DE102015005702A1 - Cytometric Bead Assay with Mass Spectrometric Detection CBAMSTOF - Google Patents
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Abstract
Mit einer Kombination aus Cytometrischem Bead Assay und Massenspektrometerischer Detektion lassen sich die Nachteile des bisherigen, farbstoffbasierten Cytometrischen Bead Assay ausgleichen. Nachteile sind ein Überstrahlen der Absorbtionswellenlängen und Emissionswellenlängen der verwendeten Farbstoffe. Dieses Problem hat eine nachgeschaltete Massenspektrometrie nicht. Sie löst die verwendeten Massenmarker scharf auf. Ein echtes Multiplexen einer Vielzahl an Analyten die gleichzeitig in einem winzigen Probenvolumen bestimmt werden können, wird auf diese Weise möglich. Aus diesem Grund beschreibt die vorliegende Erfindung einen wichtigen Schritt in der Weiterentwicklung der parallelen Analytik einer Vielzahl an Analyten aus einem winzigen Probenvolumen.With a combination of cytometric bead assay and mass spectrometric detection, the disadvantages of the previous, dye-based cytometric bead assay can be compensated. Disadvantages are an overshoot of the absorption wavelengths and emission wavelengths of the dyes used. This problem does not have a downstream mass spectrometry. It resolves the used mass markers sharply. Real multiplexing of a variety of analytes that can be determined simultaneously in a minute sample volume becomes possible in this way. For this reason, the present invention describes an important step in the further development of the parallel analysis of a plurality of analytes from a minute sample volume.
Description
Vor wenigen Jahren wurde von Scott Tanner in Toronto (Kanada) und von Garry Nolan in Stanford (USA) die Technologie des CYTOF entwickelt. Ihnen gelang hierdurch eine erhebliche Verbesserung der Technologie der Durchflußzytometrie mittels Verwendung massenmarkierter Antikörpern und einer sich anschließenden massenspektrometrischen Detektion dieser elementmarkierten Antikörper. Der hier beschriebenen Erfindung liegt die Überlegung zugrunde diese Technologie zu modifizieren und dann zur Labormedizinischen Analytik im Rahmen der Krankenversorung zu verwenden.A few years ago, the technology of the CYTOF was developed by Scott Tanner in Toronto (Canada) and Garry Nolan in Stanford (USA). They achieved a significant improvement in the technology of flow cytometry by using mass-labeled antibodies and subsequent mass spectrometric detection of these element-labeled antibodies. The invention described here is based on the consideration to modify this technology and then to use for laboratory medical analysis in the context of health care.
Zu diesem Zweck werden mit Antikörpern versehene Beads verwendet, wie sie auch bei der CBA Technologie (Cytometrischer Bead Assay) zum Einsatz kommen. Die CBA (Cytometrischer Bead Assay) Technologie wurde ursprünglich von der Firma Luminex entwickelt und als XMAP Technologie bezeichnet. Bei dieser Technologie werden mit Antikörpern beladene Mikrobeads verwendet, um einen Analyten an deren Oberfläche zu binden. Anschließend wird der Analyt mit einem Sekundärantikörper auf der Oberfläche des Beads detektiert. Dabei kodiert die Farbe des jeweiligen Beads dessen Spezifität und die Farbe des Sekundärantikörpers reportiert den Beladungszustand des jeweiligen Beads.For this purpose, antibody beads are used, as they are also used in the CBA technology (Cytometric Bead Assay) used. CBA (Cytometric Bead Assay) technology was originally developed by Luminex and referred to as XMAP technology. In this technology, antibody loaded microbeads are used to bind an analyte to their surface. Subsequently, the analyte is detected with a secondary antibody on the surface of the bead. The color of each bead encodes its specificity and the color of the secondary antibody reports the loading state of the respective bead.
Das Besondere an der hier beschriebenen Erfindung liegt darin, das die verwendeten Antikörper und/oder Beads massenmarkiert sind, d. h. mit einem Element des Periodensystems der Elemente und/oder mit einer charakteristischen und spezifischen Mischung solcher Elemente markiert sind. Solche Antikörper kommen bereits heute bei der CYTOF Technologie zum Einsatz. Für die CBA Technologie werden sie aber noch nicht verwendet.The special feature of the invention described here is that the antibodies and / or beads used are mass-labeled, d. H. are marked with an element of the periodic table of the elements and / or with a characteristic and specific mixture of such elements. Such antibodies are already used today in CYTOF technology. But they are not used for CBA technology yet.
Durch die Verwendung massenmarkierter Antikörper wird es möglich, die Art eines jeden Beads sowie die Anzahl gebundener Sekundär-Antikörper auf der Oberfläche eines jeden Beads mit Hilfe eines Massenspektrometers (z. B. mit einem Flugzeitmassenspektrometer MS-TOF) sehr genau zu quantifizieren.The use of mass-labeled antibodies makes it possible to quantify very precisely the type of each bead and the number of bound secondary antibodies on the surface of each bead using a mass spectrometer (eg with a MS-TOF time-of-flight mass spectrometer).
Zudem wird es möglich den mit dem jeweiligen Bead jeweils gemessen Analyten durch Verwendung einer jeweils anderen Masse für den entsprechenden Bead zu kodieren. Auf diese Weise wird es möglich sehr viele unterschiedliche Analyte in einer Probe parallel nebeneinander zu quantifizieren (Multiplexen).In addition, it becomes possible to code the analytes respectively measured with the respective bead by using a different mass for the corresponding bead. In this way it is possible to quantify very many different analytes in a sample parallel to each other (multiplexing).
Dabei kodiert die Masse des jeweiligen Beads für dessen Spezifität, also für den jeweiligen Analyten. Die Masse des Sekundärantikörpers kodiert für den Beladungszustand des jeweiligen Beads und somit für die Menge und somit für die Konzentration des jeweiligen Analyten.In this case, the mass of the respective beads encodes for its specificity, that is to say for the respective analyte. The mass of the secondary antibody codes for the loading state of the respective bead and thus for the amount and thus for the concentration of the respective analyte.
Viele der Probleme, die üblicherweise durch Multiplexen beim CBA auftreten, sollten bei der hier beschriebenen Kombination aus CBA und anschließender massenspektrometrischer Detektion nicht auftreten. Vor Allem deshalb nicht, da sich die einzelnen Markierungen gegenseitig nicht beeinflussen, wie Farbstoffe dies tun.Many of the problems commonly encountered by multiplexing in CBA should not occur in the combination of CBA and subsequent mass spectrometric detection described herein. Above all, not because the individual marks do not affect each other, as dyestuffs do.
Bei Massen gibt keine breiten Absorptions- und Emissionsbanden, die sich gegenseitig überlagern, wie dies bei Farbstoffen und insbesondere bei Floureszenz-Farbstoffen der Fall ist.For masses, there are no broad absorption and emission bands that overlap each other, as is the case with dyes, and in particular with fluorescent dyes.
An Stelle der Breiten Absorbtionsbanden und Emmissionsbanden der Farbstoffe treten im Falle der Massenspektrometrie sehr schmale Massenpeaks, die sich sehr genau und getrennt voneinander erfassen und quantifizieren lassen. Auf diese Weise wird mit der hier beschriebenen Erfindung eine deutliche Steigerung der Empfindlichkeit und der Quantifizierbarkeit der Methode erreicht. Ein echtes Multiplexen einer Vielzahl an Analyten die gleichzeitig in einem winzigen Probenvolumen bestimmt werden können, wird auf diese Weise möglich. Aus diesem Grund beschreibt die vorliegende Erfindung einen wichtigen Schritt in der Weiterentwicklung der parallelen Analytik einer Vielzahl an Analyten aus einem winzigen Probenvolumen Instead of the broad absorption bands and emission bands of the dyes, very narrow mass peaks occur in the case of mass spectrometry, which can be detected and quantified very accurately and separately from one another. In this way, a significant increase in the sensitivity and the quantifiability of the method is achieved with the invention described herein. Real multiplexing of a variety of analytes that can be determined simultaneously in a minute sample volume becomes possible in this way. For this reason, the present invention describes an important step in the further development of the parallel analysis of a plurality of analytes from a minute sample volume
Patent CBA mit MSTOF DetektionPatent CBA with MSTOF detection
Beschreibung der ZeichnungenDescription of the drawings
Zeichnung 1
Die Zeichnung beschreibt das Prinzip eines Cytometrischen Bead Assays, wie er auch hier zur Anwendung kommt. Die Beads können dabei entweder mit Farbstoffen kodiert sein, und/oder mit Massen (Elementen) kodiert sein. Dabei weist eine Masse oder eine Kombination aus Massen auf einen spezifischen Analyten hin. Die Spezifität entspricht dabei der Spezifität des Antikörpers auf der Oberfläche. Der ebenfalls massenmarkierte Sekundärantikörper detektiert im Anschluß ebenfalls den auf die Oberfläche des Beads gebundenen Analyten. Die Massenmarkierung des Sekundärantikörpers gibt Aufschluss über Menge und Konzentration des Analyten.The drawing describes the principle of a cytometric bead assay, as used here. The beads can either be coded with dyes, and / or encoded with masses (elements). In this case, a mass or a combination of masses indicates a specific analyte. The specificity corresponds to the specificity of the antibody on the surface. The mass-labeled secondary antibody subsequently also detects the analyte bound to the surface of the bead. The mass labeling of the secondary antibody provides information about the amount and concentration of the analyte.
Zeichnung 2
Die Zeichnung beschreibt den Aufbau des neuartigen hier beschriebenen Analysegeräts. Das Analysegerät besteht aus den hier beschriebenen Grundbausteinen einer Bead Separation, die ggf. ein Nebulizer sein kann und einer Massenspektrometrischen Detektionseinheit. Zusätzlich können gegebenenfalls Laserstrahlen die Farbe des Beads erkennen. Die Rechtecke mit 1 und 2 deuten an, daß hier weitere Elemente eingebaut werden können, wie magnetische Separation, magnetisches Mischen und wie Waschschritte für die Magnetischen Mikrobeads sowie ggf. eine Laserdetektion im Sinne eines Durchflußzytometers. Durch diese weiteren Elemente kann die Genauigkeit des Cytometrischen Bead Assays weiter verbessert werden und der Ablauf der Analytik kann weiter automatisiert werden.The drawing describes the structure of the novel analyzer described here. The analyzer consists of the basic components of a bead separation described here, which may possibly be a nebulizer and a mass spectrometric detection unit. In addition, if necessary, laser beams can detect the color of the bead. The rectangles with 1 and 2 indicate that here further elements can be installed, such as magnetic separation, magnetic mixing and washing steps for the magnetic microbeads and possibly a laser detection in the sense of a flow cytometer. These further elements can further improve the accuracy of the cytometric bead assay and further automate the analytics process.
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