DE102015103079A1 - Improved immunodiagnostic detection of anti-neutrophil antibodies - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Diagnostik von Autoimmunerkrankungen bereit zu stellen, insbesondere um das Risiko möglicher falsch negativer ANCA-Befunde zu vermindern. Gelöst wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt durch ein Verfahren zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, umfassend die Schritte des a) Inkontaktbringens einer Körperflüssigkeitsprobe mit aa) stimulierten neutrophilen Granulocyten unter Bedingungen, die eine Bindung von in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltenen anti-neutrophilen Antikörpern an die stimulierten neutrophilen Granulocyten erlaubt, und/oder ab) mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs, unter Bedingungen, die eine Bindung von in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltenen anti-neutrophilen Antikörpern an die NETs erlaubt und b) Immunmarkierens von an die stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs gebundenen anti-neutrophilen Antikörper.The invention relates to a method and a kit for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies. The object of the present invention is to provide an improved diagnosis of autoimmune diseases, in particular in order to reduce the risk of possible false-negative ANCA findings. The object is achieved in a first aspect by a method for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, comprising the steps of a) contacting a body fluid sample with aa) stimulated neutrophilic granulocytes under conditions involving binding of anti-neutrophil antibodies contained in the body fluid sample the stimulated neutrophilic granulocytes are allowed and / or abrogated with neutrophil extracellular traps, NETs produced by stimulated neutrophilic granulocytes, under conditions permitting binding of anti-neutrophil antibodies contained in the body fluid sample to the NETs, and b) immunostimulating to the stimulated neutrophil granulocytes and / or NETs bound anti-neutrophil antibody.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper.The invention relates to a method and a kit for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies.

Antikörpern gegen neutrophile Granulocyten kommt eine wichtige Rolle bei der Diagnostik von autoimmunbedingten Erkrankungen, beispielsweise bei entzündlichen Gefäßerkrankungen (Vaskulitiden) und primär sklerosierender Cholangitis, zu. Es handelt sich hier um eine Gruppe von Autoantikörpern, die vor allem an cytoplasmatische Komponenten von neutrophilen Granulocyten binden und deshalb als anti-neutrophile cytoplasmatische Antikörper (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) bezeichnet werden. In dem Krankheitsbild der Vaskulitiden sind ANCA sowohl in der Pathogenese als auch der Diagnostik bedeutsam, was seinen Niederschlag in dem Begriff der ANCA-assoziierten Vaskulitiden (AAV) findet. Antibodies to neutrophil granulocytes play an important role in the diagnosis of autoimmune diseases, such as inflammatory vascular disease (vasculitis) and primary sclerosing cholangitis. This is a group of autoantibodies that bind primarily to cytoplasmic components of neutrophilic granulocytes and are therefore termed anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA). In the clinical picture of vasculitis, ANCA are important in both pathogenesis and diagnostics, which is reflected in the notion of ANCA-associated vasculitis (AAV).

Verfahren zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler cytoplasmatischer Antikörper sind grundsätzlich bekannt. Bei einem häufig angewandten Verfahren werden fixierte neutrophile Granulocyten mit potenziell ANCA-haltigem Patientenserum inkubiert, und gebundene ANCA werden mittels gegen sie gerichteter fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper detektiert (s. z.B. Savige J, et al. 2003, Addendum to the International Consensus Statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases, American Journal of Clinical Pathology, 120, 312–318, doi: 10.1309/WAEPADW0K4LPUHFN ; Csernok E und Moosig F, 2014, Current and emerging techniques for ANCA detection in vasculitis, Nature Reviews Rheumatology 10, 494–501, doi: 10.1038/nrrheum.2014.78 ; Schulte-Pelkum J, et al. 2014, Novel clinical and diagnostic aspects of antineutrophil cytoplasmic antibodies, J Immunol Res. 2014; doi: 10.1155/2014/185416 ).Methods for immunodiagnostic detection of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies are known in principle. In one commonly used procedure, fixed neutrophil granulocytes are incubated with potentially ANCA-containing patient serum, and bound ANCA are detected by means of fluorescent-labeled secondary antibody directed against them (see, for example, US Pat Savige J, et al. 2003, Addendum to the International Consensus Statement on the Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases, American Journal of Clinical Pathology, 120, 312-318, doi: 10.1309 / WAEPADW0K4LPUHFN ; Csernok E and Moosig F, 2014, Current and emerging techniques for ANCA detection in vasculitis, Nature Reviews Rheumatology 10, 494-501, doi: 10.1038 / nrrheum.2014.78 ; Schulte-Pelkum J, et al. 2014, Novel clinical and diagnostic aspects of antineutrophil cytoplasmic antibodies, J Immunol Res. 2014; doi: 10.1155 / 2014/185416 ).

Allerdings werden mit den vorhandenen Verfahren nicht bei allen Patienten mit einer ANCA-assoziierten Erkrankung auch ANCA detektiert. So werden bei 15 % der Patienten mit ANCA assoziierten Vaskulitiden keine ANCA detektiert, so dass in diesem Zusammenhang von ANCA-negativen Vaskulitiden gesprochen wird ( Chen M, Kallenberg CG, Zhao MH, 2009, ANCA-negative pauci-immune crescentic glomerulonephritis, Nat Rev Nephrol. 2009 Jun;5(6): 313–318. doi: 10.1038/nrneph.2009.67 ; Kallenberg CGM 2014, Key advances in the clinical approach to ANCA-associated vasculitis, Nature Reviews Rheumatology 10, 484–493, doi: 10.1038/nrrheum.2014.104 ). ANCA-Befunde haben daher nur eine begrenzte Aussagekraft.However, not all patients with an ANCA-associated disease will detect ANCA with existing procedures. For example, in 15% of patients with ANCA-associated vasculitis, no ANCA is detected, so ANCA-negative vasculitis is mentioned in this context ( Chen M, Kallenberg CG, Zhao MH, 2009, ANCA-negative pauci-immune crescentic glomerulonephritis, Nat Rev Nephrol. 2009 Jun; 5 (6): 313-318. doi: 10.1038 / nrneph.2009.67 ; Kallenberg CGM 2014, Key advances in the clinical approach to ANCA-associated vasculitis, Nature Reviews Rheumatology 10, 484-493, doi: 10.1038 / nrrheum.2014.104 ). ANCA findings are therefore of limited significance.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine verbesserte Diagnostik von Autoimmunerkrankungen bereit zu stellen, insbesondere das Risiko möglicher falsch negativer ANCA-Befunde zu vermindern.The object of the present invention is to provide an improved diagnosis of autoimmune diseases, in particular to reduce the risk of possible false-negative ANCA findings.

Gelöst wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt durch ein Verfahren zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, umfassend die Schritte des a) Inkontaktbringens einer Körperflüssigkeitsprobe mit aa) stimulierten neutrophilen Granulocyten unter Bedingungen, die eine Bindung von in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltenen anti-neutrophilen Antikörpern an die stimulierten neutrophilen Granulocyten erlaubt, und/oder ab) mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs, unter Bedingungen, die eine Bindung von in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltenen anti-neutrophilen Antikörpern an die NETs erlaubt und b) Immunmarkierens von an die stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs gebundenen anti-neutrophilen Antikörper.The object is achieved in a first aspect by a method for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, comprising the steps of a) contacting a body fluid sample with aa) stimulated neutrophilic granulocytes under conditions involving binding of anti-neutrophil antibodies contained in the body fluid sample the stimulated neutrophilic granulocytes are allowed and / or abrogated with neutrophil extracellular traps, NETs produced by stimulated neutrophilic granulocytes, under conditions permitting binding of anti-neutrophil antibodies contained in the body fluid sample to the NETs, and b) immunostimulating to the stimulated neutrophil granulocytes and / or NETs bound anti-neutrophil antibody.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Kit zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, a) mindestens einen Behälter oder einen Träger mit stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs, und b) mindestens einen gegen anti-neutrophile Antikörper gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper.In a further aspect, the object is achieved by a kit for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophil antibodies, a) at least one container or carrier with stimulated neutrophilic granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs produced by stimulated neutrophilic granulocytes, and b) at least a fluorescently labeled antibody directed against anti-neutrophil antibody.

In noch einem Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung stimulierter neutrophiler Granulocyten und/oder Neutrophil Extracellular Traps, NETs, von stimulierten neutrophilen Granulocyten zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper.In yet another aspect, the object is achieved by the use of stimulated neutrophil granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs, stimulated neutrophil granulocytes for immunodiagnostic detection of anti-neutrophil antibodies.

Bei der vorliegenden Erfindung werden zum immundiagnostischen Nachweis von anti-neutrophilen Antikörpern erstmals stimulierte neutrophile Granulocyten anstelle naiver, d.h. nicht-stimulierter, neutrophiler Granulocyten verwendet. Alternativ oder zusätzlich werden von stimulierten neutrophilen Granulocyten gebildete Neutrophil Extracellular Traps, abgekürzt NETs, verwendet. Die Erfinder haben überraschend gefunden, dass bei Verwendung von stimulierten neutrophilen Granulocyten oder von von diesen gebildeten NETs Anti-Neutrophilen-Antikörper in Proben nachweisbar sind, die bei Einsatz der aus dem Stand der Technik bekannten ANCA-Diagnostik negativ getestet wurden. Damit stellt die vorliegende Erfindung einen neuen diagnostischen Parameter für Autoimmunerkrankungen bereit.In the present invention, for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, stimulated neutrophilic granulocytes are used for the first time instead of naive, ie non-stimulated, neutrophilic granulocytes. Alternatively or additionally, neutrophil extracellular traps, abbreviated NETs, formed from stimulated neutrophilic granulocytes are used. The inventors have surprisingly found that when using stimulated neutrophilic granulocytes or NETs formed by them, anti-neutrophil antibodies are detectable in samples known using the prior art ANCA diagnostics were tested negative. Thus, the present invention provides a new diagnostic parameter for autoimmune diseases.

Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass während der Stimulierung von neutrophilen Granulocyten durch verschiedene Auslöser oder Mechanismen (z.B. reaktive Sauerstoffspezies, Enzyme) Zellbestandteile verändert und Neoantigene gebildet werden. Die bekannten Verfahren detektieren keine Antikörper gegen diese Neoantigene und können deshalb zu einem falsch negativen ANCA-Befund führen. Demgegenüber bietet die Erfindung die Möglichkeit, auch gegen veränderte Zellbestandteile in stimulierten Neutrophilen gerichtete Antikörper festzustellen.Without wishing to be bound by theory, it is believed that during the stimulation of neutrophilic granulocytes by various activators or mechanisms (e.g., reactive oxygen species, enzymes) cell components are altered and neoantigens are formed. The known methods do not detect any antibodies against these neoantigens and can therefore lead to a false negative ANCA finding. In contrast, the invention offers the possibility of also detecting antibodies directed against altered cell components in stimulated neutrophils.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können isolierte unstimulierte neutrophile Granulocyten beispielsweise zunächst in geeigneter Weise stimuliert und anschließend in bekannter Weise auf einem Glasobjektträger z.B. mit Ethanol, Methanol oder Formalin fixiert werden. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten stimulierten neutrophilen Granulocyten können dabei erst soweit stimuliert sein, dass noch keine NET-Bildung erfolgt ist oder soweit, dass sie bereits NETs gebildet haben. Von stimulierten neutrophilen Granulocyten gebildete NETs können auch in isolierter Form zusätzlich oder anstelle von stimulierten neutrophilen Granulocyten in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Das weitere Nachweisverfahren kann wie im Stand der Technik bekannt erfolgen, und umfasst beispielsweise das Inkubieren von auf einem Glasobjektträger fixierten und immobilisierten stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs mit einer Körperflüssigkeitsprobe, beispielsweise einer Blutplasma- oder Blutserumprobe, das anschließende Inkubieren mit fluoreszenzmarkierten Anti-human-IgG-Antikörpern und entsprechende Waschvorgänge.For example, in the method of the present invention, isolated unstimulated neutrophil granulocytes may be suitably stimulated first and then incubated in a known manner on a glass slide, e.g. be fixed with ethanol, methanol or formalin. The stimulated neutrophilic granulocytes used in the method according to the invention can be stimulated only to the extent that no NET formation has yet occurred or to the extent that they have already formed NETs. NETs formed from stimulated neutrophilic granulocytes can also be used in isolated form in addition to or instead of stimulated neutrophilic granulocytes in the method of the invention. The further detection method may be as known in the art, and includes, for example, incubating stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs immobilized on a glass slide with a body fluid sample, such as a blood plasma or blood serum sample, followed by incubation with fluorescently labeled anti-human IgG antibodies and appropriate washings.

Unter dem Begriff „anti-neutrophile Antikörper“ oder „Anti-Neutrophilen-Antikörper“ werden allgemein Antikörper, insbesondere Autoantikörper, verstanden, die gegen Antigene von Leukocyten, insbesondere neutrophilen Granulocyten und Monocyten, gerichtet sind, unabhängig davon, wo diese Antigene an oder in den Zellen lokalisiert sind. Der Begriff umfasst auch Antikörper, die gegen Bestandteile gerichtet sind, die von den Zellen nach außen abgegeben werden, z.B. gegen Bestandteile von Neutrophil Extracellular Traps (NETs). Unter dem Begriff „anti-neutrophile cytoplasmatische Antikörper“, abgekürzt ANCA, werden Antikörper verstanden, die gegen Antigene im Cytoplasma von Leukocyten, insbesondere neutrophilen Granulocyten und Monocyten, gerichtet sind. ANCA treten vor allem in Zusammenhang mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen, beispielsweise Vaskulitiden, auf. Bei Personen mit einer entsprechenden Erkrankung finden sich ANCA als Autoantikörper, d.h. vom Körper selbst gebildete Antikörper, die gegen körpereigene Leukocyten gerichtet sind. Eine Unterscheidung verschiedener ANCA-Formen erfolgt anhand des Fluoreszenzmusters bei den zur Diagnose verwendeten indirekten Immunfluoreszenztests (indirekter IFT, IIF) an ethanol-fixierten neutrophilen Granulocyten: Bei perinukleärer Anfärbung wird von p-ANCA, bei cytoplasmatischer Anfärbung von c-ANCA, und bei atypischer Anfärbung von a-ANCA gesprochen. Unter „anti-neutrophilen cytoplasmatischen Antikörpern“ werden daher insbesondere menschliche Autoantikörper verstanden, die gegen körpereigene menschliche neutrophile Granulocyten gerichtet sind. Gegebenenfalls wird hier in Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch der Begriff „anti-stimulierte neutrophile Antikörper“, kurz ASNA, oder „anti-aktivierte neutrophile Antikörper“, kurz AANA, in Zusammenhang mit Autoantikörpern verwendet, die gegen stimulierte neutrophile Granulocyten bzw. gegen Antigene an oder in stimulierten neutrophilen Granulocyten gerichtet sind, oder gegen Antigene gerichtet sind, die in Zellbestandteilen enthalten sind, die von stimulierten neutrophilen Granulocyten nach außen abgegeben werden, beispielsweise im Rahmen der NET-Bildung.By the term "anti-neutrophil antibody" or "anti-neutrophil antibody" is meant, in general terms, antibodies, especially autoantibodies, directed against antigens of leukocytes, in particular neutrophilic granulocytes and monocytes, regardless of where these antigens on or in are localized to the cells. The term also encompasses antibodies directed against components released from the cells to the outside, e.g. against components of Neutrophil Extracellular Traps (NETs). By the term "anti-neutrophil cytoplasmic antibodies", abbreviated ANCA, is meant antibodies directed against antigens in the cytoplasm of leukocytes, especially neutrophilic granulocytes and monocytes. ANCA mainly occur in connection with various autoimmune diseases, such as vasculitis. In persons with a corresponding disease, ANCA are found to be autoantibodies, i. from the body itself formed antibodies directed against the body's own leukocytes. A differentiation of different forms of ANCA is made on the basis of the fluorescence pattern in the indirect immunofluorescence tests (indirect IFT, IIF) on ethanol-fixed neutrophilic granulocytes used for the diagnosis: in perinuclear staining of p-ANCA, in cytoplasmic staining of c-ANCA, and atypical Staining of a-ANCA spoken. Therefore, "anti-neutrophilic cytoplasmic antibodies" are understood to mean, in particular, human autoantibodies which are directed against the body's own human neutrophilic granulocytes. Optionally, the term "anti-stimulated neutrophilic antibodies", short ASNA, or "anti-activated neutrophilic antibodies", short AANA, used in connection with autoantibodies against stimulated neutrophilic granulocytes or against antigens on or in stimulated neutrophilic granulocytes, or are directed against antigens contained in cell components released from stimulated neutrophilic granulocytes to the outside, for example in the context of NET formation.

„Neutrophile Granulocyten“ oder kurz „Neutrophile“ sind bei Wirbeltieren vorkommende spezialisierte Immunzellen, die zum unspezifischen, angeborenen Immunsystem gehören und an der Immunabwehr von Mikroorganismen beteiligt sind. Beim Menschen bilden sie mit 50–65 % den größten Anteil weißer Blutkörperchen (Leukozyten) im peripheren Blut. Im unstimulierten Zustand handelt es sich um kugelförmige Zellen mit einem Durchmesser von etwa 10–15 µm. Ausgereifte Zellen sind „polymorphkernig“, und sind durch einen aus drei bis fünf Segmenten bestehenden Zellkern gekennzeichnet. Im Cytoplasma neutrophiler Granulocyten finden sich verschiedene Arten von Granula, die unterschiedliche antimikrobiell wirksame Agenzien, z.B. Enzyme, enthalten."Neutrophil granulocytes" or "neutrophils" for short, are specialized immune cells that occur in vertebrates that belong to the nonspecific innate immune system and are involved in the immune defense of microorganisms. In humans, they account for the largest proportion of white blood cells (leukocytes) in the peripheral blood at 50-65%. In the unstimulated state are spherical cells with a diameter of about 10-15 microns. Mature cells are "polymorphonuclear" and are characterized by a cell nucleus consisting of three to five segments. In the cytoplasm of neutrophilic granulocytes there are various types of granules containing different antimicrobial agents, e.g. Enzymes, included.

Unter einem „stimulierten neutrophilen Granulocyten“ wird ein neutrophiler Granulocyt verstanden, der auf einen entsprechenden Reiz hin den ursprünglich unstimulierten (naiven) Zustand verlassen hat. Insbesondere werden unter dem Begriff aus einem menschlichen oder tierischen Körper, insbesondere einem menschlichen oder tierischen Körper mit einer Autoimmunerkrankung und/oder entzündlichen Erkrankung, isolierte stimulierte oder in vitro stimulierte naive neutrophile Granulocyten verstanden. Vorzugsweise handelt es sich um menschliche stimulierte neutrophile Granulocyten. Stimulierte neutrophile Granulocyten zeigen regelmäßig eine Gestalt- und Verhaltensänderung sowie eine Änderung des physiologischen Zustands. Sie weisen regelmäßig eine nicht mehr kugelförmige, sondern amorphe, amöbenartige Gestalt auf und zeigen chemotaktisches Verhalten, Adhäsion, Degranulation, Phagocytose, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Veränderungen der Kernstruktur etc. Damit verbunden sind physiologische Veränderungen, beispielsweise hinsichtlich der Zusammensetzung der Oberflächenrezeptoren. Eine vergleichsweise schwache, reversible Stimulierung wird im Stand der Technik teilweise auch als „Priming“ bezeichnet, während für eine irreversible, häufig auch die Bildung von NETs einschließende Stimulierung auch der Begriff „Aktivierung“ verwendet wird. Der hier verwendete Begriff „Stimulierung“ umfasst sämtliche dieser Bedeutungen. Insbesondere bedeutet der Begriff hier jedoch die Setzung eines externen Reizes, der ohne weiteren Eingriff, z.B. ohne vorherige Abtötung und/oder Fixierung der Zellen, zur Adhäsion, Degranulation, Phagocytose und NET-Bildung von neutrophilen Granulocyten führt. Alternativ oder zusätzlich umfasst der Begriff hier insbesondere die Setzung eines Reizes, der einen zellulären Prozess in Gang setzt, in dessen Verlauf die zelluläre Zusammensetzung von Neutrophilen so verändert wird, dass es zu einer Vermischen von Bestandteilen, z.B. Molekülen, aus unterschiedlichen Zellkompartimenten (z.B. Granula, Zellkern, Cytoplasma, Mitochondrien, Endoplasmatisches Retikulum) kommt. Stimulierte neutrophile Granulocyten sind dem Fachmann grundsätzlich ebenso bekannt wie Verfahren zu ihrer In-vitro-Stimulierung. Ein Beispiel für ein Stimulierungsmittel ist Phorbol-12-myristat-13-acetat, PMA (s. z.B. David A. et al. 2003, Interaction of proteinase 3 with CD11b/CD18 (β2 integrin) on the cell membrane of human neutrophils, Journal of Leukocyte Biology 74, 551–557 ). Ein weiteres bekanntes Stimulierungsmittel sind Calcium-Ionophore (s. z.B. Godfrey et al., 1987, Stimulus-Specific Induction of Phospholipid and Arachidonic Acid Metabolism in Human Neutrophils, The Journal of Cell Biology 104, 925–932 ). Neutrophile aktivieren beispielsweise auch, wenn sie lange (> 3h) unaufgereinigt mit Fremdmaterial in Kontakt gebracht, z.B. in Zellkulturschalen gehalten werden (Autoaktivierung), oder nach Aufreinigung länger als 30 Minuten Fremdmaterial, z.B. Glas- oder Kunststoffoberflächen, ausgesetzt werden. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass es durch die Stimulierung zur Bildung von neuen Strukturen kommt, die als Antigene (Neoantigene) fungieren können. Dabei kann neben der Art der Stimulierung auch deren Dauer relevant sein. So wurde beobachtet, dass Calcium-Ionophore nach 30 Minuten neue Antigene generierten, die bei längerer Stimulierung – möglicherweise durch proteolytischen Abbau – wieder verschwanden. Der Fachmann kann durch Routineversuche leicht ermitteln, welche Stimulierungsbedingungen und – dauern bei einer gegebenen Stimulierungsart geeignet sind, um Neoantigene nachweisen zu können.A "stimulated neutrophilic granulocyte" is understood to be a neutrophilic granulocyte which, after an appropriate stimulus, has left the originally unstimulated (naive) state. In particular, the term "human or animal body, in particular a human or animal body having an autoimmune disease and / or an inflammatory disease" means isolated stimulated or in vitro stimulated naive neutrophilic granulocytes. Preferably, these are human stimulated neutrophilic granulocytes. Stimulated neutrophilic granulocytes regularly show a change in shape and behavior as well as a change in the physiological state. They point regularly a no longer spherical, but amorphous, amoeba-like shape and show chemotactic behavior, adhesion, degranulation, phagocytosis, formation of reactive oxygen species (ROS), changes in the nuclear structure, etc. Associated with physiological changes, for example, in terms of the composition of the surface receptors. A comparatively weak, reversible stimulation is sometimes referred to in the art as "priming", while for irreversible, often including the formation of NETs-inclusive stimulation and the term "activation" is used. The term "stimulation" as used herein includes all of these meanings. In particular, however, the term here means the setting of an external stimulus which leads to adhesion, degranulation, phagocytosis and NET formation of neutrophilic granulocytes without further intervention, eg without prior killing and / or fixation of the cells. Alternatively or additionally, the term here particularly includes the setting of a stimulus which initiates a cellular process in the course of which the cellular composition of neutrophils is changed so that it causes a mixing of constituents, eg molecules, from different cell compartments (eg granules , Nucleus, cytoplasm, mitochondria, endoplasmic reticulum). Stimulated neutrophilic granulocytes are generally known to the person skilled in the art as well as methods for their in vitro stimulation. An example of a stimulant is phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA (see, eg David A. et al. 2003, Interaction of proteinase 3 with CD11b / CD18 (β2 integrin) on the cell membrane of human neutrophils, Journal of Leukocyte Biology 74, 551-557 ). Another known stimulant are calcium ionophores (see, for example, US Pat Godfrey et al., 1987, Stimulus-Specific Induction of Phospholipid and Arachidonic Acid Metabolism in Human Neutrophils, Journal of Cell Biology 104, 925-932 ). For example, neutrophils also activate when exposed to foreign material, such as in cell culture dishes, for a long time (> 3 hours), or exposed to foreign material such as glass or plastic surfaces for more than 30 minutes after purification. Without wishing to be bound by theory, it is believed that stimulation results in the formation of new structures that can function as antigens (neoantigens). In addition to the type of stimulation and their duration may be relevant. It was observed that calcium ionophores generated new antigens after 30 minutes, which disappeared on prolonged stimulation, possibly due to proteolytic degradation. A person skilled in the art can easily determine by means of routine experiments which stimulation conditions and duration are suitable for a given type of stimulation in order to be able to detect neoantigens.

Unter einer „Körperflüssigkeitsprobe“ wird eine biologische Probe verstanden, die aus einer Körperflüssigkeit, insbesondere einer Wirbeltierkörperflüssigkeit oder menschlichen Körperflüssigkeit, besteht oder diese umfasst. Auch in geeigneter Weise, beispielsweise mit Pufferlösung, verdünnte Proben von Körperflüssigkeiten werden von dem Begriff umfasst. Beispiele für Körperflüssigkeitsproben sind Blutserumproben, auch kurz Serumproben, oder Blutplasmaproben, auch kurz Plasmaproben. Insbesondere handelt es sich um eine Körperflüssigkeitsprobe, die potenziell anti-neutrophile Antikörper enthält. Bevorzugt handelt es sich um eine menschliche Körperflüssigkeitsprobe.A "body fluid sample" is understood to mean a biological sample which consists of or comprises a body fluid, in particular a vertebrate body fluid or human body fluid. Also suitably, for example with buffer solution, diluted samples of body fluids are encompassed by the term. Examples of body fluid samples are blood serum samples, also short serum samples, or blood plasma samples, also short plasma samples. In particular, it is a body fluid sample containing potentially anti-neutrophil antibodies. It is preferably a human body fluid sample.

„Fixiert“ hat hier die in der Histologie verwendete Bedeutung, und bezeichnet die Konservierung von Zellen zum Zweck nachfolgender Untersuchungen."Fixed" here has the meaning used in histology, and refers to the preservation of cells for the purpose of subsequent investigations.

Unter dem Begriff „Neutrophil Extracellular Traps“ oder kurz „NETs“ sind Netzwerke extrazellulärer Fasern, vor allem aus globulären Proteinen und Chromatin, zu verstehen, die von neutrophilen Granulocyten gebildet und ausgestoßen werden, und die Pathogene extrazellulär binden und töten.The term "Neutrophil Extracellular Traps", or "NETs" for short, is understood to mean networks of extracellular fibers, especially globular proteins and chromatin, that are produced and expelled by neutrophilic granulocytes, and that extracellularly bind and kill the pathogens.

Unter dem Begriff „citrullinierte Proteine“ werden posttranslational modifizierte Proteine verstanden, bei denen Arginin-Reste deiminiert sind. Die „Citrullinierung“ ist ein Vorgang, bei dem das Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD, auch Protein-Arginin-Deiminase; EC 3.5.3.15) Arginin in Citrullin umwandelt.The term "citrullinated proteins" is understood to mean posttranslationally modified proteins in which arginine residues have been depleted. "Citrullination" is a process in which the enzyme peptidylarginine deiminase (PAD, also protein arginine deiminase, EC 3.5.3.15) converts arginine into citrulline.

Unter einem „immundiagnostischen Nachweis“ ist ein Nachweis zu verstehen, der auf einer Antigen-Antikörper-Bindung beruht oder eine solche Bindung beinhaltet. Beispielsweise kann ein Antigen direkt nachgewiesen werden, in dem es mit einem entsprechend markierten und das Antigen bindenden primären Antikörper in Bindung gebracht wird. Ein indirekter Nachweis kann erfolgen, indem das Antigen mit einem das Antigen bindenden primären Antikörper in Wechselwirkung gebracht und anschließend ein in geeigneter Weise markierter gegen den primären Antikörper gerichteter sekundärer Antikörper mit dem Komplex aus dem primären Antikörper und dem Antigen in Wechselwirkung gebracht wird. Die Markierung kann beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung sein. Geeignete Antikörper sowie Markierungsmittel und -verfahren sind dem Fachmann bekannt.By "immunodiagnostic detection" is meant detection based on or involving an antigen-antibody binding. For example, an antigen can be detected directly by binding to an appropriately labeled and antigen-binding primary antibody. Indirect detection can be accomplished by interacting the antigen with an antigen-binding primary antibody and then interacting a suitably labeled secondary antibody directed with the primary antibody with the complex of the primary antibody and the antigen. The label may be, for example, a fluorescent label. Suitable antibodies as well as labeling agents and methods are known in the art.

Der Ausdruck „Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe mit stimulierten neutrophilen Granulocyten“ bedeutet insbesondere, dass eine Körperflüssigkeitsprobe mit neutrophilen Granulocyten in Kontakt gebracht wird, wobei der Anteil stimulierter neutrophiler Granulocyten an den neutrophilen Granulocyten mindestens 1%, bevorzugt mindestens 2%, 3%, 4% oder mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, besonders bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80% oder mindestens 90% beträgt.In particular, the phrase "contacting a body fluid sample with stimulated neutrophil granulocytes" means that a body fluid sample is in contact with neutrophilic granulocytes the proportion of stimulated neutrophilic granulocytes on the neutrophilic granulocytes being at least 1%, preferably at least 2%, 3%, 4% or at least 5%, more preferably at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% or 50%, more preferably at least 60%, 70%, 80% or at least 90%.

Der Ausdruck „Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs“ bedeutet, dass eine Körperflüssigkeitsprobe mit NETs in Kontakt gebracht wird, die von stimulierten neutrophilen Granulocyten gebildet wurden. Der Begriff umfasst sowohl das Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe mit isolierten, d.h. von restlichen Zellbestandteilen abgetrennten, und vorzugsweise gereinigten NETs als auch das Inkontaktbringen mit NETs in Gegenwart der Zellen, die die NETs gebildet haben, oder in Gegenwart von stimulierten Zellen, die (noch) keine NETs gebildet haben.The term "contacting a body fluid sample with neutrophil extracellular traps, NETs produced by stimulated neutrophil granulocytes" means that a body fluid sample is contacted with NETs formed from stimulated neutrophilic granulocytes. The term includes both contacting a body fluid sample with isolated, i. NETs separated from remaining cell constituents, and preferably purified NETs, as well as contacting NETs in the presence of the cells which have formed the NETs or in the presence of stimulated cells which have not (yet) formed NETs.

Vorzugsweise erfolgt die Immunmarkierung der an die stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs gebundenen anti-neutrophilen Antikörper bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper. In Frage kommen dem Fachmann bekannte Anti-hIgG-Antikörper, die in geeigneter Weise mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Derartige Antikörper sind bekannt und kommerziell erhältlich. Verwendbar sind beispielsweise sekundäre Antikörper, wie sie bei der im Stand der Technik bekannten ANCA-Diagnostik verwendet werden.Preferably, the immunolabeling of the anti-neutrophilic antibodies bound to the stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs is carried out in the method according to the invention by means of fluorescence-labeled antibodies. In question come to the expert known anti-hIgG antibodies which are suitably labeled with a fluorescent dye. Such antibodies are known and commercially available. For example, secondary antibodies such as those used in the ANCA diagnostics known in the art can be used.

Bevorzugt wird die Körperflüssigkeitsprobe mit in geeigneter Weise gereinigten stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit in geeigneter Weise gereinigten NETs in Kontakt gebracht. Bevorzugt werden naive neutrophile Granulocyten gereinigt und anschließend in vitro stimuliert. Geeignete Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Nauseef et al. 2007, Isolation of Human Neutrophils From Venous Blood, Methods in Molecular Biology 412, 15–20 , beschrieben.Preferably, the body fluid sample is contacted with suitably purified stimulated neutrophil granulocytes and / or appropriately purified NETs. Preferably, naive neutrophilic granulocytes are purified and then stimulated in vitro. Suitable purification processes are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Nauseef et al. 2007, Isolation of Human Neutrophils From Venous Blood, Methods in Molecular Biology 412, 15-20 , described.

Vorzugsweise, jedoch nicht notwendig, wird die Körperflüssigkeitsprobe mit stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs in Kontakt gebracht, die in geeigneter Weise fixiert sind, beispielsweise ethanolfixiert oder formalinfixiert sind. Vorzugsweise werden die stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs vor der Fixierung gereinigt. Geeignete Fixierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Yang P. 1997, Comparative evaluation of unfixed and fixed human neutrophils for determination of antineutrophil cytoplasmic antibodies by indirect immunofluorescence, Journal of Clinical Pathology 50, 677–80 , beschrieben. Besonders bevorzugt sind die stimulierten neutrophilen Granulocyten auf einem geeigneten Träger immobilisiert. Geeignete Träger sind beispielsweise Glasobjektträger, Beads, z.B. Glas- oder Kunststoffbeads, und dergleichen.Preferably, but not necessarily, the body fluid sample is contacted with stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs which are suitably fixed, for example, ethanol-fixed or formalin-fixed. Preferably, the stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs are purified prior to fixation. Suitable fixation methods are known to the person skilled in the art and, for example, in Yang P. 1997, Comparative evaluation of unfixed and fixed human neutrophils for determination of antineutrophil cytoplasmic antibodies by indirect immunofluorescence, Journal of Clinical Pathology 50, 677-80 , described. Most preferably, the stimulated neutrophil granulocytes are immobilized on a suitable carrier. Suitable carriers are, for example, glass slides, beads, eg glass or plastic beads, and the like.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden stimulierte neutrophile Granulocyten eingesetzt, die im Vergleich zu naiven, d.h. unstimulierten, neutrophilen Granulocyten keine oder eine nur unwesentlich erhöhte Bildung von citrullinierten Proteinen aufweisen. Unter einer „unwesentlich erhöhten Bildung von citrullinierten Proteinen“ wird eine Bildung von citrullinierten Proteinen verstanden, die nicht mehr als das 5fache, 4fache, 3fache oder 2fache, vorzugsweise nicht mehr als das 1,5fache der bei naiven neutrophilen Granulocyten zu beobachtenden Bildung von citrullinierten Proteinen beträgt. Die Formulierung, wonach die stimulierten neutrophilen Granulocyten „im Vergleich zu unstimulierten neutrophilen Granulocyten keine oder eine nur unwesentlich erhöhte Bildung von citrullinierten Proteinen zeigen“ kann auch bedeuten, dass die Aktivität des Enzyms Peptidylarginin-Deiminase (PAD), insbesondere der PAD4, nicht mehr als das 5fache, 4fache, 3fache oder 2fache, vorzugsweise nicht mehr als das 1,5fache der bei naiven neutrophilen Granulocyten zu beobachtenden Aktivität erhöht ist und/oder dass lediglich bei einem geringen Teil der neutrophilen Granulocyten im Vergleich zu unstimulierten neutrophilen Granulocyten verstärkt citrullinierte Proteine gebildet werden, bevorzugt bei weniger als 25 %, weiter bevorzugt bei weniger als 20 %, 15 %, 10 % oder weniger als 5 %, und besonders bevorzugt bei weniger als 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 % oder weniger als 0,5 % der Zellen.In a preferred embodiment of the method according to the invention, stimulated neutrophilic granulocytes are used which, in comparison with naive, i. unstimulated, neutrophilic granulocytes have no or only an insignificantly increased formation of citrullinated proteins. By an "insignificantly increased formation of citrullinated proteins" is meant a formation of citrullinated proteins that are not more than 5 times, 4 times, 3 times or 2 times, preferably not more than 1.5 times the formation of citrullinated proteins observed in naive neutrophilic granulocytes is. The formulation according to which the stimulated neutrophilic granulocytes "show no or only an insignificantly increased formation of citrullinated proteins compared to unstimulated neutrophilic granulocytes" can also mean that the activity of the enzyme peptidylarginine deiminase (PAD), in particular PAD4, does not exceed 5 times, 4 times, 3 times or 2 times, preferably not more than 1.5 times the activity observed in naive neutrophilic granulocytes is increased and / or that only a small part of the neutrophilic granulocytes in comparison to unstimulated neutrophilic granulocytes increasingly citrullinated proteins are formed , preferably less than 25%, more preferably less than 20%, 15%, 10% or less than 5%, and most preferably less than 2.5%, 2%, 1.5%, 1% or less than 0.5% of the cells.

Weiter bevorzugt ist, dass, alternativ oder zusätzlich, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stimulierte neutrophile Granulocyten eingesetzt werden, die (noch) keine oder eine nur unwesentliche Bildung von NETs zeigen. Unter einer „unwesentlichen Bildung von NETs“ wird hier verstanden, dass lediglich bei einem geringen Teil der in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten neutrophilen Granulocyten NETs gebildet sind, bevorzugt bei weniger als 25 %, weiter bevorzugt bei weniger als 20 %, 15 %, 10 % oder weniger als 5 %, und besonders bevorzugt bei weniger als 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 % oder weniger als 0,5 %. Um die Bildung von NETs bei stimulierten Granulocyten zu vermindern oder zu vermeiden, kann die Stimulierung beispielsweise nach einer geeigneten Zeitdauer, d.h. einer Zeitdauer, bei deren Ablauf noch keine NET-Bildung zu beobachten ist, so abgebrochen werden, dass die stimulierten Zellen im Wesentlichen den Stimulierungszustand zum Zeitpunkt des Abbruchs beibehalten. Der Abbruch kann beispielsweise durch geeignete und dem Fachmann bekannte Fixierungsverfahren, beispielsweise durch Ethanol- oder Formalinfixierung, erfolgen.It is further preferred that, alternatively or additionally, in the method according to the invention stimulated neutrophilic granulocytes are used which (still) show no or only insignificant formation of NETs. By "insignificant formation of NETs" is meant here that only in a small part of the neutrophilic granulocytes used in the method according to the invention are NETs formed, preferably at less than 25%, more preferably at less than 20%, 15%, 10%. or less than 5%, and more preferably less than 2.5%, 2%, 1.5%, 1% or less than 0.5%. In order to reduce or avoid the formation of NETs in stimulated granulocytes, for example, after a suitable period of time, ie, a period of time at which the stimulation proceeds, no stimulation of NET can occur observe, so that the stimulated cells substantially maintain the stimulation state at the time of termination. The termination can be carried out, for example, by suitable fixing methods known to the person skilled in the art, for example by ethanol or formalin fixation.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die neutrophilen Granulocyten durch Inkontaktbringen mit Phorbol-12-myristat-13-acetat, PMA, beispielsweise in einer geeigneten Konzentration von 100 nM, stimuliert. Eine Stimulierung ohne dadurch induzierte wesentliche Bildung von citrullinierten Proteinen und/oder NETs kann beispielsweise mittels Inkontaktbringen von unstimulierten neutrophilen Granulocyten mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in einer Konzentration von 100 nM bei 37 °C über eine Zeitdauer von mindestens 30 Minuten und weniger als 180 Minuten, beispielsweise 120 Minuten, erfolgen.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the neutrophilic granulocytes are stimulated by contacting them with phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA, for example at a suitable concentration of 100 nM. Stimulation without substantially inducing substantial formation of citrullinated proteins and / or NETs can be achieved, for example, by contacting unstimulated neutrophil granulocytes with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) at a concentration of 100 nM at 37 ° C for a period of at least 30 minutes and less than 180 minutes, for example 120 minutes.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Kit zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, wobei das Kit

  • a. mindestens einen Behälter oder einen Träger mit stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs, und
  • b. mindestens einen gegen anti-neutrophile Antikörper gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper umfasst.
In a further aspect, the invention also relates to a kit for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, wherein the kit
  • a. at least one container or carrier with stimulated neutrophilic granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs, produced by stimulated neutrophilic granulocytes
  • b. at least one anti-neutrophil antibody directed fluorescently labeled antibody.

Bei dem Behälter kann es sich beispielsweise um einen Behälter aus Glas oder Kunststoff handeln, beispielsweise ein Reagenzglas, Reagenzröhrchen, Mikroreaktionsgefäß oder dergleichen, wie sie im Stand der Technik im diagnostischen Bereich häufig verwendet werden. Die stimulierten neutrophilen Granulocyten können in einer geeigneten Puffer- oder Fixierungslösung vorliegen. In dieser Form sind sie beispielsweise für die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie geeignet. Alternativ oder gegebenenfalls auch zusätzlich können die stimulierten neutrophilen Granulocyten auf einem geeigneten Träger, beispielsweise einem Glas- oder Kunststoffobjektträger, Glas- oder Kunststoffbeads, immobilisiert und fixiert sein. NETs sind ebenfalls vorzugsweise auf einem geeigneten Träger, beispielsweise einem Glas- oder Kunststoffobjektträger, Glas- oder Kunststoffbeads, immobilisiert, wobei stimulierte neutrophile Granulocyten und NETs auf getrennten Trägern, getrennt auf einem gemeinsamen Träger oder gemischt auf einem gemeinsamen Träger immobilisiert sein können. Bei den stimulierten neutrophilen Granulocyten kann es sich auch um derart stimulierte neutrophile Granulocyten handeln, dass sie im Vergleich zu unstimulierten neutrophilen Granulocyten keine oder eine nur unwesentlich erhöhte Bildung von citrullinierten Proteinen aufweisen und/oder keine oder eine nur unwesentliche Bildung von Neutrophil Extracellular Traps, NETs, zeigen.The container may be, for example, a container made of glass or plastic, for example a test tube, test tube, microreaction vessel or the like, as frequently used in the diagnostic field in the prior art. The stimulated neutrophilic granulocytes may be in a suitable buffer or fixative solution. In this form, they are suitable, for example, for fluorescence-based flow cytometry. Alternatively or optionally in addition, the stimulated neutrophilic granulocytes can be immobilized and fixed on a suitable carrier, for example a glass or plastic microscope slide, glass or plastic beads. NETs are also preferably immobilized on a suitable support, for example a glass or plastic slide, glass or plastic beads, wherein stimulated neutrophils and NETs may be immobilized on separate supports, separately on a common support or mixed on a common support. The stimulated neutrophilic granulocytes may also be neutrophil granulocytes stimulated in such a way that they have no or only insignificantly increased formation of citrullinated proteins compared to unstimulated neutrophilic granulocytes and / or no or only insignificant formation of neutrophil extracellular traps, NETs , demonstrate.

Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Kit zusätzlich geeignete Wasch- und oder Pufferlösungen. Solche Lösungen sind dem Fachmann bekannt.The kit according to the invention preferably additionally comprises suitable washing and or buffer solutions. Such solutions are known to the person skilled in the art.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung stimulierter neutrophiler Granulocyten und/oder von Neutrophil Extracellular Traps, NETs, von stimulierten neutrophilen Granulocyten zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, bevorzugt in einer Körperflüssigkeitsprobe, beispielsweise einer Plasma- oder Serumprobe einer Person mit einer Autoimmunerkrankung. Bei der Autoimmunerkrankung kann es sich um eine ANCA-assoziierte Vaskulitis handeln. Bei den stimulierten neutrophilen Granulocyten kann es sich beispielsweise um aus einem menschlichen oder Wirbeltierkörper isolierte stimulierte neutrophile Granulocyten handeln oder um neutrophile Granulocyten, die in vitro durch geeignete Stimulierung aus isolierten naiven neutrophilen Granulocyten hergestellt wurden.In a further aspect, the present invention also relates to the use of stimulated neutrophilic granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs, stimulated neutrophilic granulocytes for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, preferably in a body fluid sample, such as a person's plasma or serum sample an autoimmune disease. The autoimmune disease can be an ANCA-associated vasculitis. The stimulated neutrophilic granulocytes may be, for example, stimulated neutrophilic granulocytes isolated from a human or vertebrate body, or neutrophil granulocytes produced in vitro by appropriate stimulation from isolated naive neutrophilic granulocytes.

Die Erfindung wird im Folgenden rein zu Veranschaulichungszwecken anhand von Ausführungsbeispielen und der angehängten Figuren näher erläutert.The invention is explained in more detail below purely for illustrative purposes with reference to exemplary embodiments and the appended figures.

1. Zeitlicher Verlauf der ASNA-Antigen-Bildung bei stimulierten Neutrophilen. Gereinigte Neutrophile wurden mit PMA stimuliert, mit Patientenseren inkubiert und mittels indirekter Immunfluoreszenz (IIF) analysiert. (A) Unbehandelte Neutrophile, (B–D) Neutrophile, die für 60 Minuten (A), 120 Minuten (B) und 180 Minuten (D) mit PMA stimuliert wurden. (A–D) IIF von menschlichem IgG (hIgG); (A’–D’) DNA-Färbung mittels DAPI; Die gezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Der Balken entspricht 50 µm. 1 , Time course of ASNA antigen production in stimulated neutrophils. Purified neutrophils were stimulated with PMA, incubated with patient sera and analyzed by indirect immunofluorescence (IIF). (A) Untreated neutrophils, (B-D) neutrophils stimulated with PMA for 60 minutes (A), 120 minutes (B), and 180 minutes (D). (A-D) IIF of human IgG (hIgG); (A'-D ') DNA staining by DAPI; The data shown are representative of three independent experiments. The bar corresponds to 50 μm.

2. Repräsentative ASNA-Färbungsmuster. (A) Cytoplasmatische Färbung bei Neutrophilen, die für 30 Minuten mit PMA stimuliert wurden (C-ANSA). (B) Ganzzell-Färbung bei Neutrophilen, die für 120 Minuten mit PMA stimuliert wurden (W-ASNA; W = wholistic, engl. ganzheitlich). (C) Färbung von NETs, die durch Neutrophile nach 180 Minuten PMA-Aktivierung freigesetzt wurden (X-ASNA; x von eXtrazellulär). Der Balken entspricht 10 µm. 2 , Representative ASNA staining patterns. (A) Cytoplasmic staining for neutrophils stimulated with PMA for 30 minutes (C-ANSA). (B) Whole cell staining for neutrophils stimulated with PMA for 120 minutes (W-ASNA, W = wholistic, holistic). (C) staining of NETs released by neutrophils after 180 minutes of PMA activation (X-ASNA, x of eXtracellular). The bar corresponds to 10 μm.

3. Bildung von ASNA-Antigenen bei kultivierten Neutrophilen. IIF von Neutrophilen, die für 18 Stunden kultiviert wurden. (A) DNA-Färbung durch DAPI. (B) Färbung von Human-IgG. Der Balken entspricht 50 µm. 3 , Formation of ASNA antigens in cultured neutrophils. IIF of neutrophils cultured for 18 hours. (A) DNA staining by DAPI. (B) staining of human IgG. The bar corresponds to 50 μm.

Ausführungsbeispiel:Embodiment:

Patientenprobenpatient samples

Es wurden Seren von 293 anonymisierten Patienten, welche an das Diagnostikzentrum des Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE), Hamburg, Deutschland, geschickt wurden, um auf ANA (antinukleäre Antikörper) oder ANCA getestet zu werden, gesammelt. Es wurden ausschließlich Seren verwendet, die anderenfalls verworfen worden wären. Sera from 293 anonymized patients sent to the Diagnostic Center of the University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE), Hamburg, Germany, were collected to be tested for ANA (antinuclear antibodies) or ANCA. Only serums were used, which would otherwise have been discarded.

Neutrophilen-IsolierungNeutrophil isolation

Peripheres Blut wurde antikoaguliert mit Ethylendiamintetraessigsäure (K2 EDTA Monovette, Sarstedt) und Neutrophile wurden isoliert wie bereits beschrieben ( Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Wahn V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. The Journal of cell biology. 2007; 176: 231–41. 10.1083/jcb.200606027 .) Kurz zusammengefasst wurde Blut auf Histopaque 1119 (Sigma Aldrich) geschichtet. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 800 g, wurde die neutrophilenreiche Schicht gesammelt. Die Zellen wurden mit „Hanks-buffered salt solution“ (HBSS –, Life technologies), die mit 5mM EDTA und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich) versetzt war, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden durch einen diskontinuierlichen Percoll-Gradienten (GE Healthcare) weiter fraktioniert. Nach Zentrifugierung bei 800g für 20 Minuten wurde die Schicht mit Neutrophilen gesammelt und in HBSS– mit 0,1% BSA gewaschen.Peripheral blood was anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (K2 EDTA Monovette, Sarstedt) and neutrophils were isolated as described ( Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Delusion V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 2007; 176: 231-41. 10.1083 / jcb.200606027 .) Briefly, blood was layered on Histopaque 1119 (Sigma Aldrich). After centrifugation for 20 minutes at 800 g, the neutrophil-rich layer was collected. Cells were washed with Hanks-buffered salt solution (HBSS) supplemented with 5 mM EDTA and 0.1% bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich). The washed cells were further fractionated by a discontinuous Percoll gradient (GE Healthcare). After centrifugation at 800g for 20 minutes, the layer was collected with neutrophils and washed in HBSS with 0.1% BSA.

Alle Vorgänge erfolgten bei Raumtemperatur. Die Neutrophilen-Lebensfähigkeit betrug > 98% wie durch eine Trypan Blau (Sigma-Aldrich) Färbung festgestellt wurde. All operations were at room temperature. Neutrophil viability was> 98% as determined by Trypan Blue (Sigma-Aldrich) staining.

Neutrophilen-StimulierungNeutrophil stimulation

Neutrophile (2 × 105 Zellen/Well) wurden in sterile Zellkulturplatten ausgesät, welche mit 0,0001% Poly-L-Lysine (Sigma Aldrich) vorbehandelt wurden, um die Zelladhäsion zu verstärken. Die Platten wurden für 15 Minuten bei 37°C inkubiert, damit die Zellen zum Boden des Wells absinken. Neutrophile wurden dann mit 100 nM PMA (Sigma Aldrich) stimuliert und bis zu 180 Minuten bei 37°C inkubiert. Alternativ wurden Zellen unbehandelt bis zu 18 Stunden bei 37°C belassen. Die Neutrophilen-Stimulierung wurde durch Fixierung mit 2% Paraformaldehyd-Lösung (Sigma Aldrich) gestoppt. Die Platten wurden bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.Neutrophils (2 x 10 5 cells / well) were seeded into sterile cell culture plates pretreated with 0.0001% poly-L-lysine (Sigma Aldrich) to enhance cell adhesion. The plates were incubated for 15 minutes at 37 ° C to allow the cells to sink to the bottom of the well. Neutrophils were then stimulated with 100 nM PMA (Sigma Aldrich) and incubated at 37 ° C for up to 180 minutes. Alternatively, cells were left untreated for up to 18 hours at 37 ° C. Neutrophil stimulation was stopped by fixation with 2% paraformaldehyde solution (Sigma Aldrich). The plates were stored at 4 ° C until further use.

Indirekte Immunfluoreszenz (IIF)Indirect immunofluorescence (IIF)

Fixierte Neutrophile wurden 3-mal mit PBS mit 0,05% Tween (PBST) gewaschen. Unspezifische Bindungen der Antikörper wurde reduziert durch Vorbehandlung mit Blocking-Lösung, welche 10% Ziegenserum (Life Technologies), 5% Fischgelatine (Sigma Aldrich) und 1% BSA enthielt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gelassen wurde. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBST wurden Neutrophile mit Patientenseren in einer Verdünnung von 1:80 in PBST inkubiert. Ein Kaninchen-anti-Human-Myeloperoxidase-Antikörper (Dako) wurde als Positivkontrolle mit einer Konzentration von 1µg/ml in PBST verwendet. Patientenseren wurden 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, gefolgt von 3maligem Waschen mit PBST. Antikörper, welche an Neutrophile gebunden waren, wurden durch Hinzufügen von 7,5 µg/ml Alexa-Fluor-555-markierter polyklonaler Antikörper gegen humanes IgG bzw. Kaninchen-IgG (Life Technologies) für 1 Stunde bei Raumtemperatur gemessen. Danach wurden die Zellen mit 2 µM DAPI (Life Technologies) für 5 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Zellen wurden daraufhin 3-mal mit PBST gewaschen, um ungebundene Antikörper und DAPI zu entfernen. Fluoreszenzmarkierte Neutrophile wurden durch ein Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Apotome 200) fotografiert.Fixed neutrophils were washed 3 times with PBS with 0.05% Tween (PBST). Unspecific binding of the antibodies was reduced by pretreatment with blocking solution containing 10% goat serum (Life Technologies), 5% fish gelatin (Sigma Aldrich) and 1% BSA and left for 30 minutes at room temperature. After another wash with PBST, neutrophils were incubated with patient sera at a 1:80 dilution in PBST. A rabbit anti-human myeloperoxidase antibody (Dako) was used as a positive control at a concentration of 1 μg / ml in PBST. Patient sera were incubated for 1 hour at 37 ° C, followed by washing 3 times with PBST. Antibodies bound to neutrophils were measured by adding 7.5 μg / ml Alexa Fluor 555-labeled polyclonal antibody to human IgG or rabbit IgG (Life Technologies) for 1 hour at room temperature. Thereafter, the cells were stained with 2 μM DAPI (Life Technologies) for 5 minutes at room temperature. Cells were then washed 3 times with PBST to remove unbound antibody and DAPI. Fluorescence-labeled neutrophils were photographed by a fluorescence microscope (Zeiss Apotome 200).

ANCA-AnalyseANCA analysis

Patientenseren wurden 1:20 verdünnt. ANCA wurden quantifiziert durch kommerziell erhältliche Immundiagnostik-Kits für ANCA-IIF, anti-MPO- und anti-PR3-ELISA (alle Euroimmun) wie vom Hersteller angegeben.Patient sera were diluted 1:20. ANCA were quantified by commercially available immunodiagnostic kits for ANCA-IIF, anti-MPO and anti-PR3 ELISA (all Euroimmun) as indicated by the manufacturer.

Ergebnisse Results

Patienten mit Verdacht auf Autoimmunerkrankungen besitzen Antikörper gegen stimulierte Neutrophile. Patients with suspected autoimmune diseases have antibodies to stimulated neutrophils.

Es wurden 293 Patientenseren auf Vorhandensein von ASNA („anti stimulated nucleophile antibodies“, gegen stimulierte Nucleophile gerichtete Antikörper) gescreent. Alle Seren wurden auf ANA (n = 269) und/oder ANCA (n = 24) aufgrund eine angenommenen Autoimmunerkrankung gemessen. Die Generierung von ASNA-Antigenen wurde durch Stimulierung von gereinigten Neutrophilen mit PMA für 120 Minuten induziert. PMA ist einer der potentesten Aktivatoren von Neutrophilen und induziert Adhäsion, Degranulierung, Phagocytose und NET-Bildung in Neutrophilen. Zusätzlich aktiviert PMA eine Signalkaskade, welche zu multiplen intrazellulären Änderungen führt, einschließlich der Aktivierung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und Translokation von granulären Enzymen in den Nucleus ( Papayannopoulos V, Metzler KD, Hakkim A, Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of cell biology. 2010; 191: 677–91. 10.1083/jcb.201006052 ; Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Wahn V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. The Journal of cell biology. 2007; 176: 231–41. 10.1083/jcb.200606027 ). Diese Prozesse können potentiell Neo-Autoantigene generieren, indem sie Neutrophilen-Komponenten modifizieren oder sich neue Komplexe bzw. Strukturen formieren. Tabelle 1: Zusammenfassung des ASNA-Screenings in Seren von Patienten mit vermuteter Autoimmunerkrankung. +/– bedeutet positive oder negative Ergebnisse der ANA, ANCA oder ASNA-Analyse. Kohorte n ASNA n ANA + 207 → + 23 – 62 → + 5 ANCA + 10 → + 2 – 14 → + 2 Gesamt + 217 → + 25 – 76 → + 7 293 patient sera were screened for the presence of ASNA ("anti-stimulated nucleophile antibodies" antibodies directed against stimulated nucleophiles). All sera were measured for ANA (n = 269) and / or ANCA (n = 24) for an assumed autoimmune disease. The generation of ASNA antigens was induced by stimulation of purified neutrophils with PMA for 120 minutes. PMA is one of the most potent activators of neutrophils and induces adhesion, degranulation, phagocytosis and NET formation in neutrophils. In addition, PMA activates a signaling cascade leading to multiple intracellular changes, including activation of reactive oxygen species production and translocation of granular enzymes into the nucleus (US Pat. Papayannopoulos V, Metzler KD, Hakkim A, Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 2010; 191: 677-91. 10.1083 / jcb.201006052 ; Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Delusion V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 2007; 176: 231-41. 10.1083 / jcb.200606027 ). These processes can potentially generate neo-autoantigens by modifying neutrophil components or forming new complexes or structures. Table 1: Summary of ASNA screening in sera from patients with suspected autoimmune disease. +/- means positive or negative results of ANA, ANCA or ASNA analysis. cohort n ASNA n ANA + 207 → + 23 - 62 → + 5 ANCA + 10 → + 2 - 14 → + 2 total + 217 → + 25 - 76 → + 7

Es wurde ein positives Signal im IIF von stimulierten Neutrophilen bei 32 Patienten beobachtet (Tabelle 1), was andeutet, dass ca. 10% der Patienten mit Verdacht auf eine Autoimmunerkrankung ASNA besitzen. ASNA wurden zusätzlich in 5 bzw. 2 Patienten festgestellt, welche für ANA bzw. ANCA negativ waren. Zusätzlich wurden 10 doppelt ASNA- und ANA-positive Seren mit kommerziell erhältlichen diagnostischen Kits untersucht. Alle 10 Seren waren negativ im ANCA-IIF-Test und hatten keine messbaren anti-MPO- oder anti-PR3 Antikörper in den jeweiligen ANCA-ELISA. Die Kohorte enthielt 7 Patienten mit einer bestätigten ANCA-negativen Vaskulitis, und 2 dieser Patienten zeigten ein ASNA-positives Signal in der IIF. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass ASNA unabhängig von ANA oder ANCA sind und daher einen neuen diagnostischen Parameter darstellen. Zusätzlich können ASNA als weiterer diagnostischer Parameter bei ANA- und ANCA-negativen Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden. A positive signal was observed in the IIF of stimulated neutrophils in 32 patients (Table 1), suggesting that approximately 10% of patients with autoimmune disease suspected had ASNA. ASNA were additionally detected in 5 and 2 patients, respectively, who were negative for ANA and ANCA, respectively. In addition, 10 double ASNA and ANA positive sera were tested with commercially available diagnostic kits. All 10 sera were negative in the ANCA IIF test and had no measurable anti-MPO or anti-PR3 antibodies in the respective ANCA ELISA. The cohort contained 7 patients with confirmed ANCA-negative vasculitis, and 2 of these patients showed an ASNA-positive signal in the IIF. In conclusion, ASNA are independent of ANA or ANCA and therefore represent a new diagnostic parameter. In addition, ASNA can be used as a further diagnostic parameter in ANA- and ANCA-negative autoimmune diseases.

ASNA-Antigene bilden sich in aktivierten Neutrophilen im Laufe der ZeitASNA antigens are formed in activated neutrophils over time

Es wurde die Kinetik der Autoantigen-Generierung in stimulierten Neutrophilen untersucht. Aufgereinigte Neutrophile wurden unterschiedlich lang mit PMA (1) stimuliert. Nach Fixierung wurden stimulierte Neutrophile mit ASNA-positiven Seren aus unserer Patientenkohorte inkubiert und mittels IIF analysiert. Patienten-IgG (humanes IgG, hIgG in 1) band nicht an unstimulierte Neutrophile (1A), welches anzeigt, dass naive Neutrophile ASNA-Antigene nicht exprimieren oder exponieren. Die Bindung von ASNA wurde bei Neutrophilen sichtbar, welche länger als 60 Minuten mit PMA aktiviert waren (1B). Das Signal verstärkte sich in Zellen, welche für 120 Minuten (1C) und 180 Minuten (1D) aktiviert waren. Die Daten zeigen, dass die Generierung der ASNA-Antigene abhängig von der Dauer der Stimulierung ist. The kinetics of autoantigen generation in stimulated neutrophils were investigated. Purified neutrophils were different in duration with PMA ( 1 ). After fixation, stimulated neutrophils were incubated with ASNA-positive sera from our patient cohort and analyzed by IIF. Patient IgG (human IgG, hIgG in 1 ) did not bind to unstimulated neutrophils ( 1A ) indicating that naive neutrophils do not express or expose ASNA antigens. The binding of ASNA was seen in neutrophils that were activated with PMA for more than 60 minutes ( 1B ). The signal amplified in cells which were exposed for 120 minutes ( 1C ) and 180 minutes ( 1D ) were activated. The data show that the generation of ASNA antigens is dependent on the duration of stimulation.

Neutrophile Stimulierung produziert individuelle ASNA-FärbemusterNeutrophil stimulation produces individual ASNA staining patterns

Eine detaillierte mikroskopische Analyse der ASNA-Färbungen zeigte merkliche Unterschiede in den Färbemustern (2). Ausgewählte Seren färbten das Cytoplasma der Neutrophilen, welche für 60 Minuten mit PMA aktiviert wurden (2A). Diese Zellen sind noch lebendig und haben einen intakten Zellkern. Die cytoplasmatische Färbung ist gepunktet, welches vermuten lässt, dass das Antigen sich in Vesikeln in den Zellen befindet. Analog zu der ANCA-Nomenklatur wird dieses Färbemuster mit C-ASNA bezeichnet. Zusätzlich konnte eine Färbung der gesamten Zelle beobachtet werden, wenn Neutrophile für mindestens 120 Minuten stimuliert waren (2B). In diesem Zustand ist der Zellkern aufgelöst und granuläre und nukleäre Zellkomponenten sind innerhalb des noch lebendigen Neutrophilen vermischt ( Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Wahn V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. The Journal of cell biology. 2007; 176: 231–41. 10.1083/jcb.200606027 ). Dieses Muster wird als W-ASNA bezeichnet, da es sich um ein ganzheitliches (engl.: wholistic = ganzheitlich) Färbemuster innerhalb der Zelle handelt. Zusätzlich wurde die Färbung von NETs in einigen Seren beobachtet (2C). NETs werden bei Neutrophilen gebildet, welche für 180 Minuten mit PMA stimuliert wurden. Das Färbemuster ist im extrazellulären Raum lokalisiert und wird daher als X-ASNA bezeichnet. Anti-NETs-Antikörper (X-ASNA) wurden nur in Patientenseren beobachtet, welche einen positiven P-ANCA aufwiesen. Diese Daten weisen darauf hin, dass NETs benutzt werden können, um zwischen P- und C-ANCA bei Patienten zu differenzieren, die zusätzlich ANA-positiv sind.A detailed microscopic analysis of the ASNA stains revealed marked differences in the staining patterns ( 2 ). Selected sera stained the cytoplasm of the neutrophils which were activated with PMA for 60 minutes ( 2A ). These cells are still alive and have an intact nucleus. The cytoplasmic staining is dotted, suggesting that the antigen is in vesicles in the cells. Analogous to the ANCA nomenclature, this staining pattern is designated C-ASNA. In addition, staining of the entire cell could be observed when neutrophils were stimulated for at least 120 minutes ( 2 B ). In this state, the nucleus is dissolved and granular and nuclear cell components are mixed within the still living neutrophil ( Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, Hurwitz R, Schulze I, Delusion V, Weinrauch Y, Brinkmann V, Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 2007; 176: 231-41. 10.1083 / jcb.200606027 ). This pattern is referred to as W-ASNA because it is a wholistic staining pattern within the cell. In addition, the staining of NETs was observed in some sera ( 2C ). NETs are produced on neutrophils stimulated with PMA for 180 minutes. The staining pattern is located in the extracellular space and is therefore referred to as X-ASNA. Anti-NETs antibodies (X-ASNA) were only observed in patient sera that had a positive P-ANCA. These data indicate that NETs can be used to differentiate between P- and C-ANCA in patients who are additionally ANA-positive.

Neutrophile generieren ASNA-Antigene spontanNeutrophils spontaneously generate ASNA antigens

Im Folgenden wurde untersucht, ob ASNA-Antigene nur durch Stimulierung mit PMA erzeugt werden. Hierfür wurde die Reaktivität der Patientenseren mit unbehandelten Neutrophilen getestet, welche steril unter Gewebekulturbedingungen für 18 Stunden inkubiert wurden (3). Neutrophile sind kurzlebige Zellen, welche empfindlich gegenüber Stimulierung durch fremde Komponenten sind. So konnte beobachtet werden, dass unter den ausgewählten experimentellen Bedingungen auch eine Translokation der granulären Komponenten in den Zellkern und eine Auflösung der Kernhülle stattfindet. In diesem Zusammenhang wurde eine ganzheitliche Färbung der Neutrophilen von Myeloperoxidase MPO (nicht dargestellt) und DNA (3A) gefunden. Autoantikörper von Patientenseren reagierten mit diesen Neutrophilen (3B). Interessanterweise war das ASNA-Färbemuster hier dem W-ASNA-Muster der PMA-aktivierten Neutrophilen sehr ähnlich (3B). Es wird angenommen, dass ein Teil der ASNA Antigene erkennt, welche durch die intrazelluläre Vermischung von Komponenten aus unterschiedlichen Zellkompartimenten entstehen. Daraus kann geschlossen werden, dass multiple Stimuli, einschließlich einer langen Exposition auf fremden Oberflächen wie z.B. Gewebskulturplatten, eine Generierung von neo-Antigenen in Neutrophilen bewirken können. In the following, it was investigated whether ASNA antigens are produced only by stimulation with PMA. For this purpose, the reactivity of the patient sera with untreated neutrophils was tested, which were incubated under sterile tissue culture conditions for 18 hours ( 3 ). Neutrophils are short-lived cells that are sensitive to stimulation by foreign components. Thus it could be observed that under the selected experimental conditions a translocation of the granular components into the nucleus and a dissolution of the nuclear envelope takes place. In this context, a holistic staining of the neutrophils of myeloperoxidase MPO (not shown) and DNA ( 3A ) found. Autoantibodies from patient sera reacted with these neutrophils ( 3B ). Interestingly, the ASNA staining pattern here was very similar to the W-ASNA pattern of PMA-activated neutrophils ( 3B ). It is believed that some of the ASNA recognize antigens that result from the intracellular mixing of components from different cell compartments. It can be concluded that multiple stimuli, including prolonged exposure to foreign surfaces such as tissue culture plates, can cause neo-antigens to be generated in neutrophils.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die erhaltenen Versuchsergebnisse darauf hindeuten, dass die Stimulierung von Neutrophilen zu intrazellulären Veränderungen führt, welche Neo-Antigene generieren, die durch Autoantikörper gebunden werden können. Diese Antikörper können als Anti-stimulierte Neutrophile Antikörper (ASNA) bezeichnet werden. ASNA, welche an stimulierten Neutrophilen binden, führen zu einem cytoplasmatischen (C-ASNA), ganzheitlichen (= wholistic) (W-ASNA) oder extrazellulären (X-ASNA) Färbemuster. Die Generierung von ASNA-Antigenen ist zeitabhängig, jedoch nicht abhängig von einem bestimmten Stimulus. Etwa 10% der untersuchten Patienten mit Verdacht auf eine Autoimmunerkrankung wiesen ASNA auf. X-ASNA scheinen mit P-ANCA verknüpft zu sein, was bei der Differenzierung zwischen ANCA-positiven Seren hilfreich sein kann. Darüber hinaus wurden ASNA bei Patienten festgestellt, die in der bisher eingesetzten ANCA- und ANA-Diagnostik negativ waren. Die vorliegende Erfindung kann daher die Diagnostik von Autoimmunkrankheiten, die mit Neutrophilen assoziiert sind, verbessern.In summary, the experimental results obtained suggest that stimulation of neutrophils results in intracellular changes that generate neo-antigens that can be bound by autoantibodies. These antibodies can be referred to as anti-stimulated neutrophil antibodies (ASNA). ASNAs that bind to stimulated neutrophils result in a cytoplasmic (C-ASNA), wholistic (W-ASNA) or extracellular (X-ASNA) staining pattern. The generation of ASNA antigens is time-dependent but not dependent on a particular stimulus. About 10% of the patients with autoimmune disease suspected had ASNA. X-ASNA appear to be linked to P-ANCA, which may be helpful in differentiating between ANCA-positive sera. In addition, ASNA was detected in patients who were negative in the previous ANCA and ANA diagnostics. The present invention can therefore improve the diagnosis of autoimmune diseases associated with neutrophils.

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Claims (12)

Verfahren zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, umfassend die folgenden Schritte: a. Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe mit aa) stimulierten neutrophilen Granulocyten unter Bedingungen, die eine Bindung von in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltenen anti-neutrophilen Antikörpern an die stimulierten neutrophilen Granulocyten erlaubt, und/oder ab) mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs, unter Bedingungen, die eine Bindung von in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltenen anti-neutrophilen Antikörpern an die NETs erlaubt, und b. Immunmarkieren von an die stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs gebundenen anti-neutrophilen Antikörpern.Method for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, comprising the following steps: a. Contacting a body fluid sample with aa) stimulated neutrophilic granulocytes under conditions permitting binding of anti-neutrophilic antibodies contained in the body fluid sample to the stimulated neutrophilic granulocytes, and / or with neutrophil extracellular traps, NETs produced by stimulated neutrophilic granulocytes, under conditions which allows binding of anti-neutrophilic antibodies contained in the body fluid sample to the NETs, and b. Immuno-labeling anti-neutrophil antibodies bound to the stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Immunmarkierung der an die stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder NETs gebundenen anti-neutrophilen Antikörper mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper erfolgt.A method according to claim 1, wherein the immunolabeling of the anti-neutrophilic antibodies bound to the stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs is carried out by means of fluorescently labeled antibodies. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Körperflüssigkeitsprobe Blutplasma oder Blutserum ist.A method according to any one of the preceding claims, wherein the body fluid sample is blood plasma or blood serum. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Körperflüssigkeitsprobe mit vor der Stimulierung gereinigten stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit gereinigten NETs in Kontakt gebracht wird.A method according to any one of the preceding claims, wherein the body fluid sample is contacted with pre-stimulated stimulated neutrophilic granulocytes and / or with purified NETs. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Körperflüssigkeitsprobe mit fixierten stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit fixierten gereinigten NETs in Kontakt gebracht wird.A method according to any one of the preceding claims, wherein the body fluid sample is contacted with fixed stimulated neutrophil granulocytes and / or fixed, purified NETs. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Körperflüssigkeitsprobe mit stimulierten neutrophilen Granulocyten in Kontakt gebracht wird, und wobei die stimulierten neutrophilen Granulocyten im Vergleich zu unstimulierten neutrophilen Granulocyten keine oder eine nur unwesentlich erhöhte Bildung von citrullinierten Proteinen aufweisen und/oder keine oder eine nur unwesentliche Bildung von Neutrophil Extracellular Traps, NETs, zeigen.A method according to any one of the preceding claims wherein a body fluid sample is contacted with stimulated neutrophil granulocytes, and wherein the stimulated neutrophilic granulocytes have no or slightly increased citrullinated protein formation compared to unstimulated neutrophilic granulocytes and / or none or none at all Formation of Neutrophil Extracellular Traps, NETs, show. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die neutrophilen Granulocyten durch Inkontaktbringen der neutrophilen Granulocyten mit Phorbol-12-myristat-13-acetat, PMA, stimuliert sind.A method according to any one of the preceding claims, wherein the neutrophils are stimulated by contacting the neutrophils with phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA. Kit zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, umfassend a. mindestens einen Behälter oder einen Träger mit stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit von stimulierten neutrophilen Granulocyten produzierten Neutrophil Extracellular Traps, NETs, und b. mindestens einen gegen anti-neutrophile Antikörper gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper.Kit for immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, comprising a. at least one container or carrier with stimulated neutrophilic granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs, produced by stimulated neutrophilic granulocytes b. at least one anti-neutrophil antibody directed fluorescently labeled antibody. Kit nach Anspruch 8, umfassend mindestens einen Träger, vorzugsweise einen Glasobjektträger, mit darauf immobilisierten und fixierten stimulierten neutrophilen Granulocyten und/oder mit darauf immobilisierten und fixierten NETs.Kit according to claim 8, comprising at least one carrier, preferably a glass slide, with immobilized and fixed stimulated neutrophilic granulocytes and / or NETs immobilized thereon and fixed. Verwendung stimulierter neutrophiler Granulocyten und/oder von Neutrophil Extracellular Traps, NETs, von stimulierten neutrophilen Granulocyten zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper.Use of stimulated neutrophilic granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs, stimulated neutrophilic granulocytes for immunodiagnostic detection of anti-neutrophil antibodies. Verwendung stimulierter neutrophiler Granulocyten und/oder von Neutrophil Extracellular Traps, NETs, von stimulierten neutrophilen Granulocyten zum immundiagnostischen Nachweis anti-neutrophiler Antikörper, in einer Körperflüssigkeitsprobe, vorzugsweise einer Blutplasmaprobe oder Blutserumprobe einer Person mit einer Autoimmunerkrankung.Use of stimulated neutrophilic granulocytes and / or neutrophil extracellular traps, NETs, stimulated neutrophilic granulocytes for the immunodiagnostic detection of anti-neutrophilic antibodies, in a body fluid sample, preferably a blood plasma sample or blood serum sample of a person having an autoimmune disease. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Autoimmunerkrankung eine ANCA-assoziierte Vaskulitis ist.Use according to claim 11, wherein the autoimmune disease is an ANCA-associated vasculitis.
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