DE102017010815A1

DE102017010815A1 - Apparatus and method for the parallel handling, observation and control of tissue-like cell aggregates

Info

Publication number: DE102017010815A1
Application number: DE102017010815.3A
Authority: DE
Inventors: Roland Hemmler; Karsten Gall; Niklas Brending; Jonas Künzer
Original assignee: Lonovation GmbH
Current assignee: Lonovation GmbH
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2019-05-23

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur parallelen Handhabung von Flüssigkeiten für gewebeähnliche Zellverbände in Multiwellplatten, und für die gleichzeitige Abbildung von Beobachtungsfeldern der Multiwellplatte mit zellulärer Auflösung auf eine Kameraeinheit.
Aufgabe war es, diese Handhabung und Abbildung in einer kompakten Vorrichtung zu ermöglichen, ohne die Multiwellplatte zwischenzeitlich bewegen zu müssen.
Erfindungsgemäß wird dazu eine Beleuchtungseinheit und eine Kameraeinheit verwendet, die die gesamte Multiwellplatte beleuchten oder erfassen, oder aber Beleuchtungseinheit und Kameraeinheit werden unterhalb der Multiwellplatte auf einem Verfahrtisch relativ zur Ablageposition der Multiwellplatte verfahren.

The invention relates to a device for the parallel handling of liquids for tissue-like cell aggregates in multiwell plates, and for the simultaneous imaging of observation fields of the multiwell plate with cellular resolution on a camera unit.
Task was to enable this handling and imaging in a compact device, without having to move the multiwell plate in the meantime.
According to the invention, a lighting unit and a camera unit are used for this purpose, which illuminate or detect the entire multiwell plate, or the lighting unit and camera unit are moved below the multiwell plate on a travel table relative to the storage position of the multiwell plate.

Description

Der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsmanipulation und zur Handhabung parallel angeordneter gewebeähnlicher Zellverbände bereitzustellen, in der eine abbildende optische Beobachtungsmöglichkeit mit zellulärer Auflösung zur Beobachtung oder Qualitätssicherung der gewebeähnlichen Zellverbände integriert ist, die unabhängig und gleichzeitig von den Flüssigkeitsmanipulationen durchgeführt werden kann mit der Möglichkeit, die Auswirkungen der Flüssigkeitsmanipulationen auf die Zellverbände abzubilden oder zu messen.The invention relates to a device for fluid manipulation and for handling parallel arranged tissue-like cell aggregates, in which an imaging optical observation possibility with cellular resolution for observation or quality assurance of the tissue-like cell aggregates is integrated, which can be performed independently and simultaneously by the fluid manipulation with the possibility of Imaging or measuring the effects of fluid manipulation on cell aggregates.

Zelluläre Gewebe und gewebeähnliche Strukturen werden seit jeher mit optischen Mikroskopen beobachtet. In den letzten Jahrzehnten haben sich dabei vor allem inverse Mikroskope bewährt, bei denen das Gewebe mit dem Mikroskopobjektiv von unten her durch eine Glasscheibe beleuchtet und beobachtet wird. Normalerweise geschieht dies durch ein Deckglas mit einer Stärke, die in einer Standardausführung 130 - 180 µm bei normalen Gläsern mit einem Brechungsindex von etwa 1,52 beträgt. Viele kommerzielle Mikroskopobjektive sind in ihrem Abbildungsverhalten auf diese Deckgläser ausgelegt.Cellular tissues and tissue-like structures have always been observed with optical microscopes. In the past decades, in particular, inverse microscopes have proved to be successful, in which the tissue with the microscope objective is illuminated and observed from below through a glass pane. Typically, this is done by a coverslip with a standard thickness of 130-180 μm for normal glasses with a refractive index of about 1.52. Many commercial microscope objectives are designed for these cover glasses in their imaging behavior.

Der Vorteil der inversen Anordnung ist, dass auch lebende Zellen beobachtet werden können, bei denen eine Versorgung mit Nähr- und Kulturmedien notwendig sein kann. Die Flüssigkeiten können einfach von oben zu den Zellen zugegeben werden, ohne die Mikroskopie zu stören. Oft ist das Deckglas auf der Oberseite mit Wänden versehen, die ein Abfließen größerer Flüssigkeitsmengen verhindern. Einzelne, nach oben offene Gefäße dieser Art werden oft mit dem englischen Ausdruck „Wells“ bezeichnet. Oft befinden sich mehrere Wells auf einem Deckglas, beispielsweise 8 Wells in einer 2 mal 4 Anordnung auf einem Deckglas mit ungefährer Standardgröße eines Objektträgers, oder 8 mal 12 Wells in einem 9 mm Raster auf einem Träger, dessen Größe etwa 127 mal 85 mm beträgt und der Standardgröße einer Mikrotiterplatte entspricht. Mikrotiterplatten gibt es auch in Variationen, bei denen das Raster 36, 18, 4,5, oder 2,25 mm beträgt, sodass sie 6, 24, 384 oder 1536 Wells aufweisen, die auch mit Deckgläsern als Böden versehen sein können, sowohl durchgehend oder als Einzelfenster pro Well. Mikrotiterplatten gibt es in großer Vielfalt und auch mit intransparenten Böden oder transparenten Böden, die eine andere Stärke als Deckgläser aufweisen oder auch aus anderen transparenten Materialien gefertigt sind, wie etwa Polymethylmethacrylat (PMMA, „Plexiglas“), Polycarbonat, Polystyrol, oder Cycloolefin-Copolymeren (COC).The advantage of the inverse arrangement is that even living cells can be observed in which a supply of nutrient and culture media may be necessary. The liquids can simply be added to the cells from above without disturbing the microscopy. Often, the coverslip is provided on the top with walls that prevent leakage of larger amounts of liquid. Single, upwardly open vessels of this type are often referred to by the English term "Wells". Often, multiple wells are on a coverslip, for example, 8 wells in a 2 by 4 array on a standard sized glass slide, or 8 by 12 wells in a 9 mm grid on a support, the size of which is about 127 by 85 mm and the standard size of a microtiter plate corresponds. Microplates are also available in variations where the grid is 36, 18, 4.5, or 2.25 mm, so that they have 6, 24, 384, or 1536 wells, which may also be provided with coverslips as trays, both continuous or as a single window per well. Microtiter plates are available in great variety and also with non-transparent bottoms or transparent bottoms, which have a different thickness than cover glasses or are made of other transparent materials, such as polymethyl methacrylate (PMMA, "Plexiglas"), polycarbonate, polystyrene, or cycloolefin copolymers (COC).

In den letzten Jahren sind zunehmend Mikrostrukturtechniken verwendet worden, um weitere Funktionalitäten in diese Art Probenträger zu integrieren. Beispielsweise gibt es Probenträger, bei denen Wells über Kanäle miteinander verbunden sind, oder bei denen Einsätze, Siebe oder Strukturen für adhärente Zellkultur integriert sind. Bei verbunden Wells kann sich die zu beobachtende Einheit, beispielsweise die Einheit, in der Zellen wachsen, zwischen den Wells befinden und insbesondere mit einem Deckel nach oben verschlossen sein. Diese Einheiten oder die zu beobachtenden Wells werden nachfolgend, sofern sie mit einem transparenten Boden versehen sind, einheitlich als Beobachtungsfelder bezeichnet.In recent years, more and more microstructure techniques have been used to integrate more functionality into this type of sample carrier. For example, there are sample carriers in which wells are interconnected via channels or in which inserts, sieves or structures for adherent cell culture are integrated. When the wells are connected, the unit to be observed, for example the unit in which cells grow, can be located between the wells and, in particular, can be closed with a lid at the top. These units or the wells to be observed are subsequently referred to as observation fields, if they are provided with a transparent bottom.

Nachfolgend werden alle diese vorgenannten Probenträger unterschiedlicher Größe mit mindestens zwei Wells einheitlich und vereinfachend als Multiwellplatten bezeichnet, und Multiwellplatten mit transparenten Böden als transparente Multiwellplatten oder auch undifferenziert als Multiwellplatten. Eine transparente Multiwellplatte weist mindestens zwei Beobachtungsfelder auf. Automatisierte Mikroskopie mit Multiwellplatten und insbesondere mit Mikrotiterplatten wird oft als „High Content Screening“ bezeichnet.Hereinafter, all of these aforementioned sample carriers of different sizes with at least two wells uniformly and simplistically referred to as multiwell plates, and multiwell plates with transparent trays as transparent multiwell plates or undifferentiated as multiwell plates. A transparent multiwell plate has at least two observation fields. Automated microscopy with multiwell plates and in particular with microtiter plates is often referred to as "high content screening".

Transparente Multiwellplatten ermöglichen, Reagenzien zu den Zellen zuzugeben und die Reaktion der Zelle auf die Reagenzien im Zeitverlauf zu beobachten, oder Flüssigkeit wieder zu entnehmen oder auch auszutauschen. Dazu sind oft Vorrichtungen so integriert, dass während der Beobachtung mit dem Mikroskop Flüssigkeiten in das Probenvolumen dazugegeben oder entnommen werden können. Bei komplexeren Pipettierprotokollen wird das Mikroskop mit einem Pipettierroboter kombiniert und die Mikrotiterplatte zwischen Mikroskop und Pipettierroboter je nach Protokoll hin- und hertransportiert.Transparent multiwell plates allow reagents to be added to the cells and to monitor the cell's response to the reagents over time, or to withdraw or exchange liquid. For this purpose devices are often integrated in such a way that liquids can be added or removed into the sample volume during the observation with the microscope. For more complex pipetting protocols, the microscope is combined with a pipetting robot and the microtiter plate between microscope and pipetting robot transported back and forth depending on the protocol.

Mikrofluidische Strukturen werden ebenfalls mit inversen Mikroskopen kombiniert. Bei diesen werden Flüssigkeiten durch Pumpvorrichtungen in Kapillaren bewegt, beispielsweise durch Pumpen, die oft in den mikrofluidischen Strukturen integriert sind. Zellen können in diese Strukturen eingespült werden und im Bildfeld des inversen Mikroskops beobachtet werden. Da Pumpen nur mit großem Aufwand zu parallelisieren sind und mikrofluidische Kapillaren schwer mit Ventilen versehen werden können, ist die Anzahl der unabhängig voneinander durchführbaren Flüssigkeitsmanipulationen gering. Eine solche Anordnung wird beispielsweise in WO002014019603 beschrieben.Microfluidic structures are also combined with inverse microscopes. In these, liquids are moved by pumping devices in capillaries, for example by pumps, which are often integrated in the microfluidic structures. Cells can be flushed into these structures and observed in the image field of the inverted microscope. Since pumps can be parallelized only with great effort and microfluidic capillaries difficult to be provided with valves, the number of independently manageable liquid manipulations is low. Such an arrangement is for example in WO002014019603 described.

Cell Counter oder Coulter Counter analysieren ebenfalls Zellen, die in einzelnen Tropfen an einen optischen Detektor vorbeigeführt werden. Diese sind jedoch nicht zur Abbildung von gewebeähnlichen Zellstrukturen geeignet.Cell Counter or Coulter Counter also analyze cells that are passed in single drops to an optical detector. However, these are not suitable for imaging tissue-like cell structures.

Des Weiteren haben sich in biologischen und medizinischen Labors Pipettierroboter etabliert, die mit einem horizontal beweglichen Pipettierkopf parallel kleine Flüssigkeitsmengen aus Wells einer zweiten Multiwellplatte entnehmen und in die Wells einer Multiwellplatte, insbesondere Mikrotiterplatte abgeben. Oft muss dabei in mindestens einem Schritt fast jedem Well ein anderes Reagenz zugegeben werden, wobei diese Reagenzien dann meist der zweiten Multiwellplatte entnommen und dann den Wells der ersten Multiwellplatte zugegeben werden. Neben reinen Flüssigkeiten können in diesen Multiwellplatten auch Zellen oder Reagenzien verwendet werden, die an kleine Kügelchen gekoppelt sind und üblicherweise als „Beads“ bezeichnet werden. Der Pipettierroboter kann auch die Flüssigkeiten den Wells der ersten Multiwellplatte entnehmen und diese in die Wells der zweiten Multiwellplatte abgeben, beispielsweise um nachfolgend sezernierte Moleküle in einem Plattenlesegerät, im Massenspektrometer oder chromatographisch nachzuweisen.Furthermore, pipetting robots have established themselves in biological and medical laboratories With a horizontally movable pipetting head remove small quantities of liquid from wells of a second multiwell plate and dispense them into the wells of a multiwell plate, in particular a microtiter plate. Often, in each case at least one step, another reagent must be added to almost every well, these reagents then being usually taken from the second multiwell plate and then added to the wells of the first multiwell plate. In addition to pure liquids, cells or reagents coupled to small beads, commonly referred to as "beads", can also be used in these multiwell plates. The pipetting robot can also remove the fluids from the wells of the first multiwell plate and dispense them into the wells of the second multiwell plate, for example, to detect subsequently secreted molecules in a plate reader, in the mass spectrometer or chromatographically.

Die Proben in den einzelnen Vertiefungen der Multiwellplatten werden im Labor weit häufiger mit anderen Detektoren als Mikroskopen analysiert. Es gibt eine Vielfalt von Detektionssystemen, von denen viele auf optischen Detektoren ohne Abbildungseigenschaften basieren, etwa Lumineszenz, Absorption, Farbumschlag oder Fluoreszenz. Viele diagnostische Verfahren wie beispielsweise ELISA beruhen auf diesen Detektionssystemen. Auch die bereits erwähnten Massenspektrometer wie Quadrupol oder MALDI (Matrix assisted Laser Desorption/lonization) sowie chromatographische Verfahren wie HPLC, FPLC und Kapillarelektrophorese gehören dazu.The samples in the individual wells of the multiwell plates are much more frequently analyzed in the laboratory with detectors other than microscopes. There are a variety of detection systems, many of which are based on optical detectors with no imaging properties, such as luminescence, absorption, color change or fluorescence. Many diagnostic methods such as ELISA are based on these detection systems. The aforementioned mass spectrometers such as quadrupole or MALDI (matrix assisted laser desorption / ionization) as well as chromatographic methods such as HPLC, FPLC and capillary electrophoresis are also included.

In einigen Fällen werden Flüssigkeitsmengen auch im Nanoliterbereich pipettiert, die mit Vorrichtungen verteilt werden, deren Technik von Tintenstrahldruckern mit Piezoaktuatoren abgeleitet ist. Wegen ihrer Anfälligkeit für Verstopfung durch Partikel wird ihre Funktion manchmal durch Beobachtung des Pipettierkopfs mit vergrößernden Kameras überprüft. Diese Anordnung eignet sich jedoch nicht zur gleichzeitigen Beobachtung des Inhalts der Wells, weil der Meniskus der in den Wells befindlichen Flüssigkeiten stört.In some cases, liquid quantities are also pipetted in the nanoliter range, which are distributed with devices whose technique is derived from inkjet printers with piezoactuators. Because of their susceptibility to particulate blockage, their function is sometimes checked by observing the pipetting head with magnifying cameras. However, this arrangement is not suitable for the simultaneous observation of the contents of the wells, because the meniscus of the liquids in the wells disturbs.

Keine dieser Vorrichtungen ist geeignet, gewebeähnliche Zellverbände in inverser Anordnung mit zellulärer Auflösung in transparenten Multiwellplatten zu beobachten und gleichzeitig Flüssigkeitsmanipulationsschritte mit je nach Well unterschiedlichen Reagenzien durchzuführen, ohne die Multiwellplatte dabei zu verfahren. Inverse Mikroskope ermöglichen zwar die serielle Beobachtung von Proben in Multiwellplatten, dazu wird jedoch die Multiwellplatte mit einem Mikroskoptisch horizontal und relativ zum starren Objektiv bewegt. Bei jeder Bewegung der Multiwellplatte werden durch Inertialkräfte unkontrollierte Flüssigkeitsbewegungen und Scherkräfte auf die Zellen induziert, die sich nachteilig auf den Status oder die Adhärenz der Zellen, der gewebeähnlichen Zellverbände, oder die Homogenität des Status' über den Probenträger auswirken können.None of these devices is suitable for observing tissue-like cell assemblies in inverse arrangement with cellular resolution in transparent multi-well plates and at the same time performing fluid manipulation steps with different reagents on each well without moving the multiwell plate. Although inverse microscopes allow the serial observation of samples in multiwell plates, but the multiwell plate is moved with a microscope stage horizontally and relative to the rigid lens. With each movement of the multiwell plate, inertial forces induce uncontrolled fluid movements and shear forces on the cells which may adversely affect the status or adherence of the cells, the tissue-like cell aggregates, or the homogeneity of status over the sample carrier.

Dispensiervorrichtungen sind über dem Objektiv fixiert, um Flüssigkeiten während der Beobachtung mit dem Objektiv zuzugeben und so beispielsweise die Kinetik der Zellreaktion auf die Flüssigkeit oder die darin enthaltenen Substanzen beobachten und messen zu können.Dispensers are fixed over the lens to allow liquids to be added during observation with the objective and thus to be able to observe and measure, for example, the kinetics of the cell reaction to the liquid or the substances contained therein.

Pipettierroboter dagegen haben keine Beobachtungsysteme für die Zellbeobachtung integriert. High-Content-Screeninganlagen, bei denen Mikroskope und Pipettiervorrichtungen kombiniert werden, sind so ausgelegt, dass zunächst die Multiwellplatten in der Pipettiervorrichtung befüllt werden und dann manuell oder von einem Roboterarm dem Pipettierroboter entnommen werden und auf dem Mikroskoptisch zur seriellen Messung der Wells positioniert werden. Üblicherweise werden alle Flüssigkeitsmanipulationen zunächst auf dem Pipettierroboter durchgeführt, bevor die Multiwellplatte auf dem Mikroskoptisch zur Messung positioniert wird. Seltener sehen die Protokolle vor, dass auch zwischen Flüssigkeitsmanipulationen gemessen wird. Dazu muss die Multiwellplatte nach der Flüssigkeitsmanipulation auf den Mikroskoptisch gelegt und nach der Messung wieder auf den Pipettierroboter zurückgelegt werden. Der Transport der Multiwellplatte führt auch zu einem erhöhten Risiko, dass der Roboter sie vor allem bei der Übergabe nicht richtig greift und fallen lässt.In contrast, pipetting robots have no integrated observation systems for cell observation. High-content screening systems combining microscopes and pipetting devices are designed to first fill the multiwell plates in the pipetting device and then manually or by a robotic arm to remove them from the pipetting robot and position them on the microscope stage for serial measurement of the wells. Usually, all liquid manipulations are first performed on the pipetting robot before the multiwell plate is positioned on the microscope stage for measurement. More rarely, the protocols provide that also be measured between liquid manipulations. To do this, the multiwell plate has to be placed on the microscope stage after liquid manipulation and returned to the pipetting robot after the measurement. The transport of the multiwell plate also leads to an increased risk that the robot does not grasp and drop it properly, especially during the transfer.

Die Aufgabe besteht darin, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der Flüssigkeitsmanipulationen auf einer Multiwellplatte parallel durchgeführt werden und zumindest einzelne Wells seriell, teilparallel oder parallel gleichzeitig abbildend beobachtet werden können, ohne die Multiwellplatte dabei bewegen zu müssen.The object is to provide a device with which liquid manipulations are performed in parallel on a multiwell plate and at least individual wells can be observed serially, partially parallel or parallel imaging simultaneously, without having to move the multiwell plate thereby.

Überraschenderweise lässt sich die Aufgabe mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung lösen. Die Vorrichtung ist gekennzeichnet durch einen ortsfesten Zwischenboden, und darüber optionale Decks. Über dem Zwischenboden und den optionalen Decks befindet sich mindestens eine fest verbaute oder horizontal in ein oder zwei Richtungen verfahrbare Einheit, an der ein Pipettierkopf mit mindestens einer Pipettierspitze befestigt werden kann. Decks können horizontal in ein oder zwei Richtungen oder vertikal verfahrbar sein. Bei mehr als einem Deck befinden sich die Decks vertikal übereinander und in mindestens 1 cm insbesondere 5 - 15 cm Abstand, dabei sind beide Decks bevorzugt in mindestens einer horizontalen Richtung verfahrbar. Der Abstand zwischen Deck und Zwischenboden beträgt bevorzugt weniger als 2 cm und besonders bevorzugt weniger als 1 cm. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Pipettierkopf zusätzlich vertikal verfahren werden.Surprisingly, the problem can be solved with the device according to the invention. The device is characterized by a fixed false floor and optional decks above it. Above the intermediate floor and the optional decks is at least one unit permanently installed or horizontally movable in one or two directions, to which a pipetting head with at least one pipette tip can be attached. Decks can be horizontally in one or two directions or vertically movable. In more than one deck, the decks are vertically above each other and in at least 1 cm, in particular 5 to 15 cm distance, both decks are preferably movable in at least one horizontal direction. The distance between the deck and the intermediate bottom is preferably less than 2 cm and more preferably less than 1 cm. In a preferred embodiment, a pipetting head can additionally be moved vertically.

Die Erfindung ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenboden oder die Decks zusammen mindestens zwei Ablagepositionen für Multiwellplatten aufweisen, davon mindestens eine erste Ablageposition für eine erste Multiwellplatte, in der sich gewebeähnliche Zellverbände befinden können, und mindestens eine zweite Ablageposition für eine zweite Multiwellplatte mit mindestens zwei Wells für Flüssigkeiten. Bei Ausführungsformen ohne Deck befinden sich beide Ablagepositionen auf dem Zwischenboden. Bei mehr als einem Deck befindet sich die erste Ablageposition für die erste Multiwellplatte auf dem untersten Deck. The invention is further characterized in that the intermediate floor or the decks together have at least two storage locations for multiwell plates, at least one first storage position for a first multiwell plate, in which tissue-like cell clusters may be located, and at least one second storage position for a second multiwell plate with at least two wells for liquids. In embodiments without deck both storage positions are located on the false floor. If there is more than one deck, the first storage location for the first multiwell plate is on the bottom deck.

Die Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sich im Zwischenboden (20) eine erste Ausnehmung (31) befindet, welche mindestens so groß ist wie der von den Wells belegte Bereich der ersten Multiwellplatte. In einer Ausführungsform ohne Decks befindet sich die erste Ausnehmung an der ersten Ablageposition der ersten Multiwellplatte. Sind Decks vorhanden, so weist das unterste Deck die erste Ablageposition für die erste Multiwellplatte auf, und an dieser Stelle eine zweite Ausnehmung (30), die mindestens so groß ist wie der von den Wells belegte Bereich der ersten Multiwellplatte, und das Zwischendeck eine ersten Ausnehmung (31), die mindesten so groß ist wie die zweite Ausnehmung (30). In der bevorzugten Arbeitsposition des untersten Decks befinden sich beide Ausnehmungen so übereinander, dass der Bereich der Multiwellplatte, der von den Wells überdeckt ist, frei durch beide Ausnehmungen hindurch zugänglich ist. Auf diese Weise wird erfindungsgemäß ein optischer Zugang zu der Unterseite der ersten Multiwellplatte geschaffen.The invention is further characterized in that in the intermediate floor ( 20 ) a first recess ( 31 ) which is at least as large as the area occupied by the wells of the first multiwell plate. In one embodiment without decks, the first recess is located at the first storage position of the first multiwell plate. If decks are present, then the lowest deck has the first storage position for the first multiwell plate, and at this point a second cutout (FIG. 30 ) which is at least as large as the area occupied by the wells of the first multiwell plate, and the intermediate deck a first recess ( 31 ) which is at least as large as the second recess ( 30 ). In the preferred working position of the lowermost deck, both recesses are superimposed so that the portion of the multiwell plate covered by the wells is freely accessible through both recesses. In this way, an optical access to the underside of the first multiwell plate is inventively provided.

Der Pipettierkopf kann mit der verfahrbaren Einheit mindestens so weit verfahren werden, dass er über der ersten als auch über der zweiten Multiwellplatte positioniert werden kann. Damit kann der Pipettierkopf Flüssigkeiten aus den Wells der zweiten Multiwellplatte entnehmen und in die Wells der ersten Multiwellplatte abgeben, oder umgekehrt den Wells der ersten Multiwellplatte entnehmen und sie in die Wells der zweiten Multiwellplate abgeben. In den Wells der zweiten Multiwellplatte können sich jeweils unterschiedliche Flüssigkeiten befinden, beispielsweise Zellsuspensionen oder Testsubstanzen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung eine Temperaturregelung zumindest für die erste Multiwellplatte auf, oder Anschlüsse, mit denen die Probenträger mit CO2 begast werden können. Die beiden Ablagepositionen können sich auf verschiedenen Decks oder auf ein und demselben Deck befinden. Das Deck mit der ersten Ablageposition wird während der Flüssigkeitsmanipulationen und der Abbildung nicht verfahren.The pipetting head can be moved with the movable unit at least so far that it can be positioned over the first and also over the second multiwell plate. This allows the pipetting head to remove liquids from the wells of the second multiwell plate and deliver them into the wells of the first multiwell plate, or vice versa remove the wells of the first multiwell plate and deliver them into the wells of the second multiwell plate. In each of the wells of the second multiwell plate, there may be different liquids, for example cell suspensions or test substances. In a preferred embodiment, the device has a temperature control, at least for the first multiwell plate, or connections with which the sample carriers can be gassed with CO2. The two storage positions can be located on different decks or on the same deck. The deck with the first storage position will not move during liquid manipulations and imaging.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung zwei Decks, von denen beide in einer ersten Richtung horizontal verfahrbar sind, und die sich in einem bevorzugten vertikalen Abstand von 5 -15 cm der Deckoberflächen voneinander befinden. Der Pipettierkopf ist sowohl vertikal als auch in einer zweiten, senkrecht zur ersten Richtung horizontal verfahrbar. Ein Pipettierkopf umfasst mindestens eine Pipettenspitze, bevorzugt 2, 4, 8, 16, 24, 32 in einer Reihe oder 2*3, 4*6, 8*12, 16*24 oder 32 * 48 in einem Raster. Die Pipettenspitzen können fest oder wechselbar ausgeführt sein. Die Pipettenspitzen können umschaltbar mit Druck und Unterdruck beaufschlagt werden, sodass bei Druck Flüssigkeit abgegeben und bei Unterdruck Flüssigkeit aus einem oder mehreren Gefäßen aufgenommen werden kann. Der Pipettierkopf kann mit weiteren Funktionen ausgerüstet sein, insbesondere Sensoren zur Füllstandskontrolle oder Kameras.In a preferred embodiment, the apparatus comprises two decks, both of which are horizontally movable in a first direction, and which are at a preferred vertical distance of 5 to 15 cm of the deck surfaces from one another. The pipetting head is horizontally movable both vertically and in a second, perpendicular to the first direction. A pipetting head comprises at least one pipette tip, preferably 2, 4, 8, 16, 24, 32 in a row or 2 * 3, 4 * 6, 8 * 12, 16 * 24 or 32 * 48 in a grid. The pipette tips can be fixed or exchangeable. The pipette tips can be reversibly pressurized and vacuumed so that fluid can be dispensed under pressure and liquid can be taken from one or more vessels when under vacuum. The pipetting head can be equipped with additional functions, in particular sensors for level control or cameras.

Bevorzugt ist in eine oder beide erfindungsgemäßen Ausnehmungen (30), (31) ein Beobachtungsfenster eingefügt, das insbesondere aus Glas, Quarz, Saphir, PMMA, Polycarbonat oder COC gefertigt sein kann. Die Dicke des Beobachtungsfensters beträgt bevorzugt mehr als 1 mm, insbesondere mehr als 5 mm, um mechanisch stabil zu sein. Es kann weiterhin bevorzugt sein, bei einem materiellen Fenster Wasser, transparentes Öl, oder eine andere transparente Flüssigkeit zwischen Fenster und Multiwellplatte zu geben, um Reflexionen zu mindern oder einen verbesserten Temperaturausgleich zu ermöglichen.Preference is given in one or both recesses ( 30 ) 31 ) inserted an observation window, which can be made in particular of glass, quartz, sapphire, PMMA, polycarbonate or COC. The thickness of the observation window is preferably more than 1 mm, in particular more than 5 mm, in order to be mechanically stable. It may also be preferable to provide water, transparent oil, or other transparent liquid between window and multiwell plate in a material window to reduce reflections or allow for improved temperature compensation.

Durch das Beobachtungsfenster und die Ausnehmung kann eine Kameraeinheit mit vergrößernder Optik diese erste Multiwellplatte oder einen Ausschnitt davon von unten abbilden, erfindungsgemäß auch während einer Flüssigkeitsmanipulation und insbesondere während eines Befüll- oder Entnahmevorgangs. Das Fenster oder die Ausnehmung können bevorzugt mit einer starren oder auswechselbaren Maske, insbesondere mit einer Lochmaske, oder Blende versehen sein, um Bereiche abzudecken, über denen sich keine Proben befinden, die jedoch Streulichtquellen sein können.Through the observation window and the recess, a camera unit with magnifying optics can image this first multiwell plate or a section thereof from below, according to the invention also during liquid manipulation and in particular during a filling or removal process. The window or recess may be preferably provided with a rigid or interchangeable mask, in particular with a shadow mask, or aperture to cover areas over which there are no samples, but which may be sources of scattered light.

Die Vorrichtung ist ferner gekennzeichnet durch eine Kameraeinheit, die zumindest einen elektronischen Bildsensor und zumindest eine abbildende Optik mit mindestens einer Linse oder einem Spiegel aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die Kameraeinheit größer als 1:5, insbesondere 1:1 oder gar vergrößernd ab. Bevorzugt ist die Vergrößerung der Optik so ausgelegt, dass Zellen oder Beads sich nach der Abbildung auf einen oder mehrere Bildsensoren der Kameraeinheit noch unterscheiden lassen. Vorzugsweise lassen sich Objekte noch voneinander unterscheiden, die einen Durchmesser von 20, 10, 1 oder 0,5 µm aufweisen, was den Maßen vieler eukaryotischer oder prokaryotischer Zellen entspricht. Die bevorzugte Vergrößerung hängt außerdem vom Pixelraster des Kamerasensors ab. Viele der heute verwendeten APS CMOS oder CCD Sensoren weisen Pixelraster zwischen 1 und 10 µm auf, insbesondere von 5 µm, bei der die bevorzugt gewählte Vergrößerung mindestens 4:1, 2:1, 1:5 oder 1:10 bezogen auf einen Bildsensor beträgt.The device is further characterized by a camera unit which has at least one electronic image sensor and at least one imaging optical system with at least one lens or a mirror. In a preferred embodiment, the camera unit is larger than 1: 5, in particular 1: 1 or even increasing from. The magnification of the optics is preferably designed such that cells or beads can still be distinguished after imaging onto one or more image sensors of the camera unit. Preferably, objects can still be distinguished from each other, which have a diameter of 20, 10, 1 or 0.5 microns, which corresponds to the dimensions of many eukaryotic or prokaryotic cells. The preferred magnification depends also from the pixel grid of the camera sensor. Many of the APS CMOS or CCD sensors used today have pixel pitches of between 1 and 10 .mu.m, in particular of 5 .mu.m, in which the magnification selected is at least 4: 1, 2: 1, 1: 5 or 1:10 with respect to an image sensor ,

Heute verfügen elektronische Bildsensoren über bis zu 100.000.000 Pixel, das heißt 10.000 * 10.000. Für die längere Seite einer Mikrotiterplatte mit ihren Wells reichen jedoch schon 5.400 Pixel für ihre längere Richtung aus, um den von den Wells bedeckten Teil von 99 mm ganz mit der bevorzugten Auflösung von 20 µm aufzunehmen. In Fällen wie diesen braucht die Kameraeinheit nicht mehr horizontal verfahren zu werden und nimmt doch die gesamte Mikrotiterplatte parallel mit zellulärer Auflösung auf. Dabei verhält sich bei quadratischen Bildsensoren die Quadratwurzel der Anzahl der Bildsensorpixel umgekehrt proportional zur geforderten Auflösung.Today, electronic image sensors have up to 100,000,000 pixels, which is 10,000 * 10,000. However, for the longer side of a microtiter plate with its wells, 5,400 pixels are enough for its longer direction to accommodate the well-covered part of 99 mm all at the preferred 20 μm resolution. In cases like these, the camera unit no longer needs to be moved horizontally, yet it takes up the entire microtiter plate in parallel with cellular resolution. In the case of square image sensors, the square root of the number of image sensor pixels behaves inversely proportional to the required resolution.

In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich unter dem Beobachtungsfenster ein Umlenkspiegel, der das von der Unterseite der Multiwellplatte und durch das Beobachtungsfenster oder die Ausnehmungen im Wesentlichen vertikal ausgesandete Licht um 90° ablenkt, so dass es sich nach dem Spiegel im Wesentlichen weiter horizontal ausbreitet und die unterhalb des Decks befindliche Kamera und ihre Abbildungsoptik mit horizontaler optische Achse aufgebaut werden können. Diese Anordnung ermöglicht eine geringere Bauhöhe für die Elemente unterhalb des Decks. Dabei kann der Ablenkungswinkel auch von 90° verschieden sein. Zudem kann der Strahlengang noch weiter gefaltet sein, um eine kompakte Anordnung zu ermöglichen. Es kann bevorzugt sein, in einem solchen Strahlengang eine Feldlinse direkt unter das Beobachtungsfenster einzufügen, oder ein oder beide Beobachtungsfenster als Feldlinse, insbesondere als Feldlinse mit planarer Oberseite auszuführen.In a preferred embodiment, a deflection mirror is located below the observation window, which deflects the light emitted substantially vertically from the underside of the multiwell plate and through the observation window or recesses by 90 °, so that it propagates substantially further horizontally after the mirror and Below the deck located camera and its imaging optics can be constructed with a horizontal optical axis. This arrangement allows a lower height for the elements below the deck. In this case, the deflection angle may also be different from 90 °. In addition, the beam path can be folded further to allow a compact arrangement. It may be preferable to insert a field lens directly under the observation window in such a beam path, or to execute one or both observation windows as a field lens, in particular as a field lens with a planar top side.

Da aus technischen oder Kostengründen hochauflösende Bildsensoren nicht immer zur Verfügung stehen, könne auch kleinere Bildsensoren verwendet werden, die zu kleineren Bildausschnitten oder einer geringeren Auflösung führen.Since high-resolution image sensors are not always available for technical or cost reasons, it is also possible to use smaller image sensors which lead to smaller image sections or a lower resolution.

Es ist daher bevorzugt, die Kameraeinheit auf einem horizontalen Verfahrtisch zu befestigen, sodass sie in einer Ebene parallel zur Multiwellplatte in ein oder zwei Richtungen verfahren werden kann, insbesondere so, dass der maximale Verfahrweg des Verfahrtischs mindestens 10 cm in mindestens einer Richtung beträgt. Dabei kann bei Verwendung eines Umlenkspiegels dieser vorteilhaft mit auf dem Verfahrtisch befestigt sein, so dass Umlenkspiegel, Kamera und, sofern vorhanden, Beleuchtungseinheit mit nur einem Verfahrtisch gemeinsam verfahren werden. Es kann auch bevorzugt sein, dass die Bildsensoren, oder die Optik oder der Umlenkspiegel separat auf dem Verfahrtisch verfahren werden können, um die Kameraeinheit auf eine ausgewählte Ebene im Probenträger fokussieren zu können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verfügt die Optik über einen Fokussiertrieb, der motorisiert verstellt werden kann.It is therefore preferable to fix the camera unit on a horizontal traversing table so that it can be moved in a plane parallel to the multiwell plate in one or two directions, in particular so that the maximum traverse path of the traversing table is at least 10 cm in at least one direction. In this case, when using a deflecting mirror, this can advantageously be fastened to the travel table so that deflecting mirror, camera and, if present, illumination unit are moved together with only one travel table. It may also be preferred that the image sensors, or the optics or the deflection mirror can be moved separately on the traversing table in order to be able to focus the camera unit on a selected plane in the sample carrier. In a particularly preferred embodiment, the optics has a focusing drive, which can be adjusted by motorization.

Andere vorteilhafte Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Kameraeinheit relativ zum Umlenkspiegel verfahren wird, oder der Umlenkspiegel relativ zur Kameraeinheit, oder dass bewegliche oder vertikal drehbare Spiegel verwendet werden, die durch ihre Rotation oder Translation einen wesentlichen Teil der Unterseite der Multiwellplatte abtasten oder abbilden können, ohne dass dazu die Kameraeinheit selbst bewegt werden müsste. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Bildsensoren in einem Raster angeordnet, oder mehrere Kameras in einem Raster angeordnet, so dass die abgebildete Fläche entsprechend der Anzahl der Kameras oder Bildsensoren größer wird. Besonders vorteilhaft ist eine Kameraeinheit bestehend aus mehreren Kameras, bei der jede Kamera genau ein Beobachtungsfeld der Multiwellplatte oder Ausschnitte davon abbildet. In einer weiteren Ausführungsform wird der Strahlengang der Abbildung beispielsweise durch Verwendung von Linsen-, Prismen-, oder Spiegelarrays, so aufgeteilt, dass im Wesentlichen nur Beobachtungsfelder ohne Zwischenraum auf den Bildsensor abgebildet werden.Other advantageous embodiments are characterized in that the camera unit is moved relative to the deflection mirror, or the deflection mirror relative to the camera unit, or that movable or vertically rotatable mirrors are used, which can scan or image a substantial part of the underside of the multiwell plate by their rotation or translation without having to move the camera unit itself. In a further preferred embodiment, a plurality of image sensors are arranged in a grid, or a plurality of cameras arranged in a grid, so that the imaged area becomes larger in accordance with the number of cameras or image sensors. Particularly advantageous is a camera unit consisting of several cameras, in which each camera represents exactly one observation field of the multiwell plate or sections thereof. In a further embodiment, the beam path of the image is split, for example, by using lens, prism or mirror arrays, such that substantially only observation fields without an intermediate space are imaged onto the image sensor.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist ferner durch eine Beleuchtungseinheit gekennzeichnet, die die Beobachtungsfelder in mindestens einem ausgewählten Wellenlängenbereich beleuchtet, oder nacheinander in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen, wobei die Wellenlängenbereiche durch intermittierendes Ansteuern von Lichtquellen mit verschiedenen Emissionswellenlängenbereichen und insbesondere von Leuchtdioden oder Laserdioden oder anderen Lasern, oder durch Filterräder oder Gitter ausgewählt werden können. Dabei kann bevorzugt sein, das Bild nur in ausgewählten Wellenlängenbereichen aufzunehmen, oder in nacheinander in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen, beispielsweise durch die Verwendung von Farbfiltern oder durch die Auswertung der spektralen Auflösung der Bildsensoren. Diese Ausführungsformen sind bevorzugt, um spektrale Information über die Probe zu erlangen, insbesondere um Fluoreszenz oder Absorptionsinformation der Probe zu bestimmen.The device according to the invention is further characterized by a lighting unit which illuminates the observation fields in at least one selected wavelength range, or successively in different wavelength ranges, wherein the wavelength ranges by intermittently driving light sources with different emission wavelength ranges and in particular light emitting diodes or laser diodes or other lasers, or by filter wheels or grid can be selected. It may be preferred to record the image only in selected wavelength ranges, or in successive different wavelength ranges, for example by the use of color filters or by the evaluation of the spectral resolution of the image sensors. These embodiments are preferred for obtaining spectral information about the sample, particularly for determining fluorescence or absorption information of the sample.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Beleuchtung kollinear, führt also im Wesentlichen senkrecht durch das Beobachtungsfenster oder die Ausnehmungen die Multiwellplatte von unten. Es kann jedoch auch bevorzugt sein, die Multiwellplatte unter einem Winkel von unten zu beleuchten. Dieser Winkel muss kleiner sein als der kleinste Totalreflexionswinkel zwischen Multiwellplatte und der Unterseite des Beobachtungsfensters. Ferner ist bevorzugt, die Beleuchtung auch über den Umlenkspiegel einzukoppeln, bei parallelem Strahlengang mit der Kamera durch Verwendung von Strahl- oder Wellenlängenteilern.In a preferred embodiment, the illumination is collinear, ie it guides the multiwell plate from below essentially vertically through the observation window or the recesses. However, it may also be preferable to illuminate the multiwell plate at an angle from below. This angle must be smaller than the smallest Total reflection angle between the multiwell plate and the underside of the observation window. Furthermore, it is preferred to couple the illumination via the deflection mirror, with parallel beam path with the camera by using beam or wavelength splitters.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Multiwellplatte in einem Plattenrahmen mit Ausnehmungen oder Bohrungen auf der Unterseite, so dass die Beobachtungsfelder von unten her zumindest teilweise durch das Beobachtungsfenster oder die Ausnehmungen auf die Kameraeinheit abgebildet werden können. Bevorzugt weist der Plattenrahmen an den Seiten Aussparungen aus, sodass Laborroboter die Multiwellplatte im Plattenrahmen greifen und diesem entnehmen oder die Multiwellplatte im Plattenrahmen ablegen können. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform verbleibt die Multiwellplatte im Plattenrahmen und der Laborroboter transportiert den Plattenrahmen samt Multiwellplatte. Dazu ist es vorteilhaft, elektrische Kontakte zwischen Plattenrahmen und Deck oder anderen Elementen des Pipettierroboters als lösbare Steck- oder Berührungskontakte auszuführen.In a particularly preferred embodiment, the multiwell plate is in a plate frame with recesses or holes on the bottom, so that the observation fields from below can be imaged at least partially through the observation window or the recesses on the camera unit. The plate frame preferably has recesses on the sides, so that laboratory robots can grasp the multiwell plate in the plate frame and remove it or place the multiwell plate in the plate frame. In another preferred embodiment, the multiwell plate remains in the plate frame and the laboratory robot transports the plate frame including multiwell plate. For this purpose, it is advantageous to carry out electrical contacts between the plate frame and the deck or other elements of the pipetting robot as detachable plug-in or touch contacts.

Der bevorzugte Plattenrahmen weist pro Beobachtungsfeld zudem mindestens eine Aufnahme für eine Lichtquelle auf, insbesondere für eine LED. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aufnahme eine Sacklochbohrung, deren horizontale Achsenprojektion auf den Mittelpunkt des Beobachtungsfeldes an der Unterseite der Multiwellplatte zeigt, und die in einem Winkel zur Vertikalen schräg nach unten ausgeführt ist, so dass eine LED, die am unteren Ende der Sacklochbohrung montiert oder aufgeklebt ist, das Beobachtungsfeld in Auflichtkonfiguration relativ zur Kameraeinheit beleuchtet. Es kann bevorzugt sein, eine weitere Optik zwischen LED und Beobachtungsfeld vorzusehen, insbesondere nahe des oberen Endes der Bohrung, um effektiver und stärker fokussiert zu beleuchten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die LED ohne Bohrung so auf einer Aufnahme montiert oder geklebt, insbesondere auf einer schrägen Fläche, so dass sie direkt das Beobachtungsfeld unter einem Winkel beleuchtet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist eine Leiterplatte mit Ausnehmungen für die Strahlengänge im Plattenrahmen integriert, auf dem sämtliche elektrischen Kontakte und Bauteile integriert sind. Insbesondere können die LEDs direkt auf der Leiterplatte montiert, insbesondere geklebt sein. In beiden Fällen kann es bevorzugt sein, Bohrungen für die Aufnahme von Kabeln oder gedruckte Leiterbahnen oder Platinen für die Stromversorgung der LEDs im Plattenrahmen auszuführen.The preferred plate frame also has at least one receptacle for a light source per observation field, in particular for an LED. In a preferred embodiment, the receptacle comprises a blind hole whose horizontal axis projection points to the center of the observation field at the bottom of the multiwell plate and which is obliquely downwards at an angle to the vertical such that an LED is mounted at the lower end of the blind bore or is glued, the observation field illuminated in incident light configuration relative to the camera unit. It may be preferable to provide further optics between the LED and the field of view, particularly near the top of the bore, to illuminate more effectively and more focusedly. In a further preferred embodiment, the LED without bore is mounted or glued on a receptacle, in particular on an inclined surface, so that it directly illuminates the field of view at an angle. In a particularly preferred embodiment, a printed circuit board is integrated with recesses for the beam paths in the plate frame, on which all electrical contacts and components are integrated. In particular, the LEDs can be mounted directly on the printed circuit board, in particular glued. In both cases, it may be preferable to make holes for receiving cables or printed circuit boards or boards for the power supply of the LEDs in the plate frame.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Plattenrahmen mehrere LEDs pro Beobachtungsfeld auf, um die Beleuchtung effektiver auszuführen, oder um mit mehreren Farben zu beleuchten, insbesondere mit weißem Licht und mit schmalbandigen LEDs oder LEDs mit Farbfiltern zur Anregung von Fluoreszenz. Besonders bevorzugt ist es, dazu eine elektronische Schaltung und bevorzugt eine durch Software ansteuerbare Schaltung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu integrieren, mit der die unterschiedlichen LEDs gleichzeitig oder nacheinander an- und ausgeschaltet werden können, um die Belastung der Probe mit Licht zu reduzieren. Es kann auch bevorzugt sein, dabei nur einzelne Wells zu beleuchten, insbesondere nur die Wells, bei denen zuvor die Vitalität der Zellen mit der Kameraeinheit oder mit anderen Sensoren bestimmt und als ausreichend quantifiziert wurde.In a preferred embodiment, the panel frame includes a plurality of LEDs per field of view to make the illumination more effective, or to illuminate with a plurality of colors, particularly white light and narrow band LEDs or LEDs with color filters to excite fluorescence. To this end, it is particularly preferable to integrate an electronic circuit and preferably a software-controllable circuit in the device according to the invention, with which the different LEDs can be switched on and off simultaneously or in succession in order to reduce the load on the sample with light. It may also be preferred to illuminate only individual wells, in particular only the wells, in which previously the vitality of the cells was determined with the camera unit or with other sensors and quantified as sufficient.

Es kann bevorzugt sein, ein Deckelgehäuse zu verwenden, das pro Well je eine Bohrung oder Ausnehmungen für mehrere Wells auf der Oberseite aufweist, pro Beobachtungsfeld oder für mehrere Beobachtungsfelder je eine Ausnehmung, das den Probenträger aufnimmt. Die Unterseite der Gefäße lässt sich durch die Ausnehmungen an der Unterseite beleuchten und auf die Kameraeinheit abbilden. Pipettenspitzen können durch die Bohrungen oder die Ausnehmungen des Deckelgehäuses von oben an die Wells reichen und Flüssigkeitsmanipulationen vornehmen. Es kann bevorzugt sein, bei einem Transport mit dem Laborroboter die Multiwellplatte im Deckelgehäuse zu belassen und das Deckelgehäuse mit dem Roboter zu greifen. Ein Deckelgehäuse kann aus Metall oder anderem leitenden Material gefertigt sein, um die Funktion eines Faraday-Käfigs zu erfüllen, oder um die Multiwellplatte zu temperieren. Es kann auch bevorzugt aus Kunststoff gefertigt sein, um die Platte mit Deckelgehäuse in einem Inkubator ablegen zu können.It may be preferable to use a lid housing which has per well each bore or recesses for several wells on the top, per field of observation or for several fields of observation each have a recess which receives the sample carrier. The underside of the vessels can be illuminated through the recesses on the underside and imaged onto the camera unit. Pipette tips can pass through the holes or the recesses of the cover housing from above to the wells and liquid manipulations. It may be preferred to leave the multiwell plate in the cover housing during transport with the laboratory robot and to grip the cover housing with the robot. A lid housing may be made of metal or other conductive material to perform the function of a Faraday cage, or to temper the multiwell plate. It may also be preferably made of plastic in order to store the plate with cover housing in an incubator can.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bildsequenz von den Beobachtungsfeldern aufgenommen, insbesondere ein Video. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Bilder oder Videos mit rechnergestützter automatischer Bildverarbeitung analysiert, um die Flüssigkeitsmanipulation auszuwerten, oder die den Vitalzustand der gewebeähnlichen Zellverbände zu analysieren oder zu bewerten, oder die Reaktion der Zellen auf Stimuli, insbesondere auf den Zellen zugegebene Substanzen. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der die Auswertung der Bilder für eine Qualitätskontrolle und Dokumentation verwendet wird, oder bei der das Resultat der Auswertung der Bilder für ein Signal verwendet wird, insbesondere den Start oder Stopp eines Pipettiervorgangs, einer Zellkultur, oder einer Exposition der Zellen. Dabei ist es besonders bevorzugt, beim Pipettiervorgang eventuell auftretende Fehler wie zum Beispiel Luftblasen oder das Fehlen des jeweiligen Mediums im Beobachtungsfeld zu detektieren um die betroffenen Wells während der Messung entsprechend markieren zu können.In a preferred embodiment, an image sequence is recorded by the observation fields, in particular a video. In a particularly preferred embodiment, the images or videos are analyzed with computer-aided automatic image processing to evaluate the fluid manipulation or to analyze or evaluate the vital state of the tissue-like cell aggregates, or the reaction of the cells to stimuli, in particular cells added to the cells. Particularly preferred is an embodiment in which the evaluation of the images for quality control and documentation is used, or in which the result of the evaluation of the images is used for a signal, in particular the start or stop of a pipetting process, a cell culture, or an exposure of the cells. It is particularly preferred to detect any errors occurring during the pipetting process, such as air bubbles or the absence of the respective medium in the field of observation in order to be able to mark the affected wells accordingly during the measurement.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Kamera aus einem Bildsensor und einem Objektiv, das fest oder wechselbar mit der Fassung des Bildsensors verbunden ist. Bevorzugt sind Kameras, deren Fokusebene justierbar ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform befinden sich zwischen Bildsensor und Objektiv weitere optische Elemente, insbesondere Filter oder dichroitische Strahlteiler, die das Einkoppeln einer Beleuchtung in den Strahlengang des Objektivs ermöglichen. In a preferred embodiment, the camera consists of an image sensor and a lens which is fixed or changeable connected to the socket of the image sensor. Preference is given to cameras whose focal plane is adjustable. In a further preferred embodiment, additional optical elements, in particular filters or dichroic beam splitters, which enable the coupling of illumination into the beam path of the objective are located between image sensor and objective.

Bevorzugt befinden sich dichroitische Filter und Strahlteiler zwischen Fenster und Objektiv zum Auskoppeln des Lichts, das sich aus dem Beobachtungsfeld ausbreitet, sodass dieses Licht in unterschiedlichen Farbkanälen abgebildet werden kann.Preferably, dichroic filters and beam splitters are located between the window and the objective for decoupling the light that propagates out of the field of view, so that this light can be imaged in different color channels.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine mechanische Transport- und eine Software-Schnittstelle auf, so dass Probenträger aus einem Inkubator entnommen und auf die erste Ablageposition abgelegt werden können, oder von der ersten Ablageposition in den Inkubator transportiert werden können.In a further preferred embodiment, the device according to the invention has a mechanical transport and a software interface, so that sample carriers can be removed from an incubator and placed on the first storage position, or transported from the first storage position into the incubator.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Software auf, die mindestens eine der notwendigen oder möglichen, nachfolgend aufgeführten Funktionen der Vorrichtung steuert, insbesondere

- das Verfahren des Pipettierkopfs in ein, zwei, oder drei Raumrichtungen,
- optional das Verfahren mindestens eines Decks in ein, zwei oder drei Raumrichtungen, sofern die Decks nicht fest ausgeführt sind und nur der Pipettierkopf verfahren wird,
- das wiederholte Aufnehmen und Abgeben von Pipettierspitzen in mindestens zwei dafür vorgesehenen Ablagepositionen. Bevorzugt unter Einhaltung von Sterilität.
- die Aufnahme oder Abgabe von Flüssigkeiten mit den Pipettenspitzen des Pipettierkopfes,
- das Fokussieren der Kamera oder das Starten und Stoppen von Bildaufnahmensequenzen ,
- das Ein- und Ausschalten der LEDs, oder das Umschalten der verschiedenen Beleuchtungsfarben,
- das Wechseln von mono- dichroitischen oder anderen Farbfiltern im Strahlengang
- das Schalten oder Drehen von Spiegeln im Beleuchtungs- oder Beobachtungsstrahlengang
- optional das Verfahren des Verfahrtischs mit der Kameraeinheit, sofern ein Verfahrtisch vorgesehen ist.
- Eine Auswertung der Bildsignale oder -sequenzen, um beispielsweise die Vitalität von Zellen in den Wells oder Beobachtungsfenstern der Multiwellplatte zu klassifizieren und anhand dieser Wertes autark zu entscheiden, in welchen Wells oder Beobachtungsfenstern Experimente wegen mangelnder Zellvitalität abgebrochen werden sollen. Dazu werden besonders bevorzugt Fehler während des Pipettiervorgangs wie z.B. fehlendes Medium oder Luftblasen im System detektiert.

The device according to the invention has software which controls at least one of the necessary or possible functions of the device listed below, in particular

the method of the pipetting head in one, two or three spatial directions,
- Optionally, the process of at least one deck in one, two or three spatial directions, unless the decks are fixed and only the pipetting head is moved,
- The repeated recording and dispensing of pipetting tips in at least two designated storage positions. Preferably in compliance with sterility.
the uptake or release of liquids with the pipette tips of the pipetting head,
- focusing the camera or starting and stopping image acquisition sequences,
switching the LEDs on and off, or switching the different illumination colors,
- Changing monochloritic or other color filters in the beam path
- Switching or rotating mirrors in the illumination or observation beam path
- Optionally, the method of Verfahrischs with the camera unit, if a Verfahrisch is provided.
- An evaluation of the image signals or sequences, for example, to classify the vitality of cells in the wells or observation windows of the multiwell plate and use this value to decide independently in which wells or observation windows experiments are to be discontinued due to lack of cell vitality. For this purpose, errors during the pipetting process, such as, for example, missing medium or air bubbles, are particularly preferably detected in the system.

Dazu gehört auch das anwendungsabhängige Schalten der Beleuchtung, insbesondere der verschieden farbigen LEDs oder Laser. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Software ein Interface oder Application Programming Interface (API) für eine Auswertesoftware auf, so dass auch extern ausgewertete Signale der Kameraeinheit für die Steuerung von Prozessen der Vorrichtung verwendet werden können. APIs oder ähnliche Interfaces sind auch geeignet, um Laborroboter mit der Vorrichtung gemeinsam zu verwenden, wobei der Roboter Multiwellplatten, Plattenrahmen oder Gehäusedeckel auf die erste, zweite, oder weitere Ablagepositionen legen kann oder von dort entnehmen kann, um sie weiteren Laborgeräten, insbesondere Inkubatoren zuzuführen oder diesen zu entnehmen.This also includes the application-dependent switching of the lighting, in particular the differently colored LEDs or lasers. In a preferred embodiment, the software has an interface or application programming interface (API) for an evaluation software, so that externally evaluated signals of the camera unit can be used for the control of processes of the device. APIs or similar interfaces are also suitable for sharing laboratory robots with the apparatus, wherein the robot can place multiwell plates, plate frames or housing covers on the first, second, or further storage positions or can be removed from there to supply them to other laboratory equipment, especially incubators or to remove this.

Beansprucht werden zudem Anwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, insbesondere die Anwendung für die parallel dreidimensionale Zellkultur in Multiwellplatten mit Beobachtungsfeldern, insbesondere in Mikrotiterplatten mit transparenten Wells, wobei die Zellkultur aus Zelllinien, induzierten pluripotenten Stammzellen hervorgehen kann, oder aus Primärgewebe. Bevorzugt werden bei dieser Anwendung Zellsuspensionen, Substanzen, insbesondere Nährmedien für die Kultivierung der Zellen, einschließlich Wachstumsfaktoren oder Differenzierungsfaktoren für Stammzellen in die Wells abgegeben, oder Medium mit Zellmetaboliten wird den Wells wieder entnommen. Vorteilhaft können ferner Reagenzien für die Detektion von Vorgängen in den Zellen oder um die Zellen herum, insbesondere Vitalitätsindikatoren den Wells hinzugefügt werden. Zudem können therapeutische oder toxische Substanzen den Wells hinzugefügt werden. Es kann bevorzugt sein, mehrere dieser Schritte zeitlich gestaffelt nach einem experimentellen Protokoll hinzuzugeben, und die Vitalität der Zellen, die Qualität der gewebeähnlichen Zellverbände oder Organoide, oder die Wirkung der Toxine oder therapeutischen Substanzen durch Auswertung der Daten aus der Kameraeinheit pro Beobachtungsfeld separat zu erfassen.Also claimed are applications of the device according to the invention, in particular the application for the parallel three-dimensional cell culture in multiwell plates with observation fields, in particular in microtiter plates with transparent wells, whereby the cell culture can originate from cell lines, induced pluripotent stem cells, or from primary tissue. In this application, cell suspensions, substances, in particular nutrient media for culturing the cells, including growth factors or differentiation factors for stem cells, are preferably delivered into the wells, or medium with cell metabolites is taken from the wells again. Advantageously, reagents for the detection of events in the cells or around the cells, in particular vitality indicators, can be added to the wells. In addition, therapeutic or toxic substances can be added to the wells. It may be preferable to add several of these steps in a time-staggered manner according to an experimental protocol, and to separately detect the vitality of the cells, the quality of the tissue-like cell aggregates or organoids, or the effect of the toxins or therapeutic substances by evaluating the data from the camera unit per field of observation ,

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, insbesondere der besonders bevorzugten Ausführungsformen der Beispiele. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.Further advantages will become apparent from the description and the accompanying drawings, in particular the particularly preferred embodiments of the examples. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained not only in the respective specified combination, but also in other combinations or alone, without departing from the scope of the present invention.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den beigefügten Zeichnungen dargestellt und werden in einer der nachfolgenden Beschreibungen näher erläutert. Es zeigen:

1 Eine typische High-Content-Screening-Anlage im Stand der Technik
2 Der prinzipielle, nicht maßstabsgetreue Aufbau einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
3 zeigt einen nicht maßstabsgetreuen, horizontalen Riss durch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
4 Längsschnitt durch eine Multiwellplatte mit integrierter Mikrofluidik
5 Eine perspektivische Darstellung eines Plattenrahmens mit LEDs im Auflichtstrahlengang für die Beleuchtung
6 Eine Schnittzeichnung des Plattenrahmens mit LEDs und dem eingezeichneten Auflichtstrahlengang für die Beleuchtung mitsamt der beweglichen Ebene mit Ausnehmung sowie der ortsfesten Ebene mit dem Beobachtungsfenster.
7 Eine Explosionszeichnung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der sich die Kameraeinheit auf einem Verfahrtisch unterhalb des Beobachtungsfensters befindet, und die Beleuchtungseinheit in einem Plattenrahmen, welcher sich auf einer beweglichen Ebene mit Ausnehmung unter dem Plattenrahmen befindet.
8 Ein Verfahrtisch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform in Aufsicht mit Kameraeinheit und Lichtquellen, die in den Beobachtungsstrahlengang eingekoppelt werden.
9 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit wechselbaren Fluoreszenzfiltern im Beobachtungsstrahlengang.

Embodiments of the invention are illustrated in the accompanying drawings and are explained in more detail in one of the following descriptions. Show it:

1 A typical high-content screening system in the state of the art
2 The principal, not to scale, construction of an embodiment of the device according to the invention
3 shows a not to scale, horizontal crack through an embodiment of the device according to the invention
4 Longitudinal section through a multiwell plate with integrated microfluidics
5 A perspective view of a plate frame with LEDs in the reflected light beam path for lighting
6 A sectional drawing of the plate frame with LEDs and the drawn incident light beam path for the lighting together with the movable plane with recess and the fixed plane with the observation window.
7 An exploded view of a preferred embodiment of the device according to the invention, in which the camera unit is located on a travel table below the observation window, and the lighting unit in a plate frame, which is located on a movable plane with recess under the plate frame.
8th A travel table of another preferred embodiment in plan view with camera unit and light sources which are coupled into the observation beam path.
9 an embodiment of the device according to the invention with exchangeable fluorescence filters in the observation beam path.

1 zeigt eine typische High-Content-Screening-Anlage nach dem aktuellen Stand der Technik. Sie umfasst einen Pipettierroboter 11 und ein inverses Mikroskop 12, zwischen denen Multiwellplatten 15 hin- und hertransportiert werden. Der Pipettierroboter weist außerdem einen in allen Raumrichtungen verfahrbaren Pipettierkopf 13 mit mindestens einer Pipettenspitze 14 auf. Das inverse Mikroskop weist ein vertikal angeordnetes Objektiv 16 auf, über dem sich die horizontal verfahrbare Multiwellplatte befindet. 1 shows a typical high-content screening system according to the current state of the art. It includes a pipetting robot 11 and an inverted microscope 12 , between which multiwell plates 15 transported back and forth. The pipetting robot also has a pipetting head that can be moved in all spatial directions 13 with at least one pipette tip 14 on. The inverted microscope has a vertically arranged objective 16 over which the horizontally movable multiwell plate is located.

2 zeigt eine schematische Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Auf einem Deck 21 befinden sich mindestens zwei Ablagepositionen für Multiwellplatten, darunter eine erste Ablageposition 22 für eine erste Multiwellplatte 15 und eine zweite Ablageposition 23 für eine zweite Multiwellplatte 15. In einer Ebene über dem Deck ist der horizontal und vertikal verfahrbare Pipettierkopf 13 angebracht. In einer Ebene unterhalb des Decks 21 befindet sich die zumindest horizontal verfahrbare Kameraeinheit mit dem Objektiv 25 und einer Kamera 24 sowie einem Umlenkspiegel 26. Der Umlenkspiegel knickt den Strahlengang um 90°. Er ermöglicht, die Kamera mit horizontaler optischer Achse zu befestigen und dennoch die Multiwellplatte von unten durch das Beobachtungsfenster hindurch mit vertikaler optischer Achse aufzunehmen. Diese Anordnung ist besonders vorteilhaft, weil Kameraebene und Deck nur geringen Abstand voneinander bedürfen, insbesondere weniger als 20 oder 10 cm gemessen zwischen optischer Achse der Kamera und Unterseite der aufliegenden Multiwellplatte. Damit ist es möglich, den Unterbau des Decks flacher auszuführen, als dies ohne Umlenkspiegel möglich wäre. 2 shows a schematic embodiment of the device according to the invention. On a deck 21 There are at least two storage locations for multiwell plates, including a first storage position 22 for a first multiwell plate 15 and a second storage position 23 for a second multiwell plate 15 , In one level above the deck is the horizontally and vertically movable pipetting head 13 appropriate. In a level below the deck 21 is the at least horizontally movable camera unit with the lens 25 and a camera 24 and a deflecting mirror 26 , The deflecting mirror bends the beam path by 90 °. It allows the camera to be mounted with a horizontal optical axis while still recording the multiwell plate from below through the observation window with a vertical optical axis. This arrangement is particularly advantageous because camera level and deck require only a small distance from each other, in particular less than 20 or 10 cm measured between the optical axis of the camera and the underside of the resting multiwell plate. This makes it possible to flatten the substructure of the deck, as would be possible without deflecting mirror.

3 zeigt einen horizontalen Riss einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne Decks. In dieser Zeichnung wird das Beobachtungsfenster 31 unter der ersten Multiwellplatte 15 sichtbar. Zudem sind in dieser Zeichnung drei Prinzipalebenen der Vorrichtung für unabhängiges horizontales Verfahren von Elementen der Vorrichtung eingezeichnet: Ebene A, in der der Pipettierkopf horizontal verfahren wird. Auf Ebene B befindet sich der Zwischenboden mit der ersten Ablageposition 22 für die erste Multiwellplatte 15, das in einer bevorzugten Ausführungsform zumindest in einer Richtung horizontal und unabhängig von Pipettierkopf und Verfahrtisch mit Kameraeinheit verfahren werden kann. Auf Ebene C befindet sich die horizontal eingebaute Kameraeinheit 24, die in dieser Ebene unabhängig vom Pipettierkopf in Ebene A und vom Deck in Ebene B auf einem Verfahrtisch horizontal in mindestens eine Richtung verfahren werden kann. In dieser Ausführungsform ist der Pipettierkopf in eine horizontale Richtung verfahrbar, damit der Pipettierkopf Flüssigkeiten zwischen den Multiwellplatten transportieren kann, und vertikal verfahrbar, damit die Pipettenspitzen in die Wells einer Multiwellplatte eintauchen und Flüssigkeit aufnehmen können. 3 shows a horizontal crack of an embodiment of the device according to the invention without decks. In this drawing the observation window becomes 31 under the first multiwell plate 15 visible. In addition, in this drawing three principal levels of the device for independent horizontal movement of elements of the device are plotted: plane A , in which the pipetting head is moved horizontally. At level B is the intermediate floor with the first storage position 22 for the first multiwell plate 15 which in a preferred embodiment can be moved horizontally and independently of the pipetting head and traversing table with the camera unit, at least in one direction. At level C is the horizontally installed camera unit 24 , in this level independent of the pipetting head in level A and from the deck in level B can be moved horizontally in at least one direction on a traversing table. In this embodiment, the pipetting head is movable in a horizontal direction so that the pipetting head can transport liquids between the multiwell plates and vertically movable so that the pipette tips can dip into the wells of a multiwell plate and receive liquid.

4 stellt den Längsschnitt durch eine Multiwellplatte zur Illustration dar, deren Wells 16 über mikrofluidische Kanäle und Strukturen 65 miteinander verbunden sind. Darin können beispielsweise Zellen oder gewebeähnliche zelluläre Strukturen 66 eingespült und angewachsen oder aktiv deponiert werden. Flüssigkeiten können durch Pipetten oder Pipettenspitzen 61 zu- oder abgegeben werden. Die Multiwellplatte weist Beobachtungfelder auf, die transparent sind. Oft sind sie (62, 63) direkt als Boden der Wells 16 ausgearbeitet, oft beispielsweise (64) unter den fluiden Verbindungsstrukturen. 4 illustrates the longitudinal section through a multiwell plate for illustration, whose wells 16 via microfluidic channels and structures 65 connected to each other. In it, for example, cells or tissue-like cellular structures 66 be rinsed in and grown or actively deposited. Liquids may be through pipettes or pipette tips 61 be added or delivered. The multiwell plate has observation fields that are transparent are. Often they are (62, 63) directly as the bottom of the wells 16 often, for example, (64) among fluid interconnections.

5: Perspektivische Prinzipzeichnung eines Plattenrahmens 50, auf dem eine Multiwellplatte so aufgelegt werden kann, dass sich die Beobachtungsfelder über den oberen Bohrungen 52 befinden oder aufliegen. An der Unterseite weist dieser Plattenrahmen weitere Bohrungen 53 auf, durch die das Beobachtungslicht zur Detektionseinheit gelangt. Neben diesen Bohrungen befinden sich 1, 2, 3, 4 oder mehr Lichtquellen 51, insbesondere LED. Diese können wie gezeichnet sich einem Feld neben den Bohrungen 53 angeordnet sein, oder auch jeweils ringförmig angeordnet um die Bohrungen 53 herum. Besonders vorteilhaft ist es, die Unterseite des Plattenrahmens mit den unteren Bohrungen 53 als Leiterplatte auszuführen, die LEDs oder deren Gehäuse direkt darauf aufzubringen, etwa durch Löten, Kleben oder mit Steckverbindungen. Die Stromversorgung und die Schaltung der LEDs kann mit Leiterbahnen und elektronischen Komponenten auf der Leiterplatte ausgeführt werden. Um Wärmeeinwirkung und Streulichteffekte zu reduzieren, ist es vorteilhaft, die Bohrungen 52 und 53 mit mindestens 1, 5, oder 10 mm zu beabstanden, jedoch bevorzugt nicht mehr als 50 oder 100 mm. Es kann ferner bevorzugt sein, die Bohrungen 52 und 53 mit Feldlinsen zu versehen, um die Apertur zu erhöhen. 5 : Perspective schematic drawing of a panel frame 50 on which a multiwell plate can be placed so that the observation fields above the upper holes 52 lie or rest. At the bottom of this plate frame has more holes 53 on, passes through the observation light to the detection unit. Next to these holes are 1, 2, 3, 4 or more light sources 51 , especially LED. These can be drawn as a field next to the holes 53 be arranged, or in each case arranged in a ring around the holes 53 around. It is particularly advantageous, the underside of the plate frame with the lower holes 53 as a circuit board to apply the LEDs or their housing directly on it, such as by soldering, gluing or with connectors. The power supply and the switching of the LEDs can be carried out with tracks and electronic components on the circuit board. To reduce heat and stray light effects, it is beneficial to drill holes 52 and 53 with at least 1, 5, or 10 mm to space, but preferably not more than 50 or 100 mm. It may also be preferred, the holes 52 and 53 with field lenses to increase the aperture.

6 zeigt eine Multiwellplatte 15 mit den Beobachtungsfeldern16, die in einer Aufnahme des Plattenrahmens 50 über den Bohrungen 52 und 53 ausgerichtet ruht. Der Plattenrahmen 50 befindet sich in einer Aufnahme auf dem in mindestens einer Richtung verfahrbaren untersten Deck 21, über der Ausnehmung 30 in der Weise, dass die Beobachtungsfelder der Multiwellplatte vertikal von unten durch die Bohrungen 52 und 53 sichtbar sind. Des Weiteren befindet sich ein Beobachtungsfenster 31 im ortsfesten Zwischenboden 20, welches die Ausnehmung des beweglichen Decks 21 in ihrer bevorzugten Arbeitsposition überdeckt. In dem Plattenrahmen befinden sich Lichtquellen 51, vorzugsweise LED in einer Leiterplatte. Das von ihnen emittierte Licht gelangt zumindest teilweise durch die Bohrungen 52 zu jeweils den Unterseiten eines Beobachtungsfeldes 16. Der Beleuchtungsstrahlengang verläuft dabei in einem Winkel zum Beobachtungsstrahlengang als Auflichtbeleuchtung, um direkte Reflexionen zu vermeiden. Das aus den Beobachtungsfeldern zurückgestreute oder als Fluoreszenz oder Lumineszenz erzeugte Licht gelangt durch die oberen Bohrungen 52 und unteren Bohrungen 53 in der Leiterplatte durch die Ausnehmung 30 auf das Beobachtungsfenster 31 und von dort weiter auf die nicht eingezeichnete Kameraeinheit. Es können Lichtquellen mit mehreren Farben im Plattenrahmen eingebaut werden, die abwechselnd geschaltet werden können. Die Lichtbelastung kann reduziert werden, indem einzelne Lichtquellen außerhalb von Messzeiten oder an Beobachtungsfeldern, die nicht gebraucht werden, ausgeschaltet werden. 6 shows a multiwell plate 15 with the observation fields16 in a picture of the plate frame 50 over the holes 52 and 53 aligned resting. The plate frame 50 is located in a receptacle on the movable in at least one direction bottom deck 21 , above the recess 30 in the way that the observation fields of the multiwell plate vertically from below through the holes 52 and 53 are visible. Furthermore, there is an observation window 31 in the stationary intermediate floor 20 , which is the recess of the movable deck 21 covered in their preferred working position. In the plate frame are light sources 51 , preferably LED in a printed circuit board. The light emitted by them passes at least partially through the holes 52 to each of the subpages of an observation field 16 , The illumination beam path runs at an angle to the observation beam path as epi-illumination, in order to avoid direct reflections. The light scattered back from the fields of observation or produced as fluorescence or luminescence passes through the upper holes 52 and lower holes 53 in the circuit board through the recess 30 on the observation window 31 and from there on to the not shown camera unit. It can be installed light sources with multiple colors in the plate frame, which can be switched alternately. The light load can be reduced by switching off individual light sources outside of measurement times or on observation fields that are not needed.

7 zeigt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Explosionszeichnung. In der Ebene A befindet sich ein Pipettierkopf 13, der wie durch die Pfeile angegeben horizontal in die Richtung der Papierebene der Zeichnung, und vertikal verfahrbar ist. Dieser Pipettierkopf ist mit bevorzugt 4, 8, 24 oder 96 fest oder wechselbar montierten Pipettenspitzen 14 versehen, insbesondere mit 24 Pipettenspitzen, die wechselbar und in einem 4*6 Raster von 18 mm angeordnet sind. Die Pipettierspitzen können jede für sich schaltbar oder auch alle zusammen Flüssigkeiten abgeben oder aufnehmen. Deck 21 ist wie durch den Pfeil angegeben in Ebene B in einer Richtung senkrecht zum Pipettierkopf horizontal verfahrbar. Auf Deck 21 oder auf einem weiteren, unabhängig verfahrbaren Deck oberhalb von Deck 21 befindet sich eine zweite Ablageposition 23 für eine Multiwellplatte 15. An Ablageposition 22 befindet sich die Ausnehmung 30, welche in der bevorzugten Arbeitsposition des Decks 21 auf das Beobachtungsfenster 31 ausgerichtet ist. Das Beobachtungsfenster 31 besteht aus 6 mm starkem transparentem Material, auf dem sich der Plattenrahmen 50 wie in beschrieben befindet. Eine Multiwellplatte kann an dieser Ablageposition 22 manuell oder von einem Roboter im Plattenrahmen abgelegt oder von dort wiederaufgenommen werden. Der Plattenrahmen verfügt in der Ebene mit den Bohrungen 52 über eine Aufnahme für die Multiwellplatte, sodass ein vertikaler Abstand von einem oder mehreren Zentimetern zwischen LEDs und Leiterplatte einerseits und Multiwellplatte andererseits besteht. Durch die Beleuchtung unter einem Winkel, durch die Blendenwirkung der Bohrungen in der Leiterplatte und durch den Abstand zwischen Multiwellplatte und Leiterplatte wird das Anregungslicht bei Reflexionen an der Unterseite der Beobachtungsfelder nicht in den vertikal verlaufenden Beobachtungsstrahlengang abgelenkt. Es kann vorteilhaft sein, in den Bohrungen der Leiterplatte Feldlinsen vorzusehen. Unterhalb des Decks 21 befindet sich der ortsfeste Zwischenboden 20 mit dem auf die Position von Plattenrahmen 50 ausgerichteten Beobachtungsfenster 31. In Ebene C befindet sich ein weiterer und in beide horizontale Richtungen über die Fläche einer Multiwellplatte verfahrbarer Verfahrtisch, auf dem die Kameraeinheit 24 mit Optik 25 einschließlich eines von einer Software gesteuerten Autofokus und ein Umlenkspiegel 26 oder Prisma befestigt sind. Über den Umlenkspiegel wird der Beobachtungsstrahlengang zur Optik der Kameraeinheit umgelenkt. Dabei haben sich als Bauelemente als vorteilhaft erwiesen wie etwa

• als Optik ein Objektiv Computar Makro 10x von CBC Americas Corp, Cary, USA, mit einer Brennweite von 13 - 130 mm, Vergrößerung 0,084 - 0,84 mm,
• eine SMX M81M Kamera von Sumix, Oceanside, USA mit 0,5 Zoll monochromem CMOS Sensor mit 1,2 Megapixeln Auflösung und 12 Hz Bildfrequenz bei 1280 * 1024 Pixeln und 166 Hz bei 320 * 240 Pixeln Auflösung
• Standard 0603 SMD LEDs von Vishay Intertechnology, Inc. Malvern, USA

Es kann bevorzugt sein, statt eines Plattenrahmens 50 mit Beleuchtung eine Beleuchtungseinheit zu verwenden, die auf demselben Verfahrtisch wie die Kameraeinheit montiert ist. 7 shows a particularly preferred embodiment of the device according to the invention in an exploded view. In the plane A there is a pipetting head 13 as indicated by the arrows horizontally in the direction of the paper plane of the drawing, and vertically movable. This pipetting head is preferably with 4, 8, 24 or 96 fixed or replaceable mounted pipette tips 14 in particular with 24 pipette tips, interchangeable and arranged in a 4 * 6 grid of 18 mm. The pipetting tips can be dispensed individually or even all together liquids or absorb. deck 21 is as shown by the arrow in plane B in a direction perpendicular to the pipetting horizontally movable. On Deck 21 or on another, independently movable deck above deck 21 there is a second storage position 23 for a multiwell plate 15 , At storage position 22 there is the recess 30 which is in the preferred working position of the deck 21 on the observation window 31 is aligned. The observation window 31 consists of 6 mm thick transparent material on which the plate frame 50 as in is described. A multiwell plate can at this storage position 22 manually or by a robot stored in the plate frame or resumed from there. The plate frame has in the plane with the holes 52 via a receptacle for the multiwell plate, so that there is a vertical distance of one or more centimeters between LEDs and printed circuit board on the one hand and multiwell plate on the other. By illuminating at an angle, by the aperture effect of the holes in the circuit board and by the distance between the multiwell plate and circuit board, the excitation light is not deflected in reflections on the bottom of the observation fields in the vertical observation beam path. It may be advantageous to provide field lenses in the holes of the printed circuit board. Below the deck 21 is the stationary intermediate floor 20 with the on the position of plate frame 50 aligned observation window 31 , In level C is another and in both horizontal directions on the surface of a multiwell plate movable traversing table on which the camera unit 24 with optics 25 including software-controlled autofocus and a deflection mirror 26 or prism are attached. About the deflecting mirror of the observation beam path is deflected to the optics of the camera unit. It has proved to be advantageous as components such as

• as an optic a lens Computar macro 10x from CBC Americas Corp, Cary, USA, with a focal length of 13-130 mm, magnification 0.084-0.84 mm,
• A SMX M81M camera from Sumix, Oceanside, USA with 0.5 inch monochrome CMOS sensor with 1.2 megapixel resolution and 12 Hz frame rate at 1280 * 1024 pixels and 166 Hz at 320 * 240 pixel resolution
• Standard 0603 SMD LEDs from Vishay Intertechnology, Inc. Malvern, USA

It may be preferable to use, instead of a plate frame 50 with illumination, a lighting unit mounted on the same traversing table as the camera unit.

8 stellt den Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform einer Beleuchtungseinheit in Aufsicht dar, die sich unterhalb des Beobachtungsfensters auf Ebene C auf einem Verfahrtisch befindet. Bei dieser Beleuchtungseinheit werden zwei oder mehr Lichtquellen parallel verwendet, die in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen emittieren, beispielsweise rot (35), und blau (36). Als Lichtquellen für diese Anordnung sind LED oder Laser, insbesondere Festkörperlaser, Laserdioden oder Faserlaser besonders geeignet. Halbdurchlässige oder wellenlängenabhängig durchlässige Spiegel 33, 34, insbesondere dichroitische Spiegel befinden sich im Strahlengang zwischen Objektiv und Umlenkspiegel 26, oder zwischen Lichtquelle und erstem Spiegel 33, sodass der Beleuchtungsstrahlengang kollinear zur optischen Achse des Objektivs verläuft. 32 ist ein weiterer Umlenkspiegel. Es kann bevorzugt sein, den Strahlengang der Beleuchtung durch weitere optische Elemente, wie etwa zusätzliche Umlenkspiegel zu knicken oder zu modifizieren. Der Beobachtungsstrahlengang erreicht hinter dem dichroitischen Spiegel 34 die Kamera 24 mit Objektiv 25. 8th FIG. 2 shows the structure of a preferred embodiment of a lighting unit in plan view, which is located below the observation window on the level C located on a travel table. In this lighting unit, two or more light sources are used in parallel, which emit in different wavelength ranges, for example red ( 35 ), and blue ( 36 ). As light sources for this arrangement, LED or laser, in particular solid-state lasers, laser diodes or fiber lasers are particularly suitable. Semipermeable or wavelength dependent transmissive mirrors 33 . 34 , in particular dichroic mirrors are located in the beam path between the lens and deflecting mirror 26 , or between the light source and the first mirror 33 such that the illumination beam path is collinear with the optical axis of the objective. 32 is another deflecting mirror. It may be preferable to bend or modify the beam path of the illumination by means of further optical elements, such as additional deflection mirrors. The observation beam path reaches behind the dichroic mirror 34 the camera 24 with lens 25 ,

9: zeigt eine Ausführungsform des Detektionsstrahlengangs, bei der vom Umlenkspiegel 26 kommendes Licht wahlweise durch mono- oder dichroitische Filter 37, 38 auf die Kameraeinheit (Objektiv 25 plus Kamera 24) geleitet wird, die auf dem Verfahrtisch befestigt ist. 9 FIG. 1 shows an embodiment of the detection beam path in which the deflection mirror. FIG 26 coming light optionally by mono- or dichroic filters 37 . 38 on the camera unit (lens 25 plus camera 24 ), which is fastened on the travel table.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 002014019603 [0007]

Claims

Apparatus for automatic fluid manipulation in wells of multiwell plates and observation of observation fields on the underside of fixedly placed multiwell plates, characterized by - an intermediate bottom with at least two storage positions for the storage of multiwell plates; - A first storage position on the intermediate bottom for a first multiwell plate, which is provided with a recess at least as large as the Wells occupied area of a multiwell plate is provided; a second storage position on the intermediate bottom for a second multiwell plate; - A located below the false floor camera unit with at least one electronic image sensor and at least one imaging optics to which the observation fields of a stored in the first position multiwell plate are imaged through the recess, and for which the pixel size of the image sensor is designed so that in the field of observation adjacent , cell-sized objects with preferably 20, 10, 1 or 0.5 .mu.m in diameter can be imaged on different pixels of the image sensor and the multiwell plate can be detected in parallel completely or serially by moving the camera unit with a travel table; by a switchable lighting unit attached to the first storage position below the first multiwell plate, which illuminates at least one well of the multiwell plate picked up by the camera unit through the same observation field from below or obliquely from below in incident light; - By at least one above the false floor and at least over both storage positions away horizontally in one or two directions and vertically movable unit with pipetting with at least one pipette tip, preferably 4, 8, 16 in a row or 6, 24, 96, or 384 in one 2 * 3, 4 * 6, 8 * 12 or 16 * 24 field mounted pipette tips that can be fixed or removable mounted.

Device after Claim 1 characterized by additionally at least one horizontally movable deck between the intermediate bottom and unit with pipetting head, wherein - the first storage position is located on the bottom deck having at this point a second recess which is at least as large as the Wells occupied area of a multiwell plate; - The first recess in the intermediate bottom is at least as large as the second recess; - The bottom deck has a working position in which it remains stationary during liquid manipulation or during imaging or inspection, and in which both recesses are located one above the other; - A multiwell plate located on the first storage position is imaged through both recesses on the camera unit.

Device after Claim 1 or 2 , characterized in that at least one of the recesses is designed as an observation window, which consists of transparent material, in particular glass, quartz, sapphire, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polystyrene, or cycloolefin copolymers, preferably a thickness of more than 1 mm and in particular more than 5 mm, and can be designed as a field lens.

Device according to at least one of the preceding claims, characterized by a plate frame for receiving multiwell plates at the first storage position - each having recesses or bores on its underside and upper side, which are both below the observation fields when the multiwell plate is placed on and at least 1, preferably at least 5 and more preferably at least 10 mm apart; - Has light sources, in particular laser diodes or LED at the upper edge of the lower recesses or holes, each illuminate an observation field at an angle to the vertical from below or obliquely downwards; - Preferably contains a circuit board on which the light sources are mounted and having the lower holes or recesses. - Electrical storage, in particular batteries or rechargeable batteries for the power supply of the light sources, or has terminals which are connected via electrical connections, in particular connectors to a power source

Device according to at least one of the preceding claims, characterized in that the camera unit is located on a horizontally movable plate, which is at least so far moved in one direction, that when moving the camera unit, the image field of the at least one image sensor fully covers the smaller of the recesses, or that the camera unit has a plurality of image sensors or cameras arranged side by side or one above the other so that the entire surface covered by the wells of the multiwell plate is imaged onto the at least one image sensor with cellular resolution, in particular with 20, preferably 10 or 1 or 0.5 μm resolution becomes.

Device according to at least one of the preceding claims, characterized in that there is a deflecting mirror under the intermediate floor under the recess or observation window, which is from the underside of the multiwell plate through the at least one recess or the at least one observation window 90 ° horizontally deflects emitted and downwardly propagating light onto a horizontally aligned, permanently mounted or horizontally movable camera unit.

Device according to at least one of Claims 1 . 2 . 3 . 5 , or 6, characterized in that a lighting unit is on the same traversing table as the camera unit, and that the at least one light source of the lighting unit, preferably laser diode or LED, coupled with mirrors and dichroic beam splitters in the observation beam path of the camera unit.

Device according to at least one of the preceding claims, characterized in that the sample in the at least one well collinearly illuminated with the image, or illuminated at an angle between 0 ° and phi, where phi is the smallest critical angle to the total reflection of the transparent materials, between Sample and observation window are located.

Device according to at least one of the preceding claims, wherein the device has a temperature control at least for the first sample carrier, or further connections, with which the wells of the sample carrier can be gassed with CO2.

Device according to at least one of the preceding claims, wherein the multiwell plate is a microtiter plate with 6, 24, 96 or 384 wells, in particular with a grid of 36, 18, 9 or 4.5 mm and a measure of at least 72 * 108 mm

Device according to at least one of the preceding claims, wherein the functions of the method of pipetting head, the pressurization of the pipette tips, the illumination and the camera control, the image acquisition are controlled by software, and in a preferred embodiment, the images and the communication to other instruments takes over, in particular to robots for the handling of the plates and incubators for cell culture in multiwell plates, and in particular results of image analysis as input variables used for the control of the functions of the device.

Application of the device for the control of process errors, in particular the presence of air bubbles in the field of observation, handling or expansion of stem cells, in particular inducible pluripotent stem cells in multiwell plates, or tissue-like cell structures, especially spheroids, organoids and 3D cell cultures of primary cells, inducible pluripotent stem cells or cell cultures, in particular for the introduction of cell suspensions, or tests of drugs with these cells to test the efficacy or toxicity of the drugs on these cells by evaluating the image.