DE102014213814A1

DE102014213814A1 - Sequencing device and sequencing method for the analysis of nucleotide sequences

Info

Publication number: DE102014213814A1
Application number: DE102014213814.0A
Authority: DE
Inventors: Oliver Hayden; Harry Hedler
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens Healthcare GmbH
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2016-01-21

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung mit wenigstens einer Elektrodenanordnung zur Analyse von Nukleotidsequenzen biologischer Makromoleküle, umfassend: – eine Messvorrichtung zum Messen der Nukleotidsequenz, – einen ersten und zweiten Träger, wobei der erste und zweite Träger gegenüberliegend angeordnet sind, derart, dass der erste und zweite Träger einen Spalt mit einer ersten Spaltbreite begrenzen, und – der erste und/oder zweite Träger wenigstens eine Membran umfassen, wobei die Membran eine einstellbare Krümmung aufweist und die Krümmung die erste Spaltbreite festlegt, und – wobei die Membran wenigstens eine erste flächige Elektrode aufweist mittels der die Krümmung einstellbar ist.The invention relates to a sequencing device with at least one electrode arrangement for analyzing nucleotide sequences of biological macromolecules, comprising: a measuring device for measuring the nucleotide sequence, a first and second carrier, wherein the first and second carrier are arranged opposite one another, such that the first and second Carrier define a gap with a first gap width, and - the first and / or second carrier comprise at least one membrane, wherein the membrane has an adjustable curvature and the curvature determines the first gap width, and - wherein the membrane has at least one first planar electrode means the curvature is adjustable.

Description

Die Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung und ein Sequenzierverfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen. The invention relates to a sequencing device and a sequencing method for the analysis of nucleic acid sequences.

In der Literatur ist eine Vielzahl von Methoden zur Nukleinsäure-Sequenzierung bekannt. Dazu gehören Verfahren der sogenannten Sequenzierung durch Synthese (englisch: Sequencing-by-Synthesis). Hier wird bei Einbau eines passenden Nukleotids eine Komponente freigesetzt, die mittels Enzymkaskaden nachgewiesen wird. Numerous methods for nucleic acid sequencing are known in the literature. These include methods of so-called sequencing by synthesis (English: sequencing-by-synthesis). Here, when a suitable nucleotide is incorporated, a component is released which is detected by means of enzyme cascades.

Weiterhin ist die Nukleinsäure-Sequenzierung in Nanoporen bekannt. Von Vorteil ist, dass bei dieser Methode weder eine Markierung des DNA- oder RNA-Strangs noch eine komplexe Reaktionskaskade benötigt wird. Bei der Sequenzierung von z.B. Nukleinsäuren können dabei einzelne Basen des Nukleinsäurestrangs durch eine Veränderung der Ionenleitfähigkeit in der Pore (also ein elektrischer Porenwiderstand) beim Passieren der Nukleinsäure durch die Nanopore analysiert werden. Eine Probe der Nukleinsäure wird dabei über ein elektrisches Feld, z.B. mittels Elektrophorese, durch den Sequenzierkanal geführt. Beim Passieren des Sequenzierkanals von unterschiedlichen Nukleotiden ändert sich der Ionen-Strom, so dass das Nukleotid detektiert und die Sequenz der Nukleinsäure ermittelt werden kann. Furthermore, nucleic acid sequencing in nanopores is known. It is advantageous that in this method, neither a label of the DNA or RNA strand nor a complex reaction cascade is needed. In the sequencing of e.g. Nucleic acids can thereby be analyzed individual bases of the nucleic acid strand by a change in the ionic conductivity in the pore (ie an electrical pore resistance) when passing the nucleic acid through the nanopore. A sample of the nucleic acid is thereby passed over an electric field, e.g. by electrophoresis, passed through the sequencing channel. When passing the Sequenzierkanals of different nucleotides, the ion current changes, so that the nucleotide can be detected and the sequence of the nucleic acid can be determined.

Alternativ kann ein Tunnelstrom, der beim Passieren des Biopolymers auftritt, in dem Sequenzierkanal quer zur Transportrichtung des Biopolymers gemessen werden, wobei die Höhe des Tunnelstroms abhängig ist von z.B. dem Nukleotid oder der Aminosäure, welche sich in dem Sequenzierkanal befindet. Der Sequenzierkanal, der beispielsweise als biologische oder künstliche Nanopore oder als Nanoschlitz ausgestaltet sein kann, weist vorzugsweise eine Ausdehnung von unter 100 Nanometer zwischen zwei Sequenzierelektroden auf. Alternatively, a tunneling current that occurs when passing through the biopolymer can be measured in the sequencing channel transverse to the transport direction of the biopolymer, the height of the tunneling current being dependent on e.g. the nucleotide or amino acid located in the sequencing channel. The sequencing channel, which can be designed, for example, as a biological or artificial nanopore or as a nanotube, preferably has an extent of less than 100 nanometers between two sequencing electrodes.

Die Beabstandung der Elektroden ist einer der wichtigsten Faktoren bei der elektronischen Sequenzierung mit einem Sequenzierkanal. Je geringer die Beabstandung, desto höher ist ein möglicher integraler Stromfluss bzw. desto höher ist die Wahrscheinlichkeit eines Tunnelstromevents durch den Analyten, und desto geringer ist die Gefahr, dass sich mehrere Biomoleküle gleichzeitig zwischen den Elektroden befinden. The spacing of the electrodes is one of the most important factors in electronic sequencing sequencing. The smaller the spacing, the higher is the potential integral current flow, or the greater the likelihood of a tunneling current event by the analyte, and the lower the likelihood that multiple biomolecules will be present between the electrodes simultaneously.

Tunnelstromverfahren haben vorteilhafterweise eine bessere Basenauflösung im Vergleich zur Messung des Porenwiderstands. Dieser begründet sich in hohen elektrischen Feldstärken innerhalb der Nanopore. Diese Messungen hängen stark von der Größe und Form der Nanopore ab. Weiterhin müssen die Elektroden zum Anlegen einer Spannung an die Nanopore exakt angeordnet werden, um den Tunnelstrom ausreichend genau zu erfassen. Um eine hohe Analysesicherheit der Nukleinsäure-Sequenzierung mittels Tunnelstromanalyse zu erreichen, ist es wünschenswert, maßgeschneiderte Nanoporen mit Elektroden für definierte Anwendungen herzustellen. Die meisten Herstellungsverfahren zur Erzeugung von solid-state Nanoporen basieren auf dem Entfernen von Material aus einer dünnen Membran, ähnlich dem Bohren von Löchern. Diese Herstellung wird insbesondere mittels elektronenstrahlbasierter Fotolithografie durchgeführt. Tunnel current methods advantageously have a better base resolution compared to the measurement of the pore resistance. This is due to high electric field strengths within the nanopore. These measurements are highly dependent on the size and shape of the nanopore. Furthermore, the electrodes for applying a voltage to the nanopore must be precisely arranged in order to detect the tunnel current with sufficient accuracy. In order to achieve a high analysis security of nucleic acid sequencing by means of tunnel current analysis, it is desirable to produce tailored nanopores with electrodes for defined applications. Most manufacturing methods for producing solid-state nanopores are based on removing material from a thin membrane, similar to drilling holes. This production is carried out in particular by means of electron beam-based photolithography.

Die bisherigen Anordnungen von solid-state Nanoporen mit Elektroden sind nachteiligerweise sehr komplex und zeitaufwändig in der Herstellung. Eine ausreichend präzise Anordnung der Nanopore zu den Elektroden oder einem Kondensator derart, dass Tunnelströme mit hoher Genauigkeit gemessen werden können, ist derzeit technisch sehr aufwendig und deren Herstellung ist nachteiligerweise mit hohem Arbeits- und Zeitaufwand verbunden. The previous arrangements of solid-state nanopores with electrodes are disadvantageously very complex and time-consuming to manufacture. A sufficiently precise arrangement of the nanopore to the electrodes or a capacitor such that tunnel currents can be measured with high accuracy, is currently very expensive and their production is disadvantageously associated with high labor and time.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Sequenziervorrichtung und ein Sequenzierverfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen anzugeben, welche die genannten Nachteile überwinden. The object of the present invention is therefore to provide a sequencing device and a sequencing method for the analysis of nucleic acid sequences which overcome the mentioned disadvantages.

Die Aufgabe wird von der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung gemäß Anspruch 1 und dem erfindungsgemäßen Sequenzierverfahren gemäß Anspruch 10 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch Unteransprüche gegeben. The object is achieved by the sequencing device according to the invention according to claim 1 and the sequencing method according to the invention according to claim 10. Advantageous developments of the invention are given by subclaims.

Die Sequenziervorrichtung mit wenigstens einer Elektronenanordnung zur Analyse von Nukleotidsequenzen biologischer Makromoleküle umfasst eine Messvorrichtung zum Messen der Nukleotidsequenz. Weiterhin umfasst sie einen ersten und einen zweiten Träger, wobei der erste und zweite Träger gegenüberliegend angeordnet sind, derart, dass der erste und zweite Träger einen Spalt mit einer ersten Spaltbreite begrenzen. Der erste und/oder zweite Träger umfassen dabei wenigstens eine Membran. Die Membran weist eine einstellbare Krümmung auf, wobei die Krümmung die erste Spaltbreite festlegt. Weiterhin umfasst die Membran wenigstens eine erste flächige Elektrode, mittels der die Krümmung einstellbar ist. The sequencing device with at least one electron arrangement for analyzing nucleotide sequences of biological macromolecules comprises a measuring device for measuring the nucleotide sequence. Furthermore, it comprises a first and a second carrier, wherein the first and second carrier arranged opposite are such that the first and second carrier define a gap having a first gap width. The first and / or second carrier comprise at least one membrane. The membrane has an adjustable curvature, the curvature defining the first gap width. Furthermore, the membrane comprises at least one first planar electrode, by means of which the curvature is adjustable.

Das Sequenzierverfahren zur Analyse von Nukleotidsequenzen biologischer Makromoleküle umfasst mehrere Schritte. Zunächst erfolgt das Bereitstellen einer Messvorrichtung zum Messen einer Nukleotidsequenz. Weiterhin werden der erste und zweite Träger bereitgestellt, wobei der erste und zweite Träger gegenüberliegend angeordnet sind, derart, dass der erste und zweite Trägerkörper einen Spalt mit einer ersten Spaltbreite begrenzen. Der erste und zweite Träger umfasst dabei wenigstens eine Membran, wobei eine Krümmung der Membran einstellbar ist und die Krümmung die erste Spaltbreite festlegt. Die Krümmung der Membran wird mittels wenigstens einer ersten flächigen Elektrode eingestellt. Die biologische Probe mit Nukleinsäure wird dann von einem Eintrittsbereich des Spalts zu einem Austrittsbereich des Spaltes geführt. Während des Führens der biologischen Probe wird ein elektrischer Strom zur Analyse der Nukleinsäuresequenz mittels der ersten Messvorrichtung gemessen und aufgezeichnet. Danach erfolgt das Auswerten der Aufzeichnung zur Analyse der Nukleotidsequenz. The sequencing method for analyzing nucleotide sequences of biological macromolecules involves several steps. First, there is provided a measuring device for measuring a nucleotide sequence. Furthermore, the first and second carriers are provided, wherein the first and second carriers are arranged opposite, such that the first and second carrier bodies define a gap with a first gap width. The first and second carrier in this case comprises at least one membrane, wherein a curvature of the membrane is adjustable and the curvature determines the first gap width. The curvature of the membrane is adjusted by means of at least one first planar electrode. The biological sample with nucleic acid is then passed from an entrance region of the gap to an exit region of the gap. During the passage of the biological sample, an electric current for analyzing the nucleic acid sequence is measured and recorded by means of the first measuring device. This is followed by the evaluation of the recording for the analysis of the nucleotide sequence.

Vorteilhafterweise kann bei der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung und dem erfindungsgemäßen Sequenzierverfahren die Krümmung variiert werden, so dass die erste Spaltbreite einstellbar ist. Die erste Spaltbreite liegt typischerweise in einem Bereich von 0 bis 100 nm. Dieser Abstand kann während einer Messung fest gewählt werden oder während einer Messung variiert werden. Advantageously, in the sequencing device according to the invention and the sequencing method according to the invention, the curvature can be varied so that the first gap width can be adjusted. The first gap width is typically in a range of 0 to 100 nm. This distance can be fixed during a measurement or varied during a measurement.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist die Membran des ersten Trägers als die Messvorrichtung ausgebildet. Die Membran umfasst dabei eine erste Messelektrode eines ersten Messelektrodenpaares zur Messung eines Tunnelstroms in Gegenwart einer Nukleinsäure. Vorteilhaft lassen sich diese Messelektroden mittels auf Mikrosystemtechnik basierenden Dünnfilmprozessen herstellen. In a particularly advantageous embodiment and development of the invention, the membrane of the first carrier is designed as the measuring device. The membrane comprises a first measuring electrode of a first measuring electrode pair for measuring a tunnel current in the presence of a nucleic acid. Advantageously, these measuring electrodes can be produced by means of thin-film processes based on microsystem technology.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist eine zweite Messelektrode des Messelektrodenpaares gegenüberliegend der ersten Messelektrode auf dem zweiten Träger angeordnet. Vorteilhafterweise wird dabei die biologische Probe mit Nukleinsäure durch den entstehenden ersten Spalt geführt, welcher von den beiden Messelektroden begrenzt wird, so dass diese den Tunnelstrom messen. In a further advantageous embodiment and development of the invention, a second measuring electrode of the measuring electrode pair is arranged opposite the first measuring electrode on the second carrier. Advantageously, the biological sample is guided with nucleic acid through the resulting first gap, which is bounded by the two measuring electrodes, so that they measure the tunnel current.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung umfasst die Membran und/oder der erste und/oder der zweite Träger Silizium. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn Mikrosystemtechnik zur Herstellung der Membran und der Elektroden eingesetzt wird. In a further advantageous embodiment and development of the invention, the membrane and / or the first and / or the second carrier comprises silicon. This is particularly advantageous when microsystem technology is used to make the membrane and electrodes.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist die Oberfläche der ersten und/oder zweiten Messelektrode angeraut und/oder weist scharfe Erhebungen auf. Vorteilhafterweise lassen sich damit bei einer Spaltbreite kleiner als 2 nm Nukleotide spalten. Dies ist möglich, da die DNA- oder RNA-Probe in einem schmalen Spalt der Länge nach durch diesen geführt wird. Bei gleichzeitiger Analyse der Nukleotidsequenz lässt sich sogar eine gezielte Segmentierung der DNA oder RNA durchführen. In a further advantageous embodiment and development of the invention, the surface of the first and / or second measuring electrode is roughened and / or has sharp elevations. Advantageously, nucleotides can thus be cleaved at a gap width of less than 2 nm. This is possible because the DNA or RNA sample is guided lengthwise through it in a narrow gap. With simultaneous analysis of the nucleotide sequence can even perform a targeted segmentation of DNA or RNA.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung umfasst diese Sequenziervorrichtung eine zweite flächige Elektrode. Die zweite flächige Elektrode ist der ersten Elektrode gegenüberliegend angeordnet, derart, dass die Krümmung der Membran mittels der ersten und zweiten Elektrode kapazitiv einstellbar ist. Typischerweise ist die zweite flächige Elektrode gegenüberliegend der ersten Elektrode und vom ersten Spalt abgewandt angeordnet, so dass sich folgende Reihenfolge ergibt: der erster Spalt, die erste Elektrode und die zweite Elektrode. Vorteilhaft lässt sich somit während des gesamten Messverfahrens, insbesondere während des Führens der Probe durch den Spalt oder auch während der Messung, die Spaltbreite kapazitiv variieren. In a further advantageous embodiment and development of the invention, this sequencing device comprises a second planar electrode. The second planar electrode is arranged opposite the first electrode such that the curvature of the membrane is capacitively adjustable by means of the first and second electrodes. Typically, the second planar electrode is disposed opposite the first electrode and facing away from the first gap, resulting in the following order: the first gap, the first electrode and the second electrode. Advantageously, the gap width can thus be varied capacitively during the entire measuring process, in particular during the guidance of the sample through the gap or else during the measurement.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist mittels einer Veränderung der Krümmung ein Fluss einer biologischen Probe mit Nukleinsäure durch den Spalt erzeugbar. Mittels vorgegebener Krümmungsveränderungen der Membran können definierte Flüsse der biologischen Probe durch den Spalt eingestellt werden. Vorteilhafterweise umfasst die Vorrichtung wenigstens drei Sequenziervorrichtungen mit Membran, welche am Spalt entlang hintereinander angeordnet sind. Mittels unterschiedlicher Einstellungen der Krümmung der drei Membranen zueinander, lässt sich die biologische Probe in der Art eines Pumpvorgangs fördern. Alternativ oder zusätzlich kann das Führen der Probe auch elektrophoretisch erfolgen. In a further advantageous embodiment and development of the invention, by means of a change in the curvature, a flow of a biological sample with nucleic acid through the gap can be generated. By means of predetermined changes in the curvature of the membrane, defined flows of the biological sample can be adjusted through the gap. Advantageously, the device comprises at least three sequencing devices with membrane, which are arranged along the gap one behind the other. By means of different settings of the curvature of the three membranes to each other, the biological sample can be promoted in the manner of a pumping operation. Alternatively or additionally, the guiding of the sample can also be carried out electrophoretically.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist die Krümmung der Membran entweder konkav oder konvex zum Spalt hin ausgebildet. Insbesondere zum Führen der biologischen Probe durch den Spalt sind auch konkave Positionen der Membran von Vorteil. In einer Veränderung der Membran von einer Mittelstellung zu einer konkaven Stellung wird Unterdruck in dem Spalt erzeugt, so dass die biologische Probe in den Spalt gezogen wird. Wird die Krümmung der Membran zu einer konvexen Position hin verändert, wird die biologische Probe durch eine Art Überdruck aus dem Spalt gedrückt. Besonders vorteilhaft ist es hierbei, wenn wenigstens drei Sequenziervorrichtungen mit Membran derart hintereinander geschaltet sind, dass die Spalte sich auf einer Achse befinden. Während des Ansaugprozesses durch die konkave Ausbildung der Membran wird dann die in Flussrichtung letzte Membran geschlossen. In einem nächsten Schritt wird die dritte Membran in Flussrichtung geöffnet und die erste Membran geschlossen während sich die mittlere Membran von konkav zu konvex hin krümmt. Dabei wird die Probe aus dem Spalt hinausgedrückt, ohne zum Eingang zurückgespült zu werden, da die erste Membran den ersten Spalt geschlossen hat. In a further advantageous embodiment and development of the invention, the curvature of the membrane is formed either concave or convex toward the gap. In particular, for guiding the biological sample through the gap, concave positions of the membrane are also advantageous. In a change in the membrane from a mid-position to a concave position, negative pressure is created in the gap so that the biological sample is drawn into the gap. If the curvature of the membrane is changed to a convex position, the biological sample is forced out of the gap by a kind of overpressure. In this case, it is particularly advantageous if at least three sequencing devices with membrane are connected in series in such a way that the gaps are located on one axis. During the suction process by the concave formation of the membrane then the last membrane in the flow direction is closed. In a next step, the third membrane is opened in the flow direction and the first membrane is closed while the middle membrane curves from concave to convex. The sample is pushed out of the gap, without to be flushed back to the entrance, since the first membrane has closed the first gap.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird die Krümmung der Membran mit einer Frequenz in einem Bereich von 1 kHz bis 1 MHz unterschiedlich eingestellt. Dies ermöglicht es vorteilhaft die biologische Probe, insbesondere das Nukleotid, in einer zufälligen Orientierung und Abstand zwischen den Elektroden zu detektieren, da der Abstand je nach Aufenthaltsort des Analyten eingestellt werden kann. In a further advantageous embodiment and development of the invention, the curvature of the membrane is set differently with a frequency in a range of 1 kHz to 1 MHz. This advantageously makes it possible to detect the biological sample, in particular the nucleotide, in a random orientation and distance between the electrodes, since the distance can be adjusted depending on the location of the analyte.

Ebenfalls ist es in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung möglich, die Nukleotide mehrfach zu detektieren. Dabei werden während des Führens genau einer Nukleinsäure durch den Spalt wenigstens zwei Tunnelstrommessungen durchgeführt. Eine Mehrfachmessung erlaubt vorteilhaft eine höhere Spezifität von Nukleotiden bei der Analyse. Aufgrund der zufälligen Orientierung der Nukleotiden zwischen den Elektroden, erhält man aus einer Mehrfachmessung ein statistisches Mittel der Tunnelströme. It is also possible in a further advantageous embodiment of the invention to detect the nucleotides multiple times. At least two tunnel current measurements are carried out during the passage of exactly one nucleic acid through the gap. A multiple measurement advantageously allows a higher specificity of nucleotides in the analysis. Due to the random orientation of the nucleotides between the electrodes, one obtains a statistical mean of the tunneling currents from a multiple measurement.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die 1 bis 4 näher erläutert. Dabei zeigen: Embodiments of the present invention will be described by way of example with reference to FIGS 1 to 4 explained in more detail. Showing:

1 eine Membran des ersten Trägers umfassend eine Messvorrichtung zur Nukleinsäure-Sequenzanalayse in einer ersten Position; 1 a membrane of the first carrier comprising a nucleic acid sequence analysis measuring device in a first position;

2 eine Membran des ersten Trägers umfassend eine Messvorrichtung zur Nukleinsäure-Sequenzanalayse in einer zweiten Position; 2 a membrane of the first carrier comprising a nucleic acid sequence analysis measuring device in a second position;

3 eine Anordnung umfassend drei Membranen als Pumpvorrichtung und eine Membran umfassend eine Messvorrichtung zur Nukleinsäure-Sequenzanalayse; 3 an arrangement comprising three membranes as a pumping device and a membrane comprising a nucleic acid sequence analysis measuring device;

4 eine Membran des ersten Trägers umfassend eine Messvorrichtung zur Nukleinsäure-Sequenzanalayse und eine Schneidvorrichtung zum Fragmentieren der Nukleinsäurestränge. 4 a membrane of the first carrier comprising a nucleic acid sequence analysis measuring device and a cutting device for fragmenting the nucleic acid strands.

Die Sequenziervorrichtung 1 umfasst einen ersten Träger 2 und einen zweiten Träger 3, der dem ersten Träger 2 gegenüberliegt. Dazwischen bildet sich ein Spalt 4 aus. Dieser Spalte hat eine erste Spaltbreite 5 von typischerweise 100 nm. Der erste Träger 2 umfasst eine Membran 6. Diese Membran 6 umfasst wiederum eine erste flächige Elektrode 7. Weiterhin umfasst der erste Träger 2 eine zweite flächige Elektrode 8. Diese zweite flächige Elektrode 8 ist der ersten flächigen Elektrode 7 gegenüberliegend angeordnet, wobei sie sich vom Spalt 4 abgewandt befindet. Weiterhin umfasst die Membran 6 eine erste Messelektrode 9, welche zum Spalt 4 hin orientiert ist. Der zweite Träger 3 umfasst eine zweite Messelektrode 10, welche der ersten Messelektrode 9 gegenüberliegt. Weiterhin umfasst die Sequenziervorrichtung 1 eine erste Elektrophoreseelektrode 14 vor Eintritt in den Spalt 4 und eine zweite Elektrophoreseelektrode 15 nach dem Spalt 4 der Sequenziervorrichtung 1. The sequencing device 1 includes a first carrier 2 and a second carrier 3 , the first carrier 2 opposite. In between, a gap forms 4 out. This column has a first gap width 5 typically 100 nm. The first carrier 2 includes a membrane 6 , This membrane 6 again comprises a first planar electrode 7 , Furthermore, the first carrier comprises 2 a second planar electrode 8th , This second planar electrode 8th is the first planar electrode 7 arranged opposite each other, extending from the gap 4 turned away. Furthermore, the membrane comprises 6 a first measuring electrode 9 which leads to the gap 4 oriented. The second carrier 3 includes a second measuring electrode 10 , which is the first measuring electrode 9 opposite. Furthermore, the sequencing device comprises 1 a first electrophoresis electrode 14 before entering the gap 4 and a second electrophoresis electrode 15 after the gap 4 the sequencing device 1 ,

Eine erste Nukleinsäure 11 wird mittels der beiden Elektrophoreseelektroden 14, 15 durch den Spalt 4 mit der ersten Spaltbreite 5 gezogen. Während der Messung ist es möglich, die erste Spaltbreite 5 zu verändern. Dazu wird die Krümmung der Membran 6 mittels der ersten flächigen Elektrode 7 und der zweiten flächigen Elektrode 8 kapazitiv eingestellt. Um den Abstand zwischen den beiden Elektroden 7 und 8, d.h. um die erste Spaltbreite 5 zu bestimmen, wird der Tunnel mit einem Puffer oder einer Kalibrierlösung befüllt. Die erste Spaltbreite 5 kann dann über eine Tunnelstrommessung bestimmt werden. Es ist möglich, die erste Spaltbreite 5 über eine gesamte Messung konstant zu halten oder dynamisch mit einer variierbaren Amplitude im kHz- oder MHz-Bereich zu verändern. Vorteilhaft ist es bei einer Veränderung der ersten Spaltbreite 5 möglich, den Analyten, der in einer zufälligen Orientierung und in einem zufälligen Abstand durch den ersten Spalt 4 gezogen wird, durch Tunnelstrommessung mehrfach zu detektieren, so dass ein statistisches Mittel des Tunnelstroms ausgewertet werden kann. Die Analyse der Nukleinsäuresequenz erfolgt mittels Tunnelstrommessungen. In Abhängigkeit der Base, die den Spalt 4 durchquert und sich somit zwischen den beiden flächigen Elektroden 7, 8 befindet, verändert sich der Tunnelstrom in einer typischen Weise, so dass die Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil analysiert werden können. A first nucleic acid 11 is by means of the two electrophoresis electrodes 14 . 15 through the gap 4 with the first gap width 5 drawn. During the measurement, it is possible to use the first gap width 5 to change. This is the curvature of the membrane 6 by means of the first planar electrode 7 and the second planar electrode 8th capacitively adjusted. To the distance between the two electrodes 7 and 8th ie the first gap width 5 To determine the tunnel is filled with a buffer or a calibration solution. The first gap width 5 can then be determined via a tunnel current measurement. It is possible the first gap width 5 to keep constant over an entire measurement or to change dynamically with a variable amplitude in the kHz or MHz range. It is advantageous for a change in the first gap width 5 possible, the analyte, in a random orientation and at a random distance through the first gap 4 is pulled repeatedly by tunnel current measurement, so that a statistical mean of the tunnel current can be evaluated. The analysis of the nucleic acid sequence is carried out by means of tunnel current measurements. Depending on the base, the gap 4 traverses and thus between the two flat electrodes 7 . 8th The tunnel current changes in a typical manner so that the bases adenine, thymine, guanine, cytosine and uracil can be analyzed.

Die erste Spaltbreite 5 kann vorteilhaft von 0 nm bis 100 nm maximal variiert werden. Typischerweise wird die Messung des Tunnelstroms bei Abständen unter 10 nm durchgeführt. Die erste und zweite flächige Elektrode 7, 8 zum Einstellen der Spaltbreite 5 des Spaltes 4 sind elektrisch unabhängig von den Messelektroden 9, 10. The first gap width 5 can advantageously be varied from 0 nm to 100 nm maximum. Typically, the measurement of the tunnel current is performed at distances below 10 nm. The first and second planar electrodes 7 . 8th for adjusting the gap width 5 of the gap 4 are electrically independent of the measuring electrodes 9 . 10 ,

2 zeigt die Sequenziervorrichtung, wie in 1 beschrieben. Allerdings ist die Membran 6 hier nicht gekrümmt, sondern befindet sich in einer geraden Grundposition. Hier beträgt die erste Spaltbreite 5 demnach 100 nm, wie der Spalt 4 selber auch. Das bedeutet die Elektroden sind derart in den Träger integriert, dass sie auf gleicher Höhe zum Spalt hin abschließen. Es ist aber ebenso denkbar, typischerweise für Messelektrode 10, dass diese auf den Träger aufgebracht ist und der Spalt 4 somit etwas breiter ist als der Abstand der beiden Elektroden 9, 10 bei nicht gekrümmter Position zueinander. Die erste und zweite Nukleinsäure 11, 12 werden elektrophoretisch durch den Spalt 4 gezogen. 2 shows the sequencing device, as in 1 described. However, the membrane is 6 not curved here, but is in a straight basic position. Here is the first gap width 5 therefore 100 nm, like the gap 4 itself too. This means that the electrodes are integrated in the carrier in such a way that they terminate at the same height as the gap. But it is also conceivable, typically for measuring electrode 10 in that it is applied to the carrier and the gap 4 thus slightly wider than the distance between the two electrodes 9 . 10 in a non-curved position to each other. The first and second nucleic acids 11 . 12 be electrophoretically through the gap 4 drawn.

3 zeigt eine Sequenziervorrichtung 1 mit einer Membran umfassend Messlektroden 9, 10 in einem ersten Messbereich 21 und weitere drei Membranen, angeordnet entlang des Spaltes 4, zum Pumpen der Nukleinsäure-Probe. Die drei Membranen zum Pumpen lassen sich in einen Einlass-Bereich 22 mit einer ersten Pumpmembran 37, einen Pump-Bereich 23 mit einer zweiten Pumpmembran 38 und einem Auslass-Bereich 24 mit einer dritten Pumpmembran 39 einteilen. 3 shows a sequencing device 1 with a membrane comprising measuring electrodes 9 . 10 in a first measuring range 21 and another three membranes arranged along the gap 4 for pumping the nucleic acid sample. The three diaphragms for pumping can be placed in an inlet area 22 with a first pumping membrane 37 , a pumping area 23 with a second pumping membrane 38 and an outlet area 24 with a third pumping membrane 39 organize.

Der erste Träger 2 umfasst im Messbereich 21 eine erste flächige Elektrode 7 und eine zweite flächige Elektrode 8. Hiermit lässt sich wiederum die erste Spaltbreite 5 einstellen. Weiterhin umfasst die Membran 6 eine erste Messelektrode 9. Gegenüber dieser ersten Messelektrode 9 ist die zweite Messelektrode 10 auf dem zweiten Träger 3 angeordnet. In diesem Beispiel bleibt die erste Spaltbreite 5 während eines ersten Pumpzustands 25, eines zweiten Pumpzustands 26, eines dritten Pumpzustands 27 und eines vierten Pumpzustands 28 konstant. The first carrier 2 includes in the measuring range 21 a first planar electrode 7 and a second planar electrode 8th , This again allows the first gap width 5 to adjust. Furthermore, the membrane comprises 6 a first measuring electrode 9 , Opposite this first measuring electrode 9 is the second measuring electrode 10 on the second carrier 3 arranged. In this example, the first gap width remains 5 during a first pumping state 25 , a second pumping condition 26 , a third pumping condition 27 and a fourth pumping state 28 constant.

Die erste Nukleinsäure 11 wird in diesem Beispiel nicht elektrophoretisch, sondern mittels der drei Pumpmembranen im Bereich 22, 23 und 24 durch den Spalt 4 gezogen. Alle drei Pumpmembranen 37, 38, 39 umfassen eine erste flächige Elektrode 7 und eine zweite flächige Elektrode 8, welche im ersten Träger 2 angeordnet sind. Die Krümmung dieser Membranen 37, 38, 39 kann kapazitiv mittels der beiden Elektroden 7 und 8 eingestellt werden. Hierbei sind sowohl konkave als auch konvexe Positionen der Membran in Richtung des Spaltes 4 möglich. In einem ersten Pumpzustand 25 befinden sich die erste Pumpmembran 37 im Einlassbereich 22 und die zweite Pumpmembran 38 im Pumpbereich 23 in einer Neutralstellung. Die dritte Pumpmembran 39 des Auslassbereichs 24 ist maximal gekrümmt, so dass sie den gegenüberliegenden zweiten Träger 3 berührt und den Ausgang des Spaltes komplett verschließt. In einem zweiten Pumpzustand 26 wird nun die Pumpmembran 38 des Pumpbereiches 23 konkav gegenüber dem Spalt 4 gekrümmt. Durch die Bewegung dieser Membran 38 von einer Neutralstellung zu einer konkaven Stellung wird eine Probe mit Nukleinsäuren 11, 12 in den Spalt 4 gezogen. In einem dritten Pumpschritt 27 wird anschließend die Membran 37 des Einlassbereiches geschlossen und die Membran 39 des Auslassbereiches in eine Neutralstellung gebracht. Diese Änderung der Membranpositionen bewirkt einen Fluss 30 der Probe mit Nukleinsäure 11, 12 in Richtung des Auslasses des Spaltes 4. In einem vierten Pumpschritt wird nun auch die Membran 38 im Pumpbereich 23 derart gekrümmt, dass sie den zweiten Träger 3 berührt und den Spalt 4 verschließt. Dadurch entsteht wiederum ein Fluss 31, der die Probe aus dem Spalt 4 hinaus drückt. Anschließend beginnt der Pumpzyklus wiederum mit dem ersten Pumpzustand 25. The first nucleic acid 11 is in this example not electrophoretically, but by means of the three pumping membranes in the area 22 . 23 and 24 through the gap 4 drawn. All three pumping membranes 37 . 38 . 39 comprise a first planar electrode 7 and a second planar electrode 8th , which in the first carrier 2 are arranged. The curvature of these membranes 37 . 38 . 39 can capacitively by means of the two electrodes 7 and 8th be set. Here are both concave and convex positions of the membrane in the direction of the gap 4 possible. In a first pumping condition 25 are the first pumping membrane 37 in the inlet area 22 and the second pumping membrane 38 in the pumping area 23 in a neutral position. The third pumping membrane 39 the outlet area 24 is maximally curved so that it faces the opposite second carrier 3 touched and the output of the gap completely closes. In a second pumping state 26 now becomes the pumping membrane 38 the pumping area 23 concave against the gap 4 curved. By the movement of this membrane 38 from a neutral position to a concave position becomes a sample with nucleic acids 11 . 12 in the gap 4 drawn. In a third pumping step 27 then becomes the membrane 37 the inlet area closed and the membrane 39 the outlet area brought into a neutral position. This change in membrane positions causes a flow 30 the sample with nucleic acid 11 . 12 towards the outlet of the gap 4 , In a fourth pumping step is now the membrane 38 in the pumping area 23 curved so that it is the second carrier 3 touched and the gap 4 closes. This in turn creates a river 31 that's the sample from the gap 4 pushes out. Subsequently, the pumping cycle starts again with the first pumping state 25 ,

Typische Maße der flächigen Membran 6 und der Pumpmembranen 37, 38, 39 und der Elektroden 7, 8 betragen 100 nm × 100 nm. Die Dicke des ersten Trägers 2 und des zweiten Trägers 3 beträgt typischerweise 100 nm bis 500 nm. Typical dimensions of the flat membrane 6 and the pumping membranes 37 . 38 . 39 and the electrodes 7 . 8th be 100 nm × 100 nm. The thickness of the first carrier 2 and the second carrier 3 is typically 100 nm to 500 nm.

4 zeigt eine Anordnung zum Spalten, bzw. Fragmentieren von Nukleinsäuren. Die Sequenziervorrichtung 1 umfasst dabei, wie schon in 1 gezeigt, einen ersten Träger 2 und einen zweiten dem gegenüberliegenden Träger 3. Der erste Träger 2 umfasst eine Membran 6, zwei flächige Elektroden 7 und 8, welche die Krümmung der Membran 6 einstellen, und eine erste Messelektrode 9 der Membran 6. Gegenüber auf dem zweiten Träger 3 angeordnet ist die zweite Messelektrode 10. Die Ausschnitte 33 und 34 zeigen zwei mögliche Ausgestaltungen der Vorrichtung zum Schneiden von Nukleinsäuren. In der ersten möglichen Anordnung 33 der Schneidevorrichtung befinden sich Schneidkanten 36 auf der ersten Messelektrode 9. Mittels der Krümmung kann die erste Spaltbreite 5 derart eingestellt werden, dass die DNA mit den Schneidkanten 36 geschnitten wird. Ein Schneiden erfolgt dann, wenn die Schneidkanten 36 den gegenüberliegenden zweiten Träger 3, bzw. die zweite Messelektrode 10 berühren. In einer zweiten Anordnung der Schneidvorrichtung 34 befinden sich die Schneidkanten 36 auf der zweiten Messelektrode 10 des zweiten Trägers 3. Es ist ebenso denkbar, dass keine Schneidkanten 36 sondern lediglich angeraute Oberflächen auf den Elektroden 9, 10 angeordnet sind, um die Nukleinsäuren zu schneiden. Alternativ kann ein Schneiden der Nukleinsäuren durch eine Erhöhung der Spannung zwischen den beiden Messelektroden erfolgen, so dass eine Fragmentierung durch hohe Feldstärken oder durch elektrochemische Prozesse der Nukleinsäuren erfolgt. Es ist auch denkbar die Nukleotidsequenzierung und das Fragmetieren des Nukleotids in einer Vorrichtung mit einer oder mehreren Messelektrodenpaarem zu kombinieren. 4 shows an arrangement for splitting or fragmenting nucleic acids. The sequencing device 1 includes, as already in 1 shown a first carrier 2 and a second one opposite the carrier 3 , The first carrier 2 includes a membrane 6 , two flat electrodes 7 and 8th showing the curvature of the membrane 6 adjust, and a first measuring electrode 9 the membrane 6 , Opposite on the second carrier 3 arranged is the second measuring electrode 10 , The cutouts 33 and 34 show two possible embodiments of the device for cutting nucleic acids. In the first possible arrangement 33 the cutting device are cutting edges 36 on the first measuring electrode 9 , By means of the curvature, the first gap width 5 be adjusted so that the DNA with the cutting edges 36 is cut. Cutting takes place when the cutting edges 36 the opposite second carrier 3 , or the second measuring electrode 10 touch. In a second arrangement of the cutting device 34 are the cutting edges 36 on the second measuring electrode 10 of the second carrier 3 , It is also conceivable that no cutting edges 36 but only roughened surfaces on the electrodes 9 . 10 are arranged to cut the nucleic acids. Alternatively, the nucleic acids can be cut by increasing the voltage between the two measuring electrodes so that fragmentation takes place by high field strengths or by electrochemical processes of the nucleic acids. It is also conceivable to combine the nucleotide sequencing and the fragmenting of the nucleotide in one device with one or more pairs of measuring electrodes.

Claims

Sequencing device having at least one electrode arrangement for analyzing nucleotide sequences of biological macromolecules, comprising: A measuring device for measuring the nucleotide sequence, A first and second carrier, wherein the first and second carriers are arranged opposite each other, such that the first and second carrier define a gap with a first gap width, and The first and / or second support comprise at least one membrane, the membrane having an adjustable curvature and the curvature defining the first gap width, and - The membrane has at least a first planar electrode by means of which the curvature is adjustable.

Sequencing device according to claim 1, wherein the membrane of the first carrier is formed as the measuring device and comprises a first measuring electrode of a first measuring electrode pair for measuring at least one tunnel current in the presence of a nucleic acid.

Sequencing device according to claim 2, wherein a second measuring electrode of the first measuring electrode pair opposite to the first measuring electrode is arranged on the second carrier.

Sequencing device according to one of the preceding claims, wherein the first gap width is less than 10 nm.

Sequencing device according to one of the preceding claims, wherein the membrane and / or the first and / or second carrier comprises silicon.

Sequencing device according to one of the preceding claims, wherein the surface of the first and / or second measuring electrode is roughened and / or has sharp elevations.

Sequencing device according to one of the preceding claims with a second planar electrode, which is arranged opposite the first electrode, such that the curvature of the membrane by means of the first and second electrodes is capacitively adjustable.

Sequencing device according to one of the preceding claims, wherein by means of a change in the curvature, a flow of a biological sample with nucleic acids through the gap can be generated.

Sequencing device according to one of the preceding claims, wherein the curvature of the membrane is formed either concave or convex towards the gap.

Sequencing method for analyzing nucleotide sequences of biological macromolecules comprising the following steps: Providing a measuring device for measuring a sequence of a nucleotide, Providing a first and second carrier, wherein the first and second carriers are arranged opposite one another, such that the first and second carrier define a gap with a first gap width, and the first and / or second carrier comprise at least one membrane, wherein a curvature the membrane is adjustable and the curvature defines the first gap width, Adjusting the curvature of the membrane by means of at least one first planar electrode, Guiding a biological sample with nucleic acids from an entry region of the gap to an exit region of the gap, Measuring and recording an electric current for analysis of the nucleic acid sequence by means of the first measuring device during the guidance of the biological sample, - Evaluating the recording for analyzing the nucleotide sequences.

Sequencing method according to claim 10, wherein the membrane of the first carrier is designed as a measuring device and comprises a first measuring electrode of a first measuring electrode pair, such that at least one tunneling current is measured in the presence of a nucleic acid as an electric current.

Sequencing method according to one of claims 10 or 11, wherein at a frequency in a range of 1 kHz to 1 MHz different curvatures of the membrane are set.

The sequencing method of any one of claims 10 to 12, wherein said guiding of said biological sample is electrophoresed.

Sequencing method according to one of claims 10 to 12, wherein the guiding of the biological sample takes place in such a way that a flow of the biological sample is produced by means of concave or convex curvatures of the membrane.

The sequencing method of any one of claims 11 to 14, wherein at least two tunneling current measurements are made while passing exactly one nucleic acid through the gap.