DE102016013095A1 - Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow - Google Patents

Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow Download PDF

Info

Publication number
DE102016013095A1
DE102016013095A1 DE102016013095.4A DE102016013095A DE102016013095A1 DE 102016013095 A1 DE102016013095 A1 DE 102016013095A1 DE 102016013095 A DE102016013095 A DE 102016013095A DE 102016013095 A1 DE102016013095 A1 DE 102016013095A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
flow
rolling
erythrocytes
ovals
oriented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102016013095.4A
Other languages
German (de)
Inventor
wird später genannt werden Erfinder
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE102016013095.4A priority Critical patent/DE102016013095A1/en
Publication of DE102016013095A1 publication Critical patent/DE102016013095A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502776—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for focusing or laminating flows
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0636—Focussing flows, e.g. to laminate flows

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Verfahren und Vorrichtung zur mikroskopischen Diagnose suspendierter roter Blutkörperchen (Erythrozyten) in laminarer Strömung durch eine Durchflussküvette mit rechteckigem Strömungsquerschnitt und mindestens einer transparenten Wand für die Mikroskopie, mit den zusätzlichen Eigenschaften, dass- der rollende Bewegungsmodus („rolling mode“) gesunder Erythrozyten (Diskozyten) in zwei Schichten des Strömungskanals mit maximaler Häufung auftritt,- dass die Silhouetten der rollenden Diskozyten durch die transparente Küvettenwand hindurch als Ovale erscheinen, die längs der Strömungsrichtung orientiert sind, und dass- die orientierten Ovale sichtbar und gemacht werden durch ein vertikal zur transparenten Küvettenwand gerichtetes In-situ-Mikroskop, dessen Fokusbereich mit einer der Suspensionschichten überlappt, in welcher rollende Diskozyten auftreten.Method and apparatus for the microscopic diagnosis of suspended red blood cells (erythrocytes) in laminar flow through a flow cell having a rectangular flow cross-section and at least one transparent wall for microscopy, with the additional properties that the rolling mode of healthy erythrocytes (discyocytes ) occurs in two layers of the flow channel with maximum accumulation, - that the silhouettes of the rolling discyocytes through the transparent cuvette wall appear as ovals, which are oriented along the flow direction, and that the oriented ovals are visible and made by a vertical to the transparent cuvette wall directed in situ microscope whose focal region overlaps with one of the suspension layers in which rolling discozytes occur.

Description

Kontext der Erfindung:Context of the invention:

Der aerobe Stoffwechsel des Menschen hängt maßgeblich von der Qualität der Erythrozyten im Blutkreislauf (und gegebenfalls in Blutkonserven) ab. Insbesondere die extreme Flexibilität der Erythrozyten ermöglicht ihnen einen Zugang zu feinsten Gefäßverästelungen, auch solchen mit sehr geringem Durchmesser (< 1 µm, Kapillaren), um dort die Versorgung des Körpergewebes mit Sauerstoff sicherzustellen. Wenn die Qualität und dabei insbesondere die Flexibilität der roten Blutkörperchen vermindert ist, so verschlechtert sich die Sauerstoffversorgung des Gewebes. Daher ist es wichtig, rote Blutkörperchen in entnommenen Blutproben oder in Blutkonserven schnell und unkompliziert hinsichtlich ihrer Qualität beurteilen zu können. Außer aufwändigen biochemischen Tests (ATP-Konzentration, Hämolyse, etc) bieten sich hierzu optisch mikroskopische Diagnosen an. Bestimmte morphologische Veränderungen am Zellkörper sind charakteristisch für Erythrozyten mit verminderter Funktionsfähigkeit. Als Probentechnik für eine mikroskopische morphologische Diagnose an mikroskopierten Blutzellen ist es üblich, einen „Blutausstrich“ anzufertigen, also ein Präparat mit fixierten Blutzellen auf einem Objektträger. Auch Präparate mit beweglichen und durchlaufenden Monolagen von Blutzellen wurden schon mikroskopisch analysiert, allerdings bisher nur in wissenschaftlichen Untersuchungen, nicht in der medizinischen Diagnostik. Hierbei ist die im Vergleich zu statischen Blutausstrichen stark erhöhte Anzahl vermessener Erythrozyten eine verbesserte statistische Basis für empfindliche Messungen morphologischer Veränderungen im Zellensemble (z.B. Piety NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109(3): 221-230 ). Zur automatischen Klassifizierung der Zellen in bestimmte morphologische Klassen wird automatische Bildverarbeitung mit spezialisierten Algorithmen angewendet (siehe Albertini MC, et al, Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, Cytometry. 2013; 52A: 12-18 .).The aerobic metabolism of humans depends significantly on the quality of the erythrocytes in the bloodstream (and possibly in blood). In particular, the extreme flexibility of the erythrocytes allows them access to the finest vascular ramifications, even those with very small diameter (<1 micron, capillaries), to ensure there the supply of body tissue with oxygen. When the quality, and in particular the flexibility, of the red blood cells is reduced, the oxygen supply of the tissue deteriorates. Therefore, it is important to be able to quickly and easily assess the quality of red blood cells in blood samples taken or stored in blood. In addition to complex biochemical tests (ATP concentration, hemolysis, etc.), optically microscopic diagnoses are available. Certain morphological changes on the cell body are characteristic of erythrocytes with reduced functionality. As a sampling technique for a microscopic morphological diagnosis of microscopic blood cells, it is common practice to make a "blood smear", ie a specimen containing fixed blood cells on a microscope slide. Even preparations with mobile and continuous monolayers of blood cells have already been analyzed microscopically, but so far only in scientific studies, not in medical diagnostics. Here, the greatly increased number of measured erythrocytes compared to static blood smears is an improved statistical basis for sensitive measurements of morphological changes in the cell ensemble (eg Piety NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109 (3): 221-230 ). For the automatic classification of the cells in certain morphological classes, automatic image processing with specialized algorithms is used (see Albertini MC, et al., Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, cytometry. 2013; 52A: 12-18 .).

Typische im Blutausstrich erkennbare Morphologieklassen sind:

  1. 1. Diskozyten (bikonkave Scheiben, glatt, sehr flexibel, der gesundeste Zustand)
  2. 2. Echinozyten (zunehmend sphärische aber mit unregelmäßiger Oberfläche durch zapfenartigen Ausbuchtungen)
  3. 3. Sphärozyten (sphärische Zellen mit glatter kugeliger Oberfläche, sehr geringe Deformierbarkeit, schlechte Funktionalität für den Sauerstofftransport. )
Typical morphological classes that can be identified in the blood smear are:
  1. 1. Discyocytes (biconcave discs, smooth, very flexible, the healthiest condition)
  2. 2. echinocytes (increasingly spherical but with an irregular surface due to cone-like bulges)
  3. 3. Spherocytes (spherical cells with a smooth globular surface, very low deformability, poor oxygen transport functionality.)

In der Reihenfolge von 1 bis 3 nimmt die funktionelle Qualität der Erythrozyten ab. Dabei werden die Erythrozyten umso rigider und unfähiger zum Transport durch kapillaren Gefäße, je mehr sie sich der inflexiblen kugeligen Form der Sphärozyten annähern. Im Blutausstrich kann man durchaus eine stärkere Schädigung daran erkennen, dass tendenziell vermehrt Sphärozyten und verringert Diskozyten zu sehen sind. Wegen der statistischen Natur dieser Daignose hängt aber ihre Empfindlichkeit direkt von der Anzahl untersuchter Zellen ab, die bei Blutausstrichen naturgemäß sehr begrenzt ist.In order of 1 to 3, the functional quality of the erythrocytes decreases. The erythrocytes become all the more rigid and incompetent for transport through capillary vessels, the more they approach the inflexible spherical shape of the spherocytes. In the blood smear one can recognize a stronger damage by the tendency to see increased spherocytes and reduced discyocytes. However, due to the statistical nature of this dignose, its sensitivity depends directly on the number of cells examined, which is naturally very limited in blood smears.

Eine bessere Empfindlichkeit ist nur erzielbar durch erhöhte Statistik beispielsweise durch Anwendung von Pipettierrobotern oder von fließenden Zellsuspensionen mit automatisierter Bildauswertung. Richtungsweisend wäre dabei auch die Hinzunahme dynamischer Messgrößen, die hochempfindlich die Flexibilität der Erythrozyten anzeigen. In der Tat treten bei Erythrozyten in einer strömenden Suspension typische Bewegungsmuster auf, die direkt mit ihrer Morphologie und Flexibilität zusammenhängen. Rote Blutkörperchen - wenn sie flexible Diskozyten sind - reagieren auf das Geschwindigkeitgefälle in einer laminaren Strömung, indem sie bestimmte Orientierungen und Bewegungsarten einnehmen, die spezifisch den Parametern der Strömung angepasst sind. Insbesondere gehen flexible Diskozyten in laminarer Strömung mit nicht zu starkem Geschwindigkeitsgefälle in einen rollende Bewegungsmodus (rolling mode) über. Sofern die Scherspannung durch die laminare Umströmung der Zellen in einem bestimmten Wertebereich liegt, reagieren die Diskozyten, indem sie in Strömungsrichtung rollen wie ein rollendes Rad, allerdings freischwebend in der Suspension, ohne feste Unterlage. (Siehe Dupire J, et al, Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings oft he National Academy of Sciences oft the USA. 2012; 109(51): 20808-20813 ).A better sensitivity can only be achieved by increased statistics, for example by using pipetting robots or flowing cell suspensions with automated image analysis. Pointing the way forward would also be the addition of dynamic measurement variables which indicate the flexibility of the erythrocytes in a highly sensitive manner. In fact, erythrocytes in a flowing suspension have typical movement patterns directly related to their morphology and flexibility. Red blood cells - if they are flexible discyocytes - respond to the velocity gradient in a laminar flow by adopting certain orientations and types of motion that are specifically adapted to the parameters of the flow. In particular, flexible laminar-flow discozytes with a not-too-smooth velocity gradient go into a rolling mode. If the shear stress due to the laminar flow around the cells is in a certain range of values, the disocytes react by rolling in the direction of flow like a rolling wheel, but free-floating in the suspension, without a solid support. (Please refer Dupire J, et al., Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings often he National Academy of Sciences often the United States. 2012; 109 (51): 20808-20813 ).

Dieser Effekt wird bisher in der medizinischen Diagnostik nicht angewendet, denn bei einem Blutausstrich wird Bewegung offensichtlich nicht erfasst. Die wissenschaftlichen Untersuchungen, die den rollenden Bewegungsmodus (rolling mode) zu Tage fördern, basieren bisher auf ausgeklügelten Versuchsapparaturen zur Präparation eines definierten Geschwindigkeitsgefälles sowie auf adaptierter konventioneller Mikroskopiertechnik. Die hier verwendeten Versuchsanordnungen haben aufgrund ihrer Komplexität für die hämatologische Diagnostik bislang keine Bedeutung.This effect has not been used in medical diagnostics until now, because a blood smear obviously does not detect movement. The scientific investigations that reveal the rolling mode of motion have so far been based on sophisticated experimental equipment for the preparation of a defined speed gradient as well as adapted conventional microscopy techniques. Because of their complexity, the experimental arrangements used here are hitherto of no significance for hematological diagnostics.

Dieser Mangel an Praxistauglichkeit ist umso bedauerlicher, als die statistische Häufigkeit rollender Erythrozyten potentiell ein empfindliches Kriterium für die Blutqualität wäre, denn nur flexible Diskozyten können sich in dieser Weise bewegen, siehe obige Referenz von Dupire et al. Für die hämatologische Diagnostik wäre es daher vorteilhaft, über eine einfache apparative Ausrüstung zur Bestimmung der statistischen Häufigkeit rollfähiger Erythrozyten zu verfügen.This lack of practicality is all the more regrettable given that the statistical frequency of rolling erythrocytes is potentially a sensitive criterion for blood quality because only flexible discyocytes can move in this manner, see above reference by Dupire et al. For the Therefore, it would be advantageous for haematological diagnostics to have simple equipment for determining the statistical frequency of rolling erythrocytes.

Konzept der Erfindung:Concept of the invention:

Diese Erfindung hat ein einfaches Verfahren zum Gegenstand, mit dessen Hilfe der rollende Bewegungsmodus in kleinen Blutproben statistisch erfasst wird. Das Verfahren beruht auf einer Kombination handelsüblicher Mikroskopie-Durchflusszellen mit einem nichtinvasiven In-situ-Mikroskop.This invention has a simple method of statistically detecting rolling motion mode in small blood samples. The method is based on a combination of commercially available microscopy flow cells with a non-invasive in situ microscope.

Grundlage des Verfahrens ist die erstmalig im Labor der Erfinder entdeckte Tatsache, dass der Rollmodus auch in einfachen handelsüblichen Mikroskopier-Durchflusszellen beobachtbar ist, z.B. in der „I0.1 flow chamber“ der Firma IBIDI GmbH, Martinsried mit einem Strömungskanal von 50 mm Länge bei einem Querschnitt von 5mm Breite x 0.1mm Höhe.The basis of the method is the fact, discovered for the first time in the inventors' laboratory, that the roll mode is also observable in simple commercial microscopy flow cells, e.g. in the "I0.1 flow chamber" of the company IBIDI GmbH, Martinsried with a flow channel of 50 mm length with a cross section of 5mm width x 0.1mm height.

Zum Beispiel kann die Rollbewegung der gesunden Diskozyten wie folgt hervorgerufen werden: Eine Erythrozytensuspension wird in tausendfacher Verdünnung in einer wässrigen Salzlösung (0.9% NaCl) präpariert und mit Hilfe einer handelsüblichen Spritzenpumpe mit einem Volumenstrom von etwa 0,5ml/min durch die oben beschriebene Durchflusszelle gepumpt. Dann tritt in genau zwei schmalen Höhenabschnitten innerhalb des laminaren Geschwindigkeitsprofils der Strömung genau das Maß an Scherspannung auf, das den rollenden Bewegungsmodus bei flexiblen Diskozyten induziert. Diese Abschnitte sind zentriert etwa 10 µm unter der oberen und 10µm über der oberen Kanalwand. Entsprechend gibt es zwei Suspensionsschichten mit rollenden Diskozyten. Ihre Dicke beträgt einige Mikrometer.For example, the rolling motion of healthy discyocytes can be induced as follows: An erythrocyte suspension is diluted a thousand times in an aqueous saline solution ( 0.9 % NaCl) and pumped through the flow cell described above using a commercially available syringe pump at a flow rate of about 0.5 ml / min. Then exactly the amount of shear stress that induces the rolling motion mode in flexible discyocytes occurs within exactly two narrow height sections within the laminar velocity profile of the flow. These sections are centered about 10 μm below the top and 10μm above the top channel wall. Accordingly, there are two suspension layers with rolling discyocytes. Its thickness is a few microns.

Da der rollende Bewegungsmodus nicht im gesamten Strömungsquerschnitt auftritt, sondern nur in den beschriebenen zwei dünnen Schichten, ist das Phänomen im Mikroskop normalerweise nicht sichtbar. Bringt man allerdings die sehr begrenzte Schärfentiefe eines hochauflösenden Mikroskops zur räumlichen Koinzidenz mit der Schicht rollender Diskozyten, so kann man diese Schicht selektiv mikroskopieren. Den restlichen und damit den größten Teil der Suspension hält man so aus der Abbildung heraus. Dies ist erwünscht, denn die dortigen Diskozyten bewegen sich taumelnd und chaotisch. Vor diesem chaotischen Hintergrund wäre die Detektion der selteneren orientiert rollenden Zellen sehr erschwert wenn nicht unmöglich.Since the rolling motion mode does not occur in the entire flow cross-section, but only in the described two thin layers, the phenomenon is usually not visible in the microscope. However, if you bring the very limited depth of field of a high-resolution microscope for spatial coincidence with the layer of rolling discyocytes, so you can selectively microscopy this layer. The remaining and thus the largest part of the suspension is kept out of the picture. This is desirable because the local discyocytes are staggering and chaotic. In front of this chaotic background, the detection of the rarer oriented rolling cells would be very difficult if not impossible.

Daher ist die Beobachtung der rollenden Zellen in einer gewöhnlichen Durchflusszelle nur möglich mit einem hochauflösenden nichtinvasiven In-situ-Mikroskop, dessen Schärfentiefebereich so gering ist, dass man damit die verschiedenen Strömungsschichten entlang ihrer Höhe im Strömungskanal selektiv abbilden kann. Ein solches Instrument wird beschrieben in DE 403 20 02 C2 , DE 197 26 518 A1 und DE 100 27 044 A1 sowie in wissenschaftlichen Publikationen, die unter http://www.inftech.hs-mannheim.de/ism aufgelistet sind. Insbesondere können auch bewegte suspendierte Partikel in durchströmten Küvetten durch Anwendung kurzer Lichtblitze mikroskopiert werden. Mit „nichtinvasiv“ ist gemeint, dass die Suspension direkt beobachtet wird, ohne dass die Strömung mechanisch gestoppt wird. Es geht also um die Mikroskopie bewegter Partikel direkt durch die transparente Küvettenwand hindurch, ohne die sonst übliche Fixierung der Partikel in statischen Präparaten. Entscheidend ist außerdem die Definition des Probenvolumens allein durch die Schärfentiefe der Optik. Diese ist bei einem hochauflösenden Mikroskopobjektiv nur etwa 7 Mikrometer dick, so dass es sich ideal eignet zur selektiven Beobachtung bestimmter Höhenschichten in der laminaren Strömung von Mikroskopier-Durchflusszellen.Therefore, the observation of rolling cells in an ordinary flow cell is only possible with a high-resolution non-invasive in-situ microscope, whose depth of field is so low that it can selectively map the different flow layers along their height in the flow channel. Such an instrument is described in DE 403 20 02 C2 . DE 197 26 518 A1 and DE 100 27 044 A1 and in scientific publications listed at http://www.inftech.hs-mannheim.de/ism. In particular, also moving suspended particles can be microscopically traced in cuvettes by applying short flashes of light. By "non-invasive" is meant that the suspension is observed directly without the flow being mechanically stopped. It is therefore about the microscopy of moving particles directly through the transparent cuvette, without the usual fixation of the particles in static preparations. Another decisive factor is the definition of the sample volume by the depth of field of the optics alone. This is only about 7 micrometers thick for a high-resolution microscope objective, making it ideal for selectively observing certain height layers in the laminar flow of microscopy flow cells.

Die gesamte Anordnung mit Durchflusszelle und Mikroskop wird gezeigt in .The entire arrangement with flow cell and microscope is shown in ,

In der Art eines invertierten Mikroskops fokussiert das In-situ-Mikroskop von unten in den waagerechten Strömungskanal genau in diejenige Höhenebene, in der die meisten Diskozyten sich bewegen wie rollende Räder. Mikrometerschrauben an der Befestigung der Durchflusszelle ermöglichen eine mikrometergenaue Feinjustierung der korrekten Höheneinstellung.In the manner of an inverted microscope, the in-situ microscope focuses from below into the horizontal flow channel exactly in the height level in which most discozytes move like rolling wheels. Micrometer screws on the attachment of the flow cell allow micrometer-accurate fine adjustment of the correct height adjustment.

Da es zwei solcher Schichten im Strömungskanal gibt, wird in die untere von beiden - 10µm oberhalb der unteren Kanalbegrenzung - fokussiert. Auf diese Weise wird der optische Weg durch die Suspension verkürzt, und die Kontrastminderung durch Streuung an Zellen wird minimiert.Since there are two such layers in the flow channel, the lower one of them - 10μm above the lower channel boundary - is focused. In this way the optical path through the suspension is shortened and the contrast reduction due to scattering to cells is minimized.

Erkennung rollender Diskozyten:Detection of rolling discyocytes:

Zur eigentlichen Erkennung der rollenden Diskozyten ist folgendes zu beachten: Aus der Sicht des invertierten Mikroskops erscheint ein rollender Diskozyt in einer schmalen ovalen Silhouette mit seitlichen Eindellungen. Siehe . Das Oval ist entlang der Strömungsrichtung ausrichtet. Zur weiteren Auswertung wird durch automatische Bildverarbeitung dem Oval numerisch eine Ellipse angepasst, deren lange Halbachse die Orientierung des Ovals repräsentiert. Die Halbachse steht im Winkel φ zur Strömungsrichtung. Bei einem rollenden Diskozyten ist der Winkel φ entweder Null oder nahezu Null. Wenn der Winkel stark von Null abweicht, so befindet sich diese Zelle nicht im rollenden Modus. Die Bildverarbeitung passt unterschiedslos jeder Zelle, also auch den chaotisch taumelnden, eine Ellipse an. Taumelnde Diskozyten oder auch alle Echinozyten und Sphärozyten weisen jedoch keine Vorzugsrichtung auf, so dass die Häufigkeitsverteilung (Histogramm) ihrer Orientierungswinkel φ kein Maximum hat. Somit beweist ein statistisch gehäuftes Auftreten von Winkelwerten nahe Null immer eine reale statistische Häufung rollender Zellen und demnach das Vorhandensein flexibler Diskozyten. Als ein Maß für die Qualität der roten Blutkörperchen kann daher das prozentuale Gewicht des Winkels Null (also seine Wahrscheinlichkeit) im Histogramm aller gemessenen Winkel gewertet werden. Wenn diese Wahrscheinlichkeit bei hundert Prozent liegt, so bestehen nahezu alle roten Blutkörperchen aus flexiblen Diskozyten. Wenn aber die Wahrscheinlichkeit für alle Winkel gleich ist, so sind nahezu alle roten Blutkörperchen deformiert und/oder rigide.For the actual recognition of rolling discyocytes, the following should be noted: From the point of view of the inverted microscope, a rolling discozy appears in a narrow oval silhouette with lateral dents. Please refer , The oval is aligned along the flow direction. For further evaluation, the oval is numerically adjusted by an automatic image processing an ellipse whose long half-axis represents the orientation of the oval. The half-axis is at an angle φ to the flow direction. For a rolling discyocyte, the angle φ is either zero or nearly zero. If the angle deviates strongly from zero, then this cell is not in rolling mode. The image processing fits indiscriminately each cell, including the chaotically reeling, an ellipse at. However, tumbling disocytes or even all echinocytes and spherocytes have no preferred direction, so that the frequency distribution (histogram) of their orientation angle φ has no maximum. Thus, a statistically increased occurrence of near zero angle values always proves a real statistical accumulation of rolling cells and thus the presence of flexible discyocytes. As a measure of the quality of the red blood cells, therefore, the percentage weight of the angle zero (ie its probability) in the histogram of all measured angles can be evaluated. If this probability is one hundred percent, then almost all red blood cells are made up of flexible discyocytes. But if the probability is the same for all angles, then almost all red blood cells are deformed and / or rigid.

Die zeigt eine Messung von Winkelhistogrammen in verschiedenen Höhen des Strömungskanals durch entsprechende Höheneinstellung des Schärfentiefebereichs. Diese Messung wurde an einer Probe aus einer Blutkonserve durchgeführt, die vorher eine Woche lang in einer Blutbank gelagert worden war, bei der man also noch eine hohe Qualität der roten Blutkörperchen erwarten würde. In der Tat erkennt man deutlich die hohen Konzentrationen rollender Diskozyten in den zwei symmetrischen Ebenen etwa 10µm oberhalb des Kanalbodens und 10µm unterhalb der Kanaldecke. In der mittleren Höhe von 50µm des 100µm hohen Kanals ist das Histogramm dagegen fast homogen, d.h. es gibt dort kaum Diskozyten im rollenden Modus. Diese einfache Messung beweist die der Erfindung zugrundeliegende Entdeckung.The shows a measurement of angular histograms at different heights of the flow channel by corresponding height adjustment of the depth of field. This measurement was carried out on a sample of a stored blood previously stored in a blood bank for one week, which would still be expected to have a high quality of red blood cells. In fact, one can clearly see the high concentrations of rolling discyocytes in the two symmetric planes about 10μm above the channel bottom and 10μm below the channel cover. By contrast, in the middle height of 50 μm of the 100 μm high channel, the histogram is almost homogeneous, ie there are hardly any discocytes in rolling mode. This simple measurement proves the discovery underlying the invention.

Eine vorteilhafte Vorrichtung:An advantageous device:

Eine mögliche und erfolgreich getestete Apparatur zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in gezeigt. Durch eine Spritzenpumpe wird eine 1000fach verdünnte Blutprobe mit 0,5ml/min Volumenstrom hin und her durch eine Durchflusszelle mit den Maßen 50x5x0,1 (in mm) gepumpt. Die Abbildung geschieht durch ein Wasserimmersionsobjektiv mit 40-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 0,75. Mit Pulsen von 3µs Dauer wird die strömende Suspension mit etwa 10 Pulsen Sekunde belichtet, so dass in wenigen Minuten etwa tausend Erythrozyten abgebildet werden. Durch eine Mikrometerschraube wird die Durchflusszelle so positioniert, dass die untere der beiden Suspensionsschichten, welche rollende Diskozyten enthalten, mit dem Fokusbereich (Schärfentiefe) des Objektivs überlappt.A possible and successfully tested apparatus for carrying out the method according to the invention is described in shown. A syringe pump is used to pump a 1000-fold diluted blood sample back and forth at a flow rate of 0.5 ml / min through a flow cell measuring 50x5x0.1 mm (in mm). The illustration is made by a water immersion objective with 40x magnification and a numerical aperture of 0.75. With pulses of 3μs duration, the flowing suspension is exposed with about 10 pulses second, so that in a few minutes about a thousand erythrocytes are imaged. A micrometer screw positions the flow cell so that the lower of the two suspension layers containing rolling discozytes overlaps the focus area (depth of field) of the lens.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • DE 4032002 C2 [0011]DE 4032002 C2 [0011]
  • DE 19726518 A1 [0011]DE 19726518 A1 [0011]
  • DE 10027044 A1 [0011]DE 10027044 A1 [0011]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109(3): 221-230 [0001]NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109 (3): 221-230 [0001]
  • Albertini MC, et al, Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, Cytometry. 2013; 52A: 12-18 [0001]Albertini MC, et al., Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, cytometry. 2013; 52A: 12-18 [0001]
  • Dupire J, et al, Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings oft he National Academy of Sciences oft the USA. 2012; 109(51): 20808-20813 [0004]Dupire J, et al., Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings often he National Academy of Sciences often the United States. 2012; 109 (51): 20808-20813 [0004]

Claims (4)

Verfahren und Vorrichtung zur mikroskopischen Diagnose suspendierter roter Blutkörperchen (Erythrozyten) in laminarer Strömung durch eine Durchflussküvette mit rechteckigem Strömungsquerschnitt und mindestens einer transparenten Wand für die Mikroskopie, mit den zusätzlichen Eigenschaften, dass - der rollende Bewegungsmodus („rolling mode“) gesunder Erythrozyten (Diskozyten) in zwei Schichten des Strömungskanals mit maximaler Häufung auftritt, - dass die Silhouetten der rollenden Diskozyten durch die transparente Küvettenwand hindurch als Ovale erscheinen, die längs der Strömungsrichtung orientiert sind, und dass - die orientierten Ovale sichtbar und gemacht werden durch ein vertikal zur transparenten Küvettenwand gerichtetes In-situ-Mikroskop, dessen Fokusbereich mit einer der Suspensionschichten überlappt, in welcher rollende Diskozyten auftreten.Method and apparatus for the microscopic diagnosis of suspended red blood cells (erythrocytes) in laminar flow through a flow cell having a rectangular flow cross section and at least one transparent wall for microscopy, with the additional properties that - the rolling mode of healthy erythrocytes (discyocytes) occurs in two layers of the flow channel with maximum accumulation, that the silhouettes of the rolling discoocytes through the transparent cuvette wall appear as ovals oriented along the flow direction, and that the oriented ovals are visualized and made by an in-situ microscope directed vertically to the transparent cuvette wall, the focal region of which overlaps with one of the suspension layers in which rolling discozytes occur. Verfahren nach Anspruch 1 mit der zusätzlichen Eigenschaft, dass die orientierten ovalen Silhouetten durch automatische Bildverarbeitung detektiert und gezählt werden.Method according to Claim 1 with the additional feature that the oriented oval silhouettes are detected and counted by automatic image processing. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 mit der zusätzlichen Eigenschaft, dass die Anzahl detektierter orientierter Ovale als Messparameter zur hämatologischen Diagnose beiträgt.Method according to Claim 1 or 2 with the additional property that the number of detected oriented ovals contributes as measurement parameters to the hematological diagnosis. Eine mögliche vorteilhafte Vorrichtung (gemäß ) für das Verfahren nach Anspruch 1, wobei - durch eine Spritzenpumpe eine 1000fach verdünnte Blutprobe mit 0,5ml/min Volumenstrom hin und her durch eine Durchflusszelle mit den Maßen 50×5×0,1 (in mm) gepumpt wird und - mit Pulsen von 3µs Dauer die strömende Suspension zur Mikroskopie mit einem Objektiv x40, NA=0,75 belichtet wird, und - durch eine Mikrometerschraube die Durchflusszelle so positioniert wird, dass die untere der beiden Suspensionsschichten, welche rollende Diskozyten enthalten, mit dem Fokusbereich (Schärfentiefe) des Objektivs überlappt.A possible advantageous device (according to ) for the procedure Claim 1 in which a blood sample diluted 1000 times with 0.5 ml / min volume flow is pumped back and forth through a flow cell measuring 50 × 5 × 0.1 (in mm) by means of a syringe pump and the flowing suspension is used with pulses of 3 μs duration Microscopy is exposed with a x40 lens, NA = 0.75, and - a micrometer screw positions the flow cell so that the lower of the two suspension layers, containing rolling discozytes, overlaps the focus area (depth of field) of the objective.
DE102016013095.4A 2016-11-09 2016-11-09 Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow Withdrawn DE102016013095A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102016013095.4A DE102016013095A1 (en) 2016-11-09 2016-11-09 Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102016013095.4A DE102016013095A1 (en) 2016-11-09 2016-11-09 Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102016013095A1 true DE102016013095A1 (en) 2018-05-09

Family

ID=62002784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102016013095.4A Withdrawn DE102016013095A1 (en) 2016-11-09 2016-11-09 Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102016013095A1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4032002C2 (en) 1989-10-11 1997-05-22 Suhr Hajo Prof Dr In situ microscope probe and measuring method
DE19726518A1 (en) 1997-06-23 1999-02-04 Hajo Prof Dr Suhr Mobile microscope
DE10027044A1 (en) 2000-06-02 2001-12-06 Hajo Suhr Microscopic examination method of suspension sample, involves vibrating cuvette having pump diaphragm and volume-compensating pump diaphragm, by applying voltage to piezoelectric element

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4032002C2 (en) 1989-10-11 1997-05-22 Suhr Hajo Prof Dr In situ microscope probe and measuring method
DE19726518A1 (en) 1997-06-23 1999-02-04 Hajo Prof Dr Suhr Mobile microscope
DE10027044A1 (en) 2000-06-02 2001-12-06 Hajo Suhr Microscopic examination method of suspension sample, involves vibrating cuvette having pump diaphragm and volume-compensating pump diaphragm, by applying voltage to piezoelectric element

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Albertini MC, et al, Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, Cytometry. 2013; 52A: 12-18
Dupire J, et al, Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings oft he National Academy of Sciences oft the USA. 2012; 109(51): 20808-20813
NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109(3): 221-230

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0177718B1 (en) Method and device for sorting microscopic particles
DE69922355T2 (en) ANALYSIS OF RESTING WHOLE TREATED TREATMENTS TREATED WITH ANTIKOAGULANS
DE60109128T2 (en) Device for determining the volume of a single red blood cell
EP3042177B1 (en) In vitro method for the label-free determination of a cell type of a cell
DE102012108158B4 (en) Capillary cell, assembly and method for receiving, positioning and examining a microscopic sample
DE102007031244B3 (en) Apparatus and method for performing static and dynamic scattered light measurements in small volumes
EP0946855B1 (en) Method and devices for measuring distances between object structures
DE102020100020A1 (en) Method and device for the determination of characteristics of particles by multiparametric detection of scattered light and extinction signals
DE102014205535A1 (en) Device and in vitro method for label-free imaging and analysis of cells and crystals in a biological sample
DE102015217700B3 (en) Method for determining the mean radius of gyration of particles with a size of less than or equal to 200 nm in a suspension and apparatus for carrying out the method
DE19631498A1 (en) Method and device for optical scanning near-field microscopy on test specimens in liquids
DE102012214402A1 (en) Method for determining the sizes and concentration of liquid particles and gas particles in a multiphase liquid flow and cavitation channel
DE102013111780B4 (en) Method and device for determining a property of an object
DE102014108630B4 (en) Device and method for performing optical measurements on fluid substances in vessels with a longitudinal direction
DE202019101669U1 (en) Device for field flux fractionation in combination with Raman spectroscopy
EP3574303B1 (en) Method and device for analysing cells
EP3117448B1 (en) Device for correlative scanning transmission electron microscopy (stem) and light microscopy
DE102016013095A1 (en) Hematological diagnosis of suspended erythrocytes using the rolling mode of motion in laminar flow
DE2929018A1 (en) DEVICE FOR MEASURING THE AGGREGATION OF PARTICLES WITH A WALL OR WITH EACH OTHER
EP1756547A1 (en) Device for measuring light emitted by microscopically small particles or biological cells
DE60115591T2 (en) Method for measuring the volume of single red blood cells
DE60204735T2 (en) Method for calibrating the sample height in an analyzer
DE102009035502A1 (en) Method and device for detecting the movement and attachment of cells and particles to cell, tissue and implant layers in the simulation of flow conditions
DE29913707U1 (en) Confocal optical device for optical detection of an observation volume
EP3647767B1 (en) Isovolumetric balling of red blood cells

Legal Events

Date Code Title Description
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee