DE102017110935A1 - Anti-inflammatory high-purity oligosaccharides - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein hochreines Oligosaccharid zur Verwendung als Arzneimittel sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharid aufweist.

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The present invention relates to a high purity oligosaccharide for use as a drug, and to a pharmaceutical composition comprising the high purity oligosaccharide of the present invention.
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein hochreines Oligosaccharid zur Verwendung als Arzneimittel sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharid aufweist.The present invention relates to a high purity oligosaccharide for use as a drug, and to a pharmaceutical composition comprising the high purity oligosaccharide of the present invention.

Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation WHO zufolge leiden weltweit 230 Millionen Menschen an Asthma bronchiale. Die häufigsten Ursachen dafür sind Allergien. Dabei sind Hausstaubmilben und in Wohnräumen vorkommende Schimmelbelastung führend und zahlenmäßig steigend (Quelle: Bundesumweltamt, 2012); vgl. Eder et al. The asthma epidemic. N Engl J Med 355(21): 2226-35 (2006) ; To et al. Global asthma prevalence in adults: findings from the cross-sectional world health survey, BMC Public Health 12: 204. Während Hausstaubmilben allgegenwärtig sind, wird sich durch die derzeitige Niedrigenergiebauweise die Problematik der Schimmelbesiedelung von Wohnräumen noch ausweiten, so dass mit einer Zunahme von Schimmelpilz (z.B. Aspergillus) -assoziiertem Asthma zu rechnen ist.According to World Health Organization estimates, 230 million people worldwide suffer from bronchial asthma. The most common causes of this are allergies. At the same time, house dust mites and indoor mold pollution are leading and increasing in number (source: Federal Environment Agency, 2012); see. Eder et al. The asthma epidemic. N Engl J Med 355 (21): 2226-35 (2006) ; To et al. Global dust prevalence in adults: findings from the cross-sectional world health survey, BMC Public Health 12: 204. While house dust mites are ubiquitous, the current low-energy construction will further increase the problem of mold colonization of living spaces, with an increase in mold (eg Aspergillus) -associated asthma is to be expected.

Lungenfibrose ist eine weitere Erkrankung, die kausal mit aus der Umwelt stammendem Chitin in Verbindung gebracht; vgl. Van Dyken et al. (2017), Spontaneous Chitin Accumulation in Airways and Age-Related Fibrotic Lung Disease, Cell, Apr 20, 169(3): 497-509 . Invasive Pilzerkrankungen, z.B. verursacht durch Candida, Aspergillus oder Cryptococcus, die Hauterkrankung Rosazea „Kupferrose“ und Infektionen mit parasitären Würmern stellen ebenfalls Herausforderungen an die Medizin und die moderne Arzneimittelentwicklung dar. So sterben beispielsweise jährlich mehr Menschen an Pilzerkrankungen als an Malaria; vgl. Drgona et al. Clinical and economic burden of invasive fungal diseases in Europe: focus on pre-emptive and empirical treatment of Aspergillus and Candida species. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 33(1): 7-21 (2014), Brown et al. Hidden killers: human fungal infections, Sci. Transl. Med. 4(165) . Laut der WHO leidet in Entwicklungsländern eine Milliarde Menschen unter parasitischen Würmern, teilweise mit verheerenden Folgen. Bei den vorstehend genannten Erkrankungen kommt dem Chitin eine wichtige Rolle zu.Pulmonary fibrosis is another disease causally associated with environmental chitin; see. Van Dyken et al. (2017), Spontaneous Chitin Accumulation in Airways and Age-Related Fibrotic Lung Disease, Cell, Apr 20, 169 (3): 497-509 , Invasive fungal diseases, such as those caused by Candida, Aspergillus or Cryptococcus, the skin disease rosacea "copper rose" and infections with parasitic worms pose challenges for medicine and modern drug development. For example, more people die each year from fungal infections than from malaria; see. Drgona et al. Focus on pre-emptive and empirical treatment of Aspergillus and Candida species. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 33 (1): 7-21 (2014), Brown et al. Hidden killers: human fungal infections, Sci. Transl. Med. 4 (165) , According to the WHO, one billion people in developing countries suffer from parasitic worms, some of which have devastating consequences. Chitin plays an important role in the above-mentioned diseases.

Chitin, ein Homopoly- oder oligomer aus β(1-4)-N-Acetyl D-Glucosamin (NAG), ist nach Zellulose das am zweithäufigsten vorkommende Polysaccharid in der Natur. Es ist ein wichtiger Bestandteil von Pilzzellwänden, dem Exoskelett und Digestionstrakt von Insekten und Schalentieren und den Mikrofilarien parasitischer Nematoden. Chitin dient niederen Lebensformen als Schutz vor rauen Umweltbedingungen. In Säugetieren und Menschen kommt Chitin nicht vor, aber es lassen sich nicht nur Chitin abbauende Enzyme, sogenannte Chitinasen, sondern auch viele immunologische Effekte auf eine Chitin-Exposition von Körperzellen hin finden; vgl. Mack et al. The role of chitin, chitinases, and chitinase-like proteins in pediatric lung diseases. Mol Cell Pediatr 2(1): 3 (2015) ; Lee. Chitin, chitinases and chitinase-like proteins in allergic inflammation and tissue remodeling. Yonsei medical journal 50(1): 22-30 (2009) .Chitin, a homopoly or oligomer of β (1-4) -N-acetyl-D-glucosamine (NAG), is the second most abundant polysaccharide in nature after cellulose. It is an important component of fungal cell walls, the exoskeleton and digestive tract of insects and shellfish and the microfilariae of parasitic nematodes. Chitin serves lower life forms as protection against harsh environmental conditions. In mammals and humans, chitin is absent, but not only chitin-degrading enzymes, so-called chitinases, but also many immunological effects on chitin exposure of body cells can be found; see. Mack et al. The role of chitin, chitinases, and chitinase-like proteins in pediatric lung diseases. Mol Cell Pediatr 2 (1): 3 (2015) ; Lee. Chitin, chitinases and chitinase-like proteins in allergic inflammation and tissue remodeling. Yonsei medical journal 50 (1): 22-30 (2009) ,

Chitin unterscheidet sich von Chitosan (poly-β(1-4)-D-Glucosamin) im Vorhandensein einer Acetylgruppe an der Aminogruppe an Position 2 des Ringes. Der Grad der Acetylierung (engl. „degree of acetylation“, DA) bei kommerziell verfügbaren Präparationen entscheidet darüber, ob die Präparation als „Chitin“ (bei einem DA von >50%) oder „Chitosan“ (bei einem DA von <50%) bezeichnet wird. Somit enthalten i.d.R. kommerzielle Präparationen von Chitin zumindest Spuren von Chitosan und umgekehrt.Chitin differs from chitosan (poly-β (1-4) -D-glucosamine) in the presence of an acetyl group on the amino group at position 2 of the ring. The degree of acetylation (DA) in commercially available preparations determines whether the preparation is in the form of "chitin" (with a DA of> 50%) or "chitosan" (with a DA of <50%). ) referred to as. Thus, i.d.R. commercial preparations of chitin at least traces of chitosan and vice versa.

Es konnte gezeigt werden, dass aus Krabben oder Pilzwänden hergestellte Roh-Chitin-Präparationen ungenau bestimmter Größe, Reinheit und/oder DA z.B. peritoneale Makrophagen und natürliche Killerzellen der Maus aktivieren und Zytokine wie Interleukin (IL)-1β, Colony-Stimulating-Factor (CSF) und Interferon γ gebildet wurden. In zahlreichen weiteren in vivo Studien in der Maus wurde festgestellt, dass Chitin eine Rolle bei der Entstehung von Typ 2 Allergien zu spielen scheint, in denen es zu einer Akkumulation von eosinophilen Granulozyten sowie weiteren Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems, z.B. in den Atemwegen, beiträgt; vgl. Lee (a.a.O.), Reese et al. Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with allergy. Nature 447(7140): 92-6 (2007).It could be shown that crude chitin preparations prepared from crab or mushroom walls are of inaccurately determined size, purity and / or DA, e.g. Activate mouse peritoneal macrophages and mouse natural killer cells and generate cytokines such as interleukin (IL) -1β, colony stimulating factor (CSF) and interferon γ. In numerous other murine in vivo studies, it has been found that chitin appears to play a role in the development of type 2 allergies, in which there is accumulation of eosinophilic granulocytes as well as other cells of the innate and adaptive immune system, e.g. in the respiratory tract, contributes; see. Lee (supra), Reese et al. Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with allergy. Nature 447 (7140): 92-6 (2007).

Im Stand der Technik erfolgt die Größeneinteilung von Chitin üblicherweise in „großes“ (>70 µm), „mittleres“ (70-40 µm), „kleines“ (40-10 µm) und „sehr kleines“ (< 10 µm) Chitin. Während Größen von über 70 µm immunologisch inert sind, können „kleine“ oder sehr kleine Chitin-Fragmente, insbesondere wenn sie eingeatmet werden, alveoläre Makrophagen aktivieren und zur Sekretion von Zytokinen wie IL-12, Tumor Nekrose Faktor (TNF) und IL-18 führen; vgl. Lee (a.a.O.), Da Silva et al. Chitin is a size-dependent regulator of macrophage TNF and IL-10 production. J Immunol 182(6): 3573-82 (2009) . In Studien am Menschen oder der Maus wurden bisher nur makroskopische, durch physikalischen oder chemischen Aufbruch generierte Roh-Chitin Präparationen untersucht, wobei die kleinste untersuchte „definierte“ Größe meist bei ca. 1 µm lag; vgl. Wagener et al. Fungal chitin dampens inflammation through IL-10 induction mediated by NOD2 and TLR9 activation. PLoS pathogens 10(4): e1004050 (2014) . Die kleinste bislang genau beschrieben Partikelgröße beträgt 0.2 µm, vgl. Alvarez. The effect of chitin size, shape, source and purification method on immune recognition. Molecules 19(4): 4433-51 (2014). Da die N-Acetylglucosamin-Untereinheit des Chitins eine längste Dimension von <10 Å (1 Å = 0,1 nm) aufweist, entspricht diese Partikelgröße vermutlich ca. 200 NAG-Untereinheiten.In the prior art, the size division of chitin is usually in "large"(> 70 microns), "medium" (70-40 microns), "small" (40-10 microns) and "very small"(<10 microns) chitin , While sizes over 70 microns are immunologically inert, "small" or very small chitin fragments, especially when inhaled, can activate alveolar macrophages and secretion cytokines such as IL-12, tumor necrosis factor (TNF), and IL-18 to lead; see. Lee (op. Cit.), Da Silva et al. Chitin is a size-dependent regulator of macrophage TNF and IL-10 production. J Immunol 182 (6): 3573-82 (2009) , In studies on humans or mice, only macroscopic crude chitin preparations generated by physical or chemical disruption have been investigated so far, with the smallest examined "defined" size usually being around 1 μm; see. Wagener et al. Fungal chitin inflammation through IL-10 induction mediated by NOD2 and TLR9 activation. PLoS pathogens 10 (4): e1004050 (2014) , The smallest particle size described so far is 0.2 μm, cf. Alvarez. The effect of chitin size, shape, source and purification method on immune recognition. Molecules 19 (4): 4433-51 (2014). Since the N-acetylglucosamine subunit of chitin has a longest dimension of <10 Å (1 Å = 0.1 nm), this particle size is believed to correspond to approximately 200 NAG subunits.

Häufig ist bei den im Stand der Technik beschriebenen Untersuchungen unklar, welche Reinheit das eingesetzte Chitin aufweist bzw. wie frei es von anderen das angeborene Immunsystem stimulierende sogen. Microbe-associated molecular patterns (MAMPs) ist, ob es makroskopische Größenunterschiede gibt, welche Kettenlängen oder Molekulargewichte bzw. welcher Grad der Acetylierung vorliegen. Die im Stand der Technik in Bezug auf Chitin beschriebenen Eigenschaften sind folglich widersprüchlich, z.B. diskutiert in Bueter et al. Innate sensing of chitin and chitosan. PLoS Pathog 9(1): e1003080 (2013) .It is often unclear in the investigations described in the prior art which purity the chitin used has or how free it is from others which stimulate the innate immune system. Microbe-associated molecular patterns (MAMPs) is whether there are macroscopic size differences, what chain lengths or molecular weights, or what degree of acetylation is present. The properties described in the prior art with respect to chitin are therefore contradictory, eg discussed in Bueter et al. Innate sensing of chitin and chitosan. PLoS Pathog 9 (1): e1003080 (2013) ,

Eine gezielte Entwicklung von Medikamenten für Patienten, die an allergischem oder Schimmelpilz-assoziiertem Asthma, Lungenfibrose, invasiven Pilzerkrankungen, oder anderen der eingangs genannten Pathologien leiden, ist derzeit vor allem deshalb erschwert, da häufig die krankheitsauslösenden molekularen Strukturen und die durch sie induzierten immunologischen Effekte unbekannt oder unzureichend genau definiert sind.A targeted development of drugs for patients suffering from allergic or mold-associated asthma, pulmonary fibrosis, invasive fungal diseases, or others of the aforementioned pathologies, is currently particularly difficult, since often the disease-causing molecular structures and the immunological effects induced by them unknown or insufficiently well defined.

Die meisten der derzeit bei den eingangs genannten Krankheitsbildern eingesetzten Arzneimittel wirken deshalb weitgehend symptomatisch. Dadurch ist eine wirksame Therapie oder gar Vorbeugung einer Erkrankung nur schwerlich erreichbar, häufig gar unmöglich.Most of the drugs currently used in the aforementioned diseases therefore act largely symptomatic. As a result, an effective therapy or even prevention of a disease is difficult to achieve, often impossible.

Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Substanz und eine neue pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, mit der gezielt und möglichst ursächlich die eingangs genannten Erkrankungen behandelt bzw. diesen vorgebeugt werden können.Against this background, it is an object of the present invention to provide a novel substance and a novel pharmaceutical composition, with the targeted and possibly causative treatment of the aforementioned diseases or can be prevented.

Diese Aufgabe wird durch ein hochreines Oligosaccharid bestehend aus ≤ 6 N-Acetylglucosamin(NAG)-Untereinheiten zur Verwendung als Arzneimittel gelöst. Sie wird außerdem durch eine pharmazeutische Zusammensetzung gelöst, die ein hochreines Oligosaccharid bestehend aus ≤ 6 N-Acetylglucosamin(NAG)-Untereinheiten aufweist.This object is achieved by a high purity oligosaccharide consisting of ≤6 N-acetylglucosamine (NAG) subunits for use as a drug. It is also solved by a pharmaceutical composition comprising a high purity oligosaccharide consisting of ≤6 N-acetylglucosamine (NAG) subunits.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. Die Erfinder konnten erstmals mit dem Toll-like-Rezeptor 2 (TLR2) den natürlichen Rezeptor für Chitin identifizieren. Diese Erkenntnis hat es den Erfindern erlaubt, mit der erfindungsgemäßen Verbindung eine chemisch-strukturell genau definierte Substanz zu entwickeln, die mutmaßlich mit TLR2 interagiert, antagonistisch ist und damit Chitin-vermittelten Pathologien entgegen wirkt und deren Entstehung ggf. sogar verhindern kann.The problem underlying the invention is hereby completely solved. For the first time, the inventors were able to identify the natural receptor for chitin with toll-like receptor 2 (TLR2). This finding has allowed the inventors to develop with the compound according to the invention a chemically-structurally well-defined substance that is presumed to interact with TLR2, is antagonistic and thus counteracts chitin-mediated pathologies and possibly even prevent their formation.

TLR2 ist ein Erkennungsrezeptor der angeborenen Immunität (vgl. Kawasaki und Kawai. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol 5: 461, (2014)), der auf verschiedenen professionellen Immunzellen, aber auch Gewebszellen wie Epithelzellen oder Keratinozyten exprimiert wird. Die Aktivierung von TLR2 durch Agonisten setzt eine Signalkaskade in Gang, die z.B. die Produktion inflammatorischer Zytokine, sowie weiterer immunologischer Phänomene im Menschen auslöst. Allgemein führt die TLR2-Aktivierung zu einer Immunstimulation, die die Aktivierung der adaptiven Immunantwort auslöst und somit zell- und/oder antikörpervermittelte Abwehrmechanismen einschaltet. Bislang sind verschiedene Lipopeptide oder Lipide als Agonisten von TLR2 beschrieben wurden, z.B. acylierte Lipopeptide verschiedener Bakterien (z.B. Staphylococcus aureus) oder Mycobakterien (z.B. Mycobakterium tuberculosis), die von TLR2 gemeinsam mit TLR1 und TLR6 erkannt werden (vgl. Jin et al. Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide. Cell 130(6): 1071-82 (2007) ; Kang et al. Recognition of lipopeptide patterns by Toll-like receptor 2-Toll-like receptor 6 heterodimer. Immunity 31(6): 873-84, (2009) ). Dass Chitin ein spezifischer Agonist von TLR2 ist, war bislang nicht eindeutig, z.B. durch Bindungsstudien, belegt. Neben exogenen Substanzen, wird TLR2 auch durch körpereigene, mit bestimmten Pathologien in Verbindung gebrachten Substanzen, wie oxidiertem LPL, welches von TLR2 gemeinsam mit TLR4 erkannt wird; vgl. Chävez-Sänchez et al. Activation of TLR2 and TLR4 by minimally modified lowdensity lipoprotein in human macrophages and monocytes triggers the inflammatory response. Hum Immunol. 71(8):737-44 (2010 ). Als weitere TLR2-abhängige endogene, d.h. körpereigene, Liganden wurden beschrieben: biglycan, endoplasmin, HMGB1, HSP60, HSP70, human cardiac myosin, hyaluronan und Harnsäurekristalle; vgl. Yu et al. Endogenous toll-like receptor ligands and their biological significance. J Cell Mol Med 14(11): 2592-603 (2010) . Wie die Phänotypen von TLR2-defizienten Mäusen nahelegen, spielt TLR2 eine Rolle in verschiedenen Erkrankungen des Menschen, die durch exogene oder endogene TLR2-vermittelte Signale beeinflusst werden.TLR2 is a recognition receptor of innate immunity (see Kawasaki and Kawai, Toll-like receptor signaling pathways, Front Immunol 5: 461, (2014)), which is expressed on various professional immune cells, as well as tissue cells such as epithelial cells or keratinocytes. The activation of TLR2 by agonists sets in motion a signaling cascade that, for example, triggers the production of inflammatory cytokines as well as other immunological phenomena in humans. In general, TLR2 activation leads to an immune stimulation that triggers the activation of the adaptive immune response and thus activates cell- and / or antibody-mediated defense mechanisms. So far, various lipopeptides or lipids have been described as agonists of TLR2, eg acylated lipopeptides of various bacteria (eg Staphylococcus aureus) or mycobacteria (eg Mycobacterium tuberculosis) which are recognized by TLR2 together with TLR1 and TLR6 (cf. Jin et al. Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide. Cell 130 (6): 1071-82 (2007) ; Kang et al. Recognition of lipopeptide patterns by toll-like receptor 2-toll-like receptor 6 heterodimer. Immunity 31 (6): 873-84, (2009) ). The fact that chitin is a specific agonist of TLR2 has not yet been clearly demonstrated, for example, by binding studies. In addition to exogenous substances, TLR2 is also recognized by endogenous substances associated with certain pathologies, such as oxidized LPL, which is recognized by TLR2 together with TLR4; see. Chävez-Sänchez et al. Activation of TLR2 and TLR4 by minimally modified low-density lipoprotein in human macrophages and monocytes triggers the inflammatory response. Hum Immunol. 71 (8): 737-44 (2010 ). Other TLR2-dependent endogenous, ie endogenous, ligands have been described: biglycan, endoplasmin, HMGB1, HSP60, HSP70, human cardiac myosin, hyaluronan and uric acid crystals; see. Yu et al. Endogenous toll-like receptor ligands and their biological significance. J Cell Mol Med 14 (11): 2592-603 (2010) , As the phenotypes of TLR2-deficient mice suggest, TLR2 plays a role in various human diseases, which are influenced by exogenous or endogenous TLR2-mediated signals.

Dabei war besonders überraschend, dass das erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharid von einer Größe von ≤ 6 NAG-Untereinheiten selbst keine immunstimulierende, d.h. agonistische Wirkung zeigt. Dies war aufgrund der im Stand der Technik getroffenen Annahmen, wonach Chitinfragmente immunstimulierend wirken, nicht zu erwarten gewesen.It was particularly surprising that the high purity oligosaccharide of size ≤ 6 NAG subunits according to the invention itself was not immunostimulatory, i. shows agonistic effects. This was unexpected due to the assumptions made in the prior art that chitin fragments are immunostimulating.

Auch konnten die Erfinder feststellen, dass größere Oligosaccharide erst ab einer Kettenlänge von > 6 NAG agonistische Wirkungen aufweisen, folglich überraschenderweise gegensätzliche Aktivität im Vergleich zu Fragmenten mit ≤ 6 NAG-Untereinheiten ausüben. The inventors were also able to establish that larger oligosaccharides only have agonistic effects above a chain length of> 6 NAG, and thus surprisingly exert opposing activity in comparison with fragments having ≤ 6 NAG subunits.

Eine gezielte Verwendung von Chitin im Menschen als Arzneimittel ist mit den bisher beschriebenen Chitin-Fragmenten unbekannter molekularer Größe und Struktur, meist in Form von zerkleinerten Exoskeletten von Gliederfüßern, nur bedingt möglich oder erschwert, insbesondere auch aufgrund möglicher Verunreinigungen der Chitinpräparationen, beispielsweise durch Endotoxine. Diese Verunreinigungen weist das erfindungsgemäße Oligosaccharid bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung nicht auf, was für zusätzliche therapeutische Sicherheit sorgt.Targeted use of chitin in humans as a drug is only possible or difficult to a certain extent with the chitin fragments of unknown molecular size and structure described above, usually in the form of comminuted exoskeletons of arthropods, in particular due to possible contamination of the chitin preparations, for example by endotoxins. These impurities do not have the oligosaccharide according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention, which provides additional therapeutic safety.

Unter einem „Oligosaccharid“ wird erfindungsgemäß ein aus mehreren durch glycosidische Bindungen miteinander verbunden Monosacchariden bestehendes Kohlenhydrat verstanden. Das erfindungsgemäße „hochreine“ Oligosaccharid ist durch seine chemisch eindeutige Struktur gekennzeichnet. Dabei kann es sich um aufgereinigtes oder synthetisches Oligosaccharid handeln. Letzteres grenzt sich ab von aus der Natur isolierten Oligo- oder Polysacchariden, die als Gemische mit strukturell nicht eindeutig definierter Struktur, Größe, Reinheit und effektiver Molarität vorliegen. Aufgereinigtes Oligosaccharid lässt sich z.B. mittels HF (Hydrofluor-Säure) gespaltenem makroskopischem Chitin, z.B. aus Krabbenschalen stammend, herstellen und mittels HPLC-Chromatographie auf einer Amino-Säule, z.B. aus den Materialien Pronto-Sil oder Varian AX-5, und einem Wasser-Acetonitril-Gemisch aus mobiler Phase hochrein auch im Großmaßstab darstellen. Dadurch weist das erfindungsgemäße Oligosaccharid bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine Reinheit in Bezug auf das Oligosaccharid auf, die bei ca. ≥ 99, vorzugsweise ca. ≥ 99,9, weiter vorzugsweise ca. ≥ 99,99, weiter vorzugsweise ca. ≥ 99,999, weiter vorzugsweise ca. ≥ 99,9999, und höchst vorzugsweise ca. 100 Gew.-% liegt. Das erfindungsgemäße Oligosaccharid ist folglich hochreines Oligosaccharid.According to the invention, an "oligosaccharide" is understood as meaning a carbohydrate consisting of a plurality of monosaccharides linked together by glycosidic bonds. The "high-purity" oligosaccharide according to the invention is characterized by its chemically unique structure. This may be purified or synthetic oligosaccharide. The latter is distinguished from isolated from nature oligo- or polysaccharides, which are present as mixtures with structurally not clearly defined structure, size, purity and effective molarity. Purified oligosaccharide can be e.g. HF (hydrofluoric acid) cleaved macroscopic chitin, e.g. from crab shells and prepared by HPLC chromatography on an amino column, e.g. from the materials Pronto-Sil or Varian AX-5, and a water-acetonitrile mixture of mobile phase highly pure even on a large scale represent. As a result, the oligosaccharide or the pharmaceutical composition according to the invention has a purity with respect to the oligosaccharide which is approximately ≥99, preferably approximately ≥99.9, more preferably approximately ≥99.99, more preferably approximately ≥99.999 , more preferably about ≥99.9999, and most preferably about 100% by weight. The oligosaccharide according to the invention is consequently high-purity oligosaccharide.

„N-Acetylglucosamin (NAG)“ ist erfindungsgemäß ein Monosaccharid und ein Derivat der D-Glucose, das an der Position 2 des Ringes einen acetylierten Aminrest aufweist. NAG hat die Summenformel C8H15NO6 die CAS-Nummer 7512-17-6 und weist eine molare Masse von 221,21 g·mol-1 auf und ist in der längsten Dimension etwa 9.3 Å lang.According to the invention, "N-acetylglucosamine (NAG)" is a monosaccharide and a derivative of D-glucose which has an acetylated amine radical at position 2 of the ring. NAG has the molecular formula C 8 H 15 NO 6 CAS number 7512-17-6 and has a molar mass of 221.21 g · mol -1 and is about 9.3 Å long in the longest dimension.

Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen kann. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Sie umfassen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel sowie Puffer, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition Pharmaceutical Press; oder Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. Der Inhalt der vorliegenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.It is understood that the pharmaceutical composition according to the invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. They include, for example, binders, disintegrants, fillers, lubricants and buffers, salts and other substances suitable for the formulation of medicaments; see. Rowe et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5 th Edition Pharmaceutical Press; or Bauer et al. (1999), Textbook of Pharmaceutical Technology, 6th Edition, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. The content of the present publications is incorporated herein by reference.

Es versteht sich ferner, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung das erfindungsgemäße Oligosaccharid als einzigen Wirkstoff, ggf. aber auch weitere Wirkstoffe aufweisen kann.It is further understood that the pharmaceutical composition according to the invention may comprise the oligosaccharide according to the invention as sole active ingredient, but optionally also other active ingredients.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Arzneimittel bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von TLR2-assoziierten Pathologien vorgesehen.According to a preferred embodiment, the medicament or the pharmaceutical composition according to the invention is intended for the treatment and / or prophylaxis of TLR2-associated pathologies.

Die Erfinder haben erkannt, dass das erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharid bestehend aus ≤ 6 NAG-Untereinheiten mutmaßlich an den TLR2 bindet und dort antagonistisch wirkt, indem es die Bindung und Rezeptoraktivierung durch immunstimulierende längere Chitin-Ketten unterbindet. Dies erlaubt auf vorteilhafte Art und Weise die Behandlung und Prophylaxe nicht nur der eingangs genannten Erkrankungen sondern aller Pathologien, die über eine Aktivierung von TLR2, z.B. durch aus der Natur stammende aktivierende Chitin-Ketten, acylierte Lipopeptide verschiedener Bakterien (z.B. Staphylococcus aureus) oder Mycobakterien (z.B. Mycobakterium tuberculosis) sowie auch körpereigene, mit bestimmten Pathologien in Verbindung gebrachte Substanzen wie oxidiertes LPL oder weitere bekannte (Yu et al., 2010, cit. loc.) oder zukünftig entdeckte körpereigene oder -fremde TLR2 Agoniste, vermittelt werden.The inventors have recognized that the high purity oligosaccharide of the present invention consisting of ≤ 6 NAG subunits binds to TLR2 presumably acting there antagonistically by inhibiting binding and receptor activation by immunostimulating, longer chitin chains. This advantageously allows the treatment and prophylaxis not only of the abovementioned disorders but of all pathologies which are due to an activation of TLR2, e.g. by activating chitin chains derived from nature, acylated lipopeptides of various bacteria (eg Staphylococcus aureus) or mycobacteria (eg Mycobacterium tuberculosis) as well as endogenous substances associated with certain pathologies such as oxidized LPL or other known ones (Yu et al., 2010 , cit. loc.) or in the future discovered endogenous or foreign TLR2 agonist, be mediated.

Nach einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Arzneimittel bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Chitin-assoziierten Pathologien vorgesehen.According to a further embodiment of the invention, the pharmaceutical or pharmaceutical composition according to the invention is intended for the treatment and / or prophylaxis of chitin-associated pathologies.

Die Identifizierung von TLR2 als natürlichen Rezeptor des Chitins sowie die Feststellung, dass kleine erfindungsgemäße NAG-Oligosaccharide mutmaßlich an den TLR2 binden und diesen blockieren, erlauben erstmals die zielgerichtete Behandlung und/oder Prophylaxe von Chitin-assoziierten Pathologien. Dies ist mit den derzeit eingesetzten Arzneimitteln nicht zufriedenstellend möglich.The identification of TLR2 as a natural receptor of chitin, as well as the finding that small NAG oligosaccharides according to the invention presumably bind to TLR2 and block it, allow for the first time the targeted treatment and / or prophylaxis of chitin-associated pathologies. This is not satisfactorily possible with the currently used drugs.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die Chitin-assoziierte Pathologie eine entzündliche Erkrankung (Inflammation). According to a further embodiment of the invention, the chitin-associated pathology is an inflammatory disease (inflammation).

Da ein Großteil der Chitin-assoziierten Pathologien mit zum Teil überschießenden Entzündungsreaktionen einhergehen, wird mit dem erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharid bzw. der erfindungsgemäßen pharmazeutische Zusammensetzung auf vorteilhafte Art und Weise eine Behandlung und/oder Prophylaxe entzündlicher Erkrankungen bzw. Inflammationen möglich.Since a large part of the chitin-associated pathologies are accompanied by in some cases excessive inflammatory reactions, it is advantageously possible to treat and / or prophylactic inflammatory diseases or inflammations with the high-purity oligosaccharide or the pharmaceutical composition according to the invention.

Nach einer Weiterbildung der Erfindung handelt es sich bei der entzündlichen Erkrankung um allergisches Asthma bronchiale und/oder Lungeninflammation.According to a development of the invention, the inflammatory disease is allergic bronchial asthma and / or pulmonary inflammation.

Die Aufnahme von Chitin in den Körper erfolgt häufig über die Atemwege, bspw. über Hausstaub, Schimmelpilze etc. Dadurch können Allergien, allergisches Asthma oder andere entzündliche Lungenerkrankungen ausgelöst werden. Diese werden derzeit häufig symptomatisch behandelt. Hier kann das erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharid bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wirksam Abhilfe schaffen.The absorption of chitin in the body is often via the respiratory tract, for example. About house dust, mold, etc. This can cause allergies, allergic asthma or other inflammatory lung diseases are triggered. These are currently often treated symptomatically. Here, the high-purity oligosaccharide according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention can effectively remedy the situation.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist die Chitin-assoziierte Pathologie Rosazea („Kupferrose“).In one embodiment of the invention, the chitin-associated pathology is rosacea ("copper rose").

Rosazea ist eine Hauterkrankung, die überwiegend im Bereich des Mittelgesichts auftritt, meist im Alter zwischen 30 und 40 Jahren beginnt und sich oft zwischen dem 40. und 50. Lebensjahr deutlich verstärkt. Sie äußert sich durch fleckförmige, teils schuppende Rötungen, aber auch Schwellungen der Gesichtshaut sowie durch entzündliche Papeln und Pusteln. Später können insbesondere bei Männern auch knollenartige Wucherungen der Nase entstehen, die Rhinophym oder Knollennase genannt werden. Eine der mutmaßlichen Ursachen scheinen Haarbalgmilben zu sein. Derzeit wird Rosazea weitgehend nur durch Reduzierung der Symptome oder Sekundäreffekte behandelt. Dies erfolgt bspw. durch die Gabe von Nitroimidazol, Azelainsäure, Ivermectin oder Antibiotika wie Metronidazol, Erythromycin, Clindamycin oder Tetracyclin. Mittels des erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharids bzw. der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist nun erstmals eine gezielte, ursächliche Behandlung sowie eine Prophylaxe der Rosazea möglich.Rosacea is a skin condition that predominantly occurs in the midface area, usually between the ages of 30 and 40, and often significantly increases between the ages of 40 and 50 years. It manifests itself through patchy, partly scaly redness, but also swelling of the facial skin and inflammatory papules and pustules. Later, especially in males, tuberous growths of the nose can occur, called the rhinophyma or nodule. One of the putative causes seems to be hair follicle mites. Currently, rosacea is largely treated only by reducing symptoms or secondary effects. This is done, for example, by the administration of nitroimidazole, azelaic acid, ivermectin or antibiotics such as metronidazole, erythromycin, clindamycin or tetracycline. By means of the high-purity oligosaccharide according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention, targeted, causal treatment and prophylaxis of rosacea are now possible for the first time.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Chitin-assoziierte Pathologie eine Pilzerkrankung, vorzugsweise verursacht durch Schimmelpilze und/oder durch invasive Pilze.In another embodiment of the invention, the chitin-associated pathology is a fungal disease, preferably caused by mold and / or by invasive fungi.

Chitin ist ein Bestandteil von Pilzzellwänden und bekanntermaßen einer der Auslöser der durch Pilze verursachten Krankheiten. Durch den Einsatz des erfindungsgemäßen synthetischen Oligosaccharids bzw. der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann nun erstmals zielgerichtet zu einem sehr frühen Stadium in die Pathogenese von Pilzerkrankungen eingegriffen werden.Chitin is a component of fungal cell walls and is known to be one of the triggers of fungal diseases. By using the synthetic oligosaccharide according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention, it is now possible for the first time to intervene in a targeted manner at a very early stage in the pathogenesis of fungal diseases.

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Chitin-assoziierte Pathologie eine Infektion mit Würmern, vorzugsweise mit parasitären Würmern.In one embodiment of the invention, the chitin-associated pathology is an infection with worms, preferably with parasitic worms.

Vor allem in Entwicklungsländern leidet eine sehr große Zahl von Menschen an parasitischen Würmern. Die derzeit verfügbaren Therapien sind nach wie vor unbefriedigend. Auch hier schafft das erfindungsgemäße synthetische Oligosaccharid bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung Abhilfe und ermöglich eine frühe Intervention in die Pathogenese von durch parasitäre Würmer verursachten Erkrankungen und ermöglich zugleich eine wirksame Vorbeugung.Especially in developing countries, a very large number of people suffer from parasitic worms. Currently available therapies are still unsatisfactory. Here too, the synthetic oligosaccharide according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention remedy this situation and make possible early intervention in the pathogenesis of diseases caused by parasitic worms and at the same time enable effective prevention.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung besteht das synthetische Oligosaccharid aus ≤ 5, bevorzugt ≤ 4, weiter bevorzugt ≤ 3, weiter bevorzugt 2 NAG-Untereinheiten.According to a preferred embodiment of the invention, the synthetic oligosaccharide consists of ≦ 5, preferably ≦ 4, more preferably ≦ 3, more preferably 2 NAG subunits.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharid in einer solchen Größe bereitgestellt wird, die nach den Erkenntnissen der Erfinder eine besonders hohe antagonistische Aktivität gewährleistet. Die Größenreduzierung führt außerdem dazu, dass sich die Kosten bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharids bzw. einer entsprechenden erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verringern können. Auch die Arzneimittelformulierung kann sich vereinfachen.This measure has the advantage that the high-purity oligosaccharide according to the invention is provided in a size which, according to the findings of the inventors, ensures a particularly high antagonistic activity. The size reduction also means that the costs in the production of a high-purity oligosaccharide according to the invention or a corresponding pharmaceutical composition according to the invention can be reduced. The drug formulation can also be simplified.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, einschließlich eines Nutztiers und Menschen, zur Unterbindung von Immunaktivierung, das die Verabreichung des erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharids und/oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in das Lebewesen umfasst.Another object of the invention relates to a method for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a living animal, including a farm animal and humans, for the suppression of immune activation, which comprises the administration of the high-purity oligosaccharide and / or the pharmaceutical composition according to the invention in the living being.

Die Eigenschaften, Vorteile, Weiterbildungen und Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharids bzw. der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für das erfindungsgemäße Verfahren entsprechend.The properties, advantages, developments and refinements of the high-purity oligosaccharide according to the invention or of the pharmaceutical composition according to the invention apply correspondingly to the process according to the invention.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines hochreinen Oligosaccharids bestehend aus ≤ 6 NAG-Untereinheiten in vitro zur Blockierung und/oder Bindung des TLR2-Rezeptors.Another object of the present invention relates to the use of a high-purity oligosaccharide consisting of ≤ 6 NAG- Subunits in vitro for blocking and / or binding of the TLR2 receptor.

Die Eigenschaften, Vorteile, Weiterbildungen und Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharids bzw. der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäße Verwendung entsprechend.The properties, advantages, developments and refinements of the high-purity oligosaccharide according to the invention or of the pharmaceutical composition according to the invention apply correspondingly to the use according to the invention.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the particular combination given, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind dabei nicht einschränkend.The present invention will now be explained in more detail by means of exemplary embodiments from which further features, properties and advantages of the invention result. The embodiments are not limiting.

Es versteht sich außerdem, dass einzelne Merkmale, die in den Ausführungsbeispielen offenbart sind, nicht nur im Kontext der jeweiligen spezifischen Ausführungsform sondern in einer Allgemeingültigkeit offenbart sind und für sich genommenen einen eigenen Beitrag zur Erfindung liefern. Der Fachmann kann deshalb diese Merkmale frei mit anderen Merkmalen der Erfindung kombinieren.It should also be understood that individual features disclosed in the exemplary embodiments are disclosed not only in the context of the specific embodiment but in generality and in themselves provide a separate contribution to the invention. The person skilled in the art can therefore freely combine these features with other features of the invention.

Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen, in denen Folgendes dargestellt ist:

  • 1: Aktuelle Hypothese zur Größenabhängigkeit der durch Roh-Chitin-Präparationen verschiedener Partikelgröße hervorgerufenen Immunreaktionen.
  • 2 Chemische Strukturen ausgewählter erfindungsgemäßer hochreiner und Referenz-Oligosaccharide.
  • 3 TLR2 ist der Rezeptor für von Chitin abgeleitete Oligosaccharide.
  • 4 Antagonistische Wirkung von hochreinen von Chitin abgeleiteten Oligosacchariden mit ≤ 6 NAG-Untereinheiten.
  • 5 Von Chitin abgeleitete Oligosaccharide mit ≤ 6 NAG-Untereinheiten blockieren die Bindung und Aktivierung von NAG-Oligosacchariden mit 10-15 NAG-Untereinheiten.
Reference is made to the accompanying drawings, in which:
  • 1 : Current hypothesis on the size dependence of the immune reactions produced by crude chitin preparations of different particle size.
  • 2 Chemical structures of selected high purity and reference oligosaccharides according to the invention.
  • 3 TLR2 is the receptor for chitin-derived oligosaccharides.
  • 4 Antagonist activity of highly pure chitin-derived oligosaccharides with ≤ 6 NAG subunits.
  • 5 Chitin-derived oligosaccharides with ≤ 6 NAG subunits block binding and activation of NAG oligosaccharides with 10-15 NAG subunits.

Ausführungsbeispieleembodiments

Chitinfragmente und ImmunreaktionChitin fragments and immune reaction

Die vermeintliche Abhängigkeit der ausgelösten Immunantwort von der Größe der Chitinfragmente ist in der 1A dargestellt. So wird im Stand der Technik die Auffassung vertreten, dass die Chitinfragmentgröße bestimmend für die ausgelösten Immuneffekte sei. Während Größen von über 70 µm immunologisch inert sein sollen, so wird angenommen, dass kleine und sehr kleine Chitin-Fragmente, insbesondere wenn sie eingeatmet werden, Entzündungsreaktionen auslösen. Wie 1B zeigt, sind jedoch Partikel von 10 µm bereits so groß wie ein ganzer humaner Makrophage. Nur Oligosaccharide von 5-20 Untereinheiten sind größenmäßig mit der Größe einer TLR Erkennungsdomäne zu vergleichen (maßstabsgetreu dargestellt in 1C).The supposed dependence of the triggered immune response on the size of the chitin fragments is in the 1A shown. Thus, it is believed in the prior art that the chitin fragment size is determinative of the induced immune effects. While sizes over 70 microns are said to be immunologically inert, it is believed that small and very small chitin fragments, especially when inhaled, induce inflammatory responses. As 1B shows, however, particles of 10 microns are already as large as a whole human macrophage. Only oligosaccharides of 5-20 subunits are comparable in size to the size of a TLR recognition domain (shown to scale in FIG 1C ).

Hochreine Oligosaccharide mit ≤ 6 NAG-Untereinheiten wirken antiinflammatorischHighly pure oligosaccharides with ≤ 6 NAG subunits have an antiinflammatory effect

In der 2 sind die chemischen Strukturen einiger erfindungsgemäßer hochreiner Oligonukleotide, C4, C5, C6 (Teilabbildung A), und einiger Referenz-Oligonukleotide, C7 und C10-15 (Teilabbildung B), dargestellt.In the 2 the chemical structures of some highly pure oligonucleotides according to the invention, C4, C5, C6 (panel A), and some reference oligonucleotides, C7 and C10-15 (panel B) are shown.

TLR2 ist der Rezeptor für von molekularen Chitin-Fragmenten abgeleitete NAG-OligosaccharideTLR2 is the receptor for NAG oligosaccharides derived from molecular chitin fragments

Die Erfinder haben kommerziell verfügbare Oligosaccharide mit 3 NAG-Untereinheiten (C3) bis 7 NAG-Untereinheiten (C7) akquiriert. Die Reinheit der Präparationen wurde massenspektrometrisch verifiziert. Daneben wurden Oligosaccharide mit 10-15 NAG-Untereinheiten (C10-15) mittels Acetylierung aus einer Mischung von Chitosan-Polymeren der Kettenlängen 10 bis 15 hergestellt. Der Acetylierungsgrad wurde massenspektrometrisch auf ca. 90% bestimmt. Die Oligosaccharide wurden auf Endotoxin-Freiheit mittels Limulus-Amöbozyten-Assay (<0,25 EU/ml in Stammlösungen von >1 mM, d.h. 1000-fach höher als in Experimenten eingesetzt) und Stimulationsassays mit Polymyxin B, welches Endotoxin (LPS) bindet, überprüft.The inventors have acquired commercially available oligosaccharides having 3 NAG subunits (C3) to 7 NAG subunits (C7). The purity of the preparations was verified by mass spectrometry. In addition, oligosaccharides having 10-15 NAG subunits (C10-15) were prepared by acetylation from a mixture of chitosan polymers of chain lengths 10 to 15. The degree of acetylation was determined by mass spectrometry to about 90%. The oligosaccharides were assayed for endotoxin-free by Limulus amebocyte assay (<0.25 EU / ml in stock solutions of> 1 mM, ie, 1000-fold higher than in experiments) and polymyxin B stimulation assays, which bind endotoxin (LPS) , checked.

Zunächst wurden Chitin-Fragment verschiedener Größe auf Immunstimulierende Funktion hin untersucht und Fragment > 6 NAG führte zu einer robusten Zytokinsekretion (z.B. IL-6 und TNF) aus primären humanen Makrophagen (3A) sowie murinen bone marrow-derived macrophages (BMDM; 3B). Auch in vivo Instillation der Chitin-Fragmente zeigte eine messbare Infiltration von Neutrophilen Granulozyten (PMN) in die Lunge, d.h. Lungeninflammation (nicht gezeigt). Fragmente >6 NAG spiegelten somit wichtige für partikuläres Chitin beobachtete immunaktivierende Eigenschaften auf. Microarray Transkriptionsanalysen von Vollblut-Proben gesunder Spender, die zuvor mit Chitin 10-15 oder bekannten TLR4 (LPS) oder TLR2 (Pam2, Pam3) Liganden stimuliert worden waren, zeigten (3D), dass Chitin spezifische Effekte im Vergleich mit anderen TLR2 Liganden hervorrief (belegt durch eine Principal Component Analyse), jedoch auch mit den durch andere TLR2-Liganden induzierten Genen überlappte (Zahlen im Venn-Diagram).Initially, chitin fragments of various sizes were assayed for immunostimulating function and fragment> 6 NAG resulted in robust cytokine secretion (eg IL-6 and TNF) from primary human macrophages ( 3A ) as well as murine bone marrow-derived macrophages (BMDM; 3B ). Also in vivo instillation of the chitin fragments showed a measurable infiltration of neutrophil granulocytes (PMN) into the lung, ie pulmonary inflammation (not shown). Fragments> 6 NAGs thus reflected important immunoactivating properties observed for particulate chitin. Microarray transcription analyzes of whole blood samples from healthy donors previously stimulated with chitin 10-15 or known TLR4 (LPS) or TLR2 (Pam2, Pam3) ligands showed ( 3D ) that chitin produced specific effects compared to other TLR2 ligands (as proven by a principal component analysis), but also with others TLR2 ligand-induced genes overlapped (numbers in the Venn diagram).

Als nächstes sollte geklärt werden, über welche „pattern recognition receptors“ [PRR(s)] die bereits vielfach für undefinierte Chitin-Fragmente beschriebenen sowie die hier beobachteten Effekte der erfindungsgemäßen und Referenz-Oligosaccharide vermittelt werden. Da diese Frage bislang nicht geklärt ist, untersuchten die Erfinder die Wirkung der Oligosaccharide zunächst in Zellen mit genetischer Deletion oder Rekonstitution. Zunächst wurden BMDM von C57BL/6 WT, Myd88 Gen-Knockout (KO; 4A) und Tlr2 KO (4B) Mäusen mit Chitin und Kontrollen für 18 Stunden stimuliert und die TNF-Freisetzung wurde mit der ELISA-Methode gemessen (n=3 pro Gruppe). Es zeigte sich eine starke Reduktion der durch Chitin 10-15 und den bekannten TLR2 Liganden Pam3 verursachten TNF Sekretion. Nicht-TLR2-abhängige Stimuli wurden durch Myd88 und Tlr2 KO nicht beeinflusst. Im humanen System konnte die IL-6-Freisetzung in THP-1-Zellen ohne (WT) und mit genetischer TLR2-Deletion (CRISPR#1 und #2) mittels Cas9-CRISPR untersucht werden (4C, Bereitstellung der Zelllinien mit Genehmigung durch Prof. Dr. Veit Hornung, BioSys München, Ludwigs-Maximilians-Universität München, beschrieben unter Schmid-Burgk et al. (2014), OutKnocker: a web tool for rapid and simple genotyping of designer nuclease edited cell lines, Genome Res. Oct. 24(10): 1719-1723). Auch hier zeigte sich eine selektive und starke Reduktion der duch Chitin 10-15 und den bekannten TLR2 Liganden Pam2 und Pam3 verursachten IL-6 Sekretion. Schließlich wurde TLR2 in HEK-293 Zellen durch Transfektion von 10 ng TLR2 Plasmid (4D oben) oder leerem Vektor (EV, unten) rekonstituiert und mit Oligosaccharid C10-15 und TLR2-Liganden-Kontrollen (Pam2CSK4, Pam3CSK4) stimuliert. Die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-KB wurde mittels Dual Luciferase Assays bestimmt. Es zeigte sich, dass die Expression von TLR2 ausreichte, um die Zellen Chitin-responsiv zu machen. Zudem beobachteten die Erfinder, dass eine Expression der bisher diskutierten Kandidaten Dectin-1, Nod2 und TLR9 in HEK293T-Zellen überraschenderweise nicht zu Sensitivität gegenüber Chitin führt (nicht gezeigt), während die Expression von TLR2 zu einer Dosisabhängigen NF-KB Aktivierung führte. Auch in vivo konnte die strikte TLR2-Abhängigkeit Chitin-vermittelter Inflammation gezeigt werden. So führte die in vivo Applikation aktivierender Chitin-Ketten in die Lunge (Trachea; 4E) von Mäusen zu starker Zytokinproduktion, die jedoch in Tlr2-defizienten Mäusen sehr viel geringer ausfiel. Somit ist auch in vivo die Chitin-vermittelte Entzündung der Lunge TLR2-abhängig und könnte durch einen TLR2-Antagonisten unterbunden werden.Next, it should be clarified about which "pattern recognition receptors" [PRR (s)] are already described in many cases for undefined chitin fragments as well as the effects observed here of the inventive and reference oligosaccharides. Since this question has not yet been clarified, the inventors first investigated the effect of the oligosaccharides in cells with genetic deletion or reconstitution. First, BMDM of C57BL / 6 WT, Myd88 gene knockout (KO; 4A ) and Tlr2 KO ( 4B ) Stimulated mice with chitin and controls for 18 hours and TNF release was measured by the ELISA method (n = 3 per group). There was a marked reduction in TNF secretion caused by chitin 10-15 and the known TLR2 ligand Pam3. Non-TLR2 dependent stimuli were unaffected by Myd88 and Tlr2 KO. In the human system, IL-6 release in THP-1 cells without (WT) and with TLR2 genetic deletion (CRISPR # 1 and # 2) was investigated by means of Cas9-CRISPR ( 4C , Provision of cell lines with permission of Prof. Dr. med. Veit Hornung, BioSys Munich, Ludwigs-Maximilians-University Munich, described under Schmid-Burgk et al. (2014), OutKnocker: a web tool for rapid and simple genotyping of designer nuclease-edited cell lines, Genome Res. 24 (10): 1719-1723). Here, too, a selective and strong reduction of chitin 10-15 was found, and the known TLR2 ligands Pam2 and Pam3 caused IL-6 secretion. Finally, TLR2 was transfected into HEK-293 cells by transfection of 10 ng TLR2 ( 4D above) or empty vector (EV, below) and stimulated with oligosaccharide C10-15 and TLR2 ligand controls (Pam 2 CSK 4 , Pam 3 CSK 4 ). The activity of the transcription factor NF- K B was determined by means of dual luciferase assays. It was shown that the expression of TLR2 was sufficient to make the cells chitin-responsive. In addition, the inventors observed that expression of the previously discussed Dectin-1, Nod2 and TLR9 in HEK293T cells surprisingly did not result in sensitivity to chitin (not shown), whereas expression of TLR2 resulted in dose-dependent NF- K B activation. In vivo, too, the strict TLR2 dependence of chitin-mediated inflammation could be demonstrated. Thus, the in vivo application of activating chitin chains in the lungs (trachea; 4E ) of mice to strong cytokine production, but was much lower in Tlr2-deficient mice. Thus, chitin-mediated lung inflammation is also TLR2-dependent in vivo and could be prevented by a TLR2 antagonist.

Zudem stellten die Erfinder fest, dass das Oligosaccharid C10-15 auch mit rekombinant hergestelltem murinem TLR2-Ektodomänen-Protein in einem durchflusszytometrischen Assay interagierte (4F). Alexa647-gekoppeltes Chitin konnte mit mTLR2-Fc-PE stärker als mit Kontroll-lgG1-PE angefärbt werden. Einzelne Messungen sowie eine Quantifizierung von vier Messungen sind gezeigt. Dies konnte auch mittels neuester Messungen mit der Methode Microscale Thermophoresis (MST) bestätigt werden: MST-Titration von mTLR2-Fc Protein mit Alexa647-markiertem Chitin 10-15 zeigten eine Bindung mit nanomolarer Affinität; 4G. Ähnliche Bindungsdaten wurden für die Bindung an humanes TLR2 erhalten (nicht gezeigt).In addition, the inventors found that the oligosaccharide C10-15 also interacted with recombinantly produced murine TLR2 ectodomain protein in a flow cytometric assay ( 4F ). Alexa647-coupled chitin was stained more strongly with mTLR2-Fc-PE than with control IgG1-PE. Single measurements and a quantification of four measurements are shown. This was also confirmed by the latest measurements using the Microscale Thermophoresis (MST) method: MST titration of mTLR2-Fc protein with Alexa647-labeled chitin 10-15 showed binding with nanomolar affinity; 4G , Similar binding data were obtained for binding to human TLR2 (not shown).

Chitin Fragmente mit ≤ 6 NAG verhindern die Bindung und Aktivierung von TLR2 durch aktivierende Chitin-FragmenteChitin fragments with ≤ 6 NAG prevent binding and activation of TLR2 by activating chitin fragments

Als nächstes sollte untersucht werden, ob nicht-aktive Fragmente womöglich die Bindung von aktivierenden Fragmenten an den TLR2 Rezeptor verhindern konnten. Wie 5A zeigt, nahm die Bindung von Alexa647-gekoppeltem Chitin 10-15 (aktivierend) an mTLR2-Fc-PE mit zunehmender Konzentration des nicht-aktivierenden Fragments C5 ab. 5B zeigt, dass in Makrophagen-ähnlichen THP-1 Zellen die IL-6 Freisetzung in Folge von aktivierendem C10-15 durch die Zugabe von C4 und C5 Fragmenten stark reduziert werden kann. Ähnliches ist bei primären Makrophagen gesunder Spender zu beobachten (5C).Next, it was to be investigated whether non-active fragments could possibly prevent the binding of activating fragments to the TLR2 receptor. As 5A showed binding of Alexa647-coupled chitin 10-15 (activating) to mTLR2-Fc-PE decreased with increasing concentration of non-activating fragment C5. 5B shows that in macrophage-like THP-1 cells IL-6 release due to activating C10-15 can be greatly reduced by the addition of C4 and C5 fragments. The same can be observed with primary macrophages of healthy donors ( 5C ).

Große von Chitin-Fragmenten abgeleitete hochreine Oligosaccharide wirken immunstimulatorisch, wohingegen kleine von Chitin-Fragmenten abgeleitete erfindungsgemäße hochreine Oligosaccharide mit ≤ 6 NAG antiinflammatorisch auf die Chitin-vermittelte Entzündungsreaktion wirken. Die erfindungsgemäßen hochreinen Oligosaccharide können deshalb als antiinflammatorische Immunmodulatoren, z.B. bei allergischem Asthma oder Lungenfibrose, wo die Chitin-Stimulation zur Pathogenese beiträgt, wirken.Large, high-purity oligosaccharides derived from chitin fragments have an immunostimulatory effect, whereas small chitin-derived high purity oligosaccharides according to the invention containing ≤6 NAGs have an antiinflammatory effect on the chitin-mediated inflammatory response. The high purity oligosaccharides of the invention may therefore be used as anti-inflammatory immunomodulators, e.g. in allergic asthma or pulmonary fibrosis, where chitin stimulation contributes to the pathogenesis.

Zusammenfassend belegen die Ergebnisse der Erfinder, dass TLR2 der Rezeptor für molekulares Chitin bzw. hiervon abgeleitete NAG-Oligosaccharide im menschlichen und murinen System ist, so dass zukünftige Analysen der immunologischen Signaltransduktion sowie therapeutische Ansätze nun an diesem gut definierten Rezeptor-Signalweg ansetzen können. Zudem belegen die Ergebnisse, dass kleine, nicht aktivierende NAG-Oligosaccharide die Immunaktivierung aktivierender NAG-Oligosaccharide stark reduzieren können.In summary, the inventors' findings demonstrate that TLR2 is the molecular chitin receptor or NAG oligosaccharide derived therefrom in the human and murine systems so that future immunological signal transduction analysis and therapeutic approaches can now address this well-defined receptor signaling pathway. In addition, the results demonstrate that small, non-activating NAG oligosaccharides can greatly reduce the immune activation of activating NAG oligosaccharides.

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Claims (12)

Hochreines Oligosaccharid bestehend aus ≤ 6 N-Acetylglucosamin(NAG)-Untereinheiten zur Verwendung als Arzneimittel.High purity oligosaccharide consisting of ≤ 6 N-acetylglucosamine (NAG) subunits for use as a drug. Hochreines Oligosaccharid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von TLR2-assoziierten Pathologien.High purity oligosaccharide after Claim 1 for use in the treatment and / or prophylaxis of TLR2-associated pathologies. Hochreines Oligosaccharid nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Chitin-assoziierten Pathologien.High purity oligosaccharide after Claim 1 or 2 for use in the treatment and / or prophylaxis of chitin-associated pathologies. Hochreines Oligosaccharid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Chitin-assoziierte Pathologie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: entzündliche Erkrankung (Inflammation), allergisches Asthma bronchiale, Lungeninflammation, Lungenfibrose, Rosazea („Kupferrose“), Pilzerkrankung, vorzugsweise verursacht durch Schimmelpilze und/oder durch invasive Pilze, Infektion mit Würmern, vorzugsweise mit parasitären Würmern.High purity oligosaccharide after Claim 3 , characterized in that the chitin-associated pathology is selected from the group consisting of: inflammatory disease (inflammation), allergic bronchial asthma, pulmonary inflammation, pulmonary fibrosis, rosacea ("copper rose"), fungal disease, preferably caused by mold and / or invasive Fungi, infection with worms, preferably with parasitic worms. Hochreines Oligosaccharid nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es aus ≤ 5, bevorzugt ≤ 4, weiter bevorzugt ≤ 3, weiter bevorzugt 2 NAG-Untereinheiten besteht.Highly pure oligosaccharide according to one of the preceding claims, characterized in that it consists of ≤ 5, preferably ≤ 4, more preferably ≤ 3, more preferably 2 NAG subunits. Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend ein hochreines Oligosaccharid bestehend aus ≤ 6 NAG-Untereinheiten.A pharmaceutical composition comprising a high purity oligosaccharide consisting of ≤ 6 NAG subunits. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von TLR2-assoziierten Pathologien.Pharmaceutical composition according to Claim 6 , for the treatment and / or prophylaxis of TLR2-associated pathologies. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Chitin-assoziierten Pathologien.Pharmaceutical composition according to Claim 6 or 7 , for the treatment and / or prophylaxis of chitin-associated pathologies. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Chitin-assoziierte Pathologie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: entzündliche Erkrankung (Inflammation), allergisches Asthma bronchiale, Lungeninflammation, Rosazea („Kupferrose“), Pilzerkrankung, vorzugsweise verursacht durch Schimmelpilze und/oder durch invasive Pilze, Infektion mit Würmern, vorzugsweise durch parasitäre Würmer.Pharmaceutical composition according to Claim 12 characterized in that the chitin-associated pathology is selected from the group consisting of: inflammatory disease (inflammation), allergic bronchial asthma, pulmonary inflammation, rosacea ("copper rose"), fungal disease, preferably caused by mold and / or by invasive fungi, Infection with worms, preferably by parasitic worms. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das hochreine Oligosaccharid aus ≤ 5, bevorzugt ≤ 4, weiter bevorzugt ≤ 3, weiter bevorzugt 2 NAG-Untereinheiten besteht.Pharmaceutical composition according to one of the preceding claims, characterized in that the high-purity oligosaccharide from ≤ 5, preferably ≤ 4, more preferably ≤ 3, more preferably 2 NAG subunits. Verwendung eines hochreinen Oligosaccharids bestehend aus ≤ 6 NAG-Untereinheiten in vitro zur Blockierung des TLR2-RezeptorsUse of a high purity oligosaccharide consisting of ≤ 6 NAG subunits in vitro to block the TLR2 receptor Verwendung eines hochreinen Oligosaccharids bestehend aus ≤ 6 NAG-Untereinheiten in vitro zur Bindung des TLR2-Rezeptors.Use of a high purity oligosaccharide consisting of ≤ 6 NAG subunits in vitro to bind the TLR2 receptor.
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