DE102014104735B4 - Process for the light-directed production of covalent conjugates - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur lichtgesteuerten Erzeugung von kovalenten Konjugaten zwischen jeweils zwei Molekülen gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur durch eine lichtgesteuerte Additionsreaktion, vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition, zur kovalenten Verbindung zwischen zwei gleichen oder unterschiedlichen funktionellen Gruppen, ausgewählt aus den funktionellen Gruppen von Maleimid-Derivaten und/oder deren 2- und/oder 3-substituierten Derivaten, wobei die Derivatmoleküle als die mit den genannten funktionellen Gruppen ausgestatteten zu verbindenen Moleküle gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur jeweils eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen, und als Moleküle, die zusammen mit den funktionellen Gruppen die Derivatmoleküle bilden, bioaktive Moleküle, insbesondere Moleküle von Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren (RNA, DNA), Polysacchariden, Lipiden oder kleinen organischen Molekülen und Polymeren, und/oder synthetische Polymere und/oder Moleküle von niedrigem Molekulargewicht, insbesondere Wirkstoffmoleküle, und/oder Farbstoffmoleküle, insbesondere Fluorophore, oder Derivatmoleküle, die neben den für die Additionsreaktion notwendigen funktionellen Gruppen Farbstoffgruppen, insbesondere fluorophore Gruppen, enthalten, und/oder Moleküle von Biotin und/oder von Biotin-Analoga und/oder Molekülen einer Substratoberfläche, insbesondere von Glas, eingesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Additionsreaktion, vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition, als eine Zwei-Photonen-Reaktion bei einer Wellenlänge im Bereich von λ = 600 bis 900 nm stattfindet.Process for the light-controlled generation of covalent conjugates between two molecules of the same or different chemical nature by a light-controlled addition reaction, preferably a 2-2-cycloaddition, for the covalent connection between two identical or different functional groups selected from the functional groups of maleimide derivatives and or their 2- and / or 3-substituted derivatives, wherein the derivative molecules each having one or more functional groups as the molecules of the same or different chemical nature provided with said functional groups, and as molecules which together with the functional groups the derivative molecules form bioactive molecules, especially molecules of peptides, proteins, nucleic acids (RNA, DNA), polysaccharides, lipids or small organic molecules and polymers, and / or synthetic polymers and / or low mole molecules kulargewicht, in particular drug molecules, and / or dye molecules, in particular fluorophores, or derivative molecules containing in addition to the functional groups necessary for the addition reaction dye groups, in particular fluorophore groups, and / or molecules of biotin and / or biotin analogues and / or molecules a substrate surface, in particular glass, are used, characterized in that the addition reaction, preferably a 2-2-cycloaddition, takes place as a two-photon reaction at a wavelength in the range of λ = 600 to 900 nm.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur lichtgesteuerten Erzeugung von kovalenten Konjugaten zwischen jeweils zwei Molekülen gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur durch eine lichtgesteuerte Additionsreaktion, vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition. Die vorgeschlagenen Bedingungen für die Reaktion der Konjugatbildung ermöglichen die Anwendung des Verfahrens für die räumlich und zeitlich gesteuerte Erzeugung von Materialien sowie eine in situ Konjugation in lebender Materie, zum Beispiel Gewebe. Das Verfahren kann bei der zweidimensionalen und dreidimensionalen Stukturierung, der Manipulation und der Funktionalisierung angewendet werden.The present invention relates to a method for the light-controlled generation of covalent conjugates between in each case two molecules of the same or different chemical nature by a light-controlled addition reaction, preferably a 2-2 cycloaddition. The proposed conditions for the conjugate reaction allow the use of the method for the spatially and temporally controlled generation of materials as well as in situ conjugation in living matter, for example tissue. The method can be applied to two-dimensional and three-dimensional structuring, manipulation and functionalization.
Der Nutzen der Material- und Polymerwissenschaft für biologische und medizinische Anwendungen liegt üblicherweise in der Möglichkeit, verschiedene biologische Aktivitäten zu implementieren, was normalerweise durch kovalente oder nicht-kovalente Konjugation an den Materialien oder Polymermatrizen erreicht wird (Nature biotechnology 2005 (23) 47 bis 55). Unter verschiedenen vorgeschlagenen Techniken ist die Click-Chemie der vielversprechendste Ansatz für die Schaffung von kovalenten Konjugaten, während die Peptid-Dimerisierung und die Ligand-Protein-Wechselwirkung für die nicht-kovalente Konjugation eingesetzt werden (Chem. Rev., 2013, 113 (7), 4905–4979). Obwohl die Effizienz einer solchen chemischen Reaktion sehr hoch ist, fehlt deren Chemie eine starke räumliche und zeitliche Kontrolle über die Konjugation der bioaktiven Komponenten, da die Reaktion innerhalb des gesamten Volumens der Reaktionsmischung auftritt. The utility of materials and polymer science for biological and medical applications is usually the ability to implement various biological activities, which is usually achieved by covalent or noncovalent conjugation to the materials or polymer matrices (Nature biotechnology 2005 (23) 47-55 ). Among several proposed techniques, click chemistry is the most promising approach for creating covalent conjugates, while peptide dimerization and ligand-protein interaction are used for non-covalent conjugation (Chem. Rev., 2013, 113 (7th ed.) ), 4905-4979). Although the efficiency of such a chemical reaction is very high, its chemistry lacks strong spatial and temporal control over the conjugation of the bioactive components since the reaction occurs throughout the entire volume of the reaction mixture.
Als Alternative bietet sich eine lichtgesteuerte Reaktion an. Eine lichtgesteuerte Reaktion ermöglicht eine Konjugation im Bereich der Belichtung und im Fall eines Zwei-Photonen-Prozesses eine Konjugation nur im Belichtungsfokus. Die Vorteile der Anwendung einer solchen lichtgesteuerten Zwei-Photonen-Reaktion für die räumliche Material-Konjugation oder Material-Strukturierung konnte am Beispiel des lichtgesteuerten Materialabbaus und des lichtgesteuerten Entfernens von Schutzgruppen gezeigt werden. Wie in den Druckschriften Nature Materials, 2011, 799–806 und Nature Chemistry 2011 (12) 925–31 beschrieben, ermöglicht der lichtinduzierte Abbau die Strukturierung einer Hydrogel-Matrix, während der orthogonale Ansatz die lichtinduzierte Freisetzung von Biomolekülen und damit die Modulation der Zellansiedlung und -orientierung ermöglicht. Der vorgeschlagene Ansatz ist eine einfache Methode, um verschiedene Matrix-Strukturen mit definierten biochemischen Funktionalisierungen zu erzeugen, die beispielsweise die Schaffung verschiedener lokal sehr definierter Umgebungen ermöglicht, um Zellwachstum und -differenzierung zu lenken (Nature, 2012, (482) 477–8; Nature Materials 2013, 13 Oktober, 1–6). Jedoch wird hierbei die Strukturierung und Funktionalisierung durch das Entfernen von bereits erzeugtem Material und durch das Einführen von biologischen Aktivitäten mittels Entfernen von Schutzgruppen erreicht. Die lichtgesteuerte Synthese wäre eine vielversprechende Alternative zum lichtgesteuerten Materialabbau und lichtgesteuerten Entfernen von Schutzgruppen, weil die Synthese sowohl für die Erzeugung als auch für die Funktionalisierung des Materials zu jeder Zeit und in jeder Position genutzt werden kann. Die Photopolymerisation ist eine häufig verwendete Technik mit einer starken zeitlichen Kontrolle, wie unter anderem in der Druckschrift Polymer 48 (2007) 5599–5611 berichtet wird. Die Photopolymerisation erfordert aber in der Regel toxische Fotoinitiatoren und findet innerhalb des gesamten Volumens des Reaktionsgemisches mittels eines Radikalmechanismus statt, was ihre räumliche Kontrolle erheblich erschwert. Bis jetzt sind vor allem Fotolacke wie zum Beispiel Femtobond und Omocer verwendet worden, um dreidimensionale Nanostrukturen durch eine mit einem Fotoinitiator gesteuerte Polymerisationsreaktion zu erzeugen. Auch wenn die Produkte eines solchen Verfahrens biokompatibel sind, wie in der Druckschrift Adv. Mater. 2011 (23) 1341–1345 beschrieben, umfasst der Entwicklungsprozess mehrere nicht-biokompatible Schritte wie Vor- und Nach-Backen bei hohen Temperaturen, eine übermäßige Behandlung mit Lösungsmitteln wie Isopropanol und dem Zusatz von toxischen Fotoinitiatoren, wie aus der Druckschrift Adv. Funkt. Mater. 2013 (42), 6117–6122 hervorgeht. Die Anwesenheit von Fotoinitiatoren kann auch die nachfolgende Fluoreszenzmikroskopie erschweren. Darüber hinaus benötigen einige der häufig verwendeten Fotolacke eine Titan-Schicht, um Biokompatibilität zu erlangen, wie aus der Druckschrift Laser Appl. 2012 (24), 042011 bekannt ist. Deshalb war die Anwendung von lichtgesteuerten Strukturierungsverfahren in Gegenwart von lebenden Zellen und Geweben bisher kaum möglich. An alternative is a light-controlled reaction. A light-controlled reaction allows conjugation in the region of exposure and, in the case of a two-photon process, conjugation only in the exposure focus. The advantages of using such a light-controlled two-photon reaction for spatial material conjugation or material structuring could be demonstrated by the example of light-triggered material degradation and light-controlled deprotection. As described in the publications Nature Materials, 2011, 799-806 and Nature Chemistry 2011 (12) 925-31, light-induced degradation allows the structuring of a hydrogel matrix, while the orthogonal approach allows the light-induced release of biomolecules and thus the modulation of cell colonization and orientation. The proposed approach is a straightforward method to generate various matrix structures with defined biochemical functionalizations, allowing, for example, the creation of various locally highly defined environments to direct cell growth and differentiation (Nature, 2012, 482 477-8; Nature Materials 2013, 13 October, 1-6). However, structuring and functionalization are achieved by removing already generated material and introducing biological activities by deprotection. Light-directed synthesis would be a promising alternative to light-triggered degradation and light-driven deprotection because the synthesis can be used to generate and functionalize the material at any time and in any position. Photopolymerization is a commonly used technique with a high temporal control, as reported, inter alia, in Polymer 48 (2007) 5599-5611. However, the photopolymerization usually requires toxic photoinitiators and takes place within the entire volume of the reaction mixture by means of a radical mechanism, which makes their spatial control considerably more difficult. Photoresists such as Femtobond and Omocer, for example, have heretofore been used to create three-dimensional nanostructures through a photoinitiator-directed polymerization reaction. Even if the products of such a process are biocompatible, as in the document Adv. Mater. 2011 (23) 1341-1345, the development process involves several non-biocompatible steps such as pre- and post-baking at high temperatures, excessive treatment with solvents such as isopropanol, and the addition of toxic photoinitiators, as disclosed in Adv. Funct. Mater. 2013 (42), 6117-6122. The presence of photoinitiators can also complicate the subsequent fluorescence microscopy. In addition, some of the commonly used photoresists require a titanium layer to achieve biocompatibility, as described in the publication Laser Appl. 2012 (24), 042011 is known. Therefore, the application of light-directed structuring methods in the presence of living cells and tissues has hardly been possible.
Die zugrunde liegende Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, welches es ermöglicht, zeitlich und räumlich gesteuert, auch in Gegenwart eines biologischen Systems und unter physiologischen Bedingungen, Materialien durch Konjugationsreaktionen zu erzeugen und gegebenenfalls zu verändern, ohne das biologische System zu beeinträchtigen.The underlying object is to provide a method, which allows temporally and spatially controlled, even in the presence of a biological system and under physiological conditions, to generate materials by conjugation reactions and, if necessary, to change without affecting the biological system.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Dieses ist ein Verfahren zur lichtgesteuerten Erzeugung von kovalenten Konjugaten zwischen jeweils zwei Molekülen gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur. Die Erzeugung der Konjugate erfolgt durch eine lichtgesteuerte Additionsreaktion, vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition, zur kovalenten Verbindung zwischen zwei gleichen oder unterschiedlichen funktionellen Gruppen. Dabei sind die funktionellen Gruppen ausgewählt aus den funktionellen Gruppen von Maleimid-Derivaten und/oder deren 2- und/oder 3-substituierten Derivaten, wobei die Derivatmoleküle jeweils eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen. Mit dem Begriff Derivatmoleküle werden im Rahmen dieser Erfindung die mit den genannten funktionellen Gruppen ausgestatteten, zu verbindenden Moleküle gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur bezeichnet. Als Moleküle, die zusammen mit den funktionellen Gruppen die Derivatmoleküle bilden, werden bioaktive Moleküle, insbesondere Moleküle von Peptiden Proteinen, Nukleinsäuren (RNA, DNA), Polysacchariden, Lipiden oder kleinen organischen Molekülen und Polymeren, und/oder synthetische Polymere und/oder Moleküle von niedrigem Molekulargewicht, insbesondere Wirkstoffmoleküle, und/oder Farbstoffmoleküle, insbesondere Fluorophore, oder Derivatmoleküle, die neben den für die Additionsreaktion notwendigen funktionellen Gruppen Farbstoffgruppen, insbesondere fluorophore Gruppen enthalten, und/oder Moleküle von Biotin und/oder Biotin-Analoga und/oder Molekülen einer Substratoberfläche, insbesondere von Glas, eingesetzt. Erfindungsgemäß findet die Additionsreaktion als eine Zwei-Photonen-Reaktion bei einer Wellenlänge im Bereich von λ = 600 bis 900 nm, vorzugsweise bei λ = 800 nm, statt. The object of the invention is achieved by a method having the features of
Die Konzeption der vorliegenden Erfindung besteht in der räumlich und zeitlich gesteuerten Erzeugung einer starken kovalenten Bindung zwischen zwei Molekülen, die auch unter schonenden physiologischen Bedingungen durchführbar ist. Die lichtgesteuerte Additionsreaktion ist vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition, die normalerweise in einer Ein-Photonen-Reaktion in einem Wellenlängenbereich von λ = 280 bis 330 nm stattfinden würde. Vorliegend wurde aber ein Zwei-Photonen-Prozess mit Wellenlängen im Bereich von λ = 600 bis 900 nm entwickelt, um diese Reaktion durchführen zu können. Die Vorteile der Anwendung des Zwei-Photonen-Prozesses für eine Cycloadditionsreaktion gegenüber einer Ein-Photonen-Reaktion bestehen darin, dass der Wellenlängenbereich nicht mit Biopolymeren interferiert und damit die Reaktionen in der Gegenwart von lebenden Zellen und Gewebestrukturen durchgeführt werden können. Zusätzlich können mittels eines Zwei-Photonen-Prozesses räumlich und zeitlich gezielter Strukturen von Konjugaten, einschließlich zwei- und dreidimensionale Konjugatstrukturen, geschaffen sowie Oberflächen und Strukturen zweidimensional und dreidimensional funktionalisiert und verändert werden. The concept of the present invention is the spatially and temporally controlled generation of a strong covalent bond between two molecules, which is also feasible under mild physiological conditions. The light-directed addition reaction is preferably a 2-2 cycloaddition, which would normally take place in a one-photon reaction in a wavelength range of λ = 280 to 330 nm. In the present case, however, a two-photon process with wavelengths in the range of λ = 600 to 900 nm was developed in order to be able to carry out this reaction. The advantages of using the two-photon process for a cycloaddition reaction over a one-photon reaction is that the wavelength range does not interfere with biopolymers and thus the reactions can be performed in the presence of living cells and tissue structures. In addition, spatiotemporal structures of conjugates, including two-dimensional and three-dimensional conjugate structures, can be created by means of a two-photon process, and surfaces and structures can be functionalized and modified two-dimensionally and three-dimensionally.
Als Moleküle gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur, die zusammen mit den funktionellen Gruppen die Derivatmoleküle bilden, sind gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung bioaktive Moleküle vorgesehen. Dies können unter anderem Moleküle von Proteinen und Peptiden, insbesondere von Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antikörpern oder eines Proteins der Extrazellulären Matrix (ECM), sein. Des Weiteren können dies auch Moleküle von Nukleinsäuren (RNA, DNA), Polysacchariden, Lipiden oder kleinen organischen Molekülen und Polymeren sein.As molecules of the same or different chemical nature, which together with the functional groups form the derivative molecules, bioactive molecules are provided according to a preferred embodiment of the invention. These may be, inter alia, molecules of proteins and peptides, in particular cytokines, growth factors, antibodies or an extracellular matrix (ECM) protein. Furthermore, these may also be molecules of nucleic acids (RNA, DNA), polysaccharides, lipids or small organic molecules and polymers.
Als Moleküle gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur, die zusammen mit den funktionellen Gruppen die Derivatmoleküle bilden, können aber auch synthetische Polymere, zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG), eingesetzt werden. Dabei können auch synthetische Polymere verwendet werden, die mit den oben genannten bioaktiven Molekülen konjugiert sind, das heißt sowohl bioaktive Moleküle als auch die für den Zwei-Photonen-Prozess notwendigen funktionellen Gruppen enthalten.However, as molecules of the same or different chemical nature, which together with the functional groups form the derivative molecules, it is also possible to use synthetic polymers, for example polyethylene glycol (PEG). It is also possible to use synthetic polymers which are conjugated with the abovementioned bioactive molecules, that is to say contain both bioactive molecules and the functional groups necessary for the two-photon process.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können als Moleküle, die zusammen mit den funktionellen Gruppen die Derivatmoleküle für die Konjugation bilden, Moleküle von niedrigem Molekulargewicht, insbesondere Wirkstoffmoleküle, eingesetzt werden.In a particularly advantageous embodiment of the invention, as molecules which together with the functional groups form the derivative molecules for the conjugation, molecules of low molecular weight, in particular active substance molecules, can be used.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung können als Moleküle, die zusammen mit den funktionellen Gruppen Derivatmoleküle für die Konjugation bilden, Farbstoffmoleküle, insbesondere von Fluorophoren, verwendet werden. Alternativ können andere Derivatmoleküle neben den für die Additionsreaktion notwendigen funktionellen Gruppen Farbstoffgruppen, insbesondere fluorophore Gruppen, enthalten. Die Verwendung von Farbstoffmolekülen bzw. Farbstoffgruppen ermöglicht zum Beispiel eine Visualisierung einer zwei- oder dreidimensionalen Konjugatstruktur.According to a further embodiment of the invention, as molecules which together with the functional groups form derivative molecules for the conjugation, dye molecules, in particular of fluorophores, can be used. Alternatively, other derivative molecules besides the functional groups necessary for the addition reaction may contain dye groups, in particular fluorophore groups. For example, the use of dye molecules or dye groups enables visualization of a two- or three-dimensional conjugate structure.
Des Weiteren können als Moleküle, die zusammen mit den funktionellen Gruppen Derivatmoleküle für die Konjugation bilden, Moleküle von Biotin und/oder von Biotin-Analoga eingesetzt werden. Diese ermöglichen die nicht-kovalente Wechselwirkung mit Biotin bindenden Proteinen, beispielsweise Avidin.Furthermore, as molecules which together with the functional groups form derivative molecules for conjugation, molecules of biotin and / or of biotin analogues can be used. These allow non-covalent interaction with biotin-binding proteins, for example avidin.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht damit sowohl den Aufbau einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur als auch den schrittweisen Aufbau von Schichtebenen aus Konjugaten aus Molekülen gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur.The application of the method according to the invention thus enables both the construction of a two- or three-dimensional structure and the stepwise construction of layer planes of conjugates of molecules of the same or different chemical nature.
Zusammenfassend lassen sich die wesentlichen Vorteile der Anwendung des erfindungsgemäßen Zwei-Photonen-Prozesses folgendermaßen beschreiben:
- • Durch das Verfahren besteht die Möglichkeit, nicht nur zweidimensional, sondern auch dreidimensional zu strukturieren, zu manipulieren und zu funktionalisieren.
- • Die räumliche Auflösung ist aufgrund eines verringerten Reaktionsvolumens im Fokus des Laserstrahls wesentlich erhöht.
- • Die erhöhte Wellenlänge für den Zwei-Photonen-Prozess gegenüber dem Ein-Photonen-Prozess führt zu einer erhöhten Eindringtiefe und zu einer verminderten Toxizität für Biomaterial aufgrund des reduzierten Absorptionskoeffizienten gegenüber nahem UV-Licht.
- • The method offers the possibility of structuring, manipulating and functionalizing not only two-dimensional but also three-dimensional.
- • The spatial resolution is significantly increased due to a reduced reaction volume in the focus of the laser beam.
- • The increased wavelength for the two-photon process over the one-photon process results in increased penetration depth and reduced bio-toxicity due to the reduced absorption coefficient to near-UV light.
Vorteilhaft ist die Anwendung des Verfahrens für den schrittweisen Aufbau einer zweidimensionalen oder dreidimensionalen Konjugatstruktur. Die dreidimensionale Konjugatstruktur kann zum Beispiel eine harte, plastische oder Hydrogel-Struktur sein. Diese enthält vorzugsweise freie funktionelle Gruppen, wodurch eine weitere Zwei-Photonen-gesteuerte Additionsreaktion, zum Beispiel eine 2-2-Cycloaddition, an diesen Gruppen möglich ist, was eine post-in-situ-Modifikation bzw. Funktionalisierung mit anderen Molekülen ermöglicht, zum Beispiel Fluorophoren, Proteinen, Signalmolekülen. The use of the method for the step-by-step construction of a two-dimensional or three-dimensional conjugate structure is advantageous. The three-dimensional conjugate structure may be, for example, a hard, plastic or hydrogel structure. This preferably contains free functional groups, which allows for a further two-photon-controlled addition reaction, for example a 2-2 cycloaddition, to these groups, allowing post-in-situ modification or functionalization with other molecules, for example Example fluorophores, proteins, signaling molecules.
Als dreidimensionale Konjugatstruktur ist durch das Verfahren auch eine kovalent verbundene Mehrschichtstruktur erhältlich, die schrittweise durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen, insbesondere Molekülen von Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren (RNA, DNA), Polysacchariden, Lipiden oder kleinen organischen Molekülen und Polymeren, die die für die Zwei-Photonen-gesteuerte Additionsreaktion, wie zum Beispiel eine 2-2-Cycloaddition, erforderlichen funktionellen Gruppen aufweisen, erzeugt wird. Dabei sind die jeweiligen Moleküle zweier miteinander verbundener Schichten entweder gleicher oder wechselnder chemischer Natur. As a three-dimensional conjugate structure, the method also provides a covalently linked multi-layered structure which is progressively enhanced by the addition of bioactive molecules, in particular molecules of peptides, proteins, nucleic acids (RNA, DNA), polysaccharides, lipids or small organic molecules, and polymers which are suitable for the two-photon-controlled addition reaction, such as having a 2-2-cycloaddition, required functional groups is generated. The respective molecules of two interconnected layers are either of the same or changing chemical nature.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für die Beschichtung oder Modifikation von zweidimensionalen und dreidimensionalen Oberflächen anwendbar, die mit den für die Zwei-Photonen-gesteuerte Additionsreaktion, beispielsweise eine 2-2-Cycloaddition, notwendigen funktionellen Gruppen, ausgewählt aus den funktionellen Gruppen von Maleimid-Derivaten und/oder deren 2- und/oder 3-substituierten Derivaten, vormodifiziert sind. Insbesondere eignet sich das Verfahren zur Modifikation von Zelloberflächen, die mit den für die Zwei-Photonen-gesteuerte Additionsreaktion, vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition, notwendigen funktionellen Gruppen vormodifiziert sind. The method according to the invention is also applicable to the coating or modification of two-dimensional and three-dimensional surfaces which are functionalized with the two-photon-controlled addition reaction, for example a 2-2 cycloaddition, of the functional groups of maleimide derivatives and / or their 2- and / or 3-substituted derivatives are pre-modified. In particular, the method is suitable for the modification of cell surfaces which are premodified with the functional groups necessary for the two-photon-controlled addition reaction, preferably a 2-2-cycloaddition.
Der Zwei-Photonen-Prozess zerstört nicht die Biopolymerstruktur und kann vor allem auch in Gegenwart von lebenden Zellen und Gewebekulturen durchgeführt werden. Der beschriebene Prozess ermöglicht die Kombination von Molekül A und Molekül B als Partner, die die notwendigen reaktiven Gruppen aufweisen, wobei die Moleküle A und B von unterschiedlicher chemischer Natur sein können. Die beschriebene Reaktion vereinfacht die beschriebenen Strategien für die lichtgesteuerte Synthese und/oder die Modifikation von Materialien wie Hydrogelen, Bio-Konjugaten und funktionellen Beschichtungen. Das Verfahren ermöglicht die Erzeugung von zeitlich und räumlich exakt definiertem strukturierten Material um ein Objekt. Unabhängig davon, ob es sich bei diesem Objekt um eine lebende Zelle, ein Biopolymer oder ein Arzneimittel handelt, kann es in das strukturierte Material eingeschlossen werden. Die Konjugate bzw. Derivate der Reaktionsgruppen mit verschiedenen aktiven Molekülen, wie Peptiden, Proteinen, Polysacchariden, Lipiden, Nukleinsäuren wie DNA und RNA, Antikörpern oder niedermolekularen organischen Molekülen und Polymeren, können an oder in dem Material sowie jeweils miteinander verbunden werden, ohne dabei die Aktivitäten der betreffenden Moleküle, die Materialeigenschaften oder das biologische System zu zerstören, wenn die Verbindung in vivo erfolgt. The two-photon process does not destroy the biopolymer structure and, above all, can be carried out in the presence of living cells and tissue cultures. The described process allows the combination of molecule A and molecule B as partners, which have the necessary reactive groups, wherein the molecules A and B may be of different chemical nature. The reaction described simplifies the strategies described for the light-directed synthesis and / or the modification of materials such as hydrogels, bioconjugates and functional coatings. The method enables the generation of temporally and spatially exactly defined structured material around an object. Regardless of whether this object is a living cell, a biopolymer or a drug, it can be included in the structured material. The conjugates or derivatives of the reaction groups with different active molecules, such as peptides, proteins, polysaccharides, lipids, nucleic acids such as DNA and RNA, antibodies or low molecular weight organic molecules and polymers can be bonded to or in the material and each without the Activities of the molecules in question to destroy the material properties or the biological system when the compound is in vivo.
Die Anwendung dieser Reaktion für eine zweidimensionale und dreidimensionale Strukturierung und Manipulation bietet eine hervorragende Möglichkeit, Materialien in situ mit oder innerhalb lebender Materie zu erzeugen und die Zell- oder Gewebekultur in einer kontrollierten Art und Weise mit den so gebildeten Materialmatrizen zu verbinden.The application of this reaction for two-dimensional and three-dimensional structuring and manipulation provides an excellent opportunity to generate materials in situ with or within living matter and to connect the cell or tissue culture in a controlled manner with the material matrices so formed.
Es lassen sich die Vorteile der Erfindung folgendermaßen zusammenfassen:
Mit der Erfindung wird eine lichtgesteuerte Reaktion für eine räumlich und zeitlich definierte Erzeugung einer starken kovalenten Bindung zwischen zwei Molekülen ermöglicht. Das Verfahren eignet sich zur gesteuerten schrittweisen Konjugation der reaktiven Einheiten, das heißt der funktionellen Gruppen von unterschiedlichen Molekülen, wobei die Reaktion in situ durchgeführt werden kann. Das Verfahren kann angewendet werden, um ortsspezifische Konjugate mit günstigen pharmakologischen Eigenschaften, zum Beispiel eine reduzierte Immunogenität und eine erhöhte Zirkulationszeit, zu bilden. Das beschriebene Verfahren kann für die molekulare Konjugation in einer Lösung jeder Art verwendet werden. Insbesondere das Fehlen der Notwendigkeit eines Fotoinitiators und die niedrige Energie erlaubt die Anwendung des Verfahrens in vivo, was wiederum eine in situ-Anwendung für zweidimensionale und dreidimensionale Strukturierung, Manipulation und Strukturierung in Gegenwart von lebenden Zellen ermöglicht.The advantages of the invention can be summarized as follows:
With the invention, a light-controlled reaction for a spatially and temporally defined generation of a strong covalent bond between two molecules is made possible. The method is suitable for the controlled stepwise conjugation of the reactive units, that is the functional groups of different molecules, wherein the reaction can be carried out in situ. The method can be used to form site-specific conjugates with favorable pharmacological properties, for example, reduced immunogenicity and increased circulation time. The described method can be used for molecular conjugation in a solution of any kind. In particular, the lack of photoinitiator requirement and the low energy allows the application of the method in vivo, which in turn allows for in situ application for two-dimensional and three-dimensional structuring, manipulation and patterning in the presence of living cells.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit Maleimidgruppen funktionalisierten Substratoberfläche, insbesondere von Glas. A further aspect of the invention relates to a process for the preparation of a maleimide-functionalized substrate surface, in particular of glass.
Aus der
Gemäß der Erfindung wird eine mit Maleimidgruppen funktionalisierte Substratoberfläche, insbesondere von Glas, durch ein Verfahren hergestellt, bei dem
- a) eine Aminosilanisierung der Substratoberfläche in der Weise erfolgt, dass danach auf der modifizierten Substratoberfläche freie Aminogruppen vorliegen,
- b) eine kovalente Ankopplung von Carboxylgruppen des Polyethylenmethacrylats (PEMA) an die freien Aminogruppen der aminosilansierten Oberfläche erfolgt, wobei nach der Ankopplung auf der modifizierten Substratoberfläche freie Carbonsäure-Anhydridgruppen vorliegen und
- c) die Carbonsäure-Anhydridgruppen mit freien Aminogrup23pen eines Maleimidderivates konjugiert werden.
- a) an aminosilization of the substrate surface takes place in such a way that thereafter free amino groups are present on the modified substrate surface,
- b) a covalent coupling of carboxyl groups of the polyethylene methacrylate (PEMA) to the free amino groups of the aminosilansierten surface, wherein after coupling to the modified substrate surface free carboxylic anhydride groups are present and
- c) the carboxylic acid anhydride groups are conjugated with free amino groups of a maleimide derivative.
Eine solche Vorfunktionalisierung einer Substratoberfläche, beispielsweise von Glas, mit Maleimid-Gruppen ermöglicht, wie oben bereits beschrieben, die gezielte Anbindung von weiteren, Maleimid- oder andere funktionelle Gruppen enthaltenden Molekülen an das Substrat über eine lichtgesteuerte Zwei-Photonen-Additionsreaktion, vorzugsweise eine 2-2-Cycloaddition.Such prefunctionalization of a substrate surface, for example of glass, with maleimide groups allows, as already described above, the targeted attachment of further, maleimide or other functional group-containing molecules to the substrate via a light-controlled two-photon addition reaction, preferably a second -2-cycloaddition.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:Further details, features and advantages of the invention will become apparent from the following description of exemplary embodiments with reference to the accompanying drawings. Show it:
Die
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ein Femtosekundenlaser
a
Typische Strukturierungsparameter für zum Beispiel ein 100× Ölobjektiv bei einer Wellenlänge von 800 nm sind: eine Schreibgeschwindigkeit von 10 bis 1000 µm/s sowie eine Leistung von 0,1 bis 100 mW.Typical structuring parameters for, for example, a 100 × objective at a wavelength of 800 nm are: a writing speed of 10 to 1000 μm / s and a power of 0.1 to 100 mW.
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Beispiel 1: Example 1:
Das Beispiel 1 betrifft eine räumlich gesteuerte zweidimensional-molekulare Funktionalisierung von Aminogruppen enthaltenden Oberflächen über einen Zwei-Photonen-Prozess. Example 1 relates to a spatially controlled two-dimensional molecular functionalization of amino-containing surfaces via a two-photon process.
Oberflächen, die verfügbare Aminogruppen enthalten, können durch gewöhnliche Carbodiimidchemie mit Maleimidgruppen funktionalisiert werden, wie der rechte Teil in der
Beispiel 2: Example 2:
Das Beispiel 2 betrifft eine räumlich gesteuerte zweidimensional-molekulare Funktionalisierung von Carboxylgruppen enthaltenden Oberflächen durch einen Zwei-Photonen-Prozess. Example 2 relates to a spatially controlled two-dimensional molecular functionalization of carboxyl-containing surfaces by a two-photon process.
Substrate mit Carboxylgruppen an ihrer Oberfläche, die durch Plasmabehandlung von Kunststoff-Oberflächen hergestellt werden, können mit Maleimid durch Carbodiimid-Chemie funktionalisiert werden, wie in
Die präparierten Oberflächen wurden unter einer Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) mit einer Konzentration von 1 mg/ml inkubiert, um NHS-Ester von Carbonsäuregruppen zu bilden. Als Nächstes wurden die präparierten Oberflächen mehrmals mit Wasser gewaschen und mit wässriger Lösung des Trifluoressigsäure-Salzes von 3-Maleimidopropionilamin mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml behandelt. Die Lösung wurde auf die Probe aufgebracht, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Die bedeckte Fläche wurde bei Raumtemperatur, das heißt 15 bis 30 °C, für mindestens eine Stunde inkubiert, um die Vervollständigung der Reaktion zu erreichen. Als Nächstes wurde die Oberfläche intensiv, das heißt mindestens dreimal, mit Isopropanol gewaschen und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die funktionalisierten Oberflächen können vor der Verwendung bei –20 °C gelagert werden. Die Maleimid-funktionalisierten Oberflächen wurden als Substrat für anzubringende Maleimid-Konjugate von Peptiden, Proteinen, Polysacchariden, Lipiden, DNA, RNA, Antikörpern oder niedermolekularen organischen Molekülen und Polymeren verwendet. Als Beispiel wurde eine Lösung von ATTO532-Maleimid einer Konzentration von 0,4 mg/ml in Wasser präpariert. Die Lösung wurde auf die Maleimid-funktionalisierte Oberfläche aufgebracht und die gewünschte Struktur durch eine Zwei-Photonen-Reaktion bei einer Wellenlänge von λ = 800 nm erzeugt. Peptid-Maleimid-Konjugate oder andere wasserlösliche Maleimid-Konjugate können in ähnlicher Weise in Wasser funktionalisiert werden, während phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), gegebenenfalls mit Magnesiumionenzugabe, für Maleimid-Konjugate mit Proteinen, Antikörpern oder DNA und RNA verwendet werden muss, um ihre Konformation stabil zu halten. The prepared surfaces were incubated under a solution of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) at a concentration of 1 mg / ml to form NHS esters of carboxylic acid groups. Next, the prepared surfaces were washed several times with water and treated with aqueous solution of the trifluoroacetic acid salt of 3-maleimidopropionilamin at a concentration of 0.1 mg / ml. The solution was applied to the sample to cover the entire surface. The covered area was incubated at room temperature, ie, 15 to 30 ° C, for at least one hour to complete the reaction. Next, the surface was washed intensively, that is at least three times, with isopropanol and dried under a stream of nitrogen. The functionalized surfaces can be stored at -20 ° C before use. The maleimide functionalized surfaces have been used as a substrate for maleimide conjugates of peptides, proteins, polysaccharides, lipids, DNA, RNA, antibodies or low molecular weight organic molecules and polymers to be attached. As an example, a solution of ATTO532 maleimide of a concentration of 0.4 mg / ml in water was prepared. The solution was applied to the maleimide-functionalized surface and the desired structure generated by a two-photon reaction at a wavelength of λ = 800 nm. Peptide-maleimide conjugates or other water-soluble maleimide conjugates can similarly be functionalized in water, while phosphate buffered saline (PBS), optionally with magnesium ion addition, must be used for maleimide conjugates with proteins, antibodies or DNA and RNA to determine their conformation stable.
Beispiel 3: Example 3:
Das Beispiel 3 betrifft die räumlich-kontrollierte Erzeugung eines Polymernetzwerks, das heißt eine dreidimensionale Strukturierung, über einen Zwei-Photonen-Prozess. Example 3 relates to the spatially-controlled generation of a polymer network, that is, a three-dimensional structuring, via a two-photon process.
Das Polymernetzwerk kann aus einer Lösung von beliebigen Molekülen mit mindestens drei Maleimidgruppen-Funktionen erstellt werden. Beispielhaft wurde das im Handel erhältliche Maleimid-terminierte Polyethylenglykol PEG (MW ≤ 10000 Da) in Wasser oder, wenn das Molekulargewicht 10000 Da überschreitet, einem Acetonitril-Wasser-Gemisch gelöst. Der Feststoffgehalt der Lösung betrug 10 %. Die Lösung wurde auf einer Glasbodenschale aufgebracht und über einen Zwei-Photonen-Prozess wurde ein Hydrogel-Netzwerk erzeugt. Dabei wurde/wurden Maleimid-modifiziertes Glas oder Maleimid-modifizierte transparente Polymeroberflächen verwendet, um die geschaffenen Strukturen kovalent anzubinden. Die Zunahme des Feststoffgehaltes vom Reaktionsgemisch führt entsprechend zu einer Verstärkung bzw. Versteifung des gebildeten Material-Netzwerks, während die Abnahme des Feststoffgehaltes vom Reaktionsgemisch zu einer Verringerung bzw. Erweichung des gebildeten Material-Netzwerks führt. The polymer network can be prepared from a solution of any molecules having at least three maleimide group functions. By way of example, the commercially available maleimide-terminated polyethylene glycol PEG (M W ≦ 10000 Da) was dissolved in water or, when the molecular weight exceeds 10,000 Da, an acetonitrile-water mixture. The solids content of the solution was 10%. The solution was applied to a glass bottom dish and a hydrogel network was generated via a two-photon process. Here, maleimide-modified glass or maleimide-modified transparent polymer surfaces were used to covalently bond the created structures. The increase of the solids content of the reaction mixture leads accordingly to a reinforcement or stiffening of the formed material network, while the decrease of the solids content of the reaction mixture leads to a reduction or softening of the formed material network.
Beispiel 4: Example 4:
Das Beispiel 4 betrifft die räumlich-kontrollierte Erzeugung eines kovalent gebundenen dreidimensionalen Biopolymer-Netzwerks, wobei das Biopolymere ein Polysaccharid ist. Example 4 relates to the spatially-controlled generation of a covalently bound three-dimensional biopolymer network wherein the biopolymer is a polysaccharide.
Das Polymernetzwerk kann aus einer Lösung von beliebigen Biomolekülen erzeugt werden, die – ähnlich wie im Beispiel 3 – mit mindestens drei funktionellen Maleimidgruppen konjugiert sind und in Wasser oder einem organischen nicht-nukleophilen Lösungsmittel, wie zum Beispiel DMF, DMSO, Acetonitril, Methanol usw. oder deren Mischungen, löslich sein sollten. Biomoleküle, die in PBS oder Zellmedien löslich sind, können ohne starke Beeinträchtigung ihrer ursprünglichen Faltung und entsprechender Aktivitäten polymerisiert werden. Die Biopolymer-Maleimid-Konjugate, die eine große Anzahl an Maleimidgruppen enthalten, bilden steifere Materialien als die gleichen Biopolymer-Konjugate mit einer kleineren Menge an Maleimidgruppen. Zum Beispiel wurde eine Hyaluronsäureprobe (MW = 17000 Da) mit 4 und 6 Maleimidgruppen auf bekanntem Wege, zum Beispiel entsprechend Adv. Mater. 2013, 25, 2606–2610, funktionalisiert und – auf ähnlichem Wege wie in Beispiel 3 – ohne Befestigung an ein Substrat, es wurde nicht modifiziertes Glas verwendet, – unter Anwendung eines Zwei-Photonen-Prozesses polymerisiert. Das Speichermodul, eine rheologische Eigenschaft, des Hyaluronsäure-Konjugates mit 6 Maleimidgruppen war 40-mal größer (steifer) als das Speichermodul des Hyaluronsäure-Konjugates mit 4 Maleimidgruppen. Die Zunahme des Feststoffgehaltes vom Reaktionsgemisch führt entsprechend zu einer Verstärkung bzw. Versteifung des gebildeten Material-Netzwerks, während die Abnahme des Feststoffgehaltes vom Reaktionsgemisch zu einer Verringerung bzw. Erweichung des gebildeten Material-Netzwerks führt. The polymer network can be made from a solution of any biomolecules that are conjugated to at least three maleimide functional groups, similar to Example 3, in water or an organic non-nucleophilic solvent such as DMF, DMSO, acetonitrile, methanol, etc. or mixtures thereof, should be soluble. Biomolecules that are soluble in PBS or cell media can be polymerized without severely affecting their native folding and corresponding activities. The biopolymer-maleimide conjugates containing a large number of maleimide groups form stiffer materials than the same biopolymer conjugates with a smaller amount of maleimide groups. For example, a hyaluronic acid sample (M W = 17000 Da) having 4 and 6 maleimide groups was prepared by a known method, for example according to Adv. Mater. 2013, 25, 2606-2610, functionalized and, similar to Example 3, without attachment to a substrate, unmodified glass was used, polymerized using a two-photon process. The storage modulus, a rheological property, of the 6-maleimide hyaluronic acid conjugate was 40 times greater (stiffer) than the storage modulus of the 4-maleimide hyaluronic acid conjugate. The increase of the solids content of the reaction mixture leads accordingly to a reinforcement or stiffening of the formed material network, while the decrease of the solids content of the reaction mixture leads to a reduction or softening of the formed material network.
Beispiel 5: Example 5:
Das Beispiel 5 betrifft die räumlich kontrollierte Erzeugung eines kovalent verbundenen Biopolymer-Netzwerks, das heißt eine dreidimensionale Strukturierung, wobei das Biopolymer ein Polypeptid ist. Example 5 relates to the spatially controlled production of a covalently linked Biopolymer network, that is, a three-dimensional structuring, wherein the biopolymer is a polypeptide.
Das Konzept der Materialstrukturierung ist ähnlich wie in Beispiel 4. Zum Beispiel wurde eine Lösung von Kollagen 1 in PBS (pH 7,4) mit einer Endkonzentration von weniger als 1 mg/ml hergestellt. Die Lösung wurde über Nacht mit dem Ziel einer vollständigen Ausbildung von Kollagenfasern inkubiert. Nachfolgend wurde die Probenlösung mit 3-Maleimidopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester einer Konzentration von 100 µm/ml funktionalisiert. Die Reaktion wurde über Nacht durchgeführt und mit Mikrodialyseschläuchen gereinigt. Die dialysierte Lösung wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 4 mit oder ohne Anbindung an ein Substrat unter Anwendung eines Zwei-Photonen-Prozesses polymerisiert.The concept of material structuring is similar to Example 4. For example, a solution of
Beispiel 6: Example 6:
Das Beispiel 6 betrifft die räumlich kontrollierte Erzeugung eines kovalent verknüpften Bio-Hybridmaterial-Netzwerks. Example 6 relates to the spatially controlled generation of a covalently linked bio-hybrid material network.
Das Konzept der Material-Strukturierung ist ähnlich wie in den Beispielen 4 und 5. Auch in diesem Fall wurden die verwendeten Polymer-Peptid-Konjugate oder Polysaccharid-Polymer-Konjugate mit mindestens drei Maleimidgruppen modifiziert und für die Bildung eines Hydrogel-Netzwerks verwendet. Zum Beispiel wurde ein Maleimid-terminiertes PEG-Peptid-Konjugat mit MMP-(Matrix-Metalloproteinase)-spaltbaren Peptiden funktionalisiert, wie in ChemCom 2010 Macromol Com. 2010 beschrieben. Anschließend wurde das gereinigte Konjugat mit einem 3-Maleimidipropionic-N-hydroxysuccinimidester, siehe
Das gebildete Maleimid-terminierte PEG-Peptid-Konjugat wurde ähnlich wie in den Beispielen 4 und 5 mit oder ohne kovalente Anbindung an ein Substrat unter Anwendung eines Zwei-Photonen-Prozesses polymerisiert.The resulting maleimide-terminated PEG-peptide conjugate was polymerized similarly as in Examples 4 and 5 with or without covalent attachment to a substrate using a two-photon process.
Beispiel 7: Example 7:
Das Beispiel 7 betrifft die räumlich kontrollierte Erzeugung eines kovalent vebundenen Mehrschicht-Hydrogel-Netzwerks, das heißt eine dreidimensionale Strukturierung. Example 7 relates to the spatially controlled generation of a covalently bonded multi-layer hydrogel network, that is to say a three-dimensional structuring.
Das gebildete Maleimid-terminierte Konjugat aus den Beispielen 3 bis 6 kann durch einen Zwei-Photonen-Prozess mit oder ohne Befestigung an einem Substrat stufenweise auf der Oberfläche polymerisiert werden. Dadurch wurde ein mehrschichtiges Hydrogel-Netzwerk erzeugt, welches Schichten aus unterschiedlichen Materialien und Dicken enthält. The resulting maleimide-terminated conjugate of Examples 3 to 6 may be polymerized stepwise on the surface by a two-photon process with or without attachment to a substrate. This created a multi-layered hydrogel network containing layers of different materials and thicknesses.
Beispiel 8: Example 8:
Das Beispiel 8 betrifft die räumlich kontrollierte dreidimensionale Funktionalisierung von Zelloberflächen.Example 8 relates to the spatially controlled three-dimensional functionalization of cell surfaces.
Die Zelloberflächen wurden direkt durch die Behandlung mit einer 3-Maleimidopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester-Lösung einer Konzentration von 10 µm/ml oder mit die Zellwand durchdringenden Peptiden oder Proteinen, welche mit Maleimidgruppen vorfunktionalisiert sind, funktionalisiert. Die verschiedenen Maleimid-Konjugate wurden dann durch den Zwei-Photonen-Prozess direkt an die Zellwand angebracht. Für die Einzelzellfixierung unter dem Laser wurde eine Mikrofluid-Technologie eingesetzt, wie in der Druckschrift Biophysical Journal 2005, 3689–98, beschrieben.The cell surfaces were functionalized directly by treatment with a 10 μm / ml 3-maleimidopropionic acid N-hydroxysuccinimide ester solution or cell-wall-penetrating peptides or proteins pre-functionalized with maleimide groups. The various maleimide conjugates were then attached directly to the cell wall by the two-photon process. For single-cell fixation under the laser, microfluidic technology was used as described in the Biophysical Journal 2005, 3689-98.
Beispiel 9: Example 9:
Das Beispiel 9 betrifft die räumlich kontrollierte Funktionalisierung von Mizellen oder Partikeln.Example 9 relates to the spatially controlled functionalization of micelles or particles.
Die Oberflächen von mikrometergroßen Partikeln oder Micellen wurden mit Maleimidgruppen in einer ähnlichen Weise, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, funktionalisiert. Anschließend können die verschiedenen Maleimid-Konjugate durch Zwei-Photonen-Technik direkt an die Oberfläche angebracht werden. Für die Partikel- oder Mizellen-Fixierung unter dem Laser wurde eine Mikrofluid-Technik eingesetzt, wie in der Biophysical Journal 2005, 3689–98, beschrieben. Die funktionalisierten Teilchen oder Mizellen wurden durch Dialyse gereinigt.The surfaces of micron sized particles or micelles were functionalized with maleimide groups in a similar manner as described in Examples 1 and 2. Subsequently, the various maleimide conjugates can be attached directly to the surface by two-photon technique. For the particle or micelle fixation under the laser, a microfluidic technique was used, as described in Biophysical Journal 2005, 3689-98. The functionalized particles or micelles were purified by dialysis.
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- 11
- optischer Aufbau optical design
- 22
- Femtosekundenlaser femtosecond laser
- 33
- λ/2-Platten λ / 2 plates
- 44
- Strahlteiler beamsplitter
- 55
- akustooptischer Modulator acousto-optic modulator
- 66
- Lochblende pinhole
- 77
- Strahlaufweiter beam
- 88th
- Spiegel mirror
- 99
- dichroitischer Spiegel dichroic mirror
- 1010
- Detektor detector
- 1111
- Kamera camera
- 1212
- Galvoscanner galvoscanners
- 1313
- Objektiv lens
- 1414
- Beleuchtung lighting
- 1515
- Rechnereinheit computer unit
- 1616
- Objekttisch mit Probe Object table with sample
Claims (7)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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DE102014104735A1 DE102014104735A1 (en) | 2015-10-08 |
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
WO2010014820A2 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Life Technologies Corporation | Particles for use in supported nucleic acid ligation and detection sequencing |
-
2014
- 2014-04-03 DE DE102014104735.4A patent/DE102014104735B4/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010014820A2 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Life Technologies Corporation | Particles for use in supported nucleic acid ligation and detection sequencing |
Also Published As
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DE102014104735A1 (en) | 2015-10-08 |
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