on a support

Description

Die Erfindung betrifft ein auf einem Träger immobilisiertes Netzwerk zum Nachweis von Analyten sowie ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Träger immobilisierten Netzwerkes. The invention relates to a network immobilized on a support for the detection of analytes and to a process for the preparation of a network immobilized on a support.

Der spezifische Nachweis von Analyten spielt eine wesentliche Rolle in der chemischen, biochemischen und klinischen Analytik. The specific detection of analytes plays an essential role in chemical, biochemical and clinical analysis.

Im analytischen Bereich erfolgt die Bindung von aktiven Biomolekülen an festen Materialien bzw. Oberflächen oft adsorptiv über elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen oder dispersive Kräfte und gilt als schwer kontrollierbar und zum Teil nur begrenzt stabil. Sowohl die große räumliche Nähe zur Oberfläche als auch der Adsorptionsprozess an sich kann dabei insbesondere die aktiven Stellen des Proteins negativ beeinflussen und somit die biologische Aktivität eines Biomoleküls wie z. B. eines Proteins herabsetzen. ( V. Hlady, J. Buijs, Curr. Opin. Biotechnol. 1996, 7, 72 ; J. J. Gray, Curr. Opin. Struct. Biol. 2004, 14, 110 ; P. Jonkheim, D. Weinrich, H. Schröder, C. M. Niemeyer, H. Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9618 .) In the analytical field, the binding of active biomolecules on solid materials or surfaces is often adsorptive via electrostatic interactions, hydrogen bonds or dispersive forces and is considered to be difficult to control and partly only limited stability. Both the large spatial proximity to the surface and the adsorption process per se can adversely affect in particular the active sites of the protein and thus the biological activity of a biomolecule such. B. reduce a protein. ( V. Hlady, J. Buijs, Curr. Opin. Biotechnol. 1996, 7, 72 ; JJ Gray, Curr. Opin. Struct. Biol. 2004, 14, 110 ; P. Jonkheim, D. Weinrich, H. Schröder, CM Niemeyer, H. Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9618 .)

Alternativ erfolgt eine reaktive Immobilisierung durch kovalente Bindungsknüpfung zwischen Trägermaterial und Biomolekül. Dieser Weg verspricht eine größere Robustheit und Kontrollmöglichkeit. Gleichzeitig gilt auch hier, dass eine Beladung der Oberfläche durch den maximalen Bedeckungsgrad begrenzt ist und einer statistischen Verteilung der Proteinorientierungen auf der Oberfläche unterliegt. Da die Präsentation der aktiven Stellen bzw. der Bindungstaschen des Biomoleküls für die molekulare Erkennung wichtig ist und daher für die Assay-Performance oder auch für die Zelladhäsion entscheidend ist, sollten die jeweiligen Biomoleküle dabei idealerweise gerichtet, bzw. orientiert auf der Oberfläche gebunden sein. Die korrekte Orientierung der immobilisierten Biomoleküle auf der Oberfläche stellt daher stets eine Herausforderung dar. ( W. Kusnezow, J. D. Hoheisel., J. Mol. Recognit. 2003, 16, 165 ) Alternatively, a reactive immobilization by covalent bond formation between carrier material and biomolecule takes place. This path promises greater robustness and control. At the same time, it also applies here that loading of the surface is limited by the maximum degree of coverage and is subject to a statistical distribution of the protein orientations on the surface. Since the presentation of the active sites or the binding pockets of the biomolecule is important for molecular recognition and is therefore crucial for assay performance or for cell adhesion, the respective biomolecules should ideally be oriented or bound on the surface. The correct orientation of the immobilized biomolecules on the surface therefore always presents a challenge. W. Kuznetsov, JD Hoheisel., J. Mol. Recognit. 2003, 16, 165 )

Für eine höhere Beladung mit Biomolekülen kommen 3-dimensional beschichtete Oberflächen zum Einsatz. Hierbei kann zwischen dem Einsatz von dendritischen Polymeren oder Gelen wie z. B. Polyacrylamid-Gelen unterschieden werden. Allerdings stellen hier die zu große Diffusionsbarriere und damit verbundene zu lange Inkubationszeiten bis das thermodynamische Gleichgewischt eintritt oftmals das größte Hindernis dar. Des Weiteren kommt es auch hier in der Regel zu einer kovalenten oder nicht-kovalenten Wechselwirkung zum Biomolekül um es im Gel zu halten und ein Hinausdiffundieren zu verhindern. ( S. Li, M. Yang, W. Zhou, T. G. Johnston, R. Wang, J. Zhu, Appl. Surf. Sci. 2015, 355, 570 ; P. Arenkov, A. Kukhtin, A. Gemmell, S. Voloshchuk, V. Chupeeva, A. Mirzabekov, Anal. Biochem. 2000, 278, 123 ; D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D. Proudnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Anal. Biochem. 1997, 250, 203 ; A. V. Vasiliskov, E. N. Timofeev, S. A. Surzhikov, A. L. Drobyshev, V. V. Shick, A. D. Mirzabekov, Biotechniques 1999, 27, 592 ; S. Piletsky, E. Piletska, A. Bossi, N. Turner, A. Turner, Biotechnol. Bioeng. 2003, 82, 86 .) For a higher loading with biomolecules, 3-dimensionally coated surfaces are used. Here, between the use of dendritic polymers or gels such. B. polyacrylamide gels can be distinguished. However, here are the too large diffusion barrier and associated to long incubation times until the thermodynamic Gleichgewischt occurs often the biggest obstacle. Furthermore, it is also here usually a covalent or non-covalent interaction with the biomolecule to keep it in the gel and to prevent outward diffusion. ( Li, M. Yang, W. Zhou, TG Johnston, R. Wang, J. Zhu, Appl. Surf. Sci. 2015, 355, 570 ; P. Arenkov, A. Kukhtin, A. Gemmell, S. Voloshchuk, V. Chupeeva, A. Mirzabekov, Anal. Biochem. 2000, 278, 123 ; D. Gushin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D. Proudnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Anal. Biochem. 1997, 250, 203 ; AV Vasiliskov, EN Timofeev, SA Surzhikov, AL Drobyshev, VV Shick, AD Mirzabekov, Biotechniques 1999, 27, 592 ; S. Piletsky, E. Piletska, A. Bossi, N. Turner, A. Turner, Biotechnol. Bioeng. 2003, 82, 86 .)

Insbesondere bei der Immobilisierung von großen Biomolekülen auf Oberflächen mit funktionalisierten dendritischen Polymeren können außerdem nur wenige der funktionellen Gruppen für eine chemische Reaktion erreicht werden und verbleiben nicht abreagiert in der Matrix. So wurde z. B. im Fall der kovalenten Immobilisierung von Streptavidin an eine Polyacryl-säure-Oberfläche gezeigt, dass nur 0,1 % der Carboxylgruppen erreicht werden. Durch Einführung von Copolymeren konnte dieser Wert um den Faktor 5 gesteigert werden, was jedoch noch immer sehr wenig ist. ( A. Hennig, H. Borcherding, C. Jaeger, S. Hatami, C. Würth, A. Hoffmann, K. Hoffmann, T. Thiele, U. Schedler, U. Resch-Genger, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8268 ; A. Hennig, A. Hoffmann, H. Borcherding, T. Thiele, U. Schedler, U. Resch-Genger, Chem. Comm. 2011, 47, 7842 .) In particular, in the immobilization of large biomolecules on surfaces with functionalized dendritic polymers only a few of the functional groups for a chemical reaction can be achieved and remain unreacted in the matrix. So z. For example, in the case of covalent immobilization of streptavidin to a polyacrylic acid surface, only 0.1% of the carboxyl groups are achieved. By introducing copolymers, this value could be increased by a factor of 5, which is still very low. ( A. Hennig, H. Borcherding, C. Jaeger, S. Hatami, C. Würth, A. Hoffmann, K. Hoffmann, T. Thiele, U. Schedler, U. Resch-Genger, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8268 ; A. Hennig, A. Hoffmann, H. Borcherding, T. Thiele, U. Schedler, U. Resch-Genger, Chem. Comm. 2011, 47, 7842 .)

Ein weiteres Problem stellt der eigentliche Prozess der Oberflächenbeschichtung bei vorausgegangener separater Herstellung eines Hydrogels dar: Mit dieser Technik sind zwar definierte Hydrogele herstellbar, das Aufbringen auf die Oberfläche des Trägers (z. B. mittels Spincoating) gestaltet sich aber oftmals schwierig, da Schichtdickenschwankungen kaum zu vermeiden sind. Zudem sind viele Geometrien und Formate wie z. B. Mikrotiterplatten so nur schwer zugänglich. Letztendlich kann die Haftung der Hydrogele durch kovalente Verankerung (grafting to) am Träger nur durch separate Aktivierung des Trägers selbst, beispielsweise durch eine Plasmabehandlung erfolgen. A further problem is the actual process of the surface coating with preceding separate preparation of a hydrogel: Although definite hydrogels can be produced with this technique, application to the surface of the support (eg by means of spincoating) is often difficult since layer thickness fluctuations hardly occur to avoid. In addition, many geometries and formats such. B. microtiter plates so difficult to access. Ultimately, the adhesion of the hydrogels by covalent grafting to the carrier can only be done by separate activation of the carrier itself, for example by a plasma treatment.

In ZHANG, X. [u. a.]: Micro- and nanogels with labile crosslinks – from synthesis to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. (2015) 44, 1948–1973 , und STEINHILBER, D. [u. a.]: A Microgel Construction Kit for Bioorthogonal Encapsulation and pH-Controlled Release of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (2013) 52: 13538–13543 , wird die Herstellung eines Mikrogels mit eingeschlossenen Zellen, ausgehend von dendritischem dPG-polyazid als Netzwerkknoten und bifunktionellem PEG-DIC als Verbindungsstück beschrieben. In ZHANG, X. [ua]: Micro- and nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. (2015) 44, 1948-1973 , and STEINHILBER, D. [ua]: A Microgel Construction Kit for Bioorthogonal Encapsulation and pH-Controlled Release of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (2013) 52: 13538-13543 describes the preparation of an entrapped cell microgel based on dendritic dPG polyazide as a network node and a bifunctional PEG DIC as a connector.

Hydrogel-basierte Analyt-Nachweissysteme werden in LE GOFF, G. C. [u. a.]: Hydrogel microparticles for biosensing. Eur. Polym. J. (2015) 72: 386–412, Seiten 1–49 , offenbart. Hydrogel-based analyte detection systems are used in LE GOFF, GC [et al]: Hydrogel microparticles for biosensing. Eur. Polym. J. (2015) 72: 386-412, pages 1-49 , disclosed.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Netzwerk vorzuschlagen, das die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise behebt. The invention has for its object to propose a network that at least partially solves the disadvantages of the prior art.

Die Aufgabe wird durch ein Netzwerk mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 10 gelöst. The object is achieved by a network having the features of claim 1 and a method having the features of claim 10.

Es wird ein erfindungsgemäßes Netzwerk, das als Hydrogel vorliegt, bereitgestellt, das aus Netzwerkknoten, Verbindungsstücken und zu analysierenden Gastmolekülen besteht, wobei

a) die Netzwerkknoten aus einem funktionalisiertem, dendritischen oder einem sternenförmigen Polymer bestehen,
b) die Verbindungsstücke jeweils ein lineares, polymeres bifunktionelles Molekül sind,
c) sich die Gastmoleküle in von den Netzwerkknoten und Verbindungsstücken gebildeten Maschen befinden, und
d) das Netzwerk auf einem Substrat immobilisiert ist.

There is provided a network according to the invention, which is present as a hydrogel, which consists of network nodes, connecting pieces and guest molecules to be analyzed, wherein

a) the network nodes consist of a functionalized, dendritic or star-shaped polymer,
b) the connecting pieces are each a linear, polymeric bifunctional molecule,
c) the guest molecules are located in meshes formed by the network nodes and connectors, and
d) the network is immobilized on a substrate.

Das erfindungsgemäße Netzwerk zeichnet sich vorteilhafterweise dadurch aus, dass sowohl die Knotenpunkte des Netzwerkes als auch die Verbindungsstücke bioorthogonal sind und daher keinen Einfluss auf die Struktur und Funktion von Gastmolekülen ausüben. Das auf dem Substrat immobilisierte Netzwerk weist eine räumliche Ausdehnung auf, die durch die Dimensionierung des Substrats und die Schichtdicke des Netzwerkes bestimmt wird. The network according to the invention is advantageously characterized in that both the nodes of the network and the connecting pieces are bioorthogonal and therefore exert no influence on the structure and function of guest molecules. The immobilized on the substrate network has a spatial extent, which is determined by the dimensioning of the substrate and the layer thickness of the network.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Schichtdicke vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 nm, besonders bevorzugt bei 300 nm. According to a preferred embodiment of the invention, the layer thickness is preferably in the range of 50 to 500 nm, particularly preferably 300 nm.

Bei den bevorzugten Schichtdicken und insbesondere bei 300 nm wird bei Verwendung des Netzwerkes als Biosensor ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erhalten. At the preferred layer thicknesses and in particular at 300 nm, a good signal-to-noise ratio is obtained when using the network as a biosensor.

Die erfindungsgemäßen Netzwerke stellen somit bioorthogonale 3D-in situ-Hydrogele, insbesondere für Biosensoren dar. The networks according to the invention thus represent bioorthogonal 3D in situ hydrogels, in particular for biosensors.

Knotenpunkte und Verbindungsstücke sind dabei vorzugsweise so funktionalisiert, dass eine Verknüpfung bei Raumtemperatur in wässriger Lösung und in Gegenwart der Gastmoleküle ohne weitere Zugabe eines Katalysators stattfindet. Junctions and connecting pieces are preferably functionalized such that a linkage takes place at room temperature in aqueous solution and in the presence of the guest molecules without further addition of a catalyst.

Als Netzwerkknoten wird vorzugsweise ein dendritisches Polyglycerol-Derivat, deren Mn vorzugsweise 5000–10000 kDa beträgt, verwendet, die eine variable Anzahl an Anknüpfungspunkten aufweisen können, jedoch müssen mindestens vier Anknüpfungspunkte pro Netzwerknoten gegeben sein. Vorzugsweise sind bis zu 20, besonders bevorzugt bis 15, und am bevorzugtesten bis zu 10 Anknüpfungspunkte vorgesehen. As the network node, a dendritic polyglycerol derivative whose Mn is preferably 5000-10000 kDa is preferably used, which may have a variable number of attachment points, but at least four attachment points must be given per network node. Preferably, up to 20, more preferably up to 15, and most preferably up to 10 attachment points are provided.

Die Netzwerkknoten weisen vorzugsweise eine Funktionalität als Azid, Cyclooctin, Cycloocten, Tetrazin, Thiol, Vinyl, Acrylat und/oder Methacrylat auf, besonders bevorzugt Azid und Cyclooctin. The network nodes preferably have a functionality as azide, cyclooctyne, cyclooctene, tetrazine, thiol, vinyl, acrylate and / or methacrylate, more preferably azide and cyclooctyne.

Der Funktionalisierungsgrad der Netzwerkknoten liegt vorzugsweise bei 2 bis 30 %, besonders bevorzugt vorzugsweise 5 bis 20 % und am bevorzugtesten bei 10%. The degree of functionalization of the network nodes is preferably 2 to 30%, more preferably 5 to 20% and most preferably 10%.

Vorzugsweise sind die Verbindungsstücke Polyethylenglycol oder ein lineares Polyglycerol, die eine in Abhängigkeit vom Gastmolekül gewählte Kettenlänge aufweisen. Als geeignet für einen breiten Anwendungsbereich haben sich PEG 3000, PEG 6000 und PEG 10000 erwiesen. Daher bewegen sich bevorzugte Kettenlängen im Rahmen dieser Beispiele. Preferably, the links are polyethylene glycol or a linear polyglycerol having a chain length chosen depending on the guest molecule. PEG 3000, PEG 6000 and PEG 10000 have proven to be suitable for a wide range of applications. Therefore, preferred chain lengths are within these examples.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines auf einem Träger immobilisierten Netzwerkes ist dadurch gekennzeichnet, dass Azid-funktionalisierte dendritische Polyglycerol-Einheiten und difunktionales Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin in Gegenwart von Gastmolekülen in Wasser miteinander vermischt werden und anschließend das Gemisch auf eine Oberfläche eines Substrats aufgebracht wird, wobei sich eine Hydrogelschicht ausbildet. The process according to the invention for the preparation of a network immobilized on a support is characterized in that azide-functionalized dendritic polyglycerol units and difunctional poly (ethylene glycol) -dicyclooctyne are mixed together in the presence of guest molecules in water and then the mixture is applied to a surface of a substrate becomes, wherein a hydrogel layer is formed.

Die Umsetzung von Azid-funktionalisierten dendritischen Polyglycerol-Einheiten und difunktionalen Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin erfolgt mittels spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition in Gegenwart in Wasser. The reaction of azide-functionalized dendritic polyglycerol units and difunctional poly (ethylene glycol) -dicyclooctyne is carried out by means of a voltage-mediated azide-alkyne cycloaddition in the presence of water.

Das mit dem Gemisch versehene Substrat kann gegebenenfalls über einen vorgegebenen Zeitraum (Minuten), der sich durch die Geschwindigkeit der Vernetzung und der Schichtdicke des Netzwerkes bestimmt, ruhen gelassen werden oder bis die Bildung einer Hydrogelschicht festgestellt wird. Optionally, the substrate provided with the mixture may be allowed to rest for a predetermined period of time (minutes) determined by the rate of crosslinking and the layer thickness of the network or until formation of a hydrogel layer is detected.

Damit das im Netzwerk befindliche Wasser nicht verdunstet, erfolgt dies vorzugsweise in einer Atmosphäre mit einem Feuchtigkeitigkeitsgehalt von vorzugsweise > 90% relative Luftfeuchtigkeit. So that the water in the network does not evaporate, this is preferably done in an atmosphere with a moisture content of preferably> 90% relative humidity.

Das verfahrensgemäß eingesetzte Substrat besteht vorzugsweise aus Siliciumdioxid oder Silicium, dessen Oberfläche funktionalisiert sein kann, vorzugsweise erfolgt dies durch Silanisierung. The substrate used according to the method preferably consists of silicon dioxide or silicon whose surface may be functionalized, preferably this is done by silanization.

Das Auftragen des Gemischs erfolgt vorzugsweise mittels Spincoating, Spraycoating, Rakeln oder Spotten. Alternativ kann dies auch durch Immobilisierung mittels Kern-Schale-Struktur oder kovalenter Verankerung auf Partikeln erfolgen. The application of the mixture is preferably carried out by means of spin coating, spray coating, knife coating or spotting. Alternatively, this can also be done by immobilization by means of core-shell structure or covalent anchoring on particles.

Das erfindungsgemäße Netzwerk hat die Vorteile:

a) Aufgrund der 3D-Struktur eine hohe Beladungsmöglichkeit zu garantieren. Durch die Immobilisierung auf entsprechenden Oberflächen (die als äußere Grenzfläche eines makroskopischen Feststoffes verstanden werden), wird der sonst begrenzte Bedeckungsgrad der Oberfläche aufgehoben und eine höhere Beladung erreicht.
b) Keine langen Diffusionszeiten zu haben, da die Gastmoleküle bereits vor Ausbildung des Netzwerkes beigemischt werden und sich so direkt bei Netzwerkbildung verteilen.
c) Eine optimale Verteilung des Gastmoleküls zu gewährleisten.
d) Keine störenden Wechselwirkungen der Netzwerkkomponenten zum Gastmolekül aufgrund der gewährleisteten Bioorthogonalität.
e) Vollständige Erhaltung der Funktionalität des Gastmoleküls und Zugänglichkeit aller Bindungsstellen.
f) Kein „Ausbluten“ des Gastmoleküls aus dem Netzwerk.
g) Anpassungsmöglichkeit der Maschenweite des Netzwerkes zum optimalen Einschluss eines Gastmoleküls.
h) Automatische Vorfilterfunktion durch die Gelmatrix.
i) Variationsmöglichkeit der Schichtdicke.

The network according to the invention has the advantages:

a) Due to the 3D structure to guarantee a high loading capacity. By immobilizing on appropriate surfaces (which are considered to be the outer interface of a macroscopic solid), the otherwise limited coverage of the surface is removed and higher loading is achieved.
b) Do not have long diffusion times, since the guest molecules are mixed before the formation of the network and thus distribute directly in network formation.
c) To ensure an optimal distribution of the guest molecule.
d) No disturbing interactions of the network components to the guest molecule due to the guaranteed bioorthogonality.
e) Complete preservation of the functionality of the guest molecule and accessibility of all binding sites.
f) No "bleeding" of the guest molecule from the network.
g) adaptability of the mesh size of the network for optimal inclusion of a guest molecule.
h) Automatic pre-filter function through the gel matrix.
i) variation possibility of the layer thickness.

Es kann jeweils mindestens eine Art aber auch verschiedene Gastmoleküle in das Netzwerk eingeschlossen werden. Diese sind vorzugsweise aus der Gruppe der aktiven Biomoleküle ausgewählt, nämlich:

– Proteine, darunter fallen auch Enzyme, Enzymfragmente, Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide,
– Viren, Virenhüllen,
– Bakterien,
– Saccharide sowie deren Oligo- und Polymere,
– DNA oder RNA, darunter fallen auch Oligonukleotide, miRNA,
– oder Kombinationen aus oben genannten Biomolekülen.

In each case at least one kind but also different guest molecules can be included in the network. These are preferably selected from the group of active biomolecules, namely:

- Proteins, including enzymes, enzyme fragments, antibodies, antibody fragments, peptides,
- viruses, virus envelopes,
- bacteria,
Saccharides and their oligo- and polymers,
DNA or RNA, including oligonucleotides, miRNA,
- or combinations of the above-mentioned biomolecules.

Das erfindungsgemäße Netzwerk zeichnet sich u. a. durch folgende Eigenschaften aus.

– Das Netzwerk stellt ein Hydrogel mit vorherrschender gleichmäßiger wässriger Umgebung dar, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur und damit die Funktionalität und Bindungsstellen des Gastmoleküls durch die Bioorthogonalität des Netzwerkknotens und Verbindungsstücks nicht beeinflusst wird.
– Das Netzwerk stellt sich als in-situ-Reaktion bevorzugt bei Raumtemperatur innerhalb weniger Minuten durch Reaktion der Netzwerkknoten und Verbindungsstücke überraschenderweise unter gleichzeitigem Einschluss oder kovalenter Verknüpfung des Gastmoleküls dar.
– Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass das Gastmolekül das Netzwerk durch Diffusion nicht verlassen kann, aber jedoch die Diffusion von kleineren Molekülen möglich ist
– Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass es in Abhängigkeit des Gastmoleküls temperaturstabil mindestens bis 90°C ist.
– Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass es in Abhängigkeit des Gastmoleküls in wässrigen Medien in einem Bereich von mindestens pH 4 bis mindestens pH 11 stabil ist
– Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass es als Filter wirken kann, da größere Moleküle nicht hinein diffundieren können.

The network according to the invention is characterized, inter alia, by the following properties.

The network represents a hydrogel with a predominantly uniform aqueous environment, characterized in that the structure and thus the functionality and binding sites of the guest molecule are not influenced by the bioorthogonality of the network node and connector.
The network turns out to be an in situ reaction preferably at room temperature within a few minutes by reaction of the network nodes and connecting pieces surprisingly with simultaneous inclusion or covalent linking of the guest molecule.
- The network is characterized in that the guest molecule can not leave the network by diffusion, but the diffusion of smaller molecules is possible
- The network is characterized in that it is thermally stable at least up to 90 ° C depending on the guest molecule.
The network is characterized in that it is stable in a range from at least pH 4 to at least pH 11, depending on the guest molecule in aqueous media
The network is characterized in that it can act as a filter, as larger molecules can not diffuse into it.

Die voranstehenden Ausführungen betreffen das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Netzwerk gleichermaßen. The above statements relate equally to the method according to the invention and the network according to the invention.

Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den Unteransprüchen genannten Merkmalen. Further preferred embodiments of the invention will become apparent from the remaining, mentioned in the dependent claims characteristics.

Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen The invention will be explained in more detail in embodiments with reference to the accompanying drawings. Show it

1 eine schematische Darstellung der in-situ Netzwerkbildung als 3D-Matrix zur Einlagerung von aktiven Biomolekülen. Die 3D-Matrix dient zudem gleichzeitig als Filter, der große, störende Komponenten nicht hineinlässt, 1 a schematic representation of in-situ network formation as a 3D matrix for the incorporation of active biomolecules. At the same time, the 3D matrix also serves as a filter that does not let in large, disruptive components.

2A die verwendeten Netzwerkkomponenten: Knotenpunkte und Verbindungsstücke für Beispiel 1: den Einschluss von Streptavidin, 2A the network components used: junctions and junctions for example 1: the inclusion of streptavidin,

2B die Verknüfung der Netzwerkomponenten mittels spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition unter Ausbildung eines Triazolrings, 2 B the linking of the network components by means of voltage-mediated azide-alkyne cycloaddition to form a triazole ring,

2C die schematische Darstellung der so ausgebildeten Netzstruktur zwischen den Gelbausteinen, 2C the schematic representation of the network structure formed between the yellow bricks,

2D eine schematische Darstellung der in Gegenwart von Gastmolekülen ausgebildeten Netzstruktur, bei der die Gastmoleküle in den Maschen sitzen, 2D a schematic representation of the formed in the presence of guest molecules network structure in which the guest molecules sit in the mesh,

3 die kovalente Anbindung von Oligonukleotidsequenzen durch spannungsvermittelte Azid-Alkin-Cycloaddition an die Netzwerkknotenpunkte, 3 the covalent attachment of oligonucleotide sequences by voltage-mediated azide-alkyne cycloaddition to the network nodes,

4 den Vergleich eines kommerziellen Streptavidin-Slides mit unserem neu entwickelten Netzwerk-Slide mit eingeschlossenem Streptavidin, und 4 the comparison of a commercial streptavidin slide with our newly developed streptavidin-containing network slide, and

5 Beladung des in situ Hydrogels mit unterschiedlichen Mengen Anti-FLAG Antikörper; 1: 1 μg/cm2; 2: 2 μg/cm2; 3: 3 μg/cm2. 5 Loading the in situ hydrogel with different amounts of anti-FLAG antibody; 1: 1 μg / cm 2; 2: 2 μg / cm 2; 3: 3 μg / cm2.

1 zeigt die schematische Struktur der Netzwerkbildung und des fertigen Netzwerkes. Die Gastmoleküle sitzen in den von den Knotenpunkten und Verbindungsstücken aufgespannten Maschen. Die Diffusion kleinere Moleküle ist uneingeschränkt möglich, während das Netzwerk gleichzeitig als Filter wirkt, der zu große Moleküle nicht hineinlässt. Die Größe der Maschen kann durch Variation der Länge des Verbindungsstücks angepasst werden. 1 shows the schematic structure of the network formation and the finished network. The guest molecules sit in the meshes spanned by the nodes and connectors. The diffusion of smaller molecules is possible without restriction, while at the same time the network acts as a filter that does not let too large molecules into it. The size of the stitches can be adjusted by varying the length of the connector.

3 zeigt die schematische Darstellung der kovalenten Anbindung eines Oligonukleotids. Diese Methode eignet sich für kleine Moleküle wie kurze DNA-Stränge um ein hinausdiffundieren zu verhindern. 3 shows the schematic representation of the covalent attachment of an oligonucleotide. This method is suitable for small molecules such as short DNA strands to prevent them from diffusing out.

Beispiel 1: Example 1:

Ein konkretes Beispiel für eine deutlich höhere Beladung eines mit dem Netzwerk, in welches Streptavidin eingeschlossen wurde, beschichteten Slides gegenüber eines kommerziellen Streptavidin-Slides zeigt 4. Beide Slides wurden mit Fluoreszenz-markiertem Biotin versetzt und nach geeignetem Waschprozess die Fluoreszenz gemessen. Durch Vergleich zum Netzwerk ohne Streptavidin und der dabei nicht Detektion von Fluoreszenz wurde eine unspezifische Wechselwirkung des Fluoreszenz-markierten Biotins an das Netzwerk ausgeschlossen. Der Netzwerk-Slide zeigt dabei eine mindestens um den Faktor 8 erhöhte Beladung. A concrete example of a significantly higher loading of a slide coated with the streptavidin-coated network into a commercial streptavidin slide 4 , Both slides were mixed with fluorescence-labeled biotin and the fluorescence was measured after a suitable washing process. By comparison to the network without streptavidin and the non-detection of fluorescence, a non-specific interaction of the fluorescence-labeled biotin was excluded to the network. The network slide shows at least a factor of 8 increased loading.

Die verwendeten Knotenpunkte und Verbindungsstücke zur Darstellung des Netzwerkes mit Streptavidin zeigt 2A. The junctions and junctions used to represent the streptavidin network 2A ,

Beispiel 2: Example 2:

Mit den gleichen Netzwerkkomponenten wie in Beispiel 1 benannt und in 2A gezeigt kann auch ein Anti-FLAG Antikörper in das Gel eingeschlossen werden, die Bindungsstelle für das FLAG-Peptid bleibt vollständig zugänglich, so dass dieses mittels Diffusion an den eingeschlossenen Antikörper binden kann. Unterschiedliche Zugaben an Antikörper vor der Netzwerkbildung führt zu einer unterschiedlichen Beladung des anschließend gebildeteren Netzwerks wie 5 zeigt. Die Beladung des Netzwerkes erfolgte mit 1: 1 μg/cm2; 2: 2 μg/cm2; 3: 3 μg/cm2 Antikörper. Anschließend wurde Peptid-Lösung hinzugegeben und nach geeignetem Waschprozess die Fluoreszenz bestimmt. Es zeigt sich eine deutliche Abhängigkeit zur hinzugegebenen und damit im Gel eingeschlossenen Menge an Antikörper. Named with the same network components as in Example 1 and in 2A Alternatively, an anti-FLAG antibody can be included in the gel, the binding site for the FLAG peptide remaining fully accessible so that it can bind to the entrapped antibody by diffusion. Different additions of antibody prior to network formation results in a different loading of the subsequently formed network such as 5 shows. The loading of the network was carried out with 1: 1 μg / cm 2; 2: 2 μg / cm 2; 3: 3 μg / cm2 antibody. Subsequently, peptide solution was added and, after a suitable washing process, the fluorescence was determined. There is a clear dependence on the amount of antibodies added and thus included in the gel.

Beispiel 3: Example 3:

Mit den gleichen Netzwerkkomponenten wie in Beispiel 1 benannt und in 2A gezeigt können auch Oligonukleotidstränge wie in 3 gezeigt in das Gel implementiert werden. Zur Vermeidung eines einfachen Hinausdiffundieren dieser kurzen Sequenzen wird hierbei auf eine kovalente Verknüpfung der Oligonukleotidstränge an die Netzwerkknotenpunkte gesetzt. Hierzu tragen die Oligonukleotidstränge eine geeignete Funktionalität, im konkreten Beispiel eine Cyclooctin-Einheit wie in 3 zu sehen. Prinzipiell lassen sich Oligonukleotidstränge dieser Art auch im Anschluss in das bereits fertig gebildete Netzwerk binden. Der in-situ Ansatz gewährleistet jedoch eine deutlich bessere Verteilung der Oligonukleotidstränge im Netzwerk und führt zu einer wesentlich höheren Beladung. Passende Gegenstränge können zur Hybridisierung problemlos in das Netzwerk hineindiffundieren. Named with the same network components as in Example 1 and in 2A Oligonucleotide strands can also be shown as shown in FIG 3 shown to be implemented in the gel. In order to avoid a simple outward diffusion of these short sequences, a covalent linkage of the oligonucleotide strands to the network nodes is hereby set. For this purpose, the oligonucleotide strands carry a suitable functionality, in the specific example a cyclooctyne moiety as in 3 to see. In principle, oligonucleotide strands of this type can also be subsequently bound into the already formed network. However, the in-situ approach ensures a significantly better distribution of the oligonucleotide strands in the network and leads to a much higher loading. Appropriate counterparts can easily diffuse into the network for hybridization.

Synthesevorschrift synthesis Method

Erfindungsgemäße Netzwerke zum hochsensitiven Nachweis von Analyten bestehend aus Azid-funktionalisierten dendritischen Polyglycerol-Einheiten und difunktionalem Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin gemäß , die gemäß spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition miteinander reagieren, in Gegenwart von Gastmolekülen, aber ohne dass diese an der Netzwerk-Bildungs Reaktion teilhaben oder von der Reaktion in anderer Form als dem bloßen Einschluss oder der kovalenten Anknüpfung beeinflusst werden. Networks according to the invention for the highly sensitive detection of analytes consisting of azide-functionalized dendritic polyglycerol units and difunctional poly (ethylene glycol) -dicyclooctyne according to which react with one another according to the strain-mediated azide-alkyne cycloaddition in the presence of guest molecules, but without participating in the network-forming reaction or being affected by the reaction in any form other than mere inclusion or covalent attachment.

Streptavidin-Einschluss: Streptavidin-inclusion:

0,0017 mmol des PEG3000-Dicyclooctin, 0,0001 mmol des azidfunktionalisierten dendritischen Polyglycerols, 0,000005 mmol Streptavidin werden in 100 µl Wasser gegeben, 30 Sekunden geschüttelt auf dem Vortex und nach 8 Minuten Wartezeit per Spincoating, 120 Sekunden 200 Umdrehungen pro Minute, 60 Sekunden 1500 Umdrehungen pro Minute, auf einer 2 × 2cm2 großen Oberfläche aufgebracht. Es bildet sich eine Hydrogelschicht mit der Schichtdicke 300 nm. 0,000017 mmol des PEG3000-Dicyclooctin, 0,000001 mmol des azidfunktionalisierten dendritischen Polyglycerols, 0,00000005 mmol Streptavidin werden in 10 µl Wasser gegeben, 30 Sekunden geschüttelt auf dem Vortex und auf einer 1 × 1cm2 großen Oberfläche aufgetragen und über Nacht zur Netzwerkbildung in einer Feuchtekammer aufbewahrt. 0.00175 mmol of the PEG3000 dicyclooctyne, 0.0001 mmol of the azide-functionalized dendritic polyglycerol, 0.000005 mmol of streptavidin are added to 100 μl of water, shaken for 30 seconds on a vortex and after 8 minutes of waiting time by spin coating, 120 seconds of 200 revolutions per minute , 60 seconds at 1500 rpm, applied to a 2 × 2 cm 2 surface. It forms a hydrogel layer with the layer thickness 300 nm. 0.000017 mmol of PEG3000 dicyclooctin, 0.000001 mmol of azide-functionalized dendritic polyglycerol, 0.00000005 mmol streptavidin be placed in 10 ul of water, shaken for 30 seconds on a vortex and on a 1 × 1 cm 2 surface and stored overnight in a humidity chamber for network formation.

Antikörper-Einschluss: Antibody including:

0,000017 mmol des PEG3000-Dicyclooctin, 0,000001 mmol des azidfunktionalisierten dendritischen Polyglycerols, 1 μg, 2 μg oder 3 μg Anti-FLAG Antikörper werden in 10 µl Wasser gegeben, 30 Sekunden geschüttelt auf dem Vortex und auf einer 1 × 1cm2 großen Oberfläche aufgetragen und über Nacht zur Netzwerkbildung in einer Feuchtekammer aufbewahrt. 0.000017 mmol of the PEG3000 dicyclooctyne, 0.000001 mmol of the azide-functionalized dendritic polyglycerol, 1 μg, 2 μg or 3 μg anti-FLAG Antibodies are added to 10 μl of water, shaken for 30 seconds on a vortex and applied to a 1 × 1 cm 2 surface and stored overnight in a humidity chamber for network formation.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims

A network for the detection of analytes, formed by reaction of the three components network nodes, connectors and the guest molecules to be analyzed, wherein a) the network nodes are each a functionalized, dendritic or a star-shaped polymer, b) the connecting pieces are each a linear, polymeric bifunctional molecule, c) the respective guest molecule is located in the meshes formed by network nodes and connecting pieces, and d) the network immobilized on a substrate is present as a hydrogel.

The network of claim 1, wherein the network node is a dendritic polyglycerol derivative.

The network of claim 1 or 2, wherein the network node is characterized by a variable number of attachment points, but at least four.

A network according to any one of claims 1 to 3, wherein the functionality of the network node is azide or cyclooctyne, or however cyclooctene, tetrazine, thiol, vinyl, acrylate, or methacrylate.

A network according to any one of claims 1 to 4, wherein the connector is polyethylene glycol or a linear polyglycerol.

A network according to any one of claims 1 to 5, wherein the connector is characterized by a variable length.

The network of any one of claims 1 to 6, wherein the functionality of the linker is preferably azide or cyclooctyne, or however, cyclooctene, tetrazine, thiol, vinyl, acrylate, or methacrylate.

A network according to any one of claims 1 to 7, wherein the guest molecule is an active biomolecule, preferably a protein, saccharide, DNA, or RNA.

A network according to any one of claims 1 to 8, wherein the guest molecules are enzymes, enzyme fragments, antibodies, antibody fragments, oligonucleotides, peptides, viruses, bacteria or virus envelopes.

Process for the preparation of a network immobilized on a support according to one of Claims 1 to 9, characterized in that azide-functionalized dendritic polyglycerol units and difunctional poly (ethylene glycol) -dicyclooctyne are mixed together in the presence of guest molecules in water, subsequently the mixture applied to a surface of a substrate.

A method according to claim 10, characterized in that the substrate is left to rest after the application of the mixture until a hydrogel layer has formed.

A method according to claim 11, characterized in that the rest takes place in an atmosphere having a moisture content> 90% relative humidity.

Method according to one of claims 10 to 12, characterized in that the substrate consists of silicon dioxide or silicon.

Method according to one of claims 10 to 13, characterized in that the surface of the substrate is functionalized, preferably by silanization.

Method according to one of claims 10 to 14, characterized in that the application of the mixture by means of spin coating, spray coating, doctor blading or spotting is carried out.

Method according to one of claims 10 to 14, characterized in that the application of the mixture by means of immobilization by means of core-shell structure or covalent anchoring takes place.