DE102016208110A1

DE102016208110A1 - Verfahren und Trägermaterial zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen zur Gewinnung und Rückgewinnung von Wertmetallen

Info

Publication number: DE102016208110A1
Application number: DE102016208110.1A
Authority: DE
Inventors: Sabine Matys; Katrin Pollmann; Johannes Raff; Falk Lehmann
Original assignee: Helmholtz Zentrum Dresden Rossendorf eV
Current assignee: Helmholtz Zentrum Dresden Rossendorf eV
Priority date: 2016-05-11
Filing date: 2016-05-11
Publication date: 2017-11-16
Anticipated expiration: 2036-05-12
Also published as: DE102016208110B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen basierend auf der Phagen-Display-Methode mittels eines planaren Trägermaterials mit immobilisierten Metallionen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein planares Trägermaterial mit immobilisierten Metallionen, metallionenbindende Peptide erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Verwendung der metallionenbindenden Moleküle zur Gewinnung oder Rückgewinnung von Wertmetallen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen basierend auf der Phagen-Display-Methode mittels eines planaren Trägermaterials mit immobilisierten Metallionen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein planares Trägermaterial mit immobilisierten Metallionen, metallionenbindende Peptide erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Verwendung der metallionenbindenden Moleküle zur Gewinnung oder Rückgewinnung von Wertmetallen.
Stand der Technik
Aufgrund der vorhandenen Probleme bei der Wertmetallgewinnung (Verfügbarkeit, Abbaubarkeit) bestehen große Bestrebungen neue Methoden für die Erkundung, die Gewinnung, die Aufbereitung, die Veredlung und das Recycling von Wertmetallen zu entwickeln. Eine Möglichkeit des Recyclings besteht darin, vorhandene Wertmetalle selektiv aus industriellen Prozesswässern, Laugungslösungen aus metallurgischen Prozessen oder Bergbauwässern zu entfernen und einer wirtschaftlichen Verwertung zugänglich zu machen.
Herkömmliche Verfahren zur Entfernung von Metallen aus Lösungen weisen allerdings eine Reihe von Nachteilen auf. Die Verfahren sind meist nicht sehr selektiv, Metallionen können nicht vollständig entfernt werden und die verwendeten Materialien sind schwer abbaubar (z. B. Ionenaustauscherharze) oder erfordern toxische Chemikalien (z. B. organische Lösungsmittel).
Eine mögliche Alternative bietet die Bereitstellung metallionenbindender Moleküle mittels des Phagen-Display-Verfahrens.
Das Phagen-Display-Verfahren geht auf Arbeiten von Smith (1985) zurück. Unter Phagen-Display oder Biopanning wird ein biotechnologisches Verfahren verstanden, bei dem aus großen, rekombinanten Bibliotheken Peptide, Proteinteile oder komplette Proteine funktionell auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden, um geeignete Liganden für bestimmte Zielmoleküle zu isolieren und zu identifizieren. Ausgehend von den sogenannten Phagenbibliotheken, welche zum Teil kommerziell erhältlich sind und deren Anzahl der Phagenvarianten sich über mehrere Größenordnungen erstreckt (typischerweise in der Größenordnung 10⁹) werden in einem mehrstufigen Verfahren die Phagen selektiert, welche eine gute Bindung zum Zielmolekül aufweisen.
Anfänglich wurde das Phagen-Display-Verfahren besonders zur Identifizierung von Antikörpern bzw. Antikörperteilen verwendet. Neuere Forschungsarbeiten beschreiben das Phagen-Display-Verfahren für die Identifizierung von Peptiden, welche anorganische Materialien binden, zur Herstellung von Biosensoren (Souza et al. 2006) oder zur Verwendung in der Materialsynthese, z. B. als Keimbildner oder zur Partikelgrößenbegrenzung in der Nanopartikelsynthese (Ploss et al. 2014 und US2005/0064508 ).
Die Identifizierung von metallionenbindenden Peptiden wurde unter anderem durch Nian et al. (2010) anhand von Pb²⁺-Ionen und Day et al. (2013) anhand von Ni²⁺-Ionen beschrieben. Die Methode von Nian et al. wird als generelle Methode zur Selektion schwermetallionenbindender Peptide diskutiert und der Einsatz der selektierten Phagen für die Entfernung von toxischen Schwermetallen offenbart.
Bei der Selektion von metallionenbindenden Peptiden oder Proteinen besteht eine große Herausforderung in der Auswahl geeigneter Trägermaterialien für die ionischen Spezies. Ähnlich der Metallionenaffinitätschromatographie werden traditionell poröse Materialien, unter anderem funktionalisierte Agarose oder Siliziumdioxid, genutzt (Magdeldin and Moser 2012). Auch nicht-poröse Materialien, wie Beads, werden verwendet, welche eine schnellere Trennung zu Gunsten der geringen Oberflächengröße ermöglichen.
Bei der Auswahl geeigneter Trägermaterialien besitzen neben der Poren- und Partikelgröße auch die mechanische Stabilität, die chemische Inertheit, sowie die chemische Stabilität eine große Bedeutung. Die chemische Inertheit zeigt sich in einer geringen unspezifischen Bindung und somit einer spezifischen Bindung ausschließlich mit den Affinitätsliganden. Die chemische Stabilität betrifft die Abbaubarkeit durch Enzyme und Mikroben, die Stabilität gegen Regenerations- oder Spüllösungen, insbesondere auch der Metallionen-Trägermaterial-Bindung. Die Metallionenbindung an das Trägermaterial Agarose wird häufig mit einer geringen chemischen Stabilität offenbart, wodurch ein Metallionenverlust auftritt (Magdeldin and Moser 2012).
Aufgabe der Erfindung
Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen mittels der Phagen-Display-Methode anzugeben, bei dem der Selektionsdruck der Bakteriophagen erhöht wird, um die Moleküle mit der besten Metallionenbindung zu isolieren.
Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, selektiv Metallionen aus Lösungen zu isolieren.
Wesen der Erfindung
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren mittels eines planaren Trägermaterials mit einer geringen Menge immobilisierter Metallionen.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch die metallionenbindenden Peptide erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren und deren Verwendung zur Gewinnung und Rückgewinnung von Wertmetallen.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen umfassend die Schritte:

a) Immobilisieren von Metallionen an einem Trägermaterial zur Generierung eines Zielmaterials,
b) Kontaktieren des Zielmaterials mit einer Molekülbibliothek,
c) Entfernung nicht bindender Moleküle,
d) Elution bindender Moleküle vom Zielmaterial,
e) Vervielfältigung der bindenden Moleküle,

Metallionenbindende Moleküle im Sinne der Erfindung sind Moleküle, welche anziehende Wechselwirkungen (elektrostatische Wechselwirkungen, van-der-Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen) mit Metallionen eingehen. Metallionen sind positiv geladene Ionen von Metallen.
Erfindungsgemäß wird unter Immobilisieren die Bindung durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen (z.B. elektrostatische oder van-der-Waals-Wechselwirkungen) verstanden.
Das Zielmaterial im Sinne der Erfindung ist ein Trägermaterial mit immobilisierten Metallionen.
Planar bezeichnet im Sinne der Erfindung die räumliche Anordnung des Trägermaterials in einer Ebene.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Trägermaterial für die Metallionen eine planare, silikatische Sol-Gel-Keramik mit 0,1% bis 20% Anteil anionischer Polymere, bevorzugt mit 5% bis 15% Anteil anionischer Polymere, ganz besonders bevorzugt mit 15% Anteil anionischer Polymere.
% Anteil bezeichnet im Sinne der Erfindung Gewicht-% bezogen auf den Feststoffgehalt des Sols.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden anionische Polymere eingesetzt, da diese die Metallionen binden können und somit die Generierung des Zielmaterials ermöglichen. Weiterhin vorteilhaft stabilisieren die Polymere die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik, verhindern deren Schrumpfen und erhöhen deren Flexibilität.
In einer Ausgestaltung der Ausführungsform sind die anionischen Polymere ausgewählt aus Dispex N40, Polyacrylsäure oder Polystyrensulfonsäure.
In einer weiteren Ausführungsform ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf technischen Textilien aufgebracht. Erfindungsgemäß sind technische Textilien textile Materialien, d.h. textile Rohstoffe (Naturfasern, Chemiefasern) und nichttextile Rohstoffe, die durch verschiedene Verfahren zu linien-, flächenförmigen und räumlichen Gebilden verarbeitet wurden, und daraus gefertigte Fertigerzeugnisse, die technische oder funktionelle Eigenschaften, z. B. Festigkeit, Chemikalienbeständigkeit oder Leitfähigkeit, aufweisen. Bevorzugt ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf Glasfasergewebe aufgebracht.
In einer weiteren Ausführungsform ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf planaren Materialien aufgebracht. Bevorzugt ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf Glas aufgebracht.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Metallionen mit einer Metallsalzlösung der Metallionen an das Trägermaterial immobilisiert.
Metallionen im erfindungsgemäßen Verfahren können ausgewählt sein aus Co-, Ni-, Re-, Ga-, Mn-, V-, Sc-, Y-, In- oder Edelmetall-Ionen. Erfindungsgemäß sind Edelmetalle Metalle, die besonders korrosionsbeständig sind, z. B. Au, Ag, Pd oder Pt. Bevorzugt sind Metallionen im erfindungsgemäßen Verfahren Co-, Ni-, Re-, Ga- oder Edelmetall-Ionen, ganz besonders bevorzugt Co- oder Ni-Ionen.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung von Metallionen an das Trägermaterial mit der Metallsalzlösung der Metallionen in einer Konzentration von 1 bis 500 mmol/l.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung von Metallionen an das Trägermaterial mit der Metallsalzlösung der Metallionen für 10 bis 60 min.
In einer weiteren Ausführungsform werden ungebundene Metallionen mit Wasser oder einem Puffer entfernt.
Puffer im Sinne der Erfindung ist eine wässrige Pufferlösung bzw. eine Lösung aus einer schwachen Säure (z. B. Essigsäure) mit einem praktisch völlig dissoziierten Neutralsalz derselben Säure (z. B. Natriumacetat). Bei der Zugabe einer Säure oder Base ändert sich deren pH-Wert kaum (Pufferung).
In einer weiteren Ausführungsform ist die Molekülbibliothek eine Phagenbibliothek.
Erfindungsgemäß wird unter einer Phagenbibliothek eine rekombinante Bibliothek von Bakteriophagen, bei der Peptide, Proteinteile oder komplette Proteine funktionell auf der Oberfläche der Bakteriophagen präsentiert werden, verstanden. Zur Herstellung der Phagenbibliotheken erfolgt der Einbau der codierenden DNA in Phagemids und deren Expression in den Bakteriophagen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Phagenbibliothek ausgewählt aus PhD^TM 7, PhD^TM C7C, PhD^TM 12 von New England Biolabs GmbH (NEB) oder den pVIII-Bibliotheken F88-Cys1 bis 6 von Creative Biolabs.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Molekülbibliothek vor den Schritten a) bis e) mit dem Trägermaterial kontaktiert (Negativselektion). Durch die Kontaktierung der kompletten Phagenbibliothek mit dem Trägermaterial in Abwesenheit der Metallionen werden unspezifisch an das Trägermaterial bindende Phagen von den nicht bindenden Phagen getrennt. Die nicht bindenden Phagen werden im Folgenden mit dem Zielmaterial, d.h. dem Trägermaterial mit Metallionen, in der Positivselektion (Schritt b)) kontaktiert.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Entfernung nicht bindender Moleküle im erfindungsgemäßen Verfahren durch Puffer. Weiterhin bevorzugt erfolgt die Entfernung nicht bindender Moleküle im erfindungsgemäßen Verfahren durch zehnfaches Spülen mit Puffer.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Elution bindender Moleküle durch die Erhöhung der Ionenstärke, Verringerung des pH-Werts, Erhöhung der Konzentration an Detergenz oder Inkubation mit einer E. coli-Kultur.
In einer weiteren Ausführungsform werden bei der Elution bindender Moleküle schwach bindende Moleküle zuerst eluiert und stark bindende Moleküle zum Schluss.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Elution bindender Moleküle im erfindungsgemäßen Verfahren durch die stufenweise Erhöhung der Ionenstärke (0,5; 1; 2 M), gefolgt von der Elution mit 1 N Chlorwasserstoffsäure oder 0,2 M Glycinpuffer (pH 2,2).
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Elution bindender Moleküle im erfindungsgemäßen Verfahren durch die Inkubation mit einer E. coli-Kultur. Vorteilhaft werden durch die Inkubation mit der E. coli-Kultur besonders stark bindende Moleküle von dem Zielmaterial gelöst.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Vervielfältigung der bindenden Moleküle durch die Inkubation der Bakteriophagen mit einer E. coli-Kultur.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Vervielfältigung der codierenden DNA-Abschnitte für die metallionenbindenden Moleküle durch Polymerase-Kettenreaktion.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) bis e) zumindest zweimal wiederholt werden, bevorzugt zweimal bis fünfmal wiederholt werden, besonders bevorzugt zweimal wiederholt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA-Sequenz des metallionenbindenden Moleküls in einen Expressionsvektor ligiert und als ein Fusionsprotein exprimiert.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor pMAL oder pKLCF-c von NEB.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein ein Maltosebindeprotein, eine Cellulosebindedomäne oder eine Chitinbindedomäne.
In einer weiteren Ausführungsform wird das metallionenbindende Molekül auf Amylose-basierten Materialien, Cellulose-basierten Materialien oder Chitin-basierten Materialien immobilisiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird das metallionenbindende Molekül in Sol-Gel-Keramiken, Alginat, Chitosan oder Hydrogele eingebettet.
In einer weiteren Ausführungsform wird das metallionenbindende Molekül durch kovalente Bindung an Silikate, Cellulose oder Polymere immobilisiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Trägermaterial zur Verwendung in einem Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen, wobei das Trägermaterial eine planare, silikatische Sol-Gel-Keramik mit 0,1% bis 20% Anteil anionischer Polymere, bevorzugt mit 5% bis 15% Anteil anionischer Polymere, ganz besonders bevorzugt mit 15% Anteil anionischer Polymere und Metallionen umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform sind im erfindungsgemäßen Trägermaterial anionische Polymere ausgewählt aus Dispex N40, Polyacrylsäure oder Polystyrensulfonsäure.
In einer weiteren Ausführungsform ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf technischen Textilien aufgebracht. Bevorzugt ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf Glasfasergewebe aufgebracht.
In einer weiteren Ausführungsform ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf planaren Materialien aufgebracht. Bevorzugt ist die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik auf Glas aufgebracht.
Metallionen im erfindungsgemäßen Trägermaterial können ausgewählt sein aus Co-, Ni-, Re-, Ga-, Mn-, V-, Sc-, Y-, In- oder Edelmetall-Ionen. Erfindungsgemäß sind Edelmetalle Metalle, die besonders korrosionsbeständig sind, z. B. Au, Ag, Pd oder Pt. Bevorzugt sind Metallionen im erfindungsgemäßen Trägermaterial Co-, Ni-, Re-, Ga- oder Edelmetall-Ionen, ganz besonders bevorzugt Co- oder Ni-Ionen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Trägermaterials in einem Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein metallionenbindendes Peptid, das eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 47 enthält.
In einer weiteren Ausführungsform ist das metallionenbindende Peptid selektiv und besitzt eine hohe Affinität für das entsprechende Metallion.
Vorteilhaft ist das metallionenbindende Peptid biologisch abbaubar und kann umweltfreundlich hergestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist das metallionenbindende Peptid regenerierbar. Regenerierbar bedeutet im Sinne der Erfindung die vollständige Entfernung der Metallionen von dem Peptid.
In einer weiteren Ausführungsform bindet das erfindungsgemäße Peptid, das eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 28 enthält, Co-Ionen.
In einer weiteren Ausführungsform bindet das erfindungsgemäße Peptid, das eine der Sequenzen SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 26 oder SEQ ID NO. 29 bis SEQ ID NO. 47 enthält, Ni-Ionen.
In einer weiteren Ausführungsform bindet das erfindungsgemäße Peptid, das eine der Sequenzen SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 22 oder SEQ ID NO. 26 enthält, Co- und Ni-Ionen.
In einer weiteren Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße metallionenbindende Peptid, das eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 47 enthält, eine Länge von 7 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 7 bis 30 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt 7 bis 14 Aminosäuren.
In einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Peptid dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Peptids eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 47 ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des metallionenbindenden Moleküls bereitgestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung oder Rückgewinnung von Wertmetallen.
Vorteilhaft können mittels der metallionenbindenden Moleküle bereitgestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren selektiv Wertmetalle aus komplexen Lösungen gewonnen oder rückgewonnen werden.
Weiterhin vorteilhaft können mittels der metallionenbindenden Moleküle bereitgestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Wertmetalle aus verdünnten Lösungen gewonnen oder rückgewonnen werden.
Bevorzugt wird das metallionenbindende Molekül bereitgestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung oder Rückgewinnung von Co- oder Ni-Ionen verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das metallbindende Molekül bereitgestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Rückgewinnung der Wertmetalle aus industriellen Prozesswässern, Laugungslösungen aus metallurgischen Prozessen oder Bergbauwässer verwendet.
Vorteilhaft können die metallionenbindenden Moleküle bereitgestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren der Verwendung unter unterschiedlichen Prozessbedingungen entsprechend den Selektionsbedingungen angepasst werden.
Zur Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.
Ausführungsbeispiele
Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschreiben ohne diese zu beschränken.
Herstellen der planaren, silikatischen Sol-Gel-Keramik:
In einem ersten Ausführungsbeispiel wurde die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik mit 15% Anteil des anionischen Polymers Dispex N40 hergestellt. Dazu wurden 0,47 g Dispex N40 (45% Feststoffgehalt) in 5 ml autoklaviertes Wasser gegeben und mit 20 ml Sol 362A (1,4 g bzw. 7% Feststoffgehalt) von der Gesellschaft zur Förderung von Medizin-, Bio- und Umwelttechnologien e. V. (GMBU) gemischt. Danach wurden jeweils 5 Glasfasergewebestücke mit der Sol-Lösung unter sterilen Bedingungen beschichtet und getrocknet. Die Sol-Gel-Keramik wurde nach dem Trocknen in Petrischalen überführt.
In einer alternativen Ausgestaltung des vorbeschriebenen Ausführungsbeispiels erfolgte die Herstellung der planaren, silikatischen Sol-Gel-Keramik mit 15% Anteil des anionischen Polymers Polyacrylsäure. Dazu wurden 0,21 g Polyacrylsäure in 5 ml autoklaviertes Wasser geben und mit 20 ml Sol 362A (1,4 g bzw. 7% Feststoffgehalt) von GMBU gemischt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurde die planare, silikatische Sol-Gel-Keramik mit 15% Anteil des anionischen Polymers Polystyrensulfonsäure hergestellt. Dazu wurden 0,21 g Polystyrensulfonsäure in 5 ml autoklaviertes Wasser geben und mit 20 ml Sol 362A (1,4 g bzw. 7% Feststoffgehalt) von GMBU gemischt. Danach wurden jeweils 5 Glasfasergewebestücke mit der Sol-Lösung unter sterilen Bedingungen beschichtet und getrocknet. Die Sol-Gel-Keramik wurde nach dem Trocknen in Petrischalen überführt.
Immobilisieren von Metallionen an einem Trägermaterial zur Generierung eines Zielmaterials:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurden zur Herstellung einer 50 mM-Co-Ionenlösung 2,97 g CoCl₂ × 6H₂O von Sigma-Aldrich in 250 ml Citratpuffer gelöst. Danach wurde die Co-Ionenlösung durch Bottle-Top-Filter steril filtriert und autoklaviert. Anschließend wurde die Sol-Gel-Keramik mit 2 ml der 50 mM-Co-Ionenlösung bedeckt und für 1 h bei 37 °C mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die überschüssige Co-Ionenlösung wurde entfernt und die Sol-Gel-Keramik zehnmal mit Wasser und anschließend dreimal mit jeweils 2 ml Citratpuffer (pH 5,4) gewaschen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurden zur Herstellung einer 50 mM-Ni-Ionenlösung 2,97 g NiCl₂ × 6H₂O von Sigma-Aldrich in 250 ml Citratpuffer gelöst. Danach wurde die Ni-Ionenlösung durch Bottle-Top-Filter steril filtriert und autoklaviert. Anschließend wurde die Sol-Gel-Keramik mit 2 ml der 50 mM-Ni-Ionenlösung bedeckt und für 1 h bei 37 °C mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die überschüssige Ni-Ionenlösung wurde entfernt und die Sol-Gel-Keramik zehnmal mit Wasser und anschließend dreimal mit jeweils 2 ml Citratpuffer (pH 5,4) gewaschen.
Kontaktieren des Zielmaterials mit einer Molekülbibliothek:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurde die C7C-Phagenbibliothek von New England Biolabs GmbH (NEB) in 2 ml Citratpuffer auf die Sol-Gel-Keramik mit Co- oder Ni-Ionen gegeben und für 1 h bei 37 °C mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert.
Entfernung nicht bindender Moleküle:
Die Bakteriophagenlösung wurde entfernt und die Sol-Gel-Keramik zehnmal mit Citratpuffer (pH 5,4) gewaschen.
Elution bindender Moleküle vom Zielmaterial:
Die Sol-Gel-Keramik mit gebundenen Bakteriophagen wurde schrittweise mit jeweils 2 ml 0,5 M; 1 M und 2 M NaCl-Lösung für 10 min bei 37 °C mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert und die Lösung abgenommen. Danach wurde die Sol-Gel-Keramik dreimal mit Citratpuffer (pH 5,4) gewaschen. Anschließend wurde die Sol-Gel-Keramik mit 2 ml einer E. coli-Kultur mit einer Optischen Dichte (OD) von 0,5 für 10 min bei 37 °C mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert und die Lösung abgenommen.
Vervielfältigung der bindenden Moleküle:
Die abgenommenen Bakteriophagenlösungen wurden mit jeweils 30 ml einer E. coli-Kultur mit einer OD von 0,01 bis 0,05 in Lysogeny Broth(LB)-Medium in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben bei 37 °C für 4,5 h mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator amplifiziert.
Die E. coli-Kultur, welche mit der Sol-Gel-Keramik mit gebundenen Bakteriophagen inkubiert wurde, wurde in einen 100 ml-Erlenmeyerkolben mit 30 ml LB-Medium überführt und die Bakteriophagen bei 37 °C für 4,5 h mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator amplifiziert.
Die amplifizierten Bakteriophagen wurden mit 5 ml 20% Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000)-Lösung mit 2,5 M NaCl bei 4 °C für 12 h inkubiert und anschließend für 10 min bei 8500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Bakteriophagen in 1 ml Tris-buffered saline-(TBS)-Puffer (50 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) resuspendiert. Danach erfolgte eine weitere Zentrifugation für 10 min bei 8500 rpm zur Abtrennung von Zellresten. Der Überstand mit den Bakteriophagen wurde mit 1/6 des Volumens 20% PEG 8000-Lösung mit 2,5 M NaCl bei 4 °C für 1 h inkubiert und anschließend für 10 min bei 8500 rpm zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in 200 µl TBS-Puffer resuspendiert und für 10 min bei 8500 rpm zentrifugiert.
Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfahrens:
Die erhaltenen Bakteriophagen wurden anschließend ein zweites und drittes Mal dem gesamten erfindungsgemäßen Verfahren analog dem Ausführungsbeispiel unterzogen. Bei der dritten Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte die Elution bindender Moleküle vom Zielmaterial mit Citratpuffer (pH 3,4) und danach mit einer E. coli-Kultur mit einer Optischen Dichte (OD) von 0,5.
Anschließend erfolgte eine Vereinzelung der erhaltenen Bakteriophagen durch Verdünnung und Ausplattieren mit E. coli-Zellen auf LB-Agarplatten mit 50µg/ml Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und 40 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (Xgal). Die Kolonien wurden jeweils in 50 µl TBS-Puffer bei 4 °C für 12 h inkubiert und in 30 ml E. coli-Kultur mit einer OD von 0,01 bis 0,05 bei 37 °C für 4,5 h mit 100 rpm in einem Schüttelinkubator amplifiziert.
Zitierte Nichtpatentliteratur

G. P. Smith, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228, 1315–17.
G. R. Souza, D. R. Christianson, F. L. Staquicini, M. G. Ozawa, E. Y. Snyder, R. L. Sidman, J. H. Miller, W. Arap, R. Pasqualini, Networks of gold nanoparticles and bacteriophage as biological sensors and cell-targeting agents. 2006, 103, 1215–20.
M. Ploss, S. J. Facey, C. Bruhn, L. Zemel, K. Hofmann, R. W. Stark, B. Albert, B. Hauer, Selection of peptides binding to metallic borides by screening M13 phage display libraries. BMC Biotechnology 2014, 14, 12.
R. Nian, D. S. Kim, T. Nguyen, L. Tan, C.-W. Kim, I.-K. Yoo, W.-S. Choe, Chromatographic biopanning for the selection of peptides with high specificity to Pb2+ from phage displayed peptide library. Journal of Chromatography A 2010, 1217, 5940–9.
J. W. Day, C. H. Kim, V. V. Smider, P. G. Schultz, Identification of metal ion binding peptides containing unnatural amino acids by phage display. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, 23, 2598–600.
S. Magdeldin, A. Moser, Affinity Chromatography: Principles and Applications. Affinity Chromatography 2012, ISBN: 978-953-51-0325-7, InTech.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2005/0064508 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Smith (1985) [0005]
Souza et al. 2006 [0006]
Ploss et al. 2014 [0006]
Nian et al. (2010) [0007]
Day et al. (2013) [0007]
Magdeldin and Moser 2012 [0008]
Magdeldin and Moser 2012 [0009]

Claims

Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen umfassend die Schritte: a) Immobilisieren von Metallionen an einem Trägermaterial zur Generierung eines Zielmaterials, b) Kontaktieren des Zielmaterials mit einer Molekülbibliothek, c) Entfernung nicht bindender Moleküle, d) Elution bindender Moleküle vom Zielmaterial, e) Vervielfältigung der bindenden Moleküle, wobei das Trägermaterial eine silikatische Sol-Gel-Keramik ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial für die Metallionen eine silikatische Sol-Gel-Keramik mit 0,1% bis 20% Anteil anionischer Polymere ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das anionische Polymer ausgewählt ist aus Dispex N40, Polyacrylsäure oder Polystyrensulfonsäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung der Metallionen an dem Trägermaterial mit einer Metallsalzlösung der Metallionen in einer Konzentration von 1 bis 500 mmol/l erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülbibliothek eine Phagenbibliothek ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülbibliothek vor den Schritten a) bis e) mit dem Trägermaterial kontaktiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution bindender Moleküle durch Erhöhung der Ionenstärke, Verringerung des pH-Werts, Erhöhung der Konzentration an Detergenz oder Inkubation mit einer E. coli-Kultur erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution bindender Moleküle durch die Inkubation mit einer E. coli-Kultur erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) bis e) zumindest zweimal wiederholt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz des metallionenbindenden Moleküls in einen Expressionsvektor ligiert und als ein Fusionsprotein exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein ein Maltosebindeprotein, eine Cellulosebindedomäne oder eine Chitinbindedomäne umfasst und auf Amylose-basierten Materialien, Cellulose-basierten Materialien oder Chitin-basierten Materialien immobilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das metallbindende Molekül in Sol-Gel-Keramiken, Alginat, Chitosan oder Hydrogele eingebettet wird.
Trägermaterial zur Verwendung in einem Verfahren zur Bereitstellung von metallionenbindenden Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Trägermaterial eine planare, silikatische Sol-Gel-Keramik mit 0,1% bis 20% Anteil anionischer Polymere und Metallionen umfasst.
Metallionenbindendes Peptid, das eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 47 enthält.
Verwendung des metallionenbindenden Moleküls bereitgestellt mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Gewinnung oder Rückgewinnung von Wertmetallen, insbesondere Co- oder Ni-Ionen.