DE102014113861A1

DE102014113861A1 - A method for producing an extract from solid culture media cultured mycelia of Antrodia cinnamomea and its use in combating the metastasis of a lung tumor

Info

Publication number: DE102014113861A1
Application number: DE102014113861.9A
Authority: DE
Inventors: Chin-Chung Lin; Jong-Tar Kuo; Ching-Chun Chen; Jent-turn Lee; Yu-Yen Lin
Original assignee: Taiwan Leader Biotech Corp
Current assignee: Taiwan Leader Biotech Corp
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2016-03-24
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: DE102014113861B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für ein Extrakt aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea und dessen Anwendung, wobei es sich bei dem Extrakt um 2,3,6-Trimethoxy-4-Methylphenol, auch Leader 1 genannt, handelt, wobei das Extrakt die Beweglichkeit, die Migration und das Eindringen von Lungenkrebszellen effektiv unterdrücken kann und sich somit als sehr wirksam bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungentumors erweist. So zeigt Leader 1 eine exzellente Fähigkeit zur Bekämpfung der physiologischen Aktivität und des Mechanismus der Metastasierung eines Lungentumors.The invention relates to a preparation process for an extract of cultured in solid nutrient media mycelia of Antrodia cinnamomea and its application, wherein the extract is 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol, also called Leader 1, wherein the extract can effectively suppress the mobility, migration and invasion of lung cancer cells and thus prove to be very effective in combating the metastasis of a lung tumor. Thus, Leader 1 shows an excellent ability to combat the physiological activity and mechanism of metastasis of a lung tumor.

Description

Technisches Gebiet Technical area

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea, insbesondere eine Anwendung des genannten Extrakts bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungentumors. The invention relates to a method for producing an extract from cultured Mycelia in solid culture media of Antrodia cinnamomea, in particular an application of said extract in the fight against the metastasis of a lung tumor.

Stand der Technik State of the art

Die Bildung von Tumoren kann verschiedene Auslöser haben,, beispielsweise das Alter, die Ernährung, die Lebensgewohnheiten, die Vererbung und die Umwelt eines Individiums. Nach Angaben des Ministeriums für Gesundheit in Taiwan, verursachen bösartige Tumore im Vergleich zu anderen Todesursachen proportional die meisten Todesfälle in Taiwan, wobei die Ursache für den Tod eines Krebspatienten häufig in der Metastasierung des Tumors liegt. So stellt es eine entscheidende Strategie zur Krebsbehandlung dar, die Tumorzellen effektiv zu kontrollieren und die Metastasierung des Tumors zu verhindern. The formation of tumors can have different causes, such as the age, diet, habits, heredity and environment of an individual. According to the Ministry of Health in Taiwan, malignant tumors in proportion to other causes of death cause most deaths in Taiwan, with the cause of death of a cancer patient often being the metastasis of the tumor. Thus, a key cancer treatment strategy is to effectively control tumor cells and prevent metastasis of the tumor.

Antrodia cinnamomea ist eine Pilzart und wird in Taiwan als wertvolles Heilmittel betrachtet. In vielen wissenschaftlichen Studien wurde festgestellt, dass das Methanolextrakt und das Heißwasser-Extrakt aus Mycelien von Antrodia cinnamomea sowie das Methanolextrakt, das Ethanolextrakt und das Ethnolextrakt aus Fruchtkörpern von Antrodia cinnamomea eine optimale Wirkung gegen Entzündungen aufweisen. In manchen Studien wurde auch darauf hingewiesen, dass Mycelien und Fruchtkörper von Antrodia cinnamomea einige naphthenische Verbindungen enthalten, die gegen Krebs wirksam sind. Jedoch sind der Mechanismus und die physiologische Aktivität von Antrodia cinnamomea und der in Antrodia cinnamomea enthaltenen naphthenischen Verbindungen bei der Unterdrückung der Metastasierung eines Tumors noch nicht bekannt, sodass die herkömmlichen Extrakte von Antrodia cinnamomea nicht den Bedarf des Benutzers bei den praktischen Anwendungen bedienen können. Antrodia cinnamomea is a fungus and is considered a valuable remedy in Taiwan. In many scientific studies it has been found that the methanol extract and the hot water extract from mycelia of Antrodia cinnamomea as well as the methanol extract, the ethanol extract and the ethanol extract from fruiting bodies of Antrodia cinnamomea have an optimal effect against inflammation. Some studies have also suggested that mycelia and fruiting bodies of Antrodia cinnamomea contain some naphthenic compounds that are effective against cancer. However, the mechanism and physiological activity of Antrodia cinnamomea and the naphthenic compounds contained in Antrodia cinnamomea are not yet known in suppressing metastasis of a tumor, so that the conventional extracts of Antrodia cinnamomea can not meet the needs of the user in practical applications.

Aufgabe der Erfindung Object of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Extrakt aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea herzustellen und dessen Anwendung, wobei sich das Extrakt bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungentumors als sehr wirksam erweist. The invention has for its object to produce an extract of cultured in solid nutrient media mycelia of Antrodia cinnamomea and its application, wherein the extract proves to be very effective in combating the metastasis of a lung tumor.

Technische Lösung Technical solution

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Extrakt aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea, dessen Herstellung und dessen Anwendung gemäß den Merkmalen der Ansprüche 1, 5, 10, 11, 15 und 18 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche. This object is achieved by an extract of cultured in solid nutrient media mycelia of Antrodia cinnamomea, its preparation and its use according to the features of claims 1, 5, 10, 11, 15 and 18. Advantageous embodiments are the subject of the dependent claims.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea, das durch folgende Schritte gewonnen wird: Bereitstellen eines getrockneten, in festen Nährmedien kultivierten Mycels von Antrodia cinnamomea und Extrahieren des getrockneten, in festen Nährmedien kultivierten Mycels von Antrodia cinnamomea in Ethanol bei einer bestimmten Temperatur. The object is achieved by a method for producing an extract from solid culture media cultured Mycelia of Antrodia cinnamomea, which is obtained by the following steps: providing a dried, cultivated in solid nutrient media mycelium of Antrodia cinnamomea and extracting the dried, cultured in solid nutrient medium mycelium of Antrodia cinnamomea in ethanol at a certain temperature.

Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea, das durch folgende Schritte gewonnen wird: Bereitstellen eines getrockneten, in festen Nährmedien kultivierten Mycels von Antrodia cinnamomea und Extrahieren des getrockneten, in festen Nährmedien kultivierten Mycels von Antrodia cinnamomea in Ethanol bei einer bestimmten Temperatur, um einen Ethanolextrakt zu gewinnen, Konzentrieren des Ethanolextrakts, um ein konzentriertes Erzeugnis zu gewinnen und Partitionieren des konzentrierten Erzeugnisses mit Ethylacetat und Wasser, um einen Ethylacetat-Extrakt zu gewinnen. The object is further achieved by a process for the preparation of an extract from solid culture media cultured mycelia of Antrodia cinnamomea, which is obtained by the following steps: providing a dried, cultivated in solid culture media mycelium of Antrodia cinnamomea and extracting the dried, cultured in solid nutrient media Mycels from Antrodia cinnamomea in ethanol at a certain temperature to recover an ethanol extract, concentrate the ethanol extract to recover a concentrated product, and partition the concentrated product with ethyl acetate and water to obtain an ethyl acetate extract.

Erfindungsgemäß wird kalte Luft zum Trocknen des in festen Nährmedien kultivierten Mycels von Antrodia cinnamomea eingesetzt. According to the invention, cold air is used to dry the mycelium of Antrodia cinnamomea cultured in solid nutrient media.

Erfindungsgemäß wird das Ethanolextrakt im Vakuum konzentriert. According to the invention, the ethanol extract is concentrated in vacuo.

Erfindungsgemäß liegt die Temperatur bei 25°C bis 40°C. According to the invention, the temperature is 25 ° C to 40 ° C.

Erfindungsgemäß liegt die Konzentration an Ethanol bei einem Volumenanteil von 95%. According to the invention, the concentration of ethanol is at a volume fraction of 95%.

Erfindungsgemäß liegt die Konzentration an Ethylacetat bei einem Volumenanteil von 100%. According to the invention, the concentration of ethyl acetate is at a volume fraction of 100%.

Die Aufgabe wird ferner gelöst durch eine Anwendung des Extrakts bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungentumors. The object is further achieved by an application of the extract in combating the metastasis of a lung tumor.

Erfindungsgemäß besteht beim Einsatz des Extrakts keine toxische Wirkung auf die Lungenkrebszellen. According to the invention there is no toxic effect on the lung cancer cells when using the extract.

Erfindungsgemäß verhindert das Extrakt eine Migration der Lungenkrebszellen, um eine Metastasierung eines Lungenkrebstumors zu bekämpfen. According to the invention, the extract prevents migration of the lung cancer cells to combat metastasis of a lung cancer tumor.

Erfindungsgemäß verhindert das Extrakt einen Angriff der Lungenkrebszellen, um eine Metastasierung eines Lungenkrebstumors zu bekämpfen. According to the invention, the extract prevents attack of the lung cancer cells in order to combat metastasis of a lung cancer tumor.

Erfindungsgemäß unterdrückt das Extrakt die Fähigkeit der relevanten Proteinase, die das Wachstum der Lungenkrebszellen fördert. According to the invention, the extract suppresses the ability of the relevant proteinase to promote the growth of lung cancer cells.

Erfindungsgemäß unterdrückt das Extrakt die Fähigkeit der relevanten Proteine, die das Wachstum der Lungenkrebszellen fördern. According to the invention, the extract suppresses the ability of the relevant proteins to promote the growth of lung cancer cells.

Zusammengefasst bezieht sich die Erfindung auf die Wirkung eines Extrakts aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungenkrebstumors. Genauer gesagt offenbart die vorliegende Erfindung die physiologischen Aktivitäten und den Wirkungsmechanismus des genannten Extrakts. In summary, the invention relates to the action of an extract of solid culture media-cultured mycelia of Antrodia cinnamomea in combating the metastasis of a lung cancer tumor. More specifically, the present invention discloses the physiological activities and the mechanism of action of said extract.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Brief description of the drawings

1 zeigt eine Strukturformel eines erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea, 1 shows a structural formula of an inventive extract "Leader 1" from solid culture media cultured Mycelia of Antrodia cinnamomea,

2 zeigt eine schematische Darstellung des Einflusses des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Überlebensrate der Lungenkrebszellen, 2 shows a schematic representation of the influence of the inventive extract "Leader 1" on the survival rate of lung cancer cells,

3 zeigt eine schematische Darstellung des Einflusses des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Heilungsfähigkeit der Lungenkrebszellen, 3 shows a schematic representation of the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the ability of the lung cancer cells to heal,

4A und 4B zeigen schematisch den Einfluss des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Migrationsfähigkeit der Lungenkrebszellen, 4A and 4B show schematically the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the migration ability of lung cancer cells,

5 zeigt eine schematische Darstellung des Einflusses des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf das Angriffsvermögen der Lungenkrebszellen, 5 shows a schematic representation of the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the aggressiveness of lung cancer cells,

6A und 6B zeigen schematisch den Einfluss des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Aktivität der Matrixmetalloproteasen (MMP-2, MMP-9) der Lungenkrebszellen, 6A and 6B show schematically the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the activity of the matrix metalloproteases (MMP-2, MMP-9) of the lung cancer cells,

7 zeigt schematisch den Einfluss des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Aktivitätdes Plasminogenaktivators in den Lungenkrebszellen, 7 shows schematically the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the activity of the plasminogen activator in the lung cancer cells,

8A und 8B zeigen schematisch den Einfluss des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Aktivität der relevanten Proteasen und Proteine, die eine Metastasierung der Lungenkrebszellen fördern. 8A and 8B show schematically the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the activity of the relevant proteases and proteins that promote metastasis of lung cancer cells.

Wege der Ausführung der Erfindung Ways of carrying out the invention

Im Folgenden werden Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung anhand der detaillierten Beschreibung von Ausführungsbeispielen und den beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Die Erfindung soll nicht auf die Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen beschränkt werden. In the following, objects, features and advantages of the present invention will become more apparent from the detailed description of embodiments and the accompanying drawings. The invention is not to be limited to the description and the accompanying drawings.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea und dessen Anwendung, wobei das Extrakt eine Absiedlung von Lungenkrebszellen unterdrückt und sich somit als sehr wirksam bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungentumors erweist. Beim genannten Extrakt handelt es sich um 2,3,6-Trimethoxy-4-Methylphenol (auch Leader 1 genannt). The invention relates to a process for the production of an extract from solid culture media cultured mycelia of Antrodia cinnamomea and its use, wherein the extract suppresses a colonization of lung cancer cells and thus proves to be very effective in combating the metastasis of a lung tumor. The extract mentioned is 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol (also called Leader 1).

Während einer Absiedlung einer Krebszelle finden das Anhaften, der Angriff und die Migration der Zellen statt. Für die Absiedlung der Krebszelle wird eine Matrixmetalloprotease (MMP) benötigt, um die Extrazellularmatrix (EZM) abzubauen und so eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) zu bewirken. Gleichzeitig werden die für die Absiedlung der Krebszellen relevanten Proteine in großem Maß aktiv, um eine Absiedlung der Krebszellen zu ermöglichen. During the removal of a cancer cell, attachment, attack and migration of the cells take place. For the removal of the cancer cell, a matrix metalloprotease (MMP) is needed to break down the extracellular matrix (ECM), thus causing an epithelial-mesenchymal transition (EMT). At the same time, the proteins relevant for the removal of the cancerous cells become active to a large extent, in order to enable a removal of the cancer cells.

Bei dem Tumornekrosefaktor (TNF) handelt es sich hierbei um ein niedrigmolekulares Potein, ein sog. Cytokin, das durch Makrophagen abgesondert wird. Dabei wird der Tumornekrosefaktor TNF-α durch einen einkernigen Makrophagen abgesondert. In vielen vorherigen Studien wurde darauf hingewiesen, dass der Tumornekrosefaktor TNF-α die Infiltration und Absiedlung der Lungenkrebszellen fördert. Daher wird die Rolle des erfindungsgemäßen Extrakts aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea bei der Bekämpfung der Absiedlung von Lungenkrebszellen anhand eines Modells erläutert, bei dem die Absiedlung der Lungenkrebszelle A549 durch den Tumornekrosefaktor TNF-α induziert wird.. Tumor necrosis factor (TNF) is a low-molecular-weight potein, a so-called cytokine secreted by macrophages. The tumor necrosis factor TNF-α is secreted by a mononuclear macrophage. Many previous studies have suggested that tumor necrosis factor TNF-α promotes the infiltration and removal of lung cancer cells. Therefore, the role of the extract of the present invention in solid culture media cultured mycelia of Antrodia cinnamomea in the control of lung cancer cell dislocation will be illustrated by a model in which the colonization of lung cancer cell A549 is induced by tumor necrosis factor TNF-α.

Im Folgenden werden die Details und Inhalte der vorliegenden Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen erläutert, die jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung beschränken sollen. In the following, the details and contents of the present invention are explained by means of exemplary embodiments, which, however, are not intended to limit the scope of the invention.

Erstes Ausführungsbeispiel: Vorbereitungen First embodiment: preparations

Materialien: Materials:

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mycelien werden von der Firma „Taiwan Leader Biotech Corp.“ selbst kultiviert. Das fetale Rinderserum (Fetal Bovine Serum, FBS) wird bei Gibco BRL (Invitrogen, Grand Island, NY) gekauft. Dimethylsulfoxid (DMSO), Penicillin, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Giemsa und Casein werden bei Sigma-Aldrich (St Louis, MO) gekauft. Alle Chemikalien und Lösungen, die für die vorliegende Erfindung benötigt werden, sind Reagenzien oder Produkte mit einem Hochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Reinheitsgrad. The mycelia used in the present invention are self-cultivated by the company "Taiwan Leader Biotech Corp.". Fetal Bovine Serum (FBS) is purchased from Gibco BRL (Invitrogen, Grand Island, NY). Dimethylsulfoxide (DMSO), penicillin, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Giemsa and casein are purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO). All of the chemicals and solutions needed for the present invention are reagents or products with a high pressure liquid chromatography (HPLC) grade of purity.

Zellkultur: Cell Culture:

In der vorliegenden Erfindung wird die Absiedlung einer Krebszelle anhand der Zelle A549 des menschlichen Lungentumors experimentell untersucht. Was die Kultivierung der Zelle A549 angeht, wird zunächst die in einer Kulturflasche (75T Flask) wachsende Zelle A549 bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in eine Laborschale von 10 cm² umgepflanzt und in einem Brutschrank bei 37°C mit 5% Kohlendioxid kultiviert. Nach Empfehlung der beiden Insitute, Bioresources Collection and Research Center (BCRC) und American Type Culture Collection (ATCC), ist die Nährlösung Ham’s F12 ausgewählt worden, wobei zusätzlich 10% fetales Rinderserum hinzugegeben wurden. In the present invention, the colonization of a cancer cell is experimentally examined by the human lung tumor cell A549. Concerning the cultivation of the cell A549, first the cell A549 growing in a culture flask (75T Flask) is transplanted at a implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² into a laboratory dish of 10 cm ² and incubated in an incubator at 37 ° C 5% carbon dioxide cultivated. Following the recommendation of the two institutes, Bioresources Collection and Research Center (BCRC) and American Type Culture Collection (ATCC), the nutrient solution Ham's F12 was selected, with the addition of 10% fetal bovine serum.

Zweites Ausführungsbeispiel: Herstellung des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea Second Exemplary Embodiment: Preparation of the Leader 1 Extract According to the Invention from Mycelia of Antrodia cinnamomea Cultured in Solid Nutrient Media

Zunächst werden in festen Nährmedien kultivierte Mycelien von Antrodia cinnamomea in einem kalten Luftstrom getrocknet. Anschließend werden 2000 g der, in dem kalten Luftstrom getrockneten, in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea mit Ethanol in einem Volumenanteil von 95% extrahiert, wodurch ein Ethanolextrakt (ACME) gewonnen wird. Dabei kann ein beliebiges herkömmliches Trocknungsverfahren im zugehörigen technischen Gebiet eingesetzt werden, sodass das Trocknungsverfahren auf bestimmte beschränkt ist. Firstly, cultured mycelia of Antrodia cinnamomea are dried in solid culture media in a cold air stream. Subsequently, 2000 g of the, dried in cold air stream, cultured in solid nutrient media mycelia of Antrodia cinnamomea with ethanol in a volume fraction of 95% extracted, whereby an ethanol extract (ACME) is obtained. In this case, any conventional drying method can be used in the related technical field, so that the drying method is limited to certain.

Darauffolgend wird das Ethanolextrakt im Vakuum aufkonzentriert, um ein konzentriertes Erzeugnis mit einer Masse von 323,6 g zu gewinnen. Das konzentrierte Erzeugnis wird dann mit Ethylacetat und Wasser in einem Volumenanteil von 100% vermischt, wobei sich eine Ethylacetat-Schicht von einer wasserlöslichen Schicht absondert, wobei die wasserlösliche Schicht als wasserlöslicher Teil (ACME-Water) gekennzeichnet wird und der Ethylacetat-Teil das Ethylacetat-Extrakt (ACME-EA) darstellt. Subsequently, the ethanol extract is concentrated in vacuo to yield a concentrated product having a mass of 323.6 g. The concentrated product is then mixed with ethyl acetate and water in a volume of 100%, whereby an ethyl acetate layer separates from a water-soluble layer, the water-soluble layer being characterized as water-soluble part (ACME-Water) and the ethyl acetate part is ethyl acetate Extract (ACME-EA) represents.

Drittes Ausführungsbeispiel: Absonderung des Extrakts „Leader 1“ Third embodiment: separation of the extract "Leader 1"

Zunächst wird das im zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Ethylacetat-Extrakt (ACME-EA) mittels von Säulenchromatographie gemäß dem Konzentrationsgradienten der mobilen Phase in neun untergeordnete Fraktionen aufgeteilt, wobei hier Silikon (230~400 Mesh) als stationäre Phase und eine gemischte Lösung aus n-Hexan und Ethylacetat als mobile Phase bei der Säulenchromatographie verwendet werden. Die Säulenchromatographie wird mit der gemischten Lösung von n-Hexan und Ethylacetat als mobile Phase durchgeführt, wobei die Lösung die folgenden Volumenanteile an n-Hexan und Ethylacetat aufweist: 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 30:70 und 0:100. First, the ethyl acetate extract (ACME-EA) obtained in the second embodiment is divided into nine subordinate fractions by means of column chromatography according to the mobile phase concentration gradient, here, silicone (230~400 mesh) as a stationary phase and a mixed solution of n-hexane and ethyl acetate as the mobile phase in the column chromatography. The column chromatography is carried out with the mixed solution of n-hexane and ethyl acetate as mobile phase, the solution having the following proportions by volume of n-hexane and ethyl acetate: 100: 0, 90:10, 80:20, 70:30, 60: 40, 50:50, 30:70 and 0: 100.

Anschließend wird die vierte Fraktion mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt und abgetrennt, wobei eine Silikonsäule als immobile Phase und eine gemischte Lösung aus n-Hexan und Ethylacetat in einem Volumenverhältnis von 77:23 als mobile Phase eingesetzt wird. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min wird unter Verwendung eines UV-Detektors mit einer Wellenlänge von UV 254nm eine weitere Trennung durchgeführt, um die Bestandteile zu reinigen. Durch die massenspektrometrische Analyse wird ermittelt, dass die bioaktive Komponente ein Molekulargewicht von 198,09 aufweist, wobei ermittelt wurde, dass die Summenformel dieses Bestandteils C₁₀H₁₄O₄ ist. Die Strukturformel des genannten Bestandteils gemäß der nachfolgenden Darstellung wurde darüber hinaus anhand des ¹H- und ¹³C-Kernmagnetresonanzspektrums ermittelt.

Subsequently, the fourth fraction is purified by high performance liquid chromatography (HPLC) and separated using a silica column as an immobile phase and a mixed solution of n-hexane and ethyl acetate in a volume ratio of 77:23 as a mobile phase. At a flow rate of 5 ml / min, a further separation is performed using a UV detector with a wavelength of UV 254nm to clean the components. Mass spectrometric analysis reveals that the bioactive component has a molecular weight of 198.09, and it has been determined that the molecular formula of this component is C ₁₀ H ₁₄ O ₄ . The structural formula of said constituent, as shown below, was further determined from the ¹ H and ¹³ C nuclear magnetic resonance spectra.

Wie in 1 gezeigt ist, handelt es sich bei der bioaktiven Verbindung um 2,3,6-Trimethoxy-4-Methylphenol (Leader 1). As in 1 is shown, the bioactive compound is 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol (Leader 1).

Viertes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ zur Senkung der Überlebensrate der Lungenkrebszelle A549 Fourth Embodiment: Test of Effect of Leader 1 Extract Obtained According to the Second Embodiment for Lung Cancer Cell A549 Survival

Zuerst werden die Lungenkrebszellen A549 nach dem Verfahren zur Kultivierung von Zellen gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel kultiviert. Nach dem Spülen mit Trypsin werden die Zellen bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in einer Schale mit 24 Schächten implantiert und 24 Stunden lang kultiviert, sodass die Zellen an der Schale anhaften. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, werden die Zellen in den Nährmedien, die die chemische Verbindung „Leader 1“ jeweils mit einer Konzentration von 0, 5, 10, 20 und 40 µM enthalten, 24 Stunden lang kultiviert, wobei die Gruppe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und entsprechend 0 µM „Leader 1“ als Kontrollgruppe dient. Danach werden die Nährmedien entfernt. Weiter wird 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) in einer Konzentration von 5 mg/ml zu den Zellen hinzugegeben und wirkt zwei Stunden lang ein. MTT ist ein Tetrazoliumsalz und erscheint gelblich, wenn es in einer phosphatgepufferten Salzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS) gelöst ist. Mittels der Dehydrogenase in den Mitochondrien der Zelle wird die ringförmige Struktur von MTT reduziert, wobei ein nicht-wasserlöslicher blau-violetter Kristall entsteht. Im Anschluss werden die Zellenmembran und der blau-violette Kristall mit DMSO ausgelöst. Bei einer Wellenlänge von 570 nm wird die Absorbanz des blau-violetten Kristalls ermittelt und die Ergebnisse werden mit Hilfe von sigma plot 10.0 statistisch abgebildet. Tabelle 1 Gruppe Kontrollgruppe 5 10 20 40 Dosierung DMSO 0,05% 5µM 10µM 20µM 40µM First, the lung cancer cells A549 are cultured by the method of cultivating cells according to the first embodiment. After rinsing with trypsin, the cells are implanted at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² in a 24-well dish and cultured for 24 hours so that the cells adhere to the dish. As shown in Table 1, the cells in the nutrient media containing the chemical compound "Leader 1" each at a concentration of 0, 5, 10, 20 and 40 μM are cultured for 24 hours, the group containing dimethylsulfoxide ( DMSO) and corresponding to 0 μM "Leader 1" serves as a control group. Thereafter, the nutrient media are removed. Further, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) at a concentration of 5 mg / ml is added to the cells and acts for two hours. MTT is a tetrazolium salt and appears yellowish when dissolved in Phosphate Buffered Saline (PBS). By means of the dehydrogenase in the mitochondria of the cell, the ring-shaped structure of MTT is reduced, resulting in a non-water-soluble blue-violet crystal. Subsequently, the cell membrane and the blue-violet crystal are triggered with DMSO. At a wavelength of 570 nm, the absorbance of the blue-violet crystal is determined and the results are statistically mapped using sigma plot 10.0. Table 1 group control group 5 10 20 40 dosage DMSO 0.05% 5 .mu.m 10 .mu.M 20 microns 40 microns

In 2 ist der Einfluss des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Überlebensrate der Lungenkrebszellen schematisch dargestellt. Wie in 2 gezeigt ist, hat das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Lungenkrebszellen und zeigt bei für Konzentrationen von ~0–40 µM keine Unterschiede, was bedeutet, dass das Extrakt „Leader 1“ die Lungenkrebszellen nicht toxisch abtöten kann. In 2 the influence of the extract "Leader 1" according to the invention on the survival rate of the lung cancer cells is shown schematically. As in 2 is shown, the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment has no influence on the survivability of the lung cancer cells and shows no differences for concentrations of ~ 0-40 μM, which means that the extract "Leader 1" does not make the lung cancer cells toxic can kill.

Fünftes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ auf die Wundenheilung der Lungenkrebszelle A549 Fifth embodiment: Test of the effect of the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment on the wound healing of the lung cancer cell A549

Zuerst werden die Lungenkrebszellen A549 nach dem Verfahren zur Kultivierung von Zellen gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel kultiviert. Nach Spülen mit Trypsin werden die Zellen bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁷ Zellen/cm² in einer Schale mit 24 Schächten implantiert und 24 Stunden lang kultiviert, sodass die Zellen an der Schale anhaften. Anschließend werden in jeder Schale die Zellen entlang einer Linie abgelöst, welche eine Wunde darstellen soll und die schwimmenden Zellen werden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) sanft abgewaschen. Danach werden Nährmedien, die „Leader 1“ jeweils in einer Konzentration von 0, 5, 10, 20 und 40 µM enthalten, hinzugegeben, wobei die Beobachtungszeit jeweils 0, 12, 24 oder 48 Stunden ab dem Zeitpunkt der Zugabe des Extrakts beträgt, wobei die Gruppe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) 0 µM des Extrakts enthält und als Kontrollgruppe dient. Die Probenentwicklung wird durch Fotografie dokumentiert. First, the lung cancer cells A549 are cultured by the method of cultivating cells according to the first embodiment. After rinsing with trypsin, the cells are implanted at an implantation density of 2 × 10 ⁷ cells / cm ² in a 24-well dish and cultured for 24 hours so that the cells adhere to the dish. Subsequently, in each dish, the cells are peeled along a line intended to be a wound and the floating cells are gently washed off with phosphate buffered saline (PBS). Thereafter, nutrient media containing "Leader 1" each at a concentration of 0, 5, 10, 20 and 40 μM are added, the observation time being 0, 12, 24 or 48 hours from the time of addition of the extract, respectively the group containing dimethyl sulfoxide (DMSO) contains 0 μM of the extract and serves as a control group. Sample development is documented by photography.

3 zeigt eine schematische Darstellung des Einflusses des Expressionsspiegels des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Wundenheilungsfähigkeit der Lungenkrebszellen. Wie in 3 gezeigt, unterdrückt das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ die Fähigkeit der Lungenkrebszellen zur Selbstheilung von Wunden wirksam, wobei die Wirkung bei der höchsten Konzentration von 40µM besonders gut ist. 3 shows a schematic representation of the influence of the expression level of the inventive extract "Leader 1" on the wound healing capacity of lung cancer cells. As in 3 As shown, the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment effectively suppresses the ability of the lung cancer cells to self-heal wounds, the effect being particularly good at the highest concentration of 40 μM.

Sechstes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ auf die Migration der Lungenkrebszelle A549 Sixth embodiment: Test of the effect of the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment on the migration of lung cancer cell A549

Das Migrationsvermögen der Lungenkrebszelle wird mit einem Schalensatz mit 24 Schächten (24-well transwell kit, Millipore) analysiert. The migration capacity of the lung cancer cell is analyzed using a 24-well set of shells (24-well transwell kit, Millipore).

Zuerst werden die Lungenkrebszellen A549 nach dem Verfahren zur Kultivierung von Zellen gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel kultiviert. Nach Spülen mit Trypsin werden die Zellen bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in einer Schale mit 6 Schächten implantiert und 24 Stunden lang kultiviert, sodass die Zellen an der Schale anhaften. Darauffolgend werden Nährmedien, die die chemische Verbindung „Leader 1“ jeweils mit einer Konzentration von 0, 5, 10, 20 und 40 µM enthalten, hinzugegeben (die Gruppe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und entsprechend 0 µM des Extrakts dient als Kontrollgruppe). Die Zellen werden danach mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgespült und mit Trypsin abgelöst. Die Zellen werden in ein Zentrifugationsrohr eingefüllt und bei einer Geschwindigkeit von 1.280 von 0 µM drei Minuten lang zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Zudem wird das an den Zellen verbleibende Serum mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) langsam abgespült. Dann werden die Zellen bei der Geschwindigkeit von 1.280 U/min drei Minuten lang zentrifugiert. Die Zellen werden bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in Nährmedien mit fetalem Rinderserum getränkt, wobei die obere Schicht der Schächte mit 200µl an 0,1%-igen fetalem Rinderserum gefüllt wird, während für die untere Schicht derselben Nährmedien ein 20%-iges fetales Rinderserum eingesetzt wird, wobei das fetale Rinderserum mit oder ohne TNF-α eingeleitet werden kann. Die Nährmedien werden in einem Brutschrank gelagert und 12 oder 24 Stunden lang beobachtet. First, the lung cancer cells A549 are cultured by the method of cultivating cells according to the first embodiment. After rinsing with trypsin, the cells are implanted at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² in a 6-well dish and cultured for 24 hours so that the cells adhere to the dish. Subsequently, nutrient media containing the chemical compound "Leader 1" each at a concentration of 0, 5, 10, 20 and 40 μM are added (the group with dimethyl sulfoxide (DMSO) and corresponding to 0 μM of the extract serves as a control group). The cells are then rinsed with phosphate buffered saline (PBS) and detached with trypsin. The cells are loaded into a centrifugation tube and centrifuged at a speed of 1280 of 0 μM for three minutes to remove the supernatant. In addition, the serum remaining on the cells is slowly rinsed off with phosphate-buffered saline (PBS). Then, the cells are centrifuged at the speed of 1,280 rpm for three minutes. The cells are imbibed with fetal bovine serum at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² in nutrient media, with the upper layer of the wells being filled with 200 μl of 0.1% fetal bovine serum, while for the lower layer of the same nutrient media 20% fetal bovine serum is used, whereby the fetal bovine serum with or without TNF-α can be initiated. The nutrient media are stored in an incubator and observed for 12 or 24 hours.

Die Schächte werden herausgenommen und langsam mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) angefeuchtet, wobei die Zellen an der oberen Schicht, welche die Löcher nicht durchdrungen haben, mit Wattestäbchen entfernt werden. Weiter werden die Schächte mit Methanol bedeckt, befestigt und nach 20 Minuten zum Trocknen aufgehängt. Dann werden die Schächte in einem Giemsa-Färbereagenz eingeweicht und 20 Minuten lang gefärbt. Die Schächte werden erneut einige Minuten in doppelt destilliertem Wasser eingeweicht und zum Trocknen aufgehängt, wobei die Migration der Zellen unter Einsatz eines Mikroskops beobachtet, durch Fotografie dokumentiert und mithilfe von sigma plot 10.0 statistisch abgebildet wird. The wells are removed and moistened slowly with double distilled water (ddH ₂ O), with the cells on the top layer, which have not penetrated the holes, are removed with cotton swabs. Next, the wells are covered with methanol, fixed and hung after 20 minutes to dry. Then the wells are soaked in a Giemsa staining reagent and stained for 20 minutes. The wells are again soaked in double-distilled water for a few minutes and hung to dry, with cell migration monitored using a microscope, photographed and statistically mapped using sigma plot 10.0.

4A und 4B zeigen eine schematische Darstellung des Expressionsspiegels unter dem Einfluss des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Migrationsfähigkeit der Lungenkrebszellen, wobei das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ die Migrationsfähigkeit der Lungenkrebszellen wirksam unterdrücken kann, wobei die Wirkung bei der höchsten untersuchten Konzentration von 40µM besonders ausgeprägt ist. 4A and 4B show a schematic representation of the expression level under the influence of the extract according to the invention "Leader 1" on the migration capacity of the lung cancer cells, wherein the extract obtained according to the second embodiment "Leader 1" the migration ability of Effectively suppress lung cancer cells, the effect is particularly pronounced at the highest concentration of 40μM examined.

Siebtes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ auf das Eindringen der Lungenkrebszelle A549 Seventh Embodiment Test of the effect of the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment on the invasion of the lung cancer cell A549

Die Eindringfähigkeit der Lungenkrebszelle wird mit einem Schalensatz mit 24 Schächten (24-well transwell kit, Millipore) analysiert. The penetrability of the lung cancer cell is analyzed using a 24-well set of shells (24-well transwell kit, Millipore).

Das Angriffsvermögen der Lungenkrebszelle wird mit einem Schalensatz mit 24 Schächten analysiert. Zuerst wird Matrigel (Matrigel, 3 mg/ml-well, BD science) in die obere Schicht der Schächte eingegeben. Dann werden die Schächte im Brutschrank 24 Stunden lang gelagert, sodass das Matrigel fest wird. Somit stehen die Schächte zur Verfügung. The aggressiveness of the lung cancer cell is analyzed with a set of 24 wells. First, Matrigel (Matrigel, 3mg / ml-well, BD science) is placed in the top layer of the wells. Then the shafts are stored in the incubator for 24 hours, so that the Matrigel is firm. Thus, the shafts are available.

Zuerst werden die Lungenkrebszellen A549 nach dem Verfahren zur Kultivierung von Zellen gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel kultiviert. Nach Abnehmen der Zellen mit Trypsin werden die Zellen bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in einer Schale mit 6 Schächten implantiert und 24 Stunden lang kultiviert, sodass die Zellen an der Schale anhaften. Darauffolgend werden Nährmedien, die die chemische Verbindung „Leader 1“ jeweils in einer Konzentration von 0, 5, 10, 20 und 40 µM enthalten, hinzugegeben (die Gruppe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und 0 µM des Extrakts dient dabei als Kontrollgruppe), und die Zellen werden nach der 24-stündigen Kultivierung mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgespült und mit Trypsin abgelöst. Die Zellen werden in ein Zentrifugationsrohr eingefüllt und bei einer Geschwindigkeit von 1.280 U/min drei Minuten lang zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Zudem wird das an den Zellen zurückbleibende Serum mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) langsam abgespült. Weiter werden die Zellen bei einer Geschwindigkeit von 1.280 U/min drei Minuten lang zentrifugiert. Die Zellen werden bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² mit einem Nährmedium versetzt, wobei eine obere Schicht eines Nährmediums in den Schächten mit 200µl eines 0,1%-igen fetalem Rinderserums versetzt wird, während für die untere Schicht derselben Nährmedien ein 20%-iges fetales Rinderserum eingesetzt wird. Die Nährmedien werden in einem Brutschrank gelagert und 12 oder 24 Stunden lang beobachtet. First, the lung cancer cells A549 are cultured by the method of cultivating cells according to the first embodiment. After removing the cells with trypsin, the cells are implanted at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² in a 6-well dish and cultured for 24 hours so that the cells adhere to the dish. Subsequently, nutrient media containing the chemical compound "Leader 1" each at a concentration of 0, 5, 10, 20 and 40 μM are added (the group with dimethyl sulfoxide (DMSO) and 0 μM of the extract serves as a control group), and After 24 hours of culture, the cells are rinsed with phosphate buffered saline (PBS) and replaced with trypsin. The cells are loaded into a centrifugation tube and centrifuged at a speed of 1280 rpm for three minutes to remove the supernatant. In addition, the serum remaining on the cells is slowly rinsed off with phosphate-buffered saline (PBS). Further, the cells are centrifuged at a speed of 1,280 rpm for three minutes. The cells are supplemented with a nutrient medium at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² , with 200 μl of a 0.1% fetal bovine serum being added to an upper layer of a nutrient medium in the wells, while for the lower layer of the same nutrient media a 20% fetal bovine serum is used. The nutrient media are stored in an incubator and observed for 12 or 24 hours.

Die Schächte werden herausgenommen und langsam mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) angefeuchtet, wobei die Zellen an der oberen Schicht, die die Löcher nicht durchdrungen haben, mit Wattestäbchen entfernt werden. Danach werden die Schächte mit Methanol bedeckt, befestigt und für 20 Minuten zum Trocknen aufgehängt. Anschließend werden die Schächte in Giemsa-Reagenz eingeweicht und 20 Minuten lang gefärbt. Die Schächte werden erneut in doppelt destilliertem Wasser ein paar Minuten eingeweicht und zum Trocknen aufgehängt, wobei das Eindringen der Zellen unter Einsatz eines Mikroskops beobachtet, durch Fotografie dokumentiert und mithilfe von sigma plot 10.0 statistisch abgebildet wird. The wells are removed and moistened slowly with double distilled water (ddH ₂ O) with the cells on the top layer, which have not penetrated the holes, removed with cotton swabs. Thereafter, the wells are covered with methanol, fixed and hung to dry for 20 minutes. The wells are then soaked in Giemsa's reagent and stained for 20 minutes. The wells are re-soaked in double-distilled water for a few minutes and hung to dry, observing the penetration of the cells using a microscope, photographed and statistically mapped using sigma plot 10.0.

5 zeigt schematisch den Einfluss des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf das Eindringvermögen der Lungenkrebszellen, wobei sich das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ zur Unterdrückung des Eindringvermögens der Lungenkrebszellen als wirksam erweist, wobei die Wirkung für eine Konzentration von 40µM besonders ausgeprägt ist. 5 12 schematically shows the influence of the extract "Leader 1" according to the invention on the permeability of the lung cancer cells, wherein the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment proves to be effective in suppressing the permeability of the lung cancer cells, the effect being particularly pronounced for a concentration of 40 μM is.

Achtes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ zur Unterdrückung der Matrixmetalloprotease der Lungenkrebszelle A549 Eighth embodiment: Test of the effect of the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment for suppressing the matrix metalloprotease of the lung cancer cell A549

Die Hydrolase wird elektrophoretisch getestet. Mit der Gelatin-Zymographie wird die Enzymaktivität der Gelatinasen (englisch: gelatinases; MMP-2, MMP-9) in den Matrixmetalloproteasen (MMP) in der Lungenkrebszelle analysiert. The hydrolase is tested electrophoretically. Gelatin zymography analyzes the enzyme activity of gelatinases (MMP-2, MMP-9) in the matrix metalloproteinase (MMP) in the lung cancer cell.

Zuerst werden die Lungenkrebszellen A549 nach dem Verfahren zur Kultivierung von Zellen gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel kultiviert. Nach Abnehmen der Zellen mit Trypsin werden die Zellen bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in einer Schale mit 12 Schächten implantiert und 24 Stunden lang kultiviert, sodass die Zellen an der Schale anhaften. Darauffolgend werden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgespült. 24 Stunden nach der Zugabe der Zellen in ein Nährmedium, das die chemische Verbindung „Leader 1“ jeweils in einer Konzentration von 0, 5, 10, 20 und 40 µM enthält, werden die Zellen in Nährmedien mit 1%-igen fetalem Rinderserum zugegeben, in dem die Kultivierung weitere 24 Stunden lang durchgeführt werden soll. Eine geringe Menge einer Nährlösung für die Zellenkultur wird in das Zentrifugationsrohr gegeben und bei einer Geschwindigkeit von 1.250 U/min zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und bei –20°C aufbewahrt. First, the lung cancer cells A549 are cultured by the method of cultivating cells according to the first embodiment. After removing the cells with trypsin, the cells are implanted at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² in a 12-well dish and cultured for 24 hours so that the cells adhere to the dish. Subsequently, the cells are rinsed twice with phosphate buffered saline (PBS). 24 hours after the addition of the cells into a nutrient medium containing the chemical compound "Leader 1" in each case in a concentration of 0, 5, 10, 20 and 40 μM, the cells are added in nutrient media with 1% fetal bovine serum, in which the cultivation is to be carried out for a further 24 hours. A small amount of a nutrient solution for cell culture is added to the centrifugation tube and centrifuged at a speed of 1,250 rpm for ten minutes. The supernatant is removed and stored at -20 ° C.

Eine gleiche Menge von dem Überstand wird zusammen mit einem 6x-Matrixmetalloprotease-Farbstoff (6x MMP dye) in 8%-Gradienten-Elektrophorese-Gel-Schächte (SDS-PAGE, enthaltend Gelatin 1mg/ml) gegeben. Ein Laufpuffer wird zu der Mischung hinzugefügt, und die Reaktion wird beendet, nachdem 45kD von einer MMP-Kennzeichnung mit einem Strom von 80V und 300mA in dem Gel gelöst wordenist. An equal amount of the supernatant is added along with a 6x matrix metalloprotease dye (6x MMP dye) in 8% gradient electrophoresis gel wells (SDS-PAGE containing gelatin 1mg / ml). A running buffer is added to the mixture, and the reaction is terminated after 45kD of MMP labeling with a current of 80V and 300mA has been dissolved in the gel.

Das Gel wird abgenommen und wirkt in einem Zymogramm-Renaturisierungspuffer (englisch: zymogram renaturing buffer) bei 35 U/min. Bei Raumtemperatur wird das Verfahren zweimal durchgeführt, jeweils 30 Minuten lang. Wenn das SDS entfernt worden ist, wird das Gel mit einem Zymogramm-Entwicklungspuffer versetzt, welcher bei 35 U/min und 37°C für 20 bis 24 Stunden einwirkt und danach entfernt wird. Anschließend wird das Gel mit Coomassie-Blau (coomassie blue R-250) 30 Minuten lang gefärbt, in doppelt destilliertem Wasser eingeweicht und bleibt bis zum folgenden Tag mit dem doppelt destillierten Wasser bedeckt. Danach wird das Gel auf eine Messplatte eines Digital-Bild-Analysators (Chemi-smart 3000) gelegt, fotografiert und analysiert. Mithilfe von sigma plot 10.0 werden die Ergebnisse statistisch abgebildet. The gel is removed and acts in a zymogram renaturing buffer at 35 rpm. At room temperature, the procedure is carried out twice, each for 30 minutes. When the SDS has been removed, the gel is treated with a zymogram development buffer, which is applied at 35 rpm and 37 ° C for 20 to 24 hours and then removed. The gel is then stained with Coomassie Blue (coomassie blue R-250) for 30 minutes, soaked in double-distilled water, and covered with the double-distilled water until the following day. The gel is then placed on a measuring plate of a digital image analyzer (Chemi-smart 3000), photographed and analyzed. With the help of sigma plot 10.0 the results are displayed statistically.

6 und 6A zeigen eine schematische Darstellung des Einflusses des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf die Matrixmetalloproteasen der Lungenkrebszellen, wobei das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ die Experession der Matrixmetalloproteasen MMP-2 und MMP-9 der Lungenkrebszellen wirksam unterdrückt, wobei die Wirkung für eine Konzentration von 40µM besonders gut ist. 6 and 6A show a schematic representation of the influence of the extract "Leader 1" according to the invention on the matrix metalloproteases of the lung cancer cells, wherein the extract obtained according to the second embodiment "Leader 1" effectively suppresses the experiment of the matrix metalloproteases MMP-2 and MMP-9 of lung cancer cells, the effect especially good for a concentration of 40μM.

Neuntes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ zur Unterdrückung der Expression des Plasminogen-Aktivators der Lungenkrebszelle A549 Ninth Embodiment Test of the effect of the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment for suppressing the expression of the plasminogen activator of the lung cancer cell A549

Die Hydrolase wird elektrophoretisch getestet. Der Anteil an Plasminogen in einer Casein-Zymographie wird verwendet, um die Enzymaktivität des Urokinase-Plasminogen-Aktivators (englisch: urokinase-type plasminogen activator, uPA) in der Lungenkrebszelle zu analysieren, wobei der Urokinase-Plasminogen-Aktivator Plasminogen in Plasmin abbaut. The hydrolase is tested electrophoretically. The proportion of plasminogen in a casein zymography is used to analyze the enzyme activity of the urokinase-type plasminogen activator (uPA) in the lung cancer cell, wherein the urokinase plasminogen activator degrades plasminogen into plasmin.

Zuerst werden die Lungenkrebszellen A549 nach dem Verfahren zur Kultivierung von Zellen gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel kultiviert. Nach Abnehmen der Zellen mit Trypsin werden die Zellen bei einer Implantationsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/cm² in einer Schale mit 12 Schächten implantiert und 24 Stunden lang kultiviert, sodass die Zellen an der Schale anhaften. Darauffolgend werden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgespült. 24 Stunden nach der Zugabe der Zellen in ein Nährmedium, das die chemische Verbindung „Leader 1“ jeweils in einer Konzentration von 0, 5, 10, 20 und 40 µM enthält, werden die Zellen in Nährmedien mit 1%-igen fetalem Rinderserum zugegeben, in dem die Kultivierung weitere 24 Stunden lang durchgeführt werden soll. Eine geringe Menge einer Nährlösung, die Zellen enthält, wird in ein Zentrifugationsrohr gegeben und bei einer Geschwindigkeit von 1.250 U/min zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und bei –20°C aufbewahrt. First, the lung cancer cells A549 are cultured by the method of cultivating cells according to the first embodiment. After removing the cells with trypsin, the cells are implanted at an implantation density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² in a 12-well dish and cultured for 24 hours so that the cells adhere to the dish. Subsequently, the cells are rinsed twice with phosphate buffered saline (PBS). 24 hours after the addition of the cells into a nutrient medium containing the chemical compound "Leader 1" in each case in a concentration of 0, 5, 10, 20 and 40 μM, the cells are added in nutrient media with 1% fetal bovine serum, in which the cultivation is to be carried out for a further 24 hours. A small amount of a nutrient solution containing cells is placed in a centrifugation tube and centrifuged at a speed of 1,250 rpm for ten minutes. The supernatant is removed and stored at -20 ° C.

Eine gleiche Menge von dem Überstand wird zusammen mit einem 6x-Matrixmetallproteasen-Farbstoff (6x MMP dype) in 8%-Gradienten-Elektrophorese-Gel-Schächte (Plasminogen 15 µl/ml und Casein 1mg/ml) eingefügt. Ein Laufpuffer wird zu der Mischung zugegeben und die Reaktion wird angehalten, nachdem 45kD von einer MMP-Kennzeichnung mit einem Strom von 80V und 300mA in dem Gel gelöst worden ist. An equal amount of the supernatant is added along with a 6x matrix metalloproteinase dye (6x MMP dype) to 8% gradient electrophoresis gel wells (plasminogen 15 μl / ml and casein 1mg / ml). A running buffer is added to the mixture and the reaction is stopped after 45kD of an MMP label having a current of 80V and 300mA has been dissolved in the gel.

Das Gel wird abgenommen und in einem Zymogramm-Renaturisierungspuffer (englisch: zymogram renaturing buffer) bei 35 U/min versetzt. Das Verfahren wird bei Raumtemperatur zweimal durchgeführt, jeweils 30 Minuten lang. Nachdem das in dem Gel enthaltene SDS entfernt worden ist, wird das Gel mit einem Zymogramm-Entwicklungspuffer bei 35 U/min und 37°C eingelegt, wobei der Zymogramm-Entwicklungspuffer nach 20 bis 24 Stunden entfernt wird, mit Coomassie-Blau (coomassie blue R-250) 30 Minuten lang gefärbt wird, in doppelt destilliertem Wasser eingeweicht wird und bis zum folgenden Tag im doppelt destilliertem Wasser bedeckt bleibt. Danach wird das Gel auf eine Messplatte eines Digital-Bild-Analysators (Chemi-smart 3000) gelegt, fotografiert und analysiert. Mithilfe von sigma plot 10.0 werden die Ergebnisse statistisch abgebildet. The gel is removed and spiked in a zymogram renaturing buffer at 35 rpm. The procedure is carried out twice at room temperature, for 30 minutes each. After the SDS contained in the gel has been removed, the gel is loaded with a zymogram development buffer at 35 rpm and 37 ° C, with the zymogram development buffer removed after 20 to 24 hours, with Coomassie blue (coomassie blue R-250) for 30 minutes, soaked in double-distilled water and kept covered in double-distilled water until the following day. The gel is then placed on a measuring plate of a digital image analyzer (Chemi-smart 3000), photographed and analyzed. With the help of sigma plot 10.0 the results are displayed statistically.

7 zeigt den Einfluss des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf das Expressionsvermögen des Plasminogenaktivators in den Lungenkrebszellen, wobei sich das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ zur Unterdrückung des Expressionsvermögens des Plasminogenaktivators der Lungenkrebszellen eignet, wobei die Wirkung bei einer Konzentration von 40µM besonders ausgeprägt ist. 7 shows the influence of the inventive extract "Leader 1" on the expression capacity of the plasminogen activator in the lung cancer cells, wherein the extract obtained according to the second embodiment "Leader 1" for suppressing the expression capacity of the plasminogen activator of the lung cancer cells is, the effect at a concentration of 40μM is particularly pronounced.

Zehntes Ausführungsbeispiel: Test der Wirkung des gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnenen Extrakts „Leader 1“ auf die Steuerung der relevanten Proteine, die eine Metastasierung der Lungenkrebszelle A549 fördern Tenth embodiment: Test of the effect of the extract "Leader 1" obtained according to the second embodiment on the control of the relevant proteins which promote metastasis of the lung cancer cell A549

Nachdem die gesamten Proteine der Zelle gewonnen worden sind, wird eine gleiche Menge von Proteinen in die 8–10%igen Gradienten-Elektrophorese-Gel-Schächte gegeben und die Proteine mit einem Strom von 80V und 300mA 240 Minuten lang getrennt. Die nach der Größe getrennten Proteine werden mit einem Strom von 100V zwei Stunden lang auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) konzentriert. Danach wird die PVDF-Membran eine Stunde lang mit einem Blockierpuffer zur Reaktion gebracht, wobei der Blockierpuffer 10% w/v Magermilchpulver in einem TBS-T-Puffer und der TBS-T-Puffer einen TBS-Puffer mit 0.1% Tween 20 enthält. After the entire proteins of the cell have been recovered, an equal amount of proteins are added to the 8-10% gradient electrophoresis gel wells and the proteins separated at a current of 80V and 300mA for 240 minutes. The size-separated proteins are concentrated on polyvinylidene fluoride (PVDF) at 100V for two hours. Thereafter, the PVDF membrane is reacted for one hour with a blocking buffer, the blocking buffer containing 10% w / v skimmed milk powder in a TBS-T buffer and the TBS-T buffer containing a TBS buffer containing 0.1% Tween 20.

Anschließend wird die PVDF-Membran in eine Antikörper-Lösung von Aktin (Cell signaling Co.), eine Antikörper-Lösung von p-Akt oder Proteinkinase B (1:1000, Cell signaling Co.), eine Antikörper-Lösung von E-Cadherin (1:1000, Cell signaling Co.), eine Antikörper-Lösung von MMP-2,9 in Matrixmetalloprotease (1:1000, Santa Cruz Co.) und eine Antikörper-Lösung von TIMP-1 (1:1000, Cell signaling Co.) eingetaucht. Nachdem die Antikörperlösungen bei 4°C 12 bis 24 Stunden lang reagiert haben, werden sie in einen Kühlschrank bei –20°C zurückgestellt. Weiter wird ein TBS-T-Puffer mit 0.1% zur dreimaligen Spülung eingesetzt, um unspezifisch gebundene Antikörper und Antigene abzuspülen. Subsequently, the PVDF membrane is transformed into an antibody solution of actin (Cell Signaling Co.), an antibody solution of p-Akt or protein kinase B (1: 1000, Cell Signaling Co.), an antibody solution of E-cadherin (1: 1000, Cell Signaling Co.), an antibody solution of MMP-2.9 in matrix metalloprotease (1: 1000, Santa Cruz Co.) and an antibody solution of TIMP-1 (1: 1000, Cell Signaling Co .) immersed. After reacting at 4 ° C for 12 to 24 hours, the antibody solutions are returned to a refrigerator at -20 ° C. Furthermore, a 0.1% TBS-T buffer is used for three flushes to rinse off unspecifically bound antibodies and antigens.

Anschließend wird die PVDF-Membran in eine Anti-Maus-Sekundär-Antikörper-Lösung, die eine Meerrettichperoxidase enthält, und eine Anti-Kannichen-Sekundär-Antikörper-Lösung eingetaucht und bei Zimmertemperatur 1 bis 2 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Danach werden die Antikörper-Lösungen gesammelt und mit 0.1%-igen TBS-T-Puffer dreimal gespült. Weiter wird ein Chemilumineszenz-Verstärker-Reagenz (ECL) eingesetzt, um die Fluoreszenz-Intensität aller Gruppen zu messen, wobei der Expressionsspiegel des β-Aktin-Proteins hier als Kontrollgruppe dient. Die Ergebnisse werden mit Hilfe von sigma plot 10.0 statistisch abgebildet. Subsequently, the PVDF membrane is immersed in an anti-mouse secondary antibody solution containing a horseradish peroxidase and an anti-canker secondary antibody solution and allowed to react at room temperature for 1 to 2 hours. Thereafter, the antibody solutions are collected and rinsed three times with 0.1% TBS-T buffer. Furthermore, a chemiluminescence enhancer reagent (ECL) is used to measure the fluorescence intensity of all groups, with the expression level of the β-actin protein serving as the control group here. The results are statistically mapped using sigma plot 10.0.

8 und 8A zeigen eine schematische Darstellung des Einflusses des erfindungsgemäßen Extrakts „Leader 1“ auf das Expressionsvermögen der relevanten Proteasen und Proteine, die eine Metastasierung der Lungenkrebszellen fördern, wobei sich das gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel gewonnene Extrakt „Leader 1“ zur Unterdrückung des Expressionsvermögens der relevanten Proteasen und Proteine, die eine Metastasierung der Lungenkrebszellen fördern, eignet. 8th and 8A show a schematic representation of the influence of the inventive extract "Leader 1" on the expression of the relevant proteases and proteins that promote metastasis of the lung cancer cells, wherein the extract obtained according to the second embodiment "Leader 1" for suppressing the expression of the relevant proteases and Proteins that promote metastasis of lung cancer cells is suitable.

Somit stellt die Erfindung ein Extrakt aus in festen Nährmedien kultivierten Mycelien von Antrodia cinnamomea und dessen Anwendung bereit, wobei das Extrakt 2,3,6-Trimethoxy-4-Methylphenol beinhaltet und auch Leader 1 genannt wird. Leader 1 unterdrückt die Bewegung, die Migration und das Eindringen der Lungenkrebszellen effektiv und erweist sich somit als sehr wirksam bei der Bekämpfung der Metastasierung eines Lungentumors. So zeigt Leader 1 eine exzellente Fähigkeit zur Bekämpfung der physiologischen Aktivität und des Mechanismus der Metastasierung eines Lungentumors. Thus, the invention provides an extract of solid culture media-cultured mycelia of Antrodia cinnamomea and its use, wherein the extract includes 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol and is also called Leader 1. Leader 1 effectively suppresses the movement, migration and invasion of lung cancer cells and thus proves to be very effective in combating the metastasis of a lung tumor. Thus, Leader 1 shows an excellent ability to combat the physiological activity and mechanism of metastasis of a lung tumor.

Obwohl die vorliegende Erfindung anhand der Ausführungsbeispiele detailliert beschrieben worden ist, ist für den Fachmann selbstverständlich, dass die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt ist, sondern dass vielmehr Abwandlungen in der Weise möglich sind, dass einzelne Merkmale weggelassen oder andersartige Kombinationen von Merkmalen verwirklicht werden können, ohne den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche zu verlassen. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung schließt sämtliche Kombinationen der vorgestellten Einzelmerkmale mit ein. Although the present invention has been described in detail with reference to the embodiments, it will be understood by those skilled in the art that the invention is not limited to these embodiments, but rather modifications are possible in the manner that individual features omitted or other combinations of features can be realized without departing from the scope of the appended claims. The scope of the present invention includes all combinations of the individual features presented.

Claims

A method for producing an extract from solid culture medium cultured mycelia of Antrodia cinnamomea comprising the steps of: To provide a dried, solid culture medium cultured mycelium of Antrodia cinnamomea, and B1: Extraction of the dried Mycelium of Antrodia cinnamomea cultured in solid culture media in ethanol at a certain temperature.

A process for producing an extract according to claim 1, characterized in that a cold air stream is used to dry the cultured in solid culture media mycelium Antrodia cinnamomea.

Process for the preparation of an extract according to Claim 1, characterized in that the temperature is between 25 ° C and 40 ° C.

A process for producing an extract according to claim 1, characterized in that the concentration of the ethanol is at a volume fraction of 95%.

A method for producing an extract from solid culture medium cultured mycelia of Antrodia cinnamomea comprising the steps of: A2: providing a dried Mycelium of Antrodia cinnamomea cultured in solid nutrient media, - B2: extracting the dried, solid culture medium-cultivated mycelium of Antrodia cinnamomea in ethanol at a certain temperature to obtain an ethanol extract, - C2: concentrate the ethanol extract to obtain a concentrated product, and D2: Extraction of the concentrated product with ethyl acetate and water to obtain an ethyl acetate extract.

A process for producing an extract according to claim 5, characterized in that for drying the cultured in solid media mycelium of Antrodia cinnamomea a cold air flow is used.

Process for the preparation of an extract according to claim 5, characterized in that the ethanol extract is concentrated in vacuo.

Process for the preparation of an extract according to Claim 5, characterized in that the temperature is between 25 ° C and 40 ° C.

A process for producing an extract according to claim 5, characterized in that the concentration of the ethanol is at a volume fraction of 95% or that the concentration of the ethyl acetate is at a volume fraction of 100%.

Extract prepared by the process of any one of the preceding claims.

Use of the extract according to claim 10, characterized in that the extract serves to combat metastasis of lung cancer cells.

Use according to claim 11, characterized in that the extract serves to suppress the migration of the lung cancer cells in order to suppress metastasis of the lung cancer cells.

Use according to claim 11, characterized in that the extract serves to suppress the penetration of the lung cancer cells in order to suppress metastasis of the lung cancer cells.

Use according to claim 11, characterized in that the extract is obtained by reducing the protein kinase B (p-Akt) and the gelatinases in the matrix metalloprotease (MMP-2m MMP-9) and increasing the performance of E-cadherin and the tissue proteases of the metal protease (TIMP-1) suppresses migration and invasion of lung cancer cells.

Use of 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol in combating metastasis of lung cancer cells wherein 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol is the extract of claim 10 or by the method of any one of claims 1 to 10, the extract thus having the following structural formula:

Use according to claim 15, characterized in that the extract serves to suppress the migration and penetration of lung cancer cells in order to suppress metastasis of the lung cancer cells.

Use according to claim 15, characterized in that 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol reduces the protein kinase B (p-Akt) as well as the gelatinases in the matrix metalloprotease (MMP-2m MMP-9) and the performance of E-cadherin and the tissue suppressors of the metalloprotease (TIMP-1).

A method of combating metastasis of a lung cancer tumor, wherein the tester is brought into contact with the extract of claim 10 or with 2,3,6-trimethoxy-4-methylphenol.