DE102015108276A1

DE102015108276A1 - System zur Lasermikrodissektion und Lasermikrodissektionsverfahren

Info

Publication number: DE102015108276A1
Application number: DE102015108276.4A
Authority: DE
Inventors: Falk Schlaudraff; Christian Woditschka
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2016-12-01
Anticipated expiration: 2035-05-27
Also published as: DE102015108276B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System (300) zur Lasermikrodissektion mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung (79') und mit einem mit dieser Lasermikrodissektionseinrichtung (79') über eine Steuereinheit (82') gekoppelten Mikroskop (10), wobei das Mikroskop (10) zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes zumindest eines Ausschnitts einer in das Mikroskop (10) eingebrachten ersten Probe (51) eingerichtet ist und eine Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) zum Markieren einer Soll-Schnittlinie (86) um einen interessierenden ersten Probenbereich (510) im mikroskopischen Bild der ersten Probe (51) aufweist, die Lasermikrodissektionseinrichtung (79') eine Laserablenkeinrichtung (73') zum Verschieben eines Auftreffpunkts eines Laserstrahls auf einer zweiten Probe (53) zum Ausschneiden eines Probenbereichs (530) aus dieser zweiten Probe (53) aufweist, und wobei die Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) des Mikroskops (10) mit der Laserablenkeinrichtung der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') über die Steuereinheit (82') derart gekoppelt sind, dass bei einem Markieren der Soll-Schnittlinie (86) um den ersten Probenbereich (510) mittels der Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) des Mikroskops (10) die Laserablenkeinrichtung (73') der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') derart angesteuert wird, dass zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf der zweiten Probe (53) entlang einer Schnittlinie entsprechend der Soll-Schnittlinie automatisch verschoben wird, um einen dem ersten Probenbereich (510) entsprechenden zweiten Probenbereich (530) aus der zweiten Probe (53) auszuschneiden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Lasermikrodissektion und ein Lasermikrodissektionsverfahren, bei dem eine erste Probe in ein Mikroskop eingebracht wird, um ein mikroskopisches Bild zumindest eines Ausschnitts dieser ersten Probe zu erzeugen und einen interessierenden ersten Probenbereich (”Region of Interest”) auf dem Bild dieser ersten Probe zu bestimmen, und bei dem eine zweite Probe in eine Lasermikrodissektionseinrichtung eingebracht wird, um einen Probenbereich aus dieser zweiten Probe auszuschneiden.
Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe (”Objekt”) isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten ”Laser Capture Microdissection” wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes derartiges Lasermikroskopsystem, das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreibung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen verwendet werden, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch Tumorzellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und auf spezifische Nukleinsäuren, Metaboliten oder Proteine zu untersuchen.
Weiterhin kann die Lasermikrodissektion auch zur Manipulation von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen eingesetzt werden. Hier ist beispielsweise an eine Fluoreszenzanregung zu denken oder an die Verwendung als optische Pinzette.
Ein Problem bei den Lasermikrodissektionstechniken ist die Geschwindigkeitsbegrenzung beim Ausschneiden eines Dissektats oder beim Manipulieren einer Zielregion auf einer Probe mit mehreren auszuschneidenden bzw. zu manipulierenden Probenabschnitten. Solche Probenabschnitte werden sequentiell abgearbeitet.
Bei diesem sogenannten ”Serial Section Cutting” (SSC) werden verschiedene Serienschnitte, die aus ein und demselben Präparat stammen, seriell bearbeitet. Ein solches Verfahren ist beispielsweise aus der US 2012/0045790 A1 bekannt.
Gemäß dieser US 2012/0045790 A1 werden aus einem Präparat zwei parallele, insbesondere benachbarte Probenschnitte entnommen und jeweils auf einen Objektträger aufgebracht. Der erste Probenschnitt befindet sich auf einem Standardobjektträger (mit Deckglas), der zweite Probenschnitt befindet sich auf einem sogenannten Dissektions-Objektträger (ohne Deckglas). Ein zweckmäßig gefärbter Probenbereich auf dem Standardobjektträger wird mikroskopisch untersucht, wobei ein interessierender Probenbereich festgelegt wird. Das Bild des interessierenden Probenbereichs des ersten Probenschnitts wird mittels geometrischer Transformation in das Bild des zweiten Probenschnitts eingefügt, so dass ein Bild des korrespondierenden interessierenden Probenbereichs in dem Bild des zweiten Probenschnitts entsteht. Anschließend wird dieser korrespondierende interessierende Probenbereich mittels Lasermikrodissektion aus dem zweiten Probenschnitt ausgeschnitten und einer weiteren Analyse zugeführt. Auch bei diesem Lasermikrodissektionsverfahren können mehrere interessierende Probenbereiche nur sequentiell bearbeitet werden. Insbesondere sind der Zeit- und Rechenaufwand der geometrischen Transformation des interessierenden Probenbereichs von der Referenzprobe auf die aktuell zu schneidende Probe erheblich und verzögern das Verfahren.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, den Prozess der Lasermikrodissektion zu beschleunigen.
Offenbarung der Erfindung
Zur Lösung der genannten Aufgabe schlägt die vorliegende Erfindung ein System zur Lasermikrodissektion und ein Verfahren zur Lasermikrodissektion gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Unter ”Lasermikrodissektionseinrichtung” soll im Rahmen vorliegender Anmeldung eine Einrichtung verstanden werden, die einen Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle über eine Laserfokussierlinse auf eine Probe fokussiert. Mittels einer vor der Laserfokussierlinse im Laserstrahl befindlichen Laserablenkeinrichtung wird der Laserstrahl definiert aus seiner Richtung gelenkt, um den Auftreffpunkt des fokussierten Laserstrahls auf der Probe zu verschieben. Solche Lasermikrodissektionseinrichtungen sind an sich bekannt und sollen daher vorliegend nicht näher erläutert werden.
Unter ”Mikroskop” soll im Rahmen der vorliegenden Anmeldung eine optische Einrichtung zur mikroskopischen Visualisierung einer Probe verstanden werden. Ein solches Mikroskop besitzt somit zumindest ein Objektiv und eine nachgeschaltete Bilderzeugungseinrichtung zur visuellen Darstellung eines vergrößerten Bildes der Probe. Diese Bilderzeugungseinrichtung umfasst die gängigen, an sich bekannten Elemente, wie Zoomsystem, Tubus, Okular und/oder Kamera. Diese Elemente sind dem Fachmann wohl bekannt und sollen deshalb nicht näher erläutert werden.
Die vorliegende Erfindung schlägt eine Kombination aus Mikroskop und Lasermikrodissektionseinrichtung als System zur Lasermikrodissektion vor. Dieses System weist eine Steuereinheit zur Kopplung des Mikroskops und der Lasermikrodissektionseinrichtung auf. Das Mikroskop ist zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes zumindest eines Ausschnitts einer in das Mikroskop eingebrachten ersten Probe eingerichtet und weist eine Schnittlinienmarkiereinrichtung zum Markieren einer Soll-Schnittlinie um einen interessierenden ersten Probenbereich im mikroskopischen Bild der ersten Probe auf. Die Lasermikrodissektionseinrichtung weist eine Laserablenkeinrichtung zum Verschieben eines Auftreffpunkts eines Laserstrahls auf einer zweiten Probe zum Ausschneiden eines Probenbereichs aus dieser zweiten Probe auf. Bei diesem System sind die Schnittlinienmarkiereinrichtung des Mikroskops und die Laserablenkeinrichtung der Lasermikrodissektionseinrichtung über die genannte Steuereinheit derart gekoppelt, dass bei einem Markieren der Soll-Schnittlinie um den ersten Probenbereich mittels der genannten Schnittlinienrnarkiereinrichtung am Mikroskop die Laserablenkeinrichtung der Lasermikrodissektionseinrichtung derart angesteuert wird, dass zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf der zweiten Probe entlang einer Schnittlinie entsprechend dieser Soll-Schnittlinie verschoben wird, um einen dem ersten Probenbereich entsprechenden zweiten Probenbereich aus der zweiten Probe auszuschneiden.
Unter ”Soll-Schnittlinie” ist diejenige Linie zu verstehen, die den ersten Probenbereich umgibt und die zur Schnittlinie des fokussierten Laserstrahls korrespondiert. Eine solche Soll-Schnittlinie kann beispielsweise manuell vom Benutzer des Systems mit einem geeigneten Werkzeug (Computermaus oder Ähnliches) in dem Bild der ersten Probe um den interessierenden Probenbereich beschrieben, also gelegt oder gezeichnet werden. Es ist auch möglich, eine vorgefertigte Schnittkontur (beispielsweise ein Kreis, eine Ellipse oder Ähnliches), die den interessierenden Probenbereich umgibt, seitens des Systems vorzuschlagen. Bei Bestätigung einer solchen vorgeschlagenen Soll-Schnittlinie kann diese entweder vom Benutzer oder vom System nachgefahren werden, was unter den Begriff ”Markieren” der Soll-Schnittlinie fallen soll. Zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie wird automatisch ein dem ersten Probenbereich entsprechender zweiter Probenbereich aus der zweiten Probe mittels Lasermikrodissektion ausgeschnitten. Beide Vorgänge finden in Echtzeit statt. Für einen Benutzer des Systems ist die Verzögerung zwischen Beschreiben bzw. Markieren der Soll-Schnittlinie und Schneiden mittels Lasermikrodissektion nicht oder kaum zu bemerken, da beide Vorgänge unter geringstmöglicher Verzögerung durchgeführt werden. Derartige Verzögerungen sind lediglich durch die elektronische Kopplung bedingt. Die Schnittlinienmarkiereinrichtung einerseits und die Laserablenkeinrichtung andererseits stehen über eine Steuereinheit in Verbindung, die die Schnittkontursignale der Schnittlinienmarkiereinrichtung in entsprechende Laserablenksignale für die Laserablenkeinrichtung umsetzt. Eine solche Steuereinheit ist beispielsweise in Form eines Arbeitsplatzrechners bei herkömmlichen Lasermikrodissektionsgeräten bereits vorhanden. Der Arbeitsrechner dieses Geräts wandelt ebenfalls Schnittkontursignale der Schnittlinienmarkiereinrichtung in entsprechende Steuersignale für die Laserablenkeinrichtung um, um auf demselben Gerät bei derselben Probe die Lasermikrodissektion durchzuführen. Im Unterschied hierzu werden bei der Erfindung die entsprechenden Laserablenksignale jedoch an ein oder mehrere andere Lasermikrodissektionseinrichtungen übertragen, die mit dem Mikroskop gekoppelt sind. Auf diese Weise kann ”zeitgleich” bzw. ”in Echtzeit” (beide Begriffe sollen synonym verwendet werden) markiert und an mehreren Stationen geschnitten werden. Dies bedeutet eine enorme Zeitersparnis gegenüber dem aus dem Stand der Technik bekannten Seriell Section Cutting.
Die Schnittlinienmarkiereinrichtung stellt den räumlichen Koordinaten der Soll-Schnittstelle entsprechende Schnittkontursignale zur Verfügung. Mit anderen Worten besitzt die Schnittlinienmarkiereinrichtung einen Ausgang, an dem Schnittkontursignale abnehmbar sind, die einer Position auf der Soll-Schnittlinie entsprechen. Fährt das System oder ein Benutzer diese Soll-Schnittlinie ab, so werden sämtliche Positionen in räumlichen Koordinaten in Form von Ausgangssignalen an den Ausgang gelegt. Diese Ausgangssignale werden über die Steuereinheit in Laserablenksignale gewandelt, mit denen die Laserablenkeinrichtung der Lasermikrodissektionseinrichtung angesteuert wird. Diese Laserablenksignale führen dazu, dass der Auftreffpunkt des auf die zweite Probe fokussierten Laserstrahls automatisch entlang einer Schnittlinie verschoben wird, die der Soll-Schnittlinie in ihren räumlichen Koordinaten entspricht, so dass ein dem ersten Probenbereich entsprechender zweiter Probenbereich aus der zweiten Probe ausgeschnitten wird. Gleiches gilt in analoger Weise, wenn eine weitere Lasermikrodissektionseinrichtung mit einer weiteren, dritten Probe vorhanden ist, und so fort.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionseinrichtung mit Proben verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich und laserdissizierbar (ohne Abdeckung wie Deckglas) vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Gewebe-Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt wurden, im vorliegenden Fall jedoch auch um dickere Schnitte aus einem entsprechenden Gewebeblock. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionseinrichtung dient daher nicht zur Gewinnung von Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch mit Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z. B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw. Wie erwähnt, eignet sich die Erfindung jedoch auch zur Verarbeitung dickerer Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms vorbereitet wurden.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, gegebenenfalls dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen morphologischen Kriterien, eingerichtet sind. Im vorliegenden Fall dient das Lasermikrodissektionssystem insbesondere zum Heraustrennen von Probenpartikeln, die anschließend in einem Suspendierfluid aufgenommen werden. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen aufgrund der völlig unterschiedlichen Zielsetzung nicht auf derartige Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
Zum Heraustrennen von Probenpartikel bzw. Probenbereichen, also zur Gewinnung von Dissektaten, wird ein Probenbereich entlang einer Schnittlinie vollständig durchtrennt und somit von der umgebenden Probe abgelöst. Es ist beispielsweise nicht möglich, Material unterschiedlicher, übereinander liegender Gewebeschichten getrennt voneinander zu isolieren. Ein mittels Lasermikrodissektion gewonnenes Dissektat stellt daher stets ein ”Sammelprobenbereich” durch die gesamte Dicke der bearbeiteten Probe dar; eine Differenzierung in einzelne Gewebeschichten mittels Lasermikrodissektion ist nicht möglich bzw. kann nur indirekt über die Dicke des Probenbereichs geschehen.
Die Laserablenkeinrichtung weist beim erfindungsgemäßen System in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um eine optische Achse drehbare gläserne Keilplatten („Glaskeile”) auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen Keilpiatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserablenkeinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilpiatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der der Laserfokussierlinse. Der Schnittpunkt des Laserstrahls mit der Objektebene ist damit einstellbar.
Da Lasermikrodissektionseinrichtungen in der Regel auch ein mikroskopisches Bild der zu schneidenden Probe erzeugen, stellt die Laserfokussierlinse das entsprechende Mikroskopobjektiv, das zur Erzeugung des mikroskopischen Bildes verwendet wird, dar. Es sei jedoch an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung nicht voraussetzt, dass die eingesetzten Lasermikrodissektionseinrichtungen zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes ihrer jeweiligen Proben eingerichtet sind. Hierauf wird weiter unten noch gesondert eingegangen.
Eine oben skizzierte Laserablenkeinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserablenkeinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern, Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille bzw. Pupille der Laserfokussierlinse konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille bzw. Pupille der Laserfokussierlinse trifft. Bei der Lasermikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserablenkeinrichtung mit Keilpiatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 genannt.
Vorteile der Erfindung
Im Rahmen vorliegender Erfindung dient die erste Probe zur Bestimmung eines interessierenden Probenbereichs; sie kann somit auch als Referenzprobe verstanden werden. Diese Probe kann beispielsweise gefärbt sein und mit einem geeigneten Mikroskopieverfahren, also beispielsweise unter Fluoreszenzbeleuchtung oder mittels eines geeigneten Kontrastverfahrens, untersucht werden.
Bei der ”zweiten Probe” kann es sich um eine von mehreren Proben handeln, die jeweils in einer parallelen Lasermikrodissektionseinrichtung vorliegen. Mit besonderem Vorteil kann nämlich die Erfindung mit mehreren ”zweiten Proben” in mehreren parallel geschalteten Lasermikrodissektionseinrichtungen ausgeführt werden. Allgemein wird hierzu eine weitere (dritte, vierte, ...) Probe in eine weitere (dritte, vierte, ...) Lasermikrodissektionseinrichtung eingebracht, um einen weiteren Probenbereich aus dieser weiteren Probe auszuschneiden, wobei zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie um den ersten Probenbereich der ersten Probe (Referenzprobe) der dem ersten Probenbereich entsprechende weitere Probenbereich aus jeder weiteren Probe herausgeschnitten wird. Die entsprechenden Schnittkontursignale werden bei dieser Ausführungsform der zweiten, dritten usw. Lasermikrodissektionseinrichtung in Form der genannten Laserablenksignale übertragen, so dass parallel und zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie korrespondierende zweite, dritte usw. Probenbereiche aus der zweiten, dritten usw. Probe ausgeschnitten werden. Diese Form des erfindungsgemäßen Paralleldissezierens ist besonders bevorzugt und besonders zeiteffektiv. Alle Ausführungen bezüglich der ”zweiten Probe” gelten in gleicher Weise für jede weitere Probe, aus der ein entsprechender Probenbereich in der beschriebenen Weise ausgeschnitten wird.
Zweckmäßigerweise werden als erste und zweite Probe parallele, insbesondere unmittelbar benachbarte Probenschnitte, sogenannte Serienschnitte, eines Präparats verwendet. Werden also erste, zweite, dritte, vierte usw. Proben erfindungsgemäß behandelt, so ist es vorteilhaft, wenn diese Proben jeweils benachbarte Probenschnitte eines Präparats darstellen. Man kann dann davon ausgehen, dass sich die Eigenschaften zwischen benachbarten Proben nicht wesentlich unterscheiden, da sie benachbarte Probenschnitte ein und desselben Präparats darstellen. Dieses Anwendungsbeispiel ist auch typisch für das klassische sogenannte Serial Section Cutting.
Um möglichst übereinstimmende Probenbereiche aus der ersten und der zweiten Probe zu schneiden, ist es sinnvoll, wenn das System Mittel zum Abgleichen des Koordinatensystems eines Tisches des Mikroskops zum Tragen der ersten Probe mit dem Koordinatensystem eines Tisches der Lasermikrodissektionseinrichtung zum Tragen der zweiten Probe aufweist. Hierzu ist es vorteilhaft, wenn der Tisch der Lasermikrodissektionseinrichtung ein computergesteuerter Tisch ist, dessen Koordinatensystem zur Ansteuerung mit dem Koordinatensystem eines computergesteuerten Tischs des Mikroskops abgeglichen werden kann. Hierzu wird beispielsweise das räumliche Koordinatensystem der ersten Probe als Referenzsystem verwendet und das Koordinatensystem der zweiten Probe auf das der Referenzprobe kalibriert. Die Kalibrierung kann dabei beispielsweise mit Hilfe von einem Referenzpunkt und einer Richtungsangabe zur Festlegung der Orientierung der Proben erfolgen; die Verwendung von zwei oder mehr Referenzpunkten erhöht die Genauigkeit der Kalibrierung. Solche Referenzpunkte können beispielsweise in die parallelen Probenschnitte, beispielsweise durch Einstechen oder Ähnliches eingebracht werden. In einem auf das Referenzkoordinatensystem kalibrierten Koordinatensystem befinden sich die Referenzpunkte dann an derselben Stelle, sprich haben dieselben Koordinaten, wie im Referenzkoordinatensystem. Dieser Abgleich der Koordinatensysteme sollte vor dem Vorgang der Lasermikrodissektion erfolgen. Die Soll-Schnittlinien, die unter Visualisierung der Referenzprobe erstellt werden, können dann simultan und zeitgleich auf die zweite Probe bzw. auf die anderen Proben in den entsprechenden Lasermikrodissektionseinrichtungen in Form von Schnittlinien, die jeweils ein Laserstrahl beschreibt, übertragen werden.
Es ist vorteilhaft, wenn die Lasermikrodissektionseinrichtung zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes zumindest eines den zweiten Probenbereich umfassenden Ausschnitts der zweiten Probe eingerichtet ist. In diesem Fall entspricht die Laserfokussierlinse der Lasermikrodissektionseinrichtung einem Mikroskopobjektiv. Tatsächlich sind in der Regel Lasermikrodissektionsgeräte derart eingerichtet. Das mikroskopische Bild wird beispielsweise mit Hilfe einer Auflichtbeleuchtung erzeugt, wobei der Laserstrahl der Lasermikrodissektionseinrichtung zusammen mit dem Strahlengang der Auflichtbeleuchtung durch das Mikroskopobjektiv geführt wird. Die zweite Probe (gleiches gilt wiederum für die dritte, vierte usw. Probe) kann beispielsweise nur zum Koordinatenabgleich beleuchtet und mikroskopisch dargestellt werden, damit die Kalibrierung des Koordinatensystems der zweiten Probe anhand der Referenzpunkte erfolgen kann. Danach reicht es prinzipiell, nur die Referenzprobe zu beleuchten und die Beleuchtung der gekoppelten Lasermikrodissektionseinrichtungen abzuschalten. Selbstverständlich können die Beleuchtungen auch angeschaltet bleiben, um die Schneidprozesse zu visualisieren, das Schneidergebnis zu evaluieren oder auch um etwaige Schnittkorrekturen über eine Änderung der Soll-Schnittlinie vorzunehmen. In diesem Fall erfolgt also die Aufnahme eines mikroskopischen Bildes der zweiten Probe nicht nur zur Kalibrierung, sondern auch während der Lasermikrodissektion.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn das zur Markierung der Soll-Schnittlinie eingesetzte Mikroskop mit der parallelen Lasermikrodissektionseinrichtung über eine optische Vergleichsbrücke verbunden ist. Solche optischen Vergleichsbrücken sind an sich aus dem Stand der Technik der forensischen Vergleichsmikroskope bekannt. Bezüglich Aufbau und Funktionsweise einer solchen optischen Vergleichsbrücke sei insbesondere auf EP 1 440 334 B1 hingewiesen.
Eine solche optische Vergleichsbrücke ist insbesondere zur Darstellung jeweils eines der beiden mikroskopischen Bilder der ersten und der zweiten Probe bzw. der betreffenden Ausschnitte, insbesondere zur abwechselnden Darstellung dieser Bilder und/oder zur Darstellung eines Überlagerungsbildes dieser beiden mikroskopischen Bilder und/oder zur Darstellung eines Ausschnitts des ersten mikroskopischen Bildes der ersten Probe neben einem Ausschnitt des zweiten mikroskopischen Bildes der zweiten Probe eingerichtet, wobei diese Darstellung bzw. diese Darstellungen über einen dem Mikroskop (für die Markierung der Soll-Schnittlinie) und der Lasermikrodissektionseinrichtung gemeinsamen Beobachtertubus und/oder über eine gemeinsame Kamera erfolgt bzw. erfolgen. Hierzu wird werter unten noch näher eingegangen.
Mit Hilfe einer solchen optischen Vergleichsbrücke kann auch der oben beschriebene Abgleich der Koordinatensysteme erfolgen. Durch eine Nebeneinanderdarstellung der interessierenden Ausschnitte der ersten und zweiten Probe oder insbesondere durch ein entsprechendes Überlagerungsbild, können anhand der genannten Referenzpunkte die Koordinatensysteme durch entsprechende Tischbewegung optimal miteinander abgeglichen werden, beispielsweise indem der Probentisch der Lasermikrodissektionseinrichtung entsprechend verstellt wird, bis die Referenzpunkte zur Deckung gelangen.
Weiterhin kann umgekehrt auch das Mikroskop zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes der ersten Probe (Referenzprobe) mit einer eigenen Lasermikrodissektionseinrichtung zum Ausschneiden eines Probenbereichs aus dieser ersten Probe ausgestattet sein. Oftmals verändert beispielsweise die Färbung der Referenzprobe Eigenschaften des ausgeschnittenen ersten Probenbereichs, also des Dissektats, so dass Dissektate der Referenzprobe nicht weiter analysiert werden. Sollte dies jedoch nicht der Fall sein, ist es sinnvoll, auch das Mikroskop der Referenzprobe mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung auszustatten, die beim Beschreiben der Soll-Schnittlinie um den ersten Probenbereich eine entsprechende Laserablenkung vornimmt, um eine der Soll-Schnittlinien entsprechende Schnittlinie mit dem Laserfokus zu beschreiben, wodurch der erste Probenbereich aus der Referenzprobe ausgeschnitten wird. Hierzu muss die Referenzprobe selbstverständlich in einer zur Lasermikrodissektion geeigneten Form vorliegen, darf also kein Deckglas aufweisen und sollte beispielsweise auf einer Membranfolie aufgebracht sein.
Ein entsprechendes Mikroskopsystem, also Mikroskop mit integrierter Lasermikrodissektionseinrichtung, ist unten ausführlich unter Bezugnahme auf die 1 erläutert. Mittels der Auflichteinrichtung wird in einem solchen Mikroskopsystem der Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten der Probe verwendet wird, auf diese fokussiert. Somit verläuft, mit anderen Worten, der Strahlengang des Laserstrahls durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren Schnittpunkt, der mittels der gennannten Laserablenksignale an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lässt sich auf Grundlage eines an sich bekannten Vergleichsmikroskops schaffen. Ein besonders geeignetes Vergleichsmikroskop stellt beispielsweise das forensische Vergleichsmikroskop FS CB der Anmelderin dar. Ein solches Vergleichsmikroskop besteht aus einer motorisierten Vergleichsbrücke, die zwei Mikroskope miteinander verbindet. Diese Vergleichsbrücke verfügt über einen eingebauten ergonomischen Beobachtungstubus und stellt verschiedene Betrachtungsarten zur Verfügung. Im Folgenden soll von einer ersten und einer zweiten Probe ausgegangen werden, wobei jedes Mikroskop des Vergleichsmikroskops jeweils ein mikroskopisches Bild der ersten bzw. der zweiten Probe erzeugt. Zum einen kann genau eines der beiden Bilder im Beobachtungstubus und/oder über eine angeschlossene Kamera betrachtet werden. In einer zweiten Alternative kann ein Überlagerungsbild beider Bilder dargestellt werden (sogenanntes Mischbild). In einer dritten Alternative kann ein Ausschnitt des ersten Bildes neben einem Ausschnitt des zweiten Bildes dargestellt werden. Hierbei kann der Ausschnitt des zweiten Bildes den Ausschnitt des ersten Bildes ergänzen, d. h. es wird ein Probenbereich im sogenannten Schnittbild dargestellt, dessen einer (beispielsweise linker) Ausschnitt von der ersten Probe und dessen anderer (beispielsweise rechter) Ausschnitt von der anderen Probe stammt. Beispielsweise kann mittels einer Trennlinie der jeweilige Ausschnitt des ersten bzw. des zweiten Bildes im resultierenden Schnittbild in seiner Größe eingestellt werden.
Erfindungsgemäß wird ein derartiges Vergleichsmikroskop mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung ausgestattet, die an eines der beiden Mikroskope des Vergleichsmikroskops angeschlossen bzw. dort integriert wird. Selbstverständlich kann auch, wenn zweckmäßig, das andere Mikroskop, wie bereits oben ausgeführt, mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung ausgestattet werden.
Es ist insbesondere vorteilhaft, die Soll-Schnittlinie in dem Überlagerungsbild der beiden genannten Bilder zu beschreiben. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass der entsprechende interessierende Probenbereich in der zweiten Probe insgesamt ausgeschnitten wird, wodurch auch etwaige Abgleichungenauigkeiten der Koordinatensysteme kompensiert werden können.
Insbesondere kann auch die Vergleichsbrücke des Vergleichsmikroskops derart ausgebildet sein, dass die Vergrößerung eines der beiden Bilder gegenüber der Vergrößerung des anderen Bildes um bis zu 6 Prozent, insbesondere um +/–6 bis +/–2 Prozent, insbesondere +/–5 oder +/–4 Prozent, verändert werden kann. Beispielsweise bietet das genannte Vergleichsmikroskop der Anmelderin die Möglichkeit, im Beobachtungsstrahlengang der zweiten Probe eine Vergrößerungskorrektur von +/–5 Prozent gegenüber dem Beobachtungsstrahlengang für die erste Probe einzustellen. Auf diese Weise können Stauchungen und Verzerrungen, aber auch etwaige Kalibrierungsfehler kompensiert werden. Insbesondere können im überlagerten Bild die interessierenden Probenbereiche durch Veränderung der Vergrößerung weitgehend zur Deckung gebracht werden, um anschließend die Schnittkontur zu beschreiben.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
Figurenbeschreibung
1 zeigt ein Mikroskopsystem mit integrierter Lasermikrodissektionseinrichtung, das vorzugsweise den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt, in schematischer Darstellung.
2 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Lasermikrodissektionssystem zum zeitgleichen Sichten und Schneiden von Probenbereichen auf verschiedenen Proben.
3 zeigt eine schematische Ansicht einer visualisierten Referenzprobe mit interessierendem Probenbereich und eines zeitgleich geschnittenen Probenbereichs auf einer anderen Probe.
4 zeigt schematisch ein erfindungsgemäß mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung ausgestattetes Vergleichsmikroskop.
In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden nicht wiederholt erläutert.
In 1 ist ein mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung ausgestattetes Mikroskop, das als Mikroskopsystem bezeichnet werden soll, und das zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Mikroskopsystem 100 bzw. die zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes einer Probe eingerichtete Lasermikrodissektionseinrichtung entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw. Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der 1 mit 200 bezeichnet.
Das Mikroskopsystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem Mikroskopfuß 11 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein.
Das Mikroskop 10 kann als Konfokal-, insbesondere als Spinning-Disk-Mikroskop ausgebildet sein und verfügt in diesem Fall über entsprechende weitere oder alternative Mittel (in 1 nicht dargestellt).
Am Mikroskopfuß 11 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungs- und/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Eine Probe 51, beispielsweise eine in einer entsprechenden Aufnahmeeinrichtung bzw. Halterung 52 angebrachte Gewebeprobe, kann hierdurch in eine Objektebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
Von der Probe 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann, vor Ort, in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten), oder in anderer räumlicher Anordnung, ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein. Die dazu notwendigen Verbindungen zum Steuerrechner 81 sind mit 83 bezeichnet.
Das Mikroskopsystem 100 weist eine Lasermikrodissektionseinrichtung 79 mit einer Lasereinheit 70 mit einer Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl 77 mit Laserstrahlachse b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 des Mikroskops 10, das hier als Laserfokussierlinse dient, auf die Probe 51 fokussiert.
Bei dem Mikroskopsystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl 77 auf die Probe 51 in der Objektebene, und damit auch in den Probenbereich auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Verstelleinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Verstelleinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des Mikroskopsystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81, der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Die Steuereinheit 82 oder der Steuerrechner 81 kann auch beispielsweise mittels des Bildauswertungsmoduls 64 erhaltene Daten auswerten. Beispielsweise kann hierdurch eine Abfolge von Gewebeschichten oder anderer Strukturen, insbesondere ein interessierender Probenbereich der Probe 51 erkannt werden.
Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkeinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkeinrichtung 73 kann der Laserstrahl 77 gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teller ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf die Probe 51 in der Objektebene fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkeinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls 77 bzw. zur Positionierung der Probe 51 in der Objektebene gegenüber dem Laserstrahl 77 zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkeinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilpiatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht werden, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an dem rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden.
Der Steuerrechner 81 enthält eine Schnittlinienmarkiereinrichtung 85, mittels derer ein Benutzer beispielsweise über die gezeigte Computermaus 84 auf dem Bildschirm 88 des Steuerrechners 81 eine Soll-Schnittlinie 86 zeichnen kann. In diesem Beispiel ist die mikroskopisch visualisierte Probe 51 auf dem Bildschirm des Steuerrechners 81 dargestellt, wobei hier nur der ausgewählte interessierende Probenbereich 510 der Übersichtlichkeit halber zu sehen ist.
Ein Benutzer beschreibt eine Soll-Schnittlinie 86 um den interessierenden Probenbereich 510. Die Schnittlinienrnarkiereinrichtung stellt Schnittkontursignale zur Verfügung, die über die dargestellten Verbindungen 83 weitergeleitet werden können. Diese Schnittkontursignale enthalten die räumlichen Koordinaten der beschriebenen Soll-Schnittlinie 86. Von der Steuereinheit 82 oder einer entsprechenden Steuereinheit 82' einer parallelen Lasermikrodissektionseinrichtung 79' (vgl. 2) werden die Schnittkontursignale der Schnittlinienrnarkiereinrichtung 85 in entsprechende Laserablenksignale für die Laserablenkeinrichtung 73 oder für andere Laserablenkeinrichtungen 79', 79'' 2) umgesetzt, mit denen dann die jeweilige Laserablenkeinrichtung derart angesteuert wird, dass parallel zum Markieren der Soll-Schnittlinie 86 ein dem ersten Probenbereich 510 entsprechender Probenbereich ausgeschnitten wird. Werden die Schnittkontursignale an die Steuereinheit 82 des Mikroskopsystems 100 aus 1 übertragen, würde parallel und zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie 86 der Laserstrahl 77 eine entsprechende Schnittlinie beschreiben und somit den interessierenden Probenbereich 510 aus der ersten Probe 51 ausschneiden. Das parallele Ausschneiden anderer Probenbereiche wird nunmehr in Verbindung mit 2 erläutert.
2 zeigt eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems 300 mit einem Mikroskop 10 und einer Lasermikrodissektionseinrichtung 79'. Eine weitere Lasermikrodissektionseinrichtung 79'' ist der Lasermikrodissektionseinrichtung 79' parallel geschaltet. Die Darstellung ist sehr schematisch; bezüglich näherer Details sei auf die Erläuterungen zu 1 verwiesen.
Das Lasermikrodissektionssystem 300 weist zunächst ein Mikroskop 10 zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes (vgl. beispielsweise Bild auf Monitor 88 des Steuerrechners 81 gemäß 1) zumindest eines Ausschnitts einer in das Mikroskop eingebrachten ersten Probe 51 auf. Der Übersichtlichkeit halber ist von dem Mikroskop 10 im Wesentlichen nur das Mikroskopobjektiv 41 dargestellt. In der in 2 dargestellten Ausführungsform hat das Mikroskop 10 keine eigene Lasermikrodissektionseinrichtung, wie sie in 1 mit 79 bezeichnet ist. Des Weiteren ist der Monitor 88 des Steuerrechners 81 schematisch dargestellt. Anstelle des Monitors 88 kann hierbei beispielsweise auch die Bilderfassungseinheit 63 mit dem zugeordneten Bildauswertungsmodul 64 zum Einsatz kommen. Weiterhin kann alternativ oder zusätzlich das Bild auf der Benutzereingabe-/informationseinheit 13 angezeigt werden. Ist die Einheit als Touchscreen ausgebildet, so könnte die Schnittkontur 86 direkt mittels eines entsprechenden Stiftes auf dem Touchscreen beschrieben werden. Gleiches gilt selbstverständlich auch, wenn die Bilderfassungseinheit 63 oder der Monitor 88 über Touchscreens verfügen.
Weiterhin dargestellt ist in 2 sehr schematisch die Schnittlinienmarkiereinrichtung 85, die mit dem Monitor 88 hier wieder in Form des Steuerrechners 81 integriert ist (vgl. 1). Diese Schnittlinienmarkiereinrichtung 85 ermöglicht es, wie anhand von 1 bereits erläutert, ein Benutzer, um einen interessierenden ersten Probenbereich 510 im mikroskopischen Bild der ersten Probe 51 eine Soll-Schnittlinie 86 zu beschreiben. Die Schnittlinienmarkiereinrichtung 85 stellt räumlichen Koordinaten der Soll-Schnittlinie 86 entsprechende Schnittkontursignale zur Verfügung. Diese Signale werden über die Verbindungen 83 an eine Steuereinheit 82' übertragen. Die Steuereinheit 82' hat wie die anhand von 1 erläuterte Steuereinheit 82 (auch) die Funktion, die Laserablenkeinrichtung 73' in einer Weise anzusteuern, dass der Fokus des zugeordneten durch die Laserfokussierlinse 41' fokussierten Laserstrahls 77' in der gewünschten Weise auf der Probe 53 verschoben wird, um einen entsprechenden Probenbereich 530 aus der Probe 53 auszuschneiden. Diese Funktion der Steuereinheit 82' könnte auch von der Steuereinheit 82 übernommen werden, die dann entsprechend mit der Laserablenkeinrichtung 73' verbunden sein könnte.
Die Laserablenkeinrichtung 73' und die Schnittlinienmarkiereinrichtung 85 des Mikroskops 10 sind über die Steuereinheit 82' zueinander parallel geschaltet und gekoppelt. Sobald ein Benutzer eine Soll-Schnittlinie 86 um einen interessierenden Probenbereich 510 zeichnet, werden die entsprechenden Positionssignale der Koordinaten dieser Soll-Schnittlinie 86 mit Hilfe der Steuereinheit 82' in entsprechende Laserablenksignale für die Laserablenkeinrichtung 73' umgesetzt, anhand derer der Laserstrahl 77' in der anhand von 1 erläuterten Art und Weise abgelenkt wird, um auf der Probe 53 eine Schnittlinie zu beschreiben, die zur Soll-Schnittlinie 86 korrespondiert. Auf diese Weise wird ein dem Referenzprobenbereich 510 entsprechender Probenbereich 530 ausgeschnitten.
In 2 ist eine weitere Lasermikrodissektionseinrichtung 79'' mit Laserfokussierlinse 41'' dargestellt, die parallel zur Lasermikrodissektionseinrichtung 79' geschaltet ist und ebenfalls über die Steuereinheit 82' mit dem Mikroskop 10 gekoppelt ist. Auf diese Weise kann parallel zur zweiten Probe 53 eine dritte Probe 54 geschnitten werden, wobei hier der zum Referenzprobenbereich 510 korrespondierende Probenbereich 540 ausgeschnitten wird.
In 2 ist die Steuereinheit 82' sowohl der Lasermikrodissektionseinrichtung 79' als auch der Einrichtung 79'' zugeordnet. Es ist selbstverständlich auch möglich, für jede Lasermikrodissektionseinrichtung eine eigene Steuereinheit vorzusehen, wobei dann die Schnittlinienmarkiereinrichtung 85 über die Verbindungen 83 mit den jeweiligen Steuereinheiten in Verbindung steht.
In 3 ist die Referenzprobe oder erste Probe 51 und die zweite Probe 53 nochmals gesondert schematisch dargestellt. Die Referenzprobe 51 ist gefärbt und wird über das Mikroskop 10 geeignet beleuchtet und mikroskopisch visualisiert. Auf diese Weise lässt sich ein interessierender Probenbereich 510 (gestrichelt) vom Benutzer oder aber auch vom System (mittels geeigneter Bildverarbeitungssoftware) identifizieren. Die vom Benutzer oder vom System um den Probenbereich 510 zu beschreibende Soll-Schnittlinie ist wieder mit 86 bezeichnet. Die zweite Probe 53 stammt insbesondere aus einem zur Probe 51 benachbarten Probenschnitt desselben Präparats. Die Proben 53 und 51 sind identisch ausgerichtet und die Koordinatensysteme sind untereinander abgeglichen. Der Probenbereich 530 entspricht im Wesentlichen dem interessierenden Probenbereich 510, da er aus dem benachbarten Schnitt stammt. In der anhand von 2 erläuterten Weise wird nun parallel und zeitgleich mit dem Markieren der Soll-Schnittlinie 86 der Probenbereich 530 mittels der vom Fokus des Laserstrahls 77' erzeugten Schnittlinie 87 aus der Probe 53 geschnitten. Das so erzeugte Dissektat wird einer weiteren Analyse zugeführt. Zu beachten ist, dass die Probe 53 nicht gefärbt ist, so dass unverfälschte Analyseergebnisse erzielt werden können.
In 3 sind außerdem drei Referenzpunkte R1, R2 und R3 zu sehen, anhand derer die Probe 51 im Koordinatensystem des Mikroskops justiert werden kann. Die entsprechenden Referenzpunkte auf der Probe 53 sind mit R1', R2', und R3' bezeichnet. Nach Abgleich der Koordinatensysteme haben die Referenzpunkte R1', R2' und R3' die selben Koordinaten wie die Referenzpunkte R1, R2 und R3.
Bevor auf eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems gemäß 4 eingegangen wird, sei betont, dass zunächst selbstverständlich das Mikroskop 10 gemäß 2 auch mit einer eigenen Lasermikrodissektionseinrichtung 79 ausgestattet sein kann. Diese Ausführungsform ist in 1 dargestellt. Zum Anderen sei betont, dass in die Lasermikrodissektionseinrichtung 79' (gleiches gilt für 79'') ein eigenes Mikroskop 10' integriert werden kann. Die Laserfokussierlinse 41' stellt in diesem Fall das Mikroskopobjektiv des Mikroskops 10' dar. Auch dieser Aufbau entspricht einer Ausführungsform der 1. Dieser Fall soll nun anhand von 4 näher erläutert werden.
Das Lasermikrodissektionssystem 300 gemäß 4 weist zwei Mikroskope 10, 10' auf. Beide Mikroskope 10, 10' sind über eine optische Vergleichsbrücke 310 nach Art eines an sich bekannten Vergleichsmikroskops verbunden. Über ein Binokulartubus 320 kann ein Benutzer auf verschiedene Weise Einblick in die jeweiligen mikroskopischen Bilder nehmen. Zum Einen kann jeweils genau eines der beiden Bilder betrachtet werden, zum Anderen kann ein Überlagerungsbild beider Bilder (sogenanntes Mischbild) dargestellt werden. Schließlich kann in einer dritten Alternative ein Ausschnitt des ersten Bildes neben einem Ausschnitt des zweiten Bildes dargestellt werden. Hierbei kann der Ausschnitt des zweiten Bildes den Ausschnitt des ersten Bildes ergänzen, so dass beispielsweise ein Probenbereich als sogenanntes Schnittbild dargestellt wird, dessen linker Ausschnitt von der ersten Probe und dessen rechter Ausschnitt von der zweiten Probe stammt. Die Trennlinie zwischen den Ausschnitten kann vom Benutzer eingestellt werden.
Mittels dieser optischen Vergleichsbrücke 310 kann insbesondere in einfacher Weise ein Abgleich der Koordinatensysteme der Mikroskoptische 30 und 30' erfolgen. Hierzu wird beispielsweise der interessierende Probenbereich der ersten, vom Mikroskop 10 abgebildeten Probe und der entsprechende Probenbereich der zweiten, vom Mikroskop 10' abgebildeten Probe in Form eines Mischbildes (Überlagerungsbildes) mittels des Beobachtertubus 320 dargestellt. Beispielsweise durch Eingabe an der Benutzereingabeeinheit 13' lässt sich der Mikroskoptisch 30', der den Tisch der Lasermikrodissektionseinrichtung 79' darstellt, computergesteuert räumlich derart verstellen, dass beide interessierenden Probenbereiche exakt gleich ausgerichtet sind. Hierzu dienen insbesondere die bereits anhand von 3 besprochenen Referenzpunkte R1 bis R3 sowie R1' bis R3'.
Das Mikroskop 10' ist mit einer eigenen Lasermikrodissektionseinrichtung 79' ausgestattet. Im Wesentlichen entspricht also das Mikroskopsystem aus Mikroskop 10' und Lasermikrodissektionseinrichtung 79' dem in 1 dargestellten Mikroskopsystem 100. Das Mikroskop 10 ist nicht mit einer eigenen Lasermikrodissektionseinrichtung ausgestattet.
Über die Benutzereingabe-/informationseinheiten 13, 13', die insbesondere als Touchscreen ausgebildet sein können, kann ein Benutzer Eingaben vornehmen und sich das mikroskopische Bild der jeweiligen Probe anzeigen lassen. Auf diese Weise kann beispielsweise ein Benutzer mit einem entsprechenden Stift auf der Einheit 13 in dem angezeigten Probenbild um einen interessierenden Probenbereich 510 herum eine Soll-Schnittlinie 86 beschreiben. Bezüglich des weiteren Ablaufs des parallelen Schneidens einer im Mikroskop 10' befindlichen zweiten Probe sei auf die Erläuterungen zu 2 verwiesen.
Bezugszeichenliste

10, 10': Mikroskop
11, 11': Mikroskopfuß
12: Beleuchtungseinrichtung
13, 13': Benutzereingabe-/informationseinheit
14, 14': Triebknopf
15, 15': Schutzhaube
30, 30': Mikroskoptisch
31: manuelle Verstelleinrichtung
40: Objektivrevolver
41: Objektiv
41', 41'': Laserfokussierlinse, Objektiv
42: Objektiv
43: Beobachtungsstrahlengang
51: Probe, Referenzprobe
52: Aufnahmeeinrichtung
53: Probe
54: Probe
510: Probenbereich, Referenzprobenbereich
530: Probenbereich
540: Probenbereich
60: Tubuseinheit
61: Auskoppeleinrichtungen
62: Okularpaar
63: Bilderfassungseinheit
64: Bildauswertungsmodul
70, 70': Lasereinheit
71: Umlenkspiegel
72, 72': Umlenkspiegel
73, 73', 73'': Laserablenkeinrichtung
74: Umlenkspiegel
75: Laserlichtquelle
76: Auflichteinheit
77, 77', 77'': Laserstrahls
78, 78': Strahlteileranordnung
79, 79', 79'': Lasermikrodissektionseinrichtung
731: Keilplatten
732: Kugellager
733: Zahnrad
734: Aktor
735: Positionsgeber
81: Steuerrechner
82, 82': Steuereinheit
83: Verbindungen
84: Computermaus
85: Schnittlinienmarkiereinrichtung
86: Soll-Schnittlinie
87: Schnittlinie
88: Monitor
90: Kondensoreinheit
100: Mikroskopsystem
200: Koordinatensystem
300: System zur Lasermikrodissektion
310: optische Vergleichsbrücke
320: Beobachtertubus mit Okular
R1, R2, R3: Referenzpunkte
R1', R2', R3': Referenzpunkte
a: Beobachtungsstrahlengangachse
b: Laserstrahlachse
c, c', c'': optische Achse

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 1276586 B1 [0005, 0024, 0047, 0056]
US 2012/0045790 A1 [0010, 0011]
EP 1440334 B1 [0030]

Claims

System (300) zur Lasermikrodissektion mit einer Lasermikrodissektionseinrichtung (79') und mit einem mit dieser Lasermikrodissektionseinrichtung (79') über eine Steuereinheit (82') gekoppelten Mikroskop (10), wobei das Mikroskop (10) zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes zumindest eines Ausschnitts einer in das Mikroskop (10) eingebrachten ersten Probe (51) eingerichtet ist und eine Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) zum Markieren einer Soll-Schnittlinie (86) um einen interessierenden ersten Probenbereich (510) im mikroskopischen Bild der ersten Probe (51) aufweist, die Lasermikrodissektionseinrichtung (79') eine Laserablenkeinrichtung (73') zum Verschieben eines Auftreffpunkts eines Laserstrahls auf einer zweiten Probe (53) zum Ausschneiden eines Probenbereichs (530) aus dieser zweiten Probe (53) aufweist, und wobei die Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) des Mikroskops (10) mit der Laserablenkeinrichtung der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') über die Steuereinheit (82') derart gekoppelt sind, dass bei einem Markieren der Soll-Schnittlinie (86) um den ersten Probenbereich (510) mittels der Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) des Mikroskops (10) die Laserablenkeinrichtung (73') der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') derart angesteuert wird, dass zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf der zweiten Probe (53) entlang einer Schnittlinie entsprechend der Soll-Schnittlinie automatisch verschoben wird, um einen dem ersten Probenbereich (510) entsprechenden zweiten Probenbereich (530) aus der zweiten Probe (53) auszuschneiden.
System (300) nach Anspruch 1, wobei das System (300) Mittel zum Abgleichen des Koordinatensystems eines Tisches (30) des Mikroskops (10) zum Tragen der ersten Probe (51) mit dem Koordinatensystem eines Tisches (30') der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') zum Tragen der zweiten Probe (53) aufweist.
System (300) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mikroskop (10) eine eigene weitere Lasermikrodissektionseinrichtung (79) aufweist, die derart eingerichtet ist, dass beim Markieren einer Soll-Schnittlinie um den ersten Probenbereich (510) dieser erste Probenbereich (510) aus der ersten Probe (51) ausgeschnitten wird.
System (300) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lasermikrodissektionseinrichtung (79') zur Erzeugung eines mikroskopischen Bildes zumindest eines den zweiten Probenbereich (530) umfassenden Ausschnitts der zweiten Probe (53) eingerichtet ist.
System (300) nach Anspruch 4, wobei das Mikroskop (10) und die Lasermikrodissektionseinrichtung (79') über eine optische Vergleichsbrücke (310) miteinander verbunden sind, wobei die optische Vergleichsbrücke (310) zur Darstellung der jeweiligen mikroskopischen Bilder der ersten Probe (51) und der zweiten Probe (53) eingerichtet ist.
System (300) nach Anspruch 5, wobei die optische Vergleichsbrücke (310) zur Darstellung – jeweils eines der beiden mikroskopischen Bilder, – eines Überlagerungsbildes beider Bilder und/oder – eines Ausschnitts des ersten Bildes neben einem Ausschnitt des zweiten Bildes über einen dem Mikroskop (10) und der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') gemeinsamen Beobachtertubus (320) und/oder über eine gemeinsame Kamera eingerichtet ist.
System (300) nach Anspruch 5 oder 6, soweit auf Anspruch 2 zurückbezogen, wobei die Mittel zum Abgleichen der Koordinatensysteme die optische Vergleichsbrücke (310) umfassen.
System (300) nach Anspruch 6 oder 7, wobei die optische Vergleichsbrücke (310) derart ausgebildet ist, dass die Vergrößerung eines der beiden Bilder der ersten und der zweiten Probe (51, 53) gegenüber der Vergrößerung des anderen Bildes um bis zu 6% verändert werden kann.
Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem eine erste Probe (51) in ein Mikroskop (10) eingebracht wird, um ein mikroskopisches Bild zumindest eines Ausschnitts dieser ersten Probe (51) zu erzeugen, eine zweite Probe (53) in eine Lasermikrodissektionseinrichtung (79') eingebracht wird, wobei eine Laserablenkeinrichtung (73') der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') derart angesteuert wird, dass durch Verschieben des Auftreffpunktes eines Laserstrahls auf der zweiten Probe (53) ein Probenbereich (530) aus dieser zweiten Probe (53) ausgeschnitten wird, eine Soll-Schnittlinie (86) um einen interessierenden ersten Probenbereich (510) auf dem Bild der ersten Probe (51) mittels einer Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) des Mikroskops (10) markiert wird, wobei die Schnittlinienmarkiereinrichtung (85) des Mikroskops (10) und die Laserablenkeinrichtung (73') der Lasermikrodissektionseinrichtung (70') derart gekoppelt sind, dass bei einem Markieren der Soll-Schnittlinie (86) um den ersten Probenbereich (510) der ersten Probe (51) zeitgleich ein zweiter Probenbereich (530) entlang einer Schnittlinie, die der Soll-Schnittlinie (86) entspricht, aus der zweiten Probe (53) ausgeschnitten wird.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem als erste Probe (51) und als zweite Probe (53) parallele, insbesondere benachbarte Probenschnitte desselben Präparats verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem die erste Probe (51) als Referenzprobe verwendet wird und das Koordinatensystem eines die zweite Probe (53) tragenden Tisches der Lasermikrodissektionseinrichtung (79') mit dem Koordinatensystem eines die erste Probe (51) tragenden Tisches des Mikroskops (10) abgeglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Abgleich der Koordinatensysteme mittels mindestens einem auf der ersten Probe (51) befindlichen Referenzpunkt (R1, R2) und mindestens einem auf der zweiten Probe (53) befindlichen Referenzpunkt (R1', R2') vorgenommen wird, die sich in den abgeglichenen Koordinatensystemen jeweils an derselben Stelle befinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem von der in die Lasermikrodissektionseinrichtung (79') eingebrachten zweiten Probe (53) ein mikroskopisches Bild erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das mikroskopische Bild der ersten Probe (51) und das mikroskopische Bild der zweiten Probe (53) überlagert werden.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Soll-Schnittlinie (86) um den ersten Probenbereich (510) in dem überlagerten Bild markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das mikroskopische Bild der ersten Probe (51) ganz oder ausschnittsweise neben dem Bild oder einem Ausschnitt des Bildes der zweiten Probe (53) dargestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, bei dem eine dritte Probe (54) in eine dritte Lasermikrodissektionseinrichtung (79'') eingebracht wird, um einen dritten Probenbereich (540) aus dieser dritten Probe (54) auszuschneiden, wobei zeitgleich zum Markieren der Soll-Schnittlinie (86) um den erste Probenbereich (510) der ersten Probe (51) automatisch der dem ersten Probenbereich (510) entsprechende dritte Probenbereich (540) aus der dritten Probe (54) ausgeschnitten wird.