DE102013216886A1

DE102013216886A1 - Sensor, method and test kit for measuring glucose

Info

Publication number: DE102013216886A1
Application number: DE201310216886
Authority: DE
Inventors: Michael Ullmann; Aenne Andresen; Malte Rolff
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2013-08-26
Publication date: 2015-02-26
Also published as: WO2015028255A1

Abstract

Bei einem Sensor (100; 200; 300; 400) zum Nachweis von Glucose ist in oder auf einem Träger (101; 201; 301) des Sensors das Enzym Hexokinase enthalten. Weiterhin umfasst der Sensor das Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und wenigstens ein Mittel zum Nachweis von NADH und/oder NADPH, das durch eine gekoppelte Enzymreaktion gebildet wird. Der Nachweis erfolgt insbesondere durch Auswertung mindestens eines Parameters einer durch eine chemische Reaktion erzeugten elektromagnetischen Strahlung.In a sensor (100; 200; 300; 400) for detecting glucose, the enzyme hexokinase is contained in or on a support (101; 201; 301) of the sensor. Furthermore, the sensor comprises the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase and at least one means for detecting NADH and / or NADPH, which is formed by a coupled enzyme reaction. The detection is carried out in particular by evaluating at least one parameter of an electromagnetic radiation generated by a chemical reaction.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor zur Glucosebestimmung, eine Verwendung des Sensors, ein Verfahren zur Messung von Glucose sowie ein Testkit zur Messung von Glucose, wobei gekoppelte Enzymreaktionen eingesetzt werden.The present invention relates to a sensor for determining glucose, a use of the sensor, a method for measuring glucose, and a test kit for measuring glucose using coupled enzyme reactions.

Stand der TechnikState of the art

Die Messung von Glucose insbesondere im Blut spielt in der Medizin eine wichtige Rolle. Der Glucoseanteil im Blut, allgemein als Blutzucker beschrieben, ist ein wichtiger Messwert, der vor allem bei der sogenannten Zuckerkrankheit (Diabetes mellitus) von entscheidender Bedeutung ist. Weltweit leiden circa 300 Mio. Patienten an Diabetes mellitus. Um eine bestmögliche Therapie der Patienten zu ermöglichen, ist eine Überwachung der Blutzuckerwerte erforderlich. Die Blutzuckermessung ist eine der häufigsten Laborbestimmungen eines einzelnen Blutwertes überhaupt. Die Güte der Blutzuckereinstellung stellt insbesondere bei insulinpflichtigen Diabetes-Patienten einen kritischen Faktor für die Lebenserwartung und die Lebensqualität des Patienten dar. Üblicherweise wird zur Blutzuckerbestimmung eine Blutprobe entnommen, beispielsweise durch Anstechen der Fingerkuppe. Der so gewonnene Bluttropfen wird auf einen Teststreifen aufgebracht und in einem Glukometer-Gerät analysiert. Der Patient kann diese Analyse eigenständig durchführen. Allerdings ist die Gewinnung der Blutprobe mit Unannehmlichkeiten verbunden. Weiterhin weist diese Standardmethode zugelassene Fehlertoleranzen von bis zu +/–20 % auf, sodass es zu erheblichen Fehleinschätzungen des Blutzuckergehaltes kommen kann. Weiterhin erlaubt dieses Vorgehen nur eine punktuelle Bestimmung des Blutzuckergehaltes, beispielsweise 3–4 Mal pro Tag. Eine kontinuierliche oder zumindest häufigere Messung des Blutzuckergehaltes und damit eine optimale Einstellung der Medikamentengabe, insbesondere eine optimale Insulin-Dosierung, sind damit in der Regel nicht möglich. The measurement of glucose, especially in the blood, plays an important role in medicine. The proportion of glucose in the blood, commonly described as blood sugar, is an important measurement, which is especially important in the so-called diabetes mellitus (diabetes mellitus). Worldwide, approximately 300 million patients suffer from diabetes mellitus. In order to provide the best possible therapy for patients, monitoring of blood sugar levels is required. The blood glucose measurement is one of the most common laboratory tests of a single blood value at all. The quality of the blood sugar adjustment represents a critical factor for the life expectancy and the quality of life of the patient, especially in insulin-dependent diabetes patients. Usually, a blood sample is taken for blood sugar determination, for example by piercing the fingertip. The blood drop thus obtained is applied to a test strip and analyzed in a glucometer device. The patient can perform this analysis independently. However, obtaining the blood sample is associated with inconvenience. Furthermore, this standard method has allowed error tolerances of up to +/- 20%, so that it can lead to significant misjudgment of blood sugar content. Furthermore, this procedure allows only a selective determination of the blood sugar content, for example, 3-4 times a day. A continuous or at least more frequent measurement of the blood sugar content and thus an optimal adjustment of the drug administration, in particular an optimal insulin dosage, are thus generally not possible.

Es existieren bereits Ansätze, die eine kontinuierliche Blutzuckerbestimmung, die möglichst schmerzfrei sein sollte, zum Ziel haben. Ein Lösungsansatz in dieser Richtung verwendet das Glucose-spezifische Enzym Hexokinase, das auf einem Sol-Gel immobilisiert ist ( Hussain et al., Analytical Biochemistry, 2005, 137–143 ). Die Hexokinase setzt Glucose in einer enzymatischen Reaktion zu Glucose-6-Phosphat unter Verbrauch von ATP um. Bei dieser Reaktion ändern sich die Fluoreszenz-Eigenschaften des katalysierenden Enzyms. Die Fluoreszenz lässt sich hierbei als spontane Licht-Emission nach einer externen Anregung betrachten. Die Fluoreszenz des Enzyms kann beispielsweise durch eine UV-Strahlung angeregt werden. Wenn das Enzym katalytisch aktiv ist, also bei einer Umsetzung von Glucose, wird die Fluoreszenz drastisch herabgesetzt, sodass anhand einer Verminderung der Fluoreszenz die Glucose-Konzentration bestimmt werden kann. Die auf dem Sol-Gel immobilisierte Hexokinase kann als Sensor (Mikrosensor) in den Organismus und damit in den Patienten implantiert werden, um ohne einen weiteren Eingriff eine Glucosemessung vornehmen zu können. Es ist allerdings für jede Messung eine potentiell schädigende UV-Bestrahlung erforderlich. Weiterhin darf der Sensor nur sehr flach unter die Haut implantiert werden, da die mittels der UV-Strahlung zugeführte Energiemenge nicht beliebig hoch sein darf. Ansonsten ist mit Schädigungen der Haut zu rechnen. Durch eine flache Implantation des Sensors werden allerdings die interstitiellen Schichten mit der Interstitialflüssigkeit, deren Glucose-Gehalt repräsentativ für den Blutzuckergehalt ist, nicht erreicht. Insofern konnten mit diesem Ansatz bislang noch keine befriedigenden Ergebnisse erzielt werden. There are already approaches that have the goal of a continuous blood glucose determination, which should be as painless as possible. One approach in this direction uses the glucose-specific enzyme hexokinase immobilized on a sol-gel ( Hussain et al., Analytical Biochemistry, 2005, 137-143 ). The hexokinase converts glucose in an enzymatic reaction to glucose-6-phosphate consuming ATP. In this reaction, the fluorescence properties of the catalyzing enzyme change. The fluorescence can be considered as spontaneous light emission after an external excitation. The fluorescence of the enzyme can be excited, for example, by UV radiation. When the enzyme is catalytically active, ie when glucose is converted, the fluorescence is drastically reduced so that the glucose concentration can be determined by reducing the fluorescence. The immobilized on the sol-gel hexokinase can be implanted as a sensor (microsensor) in the organism and thus in the patient to make a glucose measurement without further intervention can. However, potentially damaging UV radiation is required for each measurement. Furthermore, the sensor must be implanted only very shallow under the skin, since the amount of energy supplied by the UV radiation must not be arbitrarily high. Otherwise, damage to the skin can be expected. However, a shallow implantation of the sensor does not achieve the interstitial layers with the interstitial fluid whose glucose content is representative of the blood sugar content. In this respect, no satisfactory results have yet been achieved with this approach.

Ein anderer Ansatz zur Bestimmung oder Messung von Glucose im Labor (in vitro) setzt ebenfalls das Enzym Hexokinase ein. Die Hexokinase-Reaktion, deren Produkt Glucose-6-Phosphat ist, wird mit einer weiteren enzymatischen Reaktion gekoppelt. Dabei wird das Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase eingesetzt, wodurch eine Oxidation des Glucose-6-Phosphats zu 6-Phosphogluconolacton katalysiert wird. Bei dieser Reaktion wird NAD⁺ zu NADH + H⁺ reduziert. Der Anstieg von NADH kann spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt werden, da bei dieser Wellenlänge das Absorptionsmaximum von NADH liegt. Another approach to measuring or measuring glucose in the laboratory (in vitro) also uses the enzyme hexokinase. The hexokinase reaction, whose product is glucose-6-phosphate, is coupled with another enzymatic reaction. In this case, the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase is used, whereby an oxidation of the glucose-6-phosphate is catalyzed to 6-phosphogluconolactone. In this reaction, NAD ^⁺ reduced to NADH + H. The increase in NADH can be followed spectrometrically at a wavelength of 340 nm, since at this wavelength the absorption maximum of NADH is.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention

Kern der Erfindung ist ein Sensor, mit dem Glucose qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen und insbesondere eine Glucosekonzentration bestimmt werden kann. Der Sensor ist insbesondere zum Glucosenachweis und zur Glucosebestimmung in einer Körperflüssigkeit geeignet. Beispielsweise kann damit die interstitielle Glucosekonzentration ermittelt werden und damit indirekt die Glucosekonzentration im Blut. Der Sensor umfasst einen Träger, in oder auf dem das Enzym Hexokinase enthalten ist. Weiterhin umfasst der Sensor das Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und wenigstens ein Mittel zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von NADH (Nicotinamidadenindinukleotid, reduzierte Form) und/oder NADPH (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, reduzierte Form), welches bei der gekoppelten enzymatischen Reaktion gebildet wird. Für den Nachweis ist es vorgesehen, dass wenigstens ein Parameter, beispielsweise die Intensität, einer durch eine chemische Reaktion erzeugten elektromagnetischen Strahlung (= Chemolumineszenz) ausgewertet wird. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mittel zum Nachweis von NADH und/oder NADPH um ein Enzym, insbesondere um eine Luciferase, mit deren Hilfe in Abhängigkeit von der NADH- und/oder NADPH-Konzentration eine Lumineszenz erzeugt wird, insbesondere sichtbares Licht, wobei sich die Intensität der Lumineszenz in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration ändert. Die Intensität der Lumineszenz kann in sehr einfacher Weise erfasst werden. Bei der Messung dieser Lichtintensität wird die Glucosekonzentration vorzugsweise über das Gesetz von Lambert-Beer berechnet. Die Auswertung der erzeugten Chemolumineszenz führt auch dann zu verwertbaren Ergebnissen, wenn die Strahlung ein Medium durchlaufen hat, z.B. das den Sensor umgebende Gewebe.The core of the invention is a sensor with which glucose can be qualitatively and / or quantitatively detected and in particular a glucose concentration can be determined. The sensor is particularly suitable for glucose detection and glucose determination in a body fluid. For example, it is possible to determine the interstitial glucose concentration and thus indirectly the glucose concentration in the blood. The sensor comprises a carrier in or on which the enzyme hexokinase is contained. Furthermore, the sensor comprises the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase and at least one agent for qualitative and / or quantitative detection of NADH (nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form) and / or NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form) formed in the coupled enzymatic reaction. For the detection, it is provided that at least one parameter, for example the intensity, of an electromagnetic radiation (= chemoluminescence) generated by a chemical reaction is evaluated. The means for detecting NADH and / or NADPH is preferably an enzyme, in particular a luciferase, with the aid of which a luminescence is generated, in particular visible light, as a function of the NADH and / or NADPH concentration the intensity of the luminescence changes as a function of the glucose concentration. The intensity of the luminescence can be detected in a very simple manner. When measuring this light intensity, the glucose concentration is preferably calculated by the law of Lambert-Beer. The evaluation of the chemiluminescence produced also leads to useful results if the radiation has passed through a medium, for example the tissue surrounding the sensor.

Einzelne oder alle der eingesetzten Enzyme können auf dem Träger immobilisiert sein. Eine Enzym-Immobilisierung ist die räumliche Fixierung der Enzyme in einen umgrenzten Reaktionsraum und hat im Allgemeinen den Vorteil, dass die Enzyme besonders stabil und langlebig sind. Es ist aber auch möglich, dass einzelne oder alle Enzyme in Lösung vorliegen, wobei in diesem Fall zweckmäßigerweise eine semipermeable Umhüllung des Sensors vorgesehen ist, die für Glucose nach innen durchlässig und die für die enzymatische Lösung nach außen, also insbesondere für die Enzyme und deren Reaktanten, undurchlässig ist. Weiterhin sind in der Sonde vorzugsweise noch weitere Substanzen, insbesondere ATP (Adenosintriphosphat) und/oder NAD⁺ (Nicotinamidadenindinukleotid, oxidierte Form) und/oder NADP⁺ (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, oxidierte Form) und/oder mindestens ein Luciferin als Substrat der Luciferase und/oder O₂ enthalten, die für die enzymatischen Reaktionen erforderlich sind. Für diese zusätzlichen Substanzen können ein oder mehrere Reservoire in oder auf dem Sensor vorgesehen sein. Es sind auch externe Reservoire möglich. Im Prinzip können einige oder alle dieser Substanzen auch aus dem Körper des Patienten stammen. Single or all of the enzymes used can be immobilized on the support. An enzyme immobilization is the spatial fixation of the enzymes in a confined reaction space and has the general advantage that the enzymes are particularly stable and long-lived. But it is also possible that single or all enzymes are present in solution, in which case expediently a semipermeable enclosure of the sensor is provided which is permeable to glucose inward and outwardly for the enzymatic solution, ie in particular for the enzymes and their Reactants, impermeable. Furthermore, in the probe preferably further substances, in particular ATP (adenosine triphosphate) and / or NAD ⁺ (Nicotinamidadenindinukleotid, oxidized form) and / or NADP ⁺ (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, oxidized form) and / or at least one luciferin as a substrate of luciferase and / or O ₂ , which are required for the enzymatic reactions. For these additional substances, one or more reservoirs may be provided in or on the sensor. There are also external reservoirs possible. In principle, some or all of these substances can also come from the body of the patient.

Der erfindungsgemäße Sensor ist insbesondere zur Implantation in einem menschlichen oder tierischen Körper vorgesehen (Mikrosensor). Hierbei wird der Sensor vorzugsweise an einer leicht zugänglichen Position im Körper implantiert, sodass die Messung beispielsweise der Chemolumineszenz ohne weitere Probleme erfolgen kann. Besonders geeignet ist beispielsweise eine Implantation im Ohr, insbesondere im Ohrläppchen. Weiterhin ist auch der Oberarm hierfür sehr geeignet, da die Temperatur hier relativ konstant ist. Weitere Möglichkeiten sind eine Implantation am Handgelenk, im Bauchbereich, am Oberschenkel oder an anderen Positionen. Die Form des implantierbaren Sensors kann beispielsweise als ovale oder zylindrische Kapsel realisiert sein. Der Sensor ist vorzugsweise abgerundet und weist keine Kanten auf, damit eine Verletzungsgefahr des umgebenden Gewebes vermieden wird. The sensor according to the invention is intended in particular for implantation in a human or animal body (microsensor). In this case, the sensor is preferably implanted in an easily accessible position in the body so that the measurement of chemiluminescence, for example, can be carried out without further problems. For example, implantation in the ear, in particular in the earlobe, is particularly suitable. Furthermore, the upper arm is very suitable for this, since the temperature is relatively constant here. Other options include implantation on the wrist, in the abdominal area, on the thigh or in other positions. The shape of the implantable sensor can be realized for example as an oval or cylindrical capsule. The sensor is preferably rounded and has no edges, so that a risk of injury to the surrounding tissue is avoided.

In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Sensors ist es vorgesehen, dass der Sensor an der Spitze eines Katheters, insbesondere eines zentralvenösen Katheters (ZVK), angebracht wird. Beispielsweise kann der Sensor in Form eines Hohlzylinders gestaltet sein, der auf einen üblichen ZVK aufgeschoben wird. Zusammen mit dem ZVK kann der Sensor insbesondere in ein venöses Blutgefäß eingebracht werden, sodass mittels des Sensors der Blutzuckergehalt direkt bestimmt werden kann. Diese Ausgestaltung ist insbesondere für die kontinuierliche Blutzuckerüberwachung von Intensivpatienten vorteilhaft, bei denen routinemäßig ein ZVK für Infusionen und Blutentnahmen in z. B. die Hals- oder Schlüsselbeinvene eingebracht wird.In another preferred embodiment of the sensor according to the invention, it is provided that the sensor is attached to the tip of a catheter, in particular a central venous catheter (CVC). For example, the sensor may be designed in the form of a hollow cylinder, which is pushed onto a conventional ZVK. Together with the CVC, the sensor can be introduced in particular into a venous blood vessel, so that the blood sugar content can be determined directly by means of the sensor. This embodiment is particularly advantageous for the continuous monitoring of blood glucose in intensive care patients, in which routinely a CVC for infusions and blood withdrawals in z. B. the cervical or subclavian vein is introduced.

Bei dem Trägermaterial der Sonde handelt es sich zweckmäßigerweise um ein physiologisch gut verträgliches Substrat, beispielsweise ein Sol-Gel. Ein Sol-Gel ist in besonderer Weise zur Immobilisierung der Enzyme geeignet, z.B. zu einer sogenannten Einschlussimmobilisierung, unter der man die Einhüllung des Enzyms in eine Trägermatrix versteht, aus der sich das Enzym nicht mehr lösen kann. Die Matrix muss jedoch eine ausreichende Diffusion für den An- und Abtransport der Edukte und Produkte für die Enzymreaktion ermöglichen. Der Träger, insbesondere das Sol-Gel, kann in Form einer inneren Schicht in dem Sensor angeordnet sein. Diese Schicht kann einen Innenraum begrenzen, in dem beispielsweise eine Pufferlösung mit den für die Reaktionen erforderlichen Substanzen in gelöster Form enthalten ist. Auch andere Einschlussimmobilisierungs-Matrizes sind geeignet. Es können verschiedene natürliche oder synthetische Polymere als Basis des Trägers eingesetzt werden, vor allem Polysaccharide wie beispielsweise Alginat, Carrageen, Chitin, Chitosan, Pektinat und/oder deren Derivate oder synthetische biokompatible Polymere mit polaren Gruppen wie z.B. Polylactide, Polylactid-co-Glycolid oder auch Polyvinylalkohol, Polyacrylate oder ähnliches. Besonders geeignet ist beispielsweise das Hydrogel pHEMA (Polyhydroxyethylmethacrylat), das aus einer Umsetzung von Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) und Polyethylenglycol gebildet wird. Weitere anorganische Matrizes sind z.B. Zeolithe und mesoporöse Silikate wie z.B. SBA-15 und MCM-41. Besonders geeignet sind beispielsweise Tetramethylorthosilikate und/oder kohlenhydratmodifizierte Silikate. The carrier material of the probe is expediently a physiologically well-tolerated substrate, for example a sol-gel. A sol-gel is particularly suitable for the immobilization of enzymes, for example, to a so-called inclusion immobilization, which is understood as the encapsulation of the enzyme in a carrier matrix, from which the enzyme can no longer dissolve. However, the matrix must allow sufficient diffusion for the delivery and removal of the starting materials and products for the enzyme reaction. The carrier, in particular the sol-gel, can be arranged in the form of an inner layer in the sensor. This layer can limit an interior in which, for example, a buffer solution with the substances required for the reactions is contained in dissolved form. Other inclusion immobilization matrices are also suitable. Various natural or synthetic polymers can be used as the basis of the carrier, especially polysaccharides such as alginate, carrageenan, chitin, chitosan, pectinate and / or their derivatives or synthetic biocompatible polymers with polar groups such as polylactides, polylactide-co-glycolide or also polyvinyl alcohol, polyacrylates or the like. Particularly suitable is, for example, the hydrogel pHEMA (polyhydroxyethyl methacrylate), which is formed from a reaction of hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and polyethylene glycol. Other inorganic matrices are For example, zeolites and mesoporous silicates such as SBA-15 and MCM-41. For example, tetramethyl orthosilicates and / or carbohydrate-modified silicates are particularly suitable.

Auch Hohlfaser- und Mikrokapsel-Strukturen als Trägerstruktur können insbesondere zur Einschlussimmobilisierung herangezogen werden. Weiterhin können die Enzyme auch durch chemische Vernetzung („Crosslinking“) immobilisiert und somit stabilisiert werden, entweder durch Quervernetzung der Enzymmoleküle untereinander oder durch Quervernetzung mit zugesetzten Trägermolekülen („co-Crosslinking“). Geeignete Quervernetzungsreagenzien für ein co-Crosslinking der hier verwendeten Enzyme sind z.B. Glutaraldehyd und/oder N-Hydroxysuccinimid. Also, hollow fiber and microcapsule structures as a support structure can be used in particular for inclusion immobilization. Furthermore, the enzymes can also be immobilized by chemical crosslinking ("crosslinking") and thus stabilized, either by cross-linking of the enzyme molecules with one another or by cross-linking with added carrier molecules ("co-crosslinking"). Suitable cross-linking reagents for co-crosslinking the enzymes used herein are e.g. Glutaraldehyde and / or N-hydroxysuccinimide.

Zweckmäßigerweise ist der Sensor von einer äußeren Membran umgeben, die für Glucose durchlässig ist. Vorteilhafterweise handelt es sich um eine biokompatible Membran aus beispielsweise pHEMA (Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)) und/oder Parylene, das auf einem kettenförmigen Poly-p-Xylylen basiert, und/oder PMMA (Polymethylmethacrylat) und/oder Polyisobutylen. Durch die äußere Membran wird zum einen der Sensorinhalt ummantelt. Weiterhin hat die Membran die Funktion eines Molekularsiebes. Durch die Membran kann Glucose aus dem umgebenden Gewebe oder der umgebenden Flüssigkeit in den Sensor eintreten, größere Fremdmoleküle wie z.B. Proteine und anderes, jedoch nicht. Weiterhin grenzt die Membran den Sensor auch nach außen ab, wobei die größeren Reaktanten, insbesondere ATP, NAD(H), die Substrate der Luciferase usw., innerhalb des Sensors zurückgehalten werden. Die Porengröße der umhüllenden Membran wird somit vorzugsweise auf 0,5–5 nm, noch bevorzugter auf 1–3 nm und am bevorzugtesten auf 1–2 nm eingestellt, sodass Glucose gerade noch in das Innere des Sensors hineindiffundieren kann, ohne dass Reaktanden oder Enzyme den Sensor verlassen können. Die Schichtdicke der Membran ist bevorzugt im Bereich 20 µm–1 mm, noch bevorzugter 50–250 µm. Weiterhin kann durch entsprechende Gestaltung der Membran die Gefahr einer Sensoreinkapselung durch den Körper und das Ausmaß der Entzündungsreaktion minimiert werden. Dies kann z.B. durch eine entsprechende Beschichtung auf der umhüllenden Membran erreicht werden (Coating), wodurch Abstoßungsreaktionen und/oder Entzündungsprozesse am Implantationsort deutlich reduziert oder ganz verhindert werden können. Die Porengröße der Membran nach der Beschichtung beträgt vorzugsweise ebenfalls 0,5–5 nm, noch bevorzugter 1–3 nm und am bevorzugtesten 1–2 nm. Beispielsweise kann der Sensor mit einer dünnen Platinschicht (bevorzugte Schichtdicke 0,5–10 nm, noch bevorzugter 1–6 nm, am bevorzugtesten 2–5 nm) beschichtet werden, z.B. durch Sputter-Abscheidung, um das bei Entzündungsprozessen entstehende Wasserstoffperoxid zu reduzieren. Grundsätzlich kann die Beschichtung aus jedem bioverträglichen Material bestehen, das katalytisch insbesondere Wasserstoffperoxid zersetzt, beispielsweise Platin, Ruthenium, Rhodium, Silber, Mangan, Gold, Palladium sowie deren Oxide und Legierungen. Optional kann die äußere Sensormembran in verschiedenen Lamellen aufgebaut sein, beispielsweise mit einer äußeren großporigen Schicht aus beispielsweise PET (Polyethylenterephthalat) und/oder ePTFE (expandiertes Polytetrafluorethylen) und/oder HD-PE (High Density Polyethylen). Die großporige Schicht hat vor allem den Vorteil, dass körpereigenes Gewebe unter Freilassung von Diffusionskanälen für die Reaktanten in den Sensor einwachsen kann, um eine Fixierung des Sensors im Gewebe zu erreichen und weist deshalb bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 10–100 µm, noch bevorzugter 30–90 µm auf. Die Schichtdicke dieser großporigen Lamelle ist bevorzugt im Bereich 10 µm–1 mm, noch bevorzugter 50–250 µm, am bevorzugtesten 75–125 µm. Unterhalb der großporigen Schicht kann eine Molekularsieb-Schicht mit einer entsprechenden Porengröße von 0,5–5 nm, noch bevorzugter 1–3 nm und am bevorzugtesten 1–2 nm vorgesehen sein. Die Schichtdicke dieser Molekularsieb-Schicht liegt bevorzugt im Bereich 10 µm–1 mm, noch bevorzugter 50–250 µm, am bevorzugtesten 75–125 µm. Weiterhin kann zwischen der großporigen und der Molekularsieb-Schicht optional eine weitere Schicht eingebaut sein, die die Funktion eines Vorfilters übernimmt. Bevorzugt ist diese Vorfilterschicht aus beispielsweise PET (Polyethylenterephthalat), ePTFE (expandiertes Polytetrafluorethylen) und/oder HD-PE (High Density Polyethylen) aufgebaut und weist eine Porengröße von bevorzugt 0,1–10 µm und noch bevorzugter 1–5 µm auf. Die Schichtdicke dieser Molekularsieb-Schicht ist bevorzugt im Bereich 10 µm–1 mm, noch bevorzugter 50–250 µm, am bevorzugtesten 75–125 µm.Conveniently, the sensor is surrounded by an outer membrane that is permeable to glucose. Advantageously, it is a biocompatible membrane of, for example, pHEMA (poly (2-hydroxyethyl methacrylate)) and / or parylene, which is based on a chain-like poly-p-xylylene, and / or PMMA (polymethyl methacrylate) and / or polyisobutylene. On the one hand, the sensor content is covered by the outer membrane. Furthermore, the membrane has the function of a molecular sieve. Through the membrane, glucose may enter the sensor from the surrounding tissue or fluid, larger foreign molecules, e.g. Proteins and others, but not. Furthermore, the membrane also externally delimits the sensor, with the larger reactants, particularly ATP, NAD (H), the luciferase substrates, etc. being retained within the sensor. The pore size of the enveloping membrane is thus preferably set at 0.5-5 nm, more preferably at 1-3 nm, and most preferably at 1-2 nm so that glucose can just diffuse into the interior of the sensor without any reactants or enzymes leave the sensor. The layer thickness of the membrane is preferably in the range 20 μm-1 mm, more preferably 50-250 μm. Furthermore, by appropriate design of the membrane, the risk of sensor encapsulation by the body and the extent of the inflammatory reaction can be minimized. This can e.g. be achieved by a corresponding coating on the enveloping membrane (coating), whereby rejection reactions and / or inflammatory processes at the implantation site can be significantly reduced or completely prevented. The pore size of the membrane after coating is also preferably 0.5-5 nm, more preferably 1-3 nm and most preferably 1-2 nm. For example, the sensor may be coated with a thin platinum layer (preferred layer thickness 0.5-10 nm, still more preferably 1-6 nm, most preferably 2-5 nm), eg by sputter deposition to reduce the hydrogen peroxide produced in inflammatory processes. In principle, the coating can consist of any biocompatible material which catalytically decomposes in particular hydrogen peroxide, for example platinum, ruthenium, rhodium, silver, manganese, gold, palladium and their oxides and alloys. Optionally, the outer sensor membrane can be constructed in different lamellae, for example with an outer large pore layer of, for example, PET (polyethylene terephthalate) and / or ePTFE (expanded polytetrafluoroethylene) and / or HDPE (high density polyethylene). The large-pore layer has the particular advantage that the body's own tissue can grow into the sensor, leaving diffusion channels for the reactants in order to achieve a fixation of the sensor in the tissue and therefore preferably has a pore size in the range of 10-100 microns, more preferably 30-90 μm. The layer thickness of this large-pored lamella is preferably in the range 10 μm-1 mm, more preferably 50-250 μm, most preferably 75-125 μm. Below the large pore layer may be provided a molecular sieve layer having a corresponding pore size of 0.5-5 nm, more preferably 1-3 nm, and most preferably 1-2 nm. The layer thickness of this molecular sieve layer is preferably in the range 10 μm-1 mm, more preferably 50-250 μm, most preferably 75-125 μm. Furthermore, between the large-pored and the molecular sieve layer optionally another layer can be installed, which takes over the function of a prefilter. This prefilter layer is preferably composed of, for example, PET (polyethylene terephthalate), ePTFE (expanded polytetrafluoroethylene) and / or HDPE (high density polyethylene) and has a pore size of preferably 0.1-10 μm and more preferably 1-5 μm. The layer thickness of this molecular sieve layer is preferably in the range 10 μm-1 mm, more preferably 50-250 μm, most preferably 75-125 μm.

Innerhalb des erfindungsgemäßen Sensors kann ein integrierter Photosensor vorgesehen sein. Der Photosensor kann beispielsweise innerhalb einer transparenten Kapsel angeordnet sein, die sich im Inneren des Sensors befindet. Durch den integrierten Photosensor kann die enzymatisch erzeugte Chemolumineszenz in direkter Nähe zum Erzeugungsort der Chemolumineszenz erfasst werden, sodass keine Messverluste auftreten. Der Photosensor kann mit einer Drahtlos-Datenübertragungseinrichtung, insbesondere einer integrierten Antenne, kombiniert werden, sodass die erfassten Messwerte über die Antenne, beispielsweise über eine Bluetooth-Verbindung, an eine externe Auswerteeinheit mit einem entsprechenden Empfänger weitergeleitet werden können. Hierfür kann beispielsweise ein Smartphone eingesetzt werden, das eine entsprechende Applikation aufweist. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Sensor einen Temperatursensor umfassen, der sich beispielsweise innerhalb der erwähnten transparenten Kapsel im Inneren des erfindungsgemäßen Sensors befindet, die auch den Photosensor enthält. Hierdurch können aktuelle Temperaturwerte erfasst werden und Temperatureinflüsse bei der Auswertung der Messergebnisse berücksichtigt werden. Within the sensor according to the invention, an integrated photosensor can be provided. The photosensor may, for example, be arranged inside a transparent capsule which is located inside the sensor. The integrated photosensor allows the detection of enzymatically generated chemiluminescence in the immediate vicinity of the site of chemiluminescence, so that no measurement losses occur. The photosensor can be combined with a wireless data transmission device, in particular an integrated antenna, so that the detected measured values can be forwarded via the antenna, for example via a Bluetooth connection, to an external evaluation unit with a corresponding receiver. For this example, a smartphone can be used, which has a corresponding application. Furthermore, the sensor according to the invention may comprise a temperature sensor which is located, for example, within the mentioned transparent capsule in the interior of the sensor according to the invention which also contains the photosensor. In this way, current temperature values can be recorded and temperature influences taken into account in the evaluation of the measurement results.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des Sensors ist die innere transparente Kapsel mit dem Photosensor direkt von dem Sol-Gel, das die immobilisierten Enzyme enthält, umgeben. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass die erzeugte Chemolumineszenz ortsnah ohne weitere Intensitätsverluste erfasst wird, da keine unerwünschte Intensitätsabschwächung durch lichtabsorbierende Medien zwischen chemolumineszentem Enzym und Detektor auftreten kann. In a preferred embodiment of the sensor, the inner transparent capsule with the photosensor is surrounded directly by the sol-gel containing the immobilized enzymes. This embodiment has the advantage that the chemiluminescence generated is detected close to the location without any further loss of intensity, since no undesired intensity attenuation by light-absorbing media between chemiluminescent enzyme and detector can occur.

Die Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung des beschriebenen Sensors zur Messung des Glucosegehaltes oder der Glucosekonzentration in einer Körperflüssigkeit, beispielsweise in der Interstitialflüssigkeit im Mensch oder Tier, wobei die Intensität von chemisch erzeugtem, sichtbarem Licht gemessen wird. Aus der Glucosekonzentration in der Interstitialflüssigkeit kann auf die Glucosekonzentration im Blut rückgeschlossen werden. Beim Menschen handelt es sich insbesondere um Diabetes-Patienten, bei denen eine Überwachung des Blutzuckerspiegels erforderlich ist. In ähnlicher Weise kann der erfindungsgemäße Sensor auch bei Tieren eingesetzt werden, bei denen eine Überwachung des Glucosespiegels sinnvoll ist. Der in den Körper einbringbare oder implantierbare Sensor ist in sehr vorteilhafter Weise zur Messung des Glucosespiegels geeignet, da für die Messung nach der Einbringung oder Implantation des Sensors kein weiterer Eingriff mehr erforderlich ist. Es muss lediglich die Intensität der erzeugten Chemolumineszenz erfasst werden. Dies kann in einfacher Weise mit einem kleinen, handlichen Photometer erfolgen, das zum Messzeitpunkt beispielsweise an das Ohr oder einen anderen Implantationsort gehalten wird und das eine Umrechnung der gemessenen Intensität der Chemolumineszenz in eine bestimmte Blutzuckerkonzentration erlaubt. Weiterhin kann eine Detektionseinheit auch z. B. als Clip am Oberarm, Oberschenkel, Bauch oder ähnlichem mit z. B. einem Gurt fixiert werden. Alternativ kann ein Photosensor in den erfindungsgemäßen Sensor integriert sein, gegebenenfalls in Kombination mit einer integrierten Antenne. So kann der Patient unmittelbar den aktuellen Glucosewert ablesen und entsprechende Maßnahmen ergreifen, ohne dass ein weiterer Eingriff, z. B. eine Blutentnahme oder eine Bestrahlung mit UV-Licht, erforderlich wären. Die Messung kann zu beliebigen Zeitpunkten wiederholt werden. Da sie sehr bequem durchzuführen ist, sind auch häufige Messungen ohne Weiteres möglich, bis hin zu einer kontinuierlichen Überwachung des Glucosespiegels, wenn erforderlich. The invention further comprises the use of the described sensor for measuring the glucose content or the glucose concentration in a body fluid, for example in the human or animal interstitial fluid, wherein the intensity of chemically generated, visible light is measured. From the glucose concentration in the interstitial fluid can be deduced the glucose concentration in the blood. In particular, humans are diabetic patients who require monitoring of blood sugar levels. Similarly, the sensor according to the invention can also be used in animals in which monitoring of the glucose level makes sense. The insertable or implantable in the body sensor is very suitable for measuring the glucose level, since no further intervention is required for the measurement after the introduction or implantation of the sensor. It is only necessary to record the intensity of the chemiluminescence produced. This can be done in a simple manner with a small, handy photometer, which is held at the time of measurement, for example, to the ear or other implantation site and allows a conversion of the measured intensity of chemiluminescence in a specific blood sugar concentration. Furthermore, a detection unit also z. B. as a clip on the upper arm, thigh, abdomen or the like with z. B. a belt to be fixed. Alternatively, a photosensor may be integrated in the sensor according to the invention, optionally in combination with an integrated antenna. Thus, the patient can immediately read the current glucose level and take appropriate action without any further intervention, eg. As a blood collection or irradiation with UV light would be required. The measurement can be repeated at any time. Because it is very convenient to perform, frequent measurements are readily available, all the way to continuous monitoring of glucose levels, if required.

Es ist möglich, dass die detektierte Glucosekonzentration beispielsweise auf eine Smartphone-Applikation übertragen wird, die den zeitlichen Verlauf des Glucosespiegels speichert und auswertet sowie gegebenenfalls lebensbedrohliche Änderungen an eine zentrale medizinische Einrichtung übermittelt.It is possible that the detected glucose concentration is transmitted, for example, to a smartphone application which stores and evaluates the time course of the glucose level and, if appropriate, transmits life-threatening changes to a central medical facility.

Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Messung und/oder zum Nachweis von Glucose, beispielsweise zur Glucosemessung in einer Körperflüssigkeit. Bei diesem Verfahren wird die in der Flüssigkeit enthaltene Glucose zunächst durch Katalyse mit dem Enzym Hexokinase zu Glucose-6-Phosphat umgesetzt. Das Glucose-6-Phosphat wird mittels des Enzyms Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase zu 6-Phosphogluconolacton umgesetzt. Bei dieser Reaktion wird NAD⁺ mit H⁺ und 2 e^– zu NADH und/oder NADP⁺ mit H⁺ und 2 e^– zu NADPH reduziert. Erfindungsgemäß werden das gebildete NADH und/oder das NADPH in einer anschließenden Reaktion nachgewiesen, wobei mindestens ein Parameter einer durch eine chemische Reaktion erzeugten elektromagnetischen Strahlung (Chemolumineszenz) ausgewertet wird. Insbesondere kann mit diesem Verfahren ein quantitativer Nachweis von Glucose geführt werden, da das nachweisbare NADH und/oder NADPH in direktem Zusammenhang mit dem Glucosegehalt in der Probe steht. Dieses Verfahren ist daher allgemein zur Messung von Glucose und insbesondere zur Messung von Glucose in einer Körperflüssigkeit geeignet. Mit besonderem Vorteil erfolgen der Nachweis von NADH und/oder von NADPH und damit die Messung der Glucose durch eine enzymatisch katalysierte Reaktion, wobei letztendlich die elektromagnetische Strahlung und insbesondere sichtbares Licht erzeugt wird, die bzw. das zur Auswertung herangezogen wird.The invention further encompasses a method for measuring and / or detecting glucose, for example for glucose measurement in a body fluid. In this method, the glucose contained in the liquid is first converted by catalysis with the enzyme hexokinase to glucose-6-phosphate. The glucose-6-phosphate is converted by means of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase to 6-phosphogluconolactone. In this reaction, NAD ^{+ is} reduced with H ⁺ and 2 e ^- to NADH and / or NADP ⁺ with H ⁺ and 2 e ^- to NADPH. According to the invention, the NADH formed and / or the NADPH are detected in a subsequent reaction, wherein at least one parameter of an electromagnetic radiation generated by a chemical reaction (chemiluminescence) is evaluated. In particular, this method can be used to quantitatively detect glucose since the detectable NADH and / or NADPH is directly related to the glucose content in the sample. This method is therefore generally suitable for the measurement of glucose and in particular for the measurement of glucose in a body fluid. With particular advantage, the detection of NADH and / or NADPH and thus the measurement of glucose by an enzymatically catalyzed reaction, wherein ultimately the electromagnetic radiation and in particular visible light is generated, which is used for the evaluation.

Gegenüber bekannten Verfahren hat das erfindungsgemäße Verfahren den großen Vorteil, dass keine speziellen Messverfahren, beispielsweise keine spektrometrische Messung bei einer bestimmten Wellenlänge, zur Auswertung erforderlich sind. Die Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens können mit wenig Aufwand und in miniaturisierter Weise realisiert werden. Es ist beispielsweise kein aufwändiges Spektrometer erforderlich. Vielmehr kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit besonderem Vorteil sichtbares Licht durch eine chemische Reaktion erzeugt werden (= Chemolumineszenz), das in sehr einfacher Weise ausgewertet werden kann. Auszuwertende Parameter der Chemolumineszenz sind beispielsweise die Intensität der Lumineszenz bei bestimmten Wellenlängen, die Integrale unter den detektierten optischen Emissionsbanden oder deren Verhältnisse zu einander. Auch können temperaturabhängige Unterschiede der Lichtreaktion (z.B. Intensität) zum Nachweis von NADH und/oder NADPH bzw. der Glucose herangezogen werden. Beispielsweise kann die Intensität des erzeugten Lichts durch einen einfachen Photosensor erfasst werden, der optional mit einem optischen Filter versehen sein kann, der durchlässig für den Wellenlängenbereich der erzeugten Chemolumineszenz ist, jedoch Umgebungslicht anderer Wellenlängen herausfiltert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Labor, beispielsweise zur Bestimmung der Glucose in einer Blutprobe oder anderen Proben, durchgeführt werden. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren in besonderer Weise zur Realisierung des bereits beschriebenen Sensors, der in den Körper eingebracht oder implantiert werden kann und der eine Messung des Glucosegehaltes vor allem in der Interstitialflüssigkeit ohne weiteren Eingriff und ohne Schädigungen, wie sie beispielsweise bei einer UV-Bestrahlung zu befürchten wären, erlaubt. Bei einem stabilen Stoffwechsel entspricht der Glucosegehalt in der Interstitialflüssigkeit ungefähr dem Blutzuckergehalt, sodass aus einer Messung in der Interstitialflüssigkeit indirekt auch der Blutzuckergehalt bestimmt werden kann. Da insbesondere bei schnellen Konzentrationssprüngen des Glucosegehaltes im Blut der Wert in der Interstitialflüssigkeit sich unter Umständen nur zeitverzögert anpassen kann, kann es zweckmäßig sein, vor einer entsprechenden Insulindosierung auf der Basis der erfindungsgemäßen Messung in der Interstitialflüssigkeit zusätzlich eine Blutzuckermessung mit herkömmlichen Methoden durchzuführen. Compared with known methods, the method according to the invention has the great advantage that no special measuring methods, for example no spectrometric measurement at a specific wavelength, are required for the evaluation. The devices for carrying out the method can be realized with little effort and in a miniaturized way. For example, no complex spectrometer is required. Rather, in the method according to the invention visible light can be produced with particular advantage by a chemical reaction (= chemiluminescence), which can be evaluated in a very simple manner. Evaluated parameters of the chemiluminescence are, for example, the intensity of the luminescence at certain wavelengths, the integrals among the detected optical emission bands or their relationships to each other. Also, temperature-dependent differences in the light reaction (eg intensity) can be used to detect NADH and / or NADPH or glucose. For example, the intensity of the generated light can be detected by a simple photosensor, which is optional may be provided with an optical filter which is transmissive to the wavelength range of the chemiluminescence produced but which filters out ambient light of other wavelengths. The method according to the invention can be carried out in the laboratory, for example for the determination of glucose in a blood sample or other samples. In addition, the inventive method is particularly suitable for the realization of the previously described sensor, which can be introduced or implanted in the body and a measurement of the glucose content, especially in the interstitial fluid without further intervention and without damage, as for example in a UV Radiation would be allowed. In the case of a stable metabolism, the glucose content in the interstitial fluid approximately corresponds to the blood sugar content, so that the blood sugar content can also be determined indirectly from a measurement in the interstitial fluid. Since the value in the interstitial fluid can possibly adapt only with a time delay, in particular in the case of rapid changes in the concentration of the glucose content in the blood, it may be expedient to additionally carry out a blood sugar measurement using conventional methods before a corresponding insulin dosage on the basis of the measurement according to the invention in the interstitial fluid.

Für den Glucosenachweis gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sind vorteilhafterweise keine speziellen Laborgeräte, wie beispielsweise ein Spektrometer, und keine hautschädigenden externen Anregungsquellen, wie beispielsweise UV-Laser, erforderlich. Die Durchführung und Auswertung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens kann daher ohne Weiteres auch von einem Patienten beispielsweise zuhause oder unterwegs erfolgen. For the detection of glucose according to the method of the invention are advantageously no special laboratory equipment, such as a spectrometer, and no skin damaging external excitation sources, such as UV laser required. The implementation and evaluation of the detection method according to the invention can therefore be carried out by a patient, for example at home or on the road.

Zur enzymatischen Erzeugung der Chemolumineszenz im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens kann als Enzym beispielsweise eine Luciferase eingesetzt werden. Unter der Bezeichnung „Luciferasen“ werden strukturell unterschiedliche Enzyme zusammengefasst, denen gemeinsam ist, dass sie sogenannte Luciferine (Naturstoffe) zu instabilen Produkten umsetzen, bei deren Zerfall es zu einer Lumineszenz kommt, wobei also sichtbares Licht emittiert wird. Die Intensität des emittierten Lichts ist abhängig von den Konzentrationen der Reaktanten der Enzymreaktionen und wird erfindungsgemäß genutzt, um NADH und/oder NADPH und damit indirekt Glucose qualitativ und/oder quantitativ nachzuweisen. Prinzipiell können für das erfindungsgemäße Verfahren und für den erfindungsgemäßen Sensor (Mikrosensor) alle Luciferasen verwendet werden, also beispielsweise Firefly-Luciferasen (Familie der Lampyridae, z.B. aus Photinus pyralis, Lampyris noctiluca, Lamprohiza splendidula u.v.m.) oder Seefeder-Luciferasen (Ordnung Pennatulacea, z.B. aus Renilla reniformis) oder Pilz-Luciferasen (z.B. aus Omphalotus olearius) oder bakterielle Luciferasen (z.B. aus Vibrio harveyi). Firefly-Luciferasen können in Anwesenheit von ATP allerdings auch ohne NAD(P)H reagieren, wodurch unter Umständen die Auswertung der Messdaten erschwert wird. Im Allgemeinen sind daher insbesondere Seefedern-Luciferasen bevorzugt, die kein ATP für die NAD(P)H-abhängige Reaktion benötigen. Ein weiterer Vorteil der Seefeder-Luciferasen ist, dass diese Luciferasen keine post-translationale Modifikation für ihre Aktivität benötigen. Bakterielle Luciferasen benötigen zusätzlich zum NAD(P)H und einem langkettigen Aldehyd noch FMNH₂ (Flavinmononucleotid, reduzierte Form) als weiteren Verbrauchsstoff zur Katalyse der Lichtreaktion. Da FMNH₂ in der Gegenwart des für die Lichtreaktion benötigten Sauerstoffs eine Autooxidation zeigt und schnell komplett abreagieren würde, ist die Kombination mit einem vierten Enzym zur ständigen Neuproduktion von FMNH₂ vorteilhaft. Beispielsweise kann hierfür eine NAD(P)H:FMN-Oxidoreduktase eingesetzt werden. Durch dieses zusätzliche Enzym bei der Verwendung von bakteriellen Luciferasen kann die Funktionsfähigkeit des Sensors verbessert und seine Lebensdauer erhöht werden.For the enzymatic production of chemiluminescence in the course of the process according to the invention, it is possible, for example, to use a luciferase as the enzyme. The term "luciferases" summarizes structurally different enzymes, which have in common that they convert so-called luciferins (natural products) to unstable products, in whose decay it comes to a luminescence, ie visible light is emitted. The intensity of the emitted light is dependent on the concentrations of the reactants of the enzyme reactions and is used according to the invention to qualitatively and / or quantitatively detect NADH and / or NADPH and thus indirectly glucose. In principle, all luciferases can be used for the method according to the invention and for the sensor according to the invention (microsensor), for example firefly luciferases (family of Lampyridae, eg from Photinus pyralis, Lampyris noctiluca, Lamprohiza splendidula and many more) or Seefeder luciferases (order Pennatulacea, eg from Renilla reniformis) or fungal luciferases (eg from Omphalotus olearius) or bacterial luciferases (eg from Vibrio harveyi). However, in the presence of ATP, firefly luciferases can also react without NAD (P) H, which may make it difficult to evaluate the measurement data. Therefore, in particular, sea-feather luciferases which do not require ATP for the NAD (P) H-dependent reaction are generally preferred. Another advantage of the Seefeder luciferases is that these luciferases do not require post-translational modification for their activity. Bacterial luciferases require, in addition to NAD (P) H and a long-chain aldehyde, FMNH ₂ (flavin mononucleotide, reduced form) as a further consumable for the catalysis of the light reaction. Since FMNH ₂ would auto-oxidize in the presence of the oxygen required for the light reaction and would rapidly be completely consumed, the combination with a fourth enzyme for the continuous re-production of FMNH _{2 is} advantageous. For example, an NAD (P) H: FMN oxidoreductase can be used for this purpose. This additional enzyme in the use of bacterial luciferases can improve the functionality of the sensor and increase its life.

Als Substrate für die Luciferasen (Luciferine) kommen z.B. bei dem Einsatz von Renilla-Luciferasen beispielsweise Coelenterazin oder bei dem Einsatz von Firefly-Luciferasen beispielsweise D-Luciferin zum Einsatz. Diese verschiedenen Substrate der Luciferasen sind kommerziell erhältlich. As substrates for the luciferases (luciferins) are e.g. in the use of Renilla luciferases, for example, coelenterazine or in the use of firefly luciferases, for example, D-luciferin used. These various substrates of the luciferases are commercially available.

Für die enzymatischen Reaktionen sind vor allem ATP, NAD⁺ und/oder NADP⁺ sowie Substrate für die Luciferase erforderlich. Diese Substanzen werden zweckmäßigerweise extern zugesetzt. Im Prinzip ist es auch möglich, zumindest zum Teil körpereigene Substanzen zu verwenden, insbesondere wenn konstante Konzentrationen dieser Substanzen gewährleistet werden können, wobei in diesem Fall bei einem Sensor die Porengröße einer äußeren Membran des Sensors angepasst werden muss, um die Eindiffusion dieser Substanzen in den Sensor zu ermöglichen. Weiterhin sollte sichergestellt werden, dass insbesondere für die Luciferase-Reaktion Sauerstoff beispielsweise aus der Luft oder als O₂-Atmosphäre vorliegt.For the enzymatic reactions, especially ATP, NAD ⁺ and / or NADP ⁺ as well as substrates for the luciferase are required. These substances are expediently added externally. In principle, it is also possible to use at least some of the body's own substances, in particular if constant concentrations of these substances can be ensured, in which case the pore size of an outer membrane of the sensor must be adjusted in order to prevent the diffusion of these substances into the sensor Enable sensor. Furthermore, it should be ensured that, in particular for the luciferase reaction, oxygen is present, for example, from the air or as an O ₂ atmosphere.

Für das erfindungsgemäße Verfahren und für den Einsatz im oder auf dem erfindungsgemäßen Sensor sind die folgenden Konzentrationsbereiche für die verschiedenen Enzyme und Substrate besonders geeignet, wobei als Lösungsmittel für die Reaktionslösung beispielsweise gepufferte (siehe unten) und/oder nicht gepufferte wässrige Lösungen und/oder alle anderen Lösungsmittel verwendet werden können, die nicht zu einer Denaturierung der Enzyme führen. Die Konzentrationsangaben sind im Hinblick auf die Molarität (M) beschrieben, wobei M = mol/L ist. Luciferase: 5 nM–10 mM, bevorzugt 10 µM–5 mM, insbesondere 100 µM–2 mM Hexokinase: 5 nM–5 mM, bevorzugt 10 µM–2 mM, insbesondere 50 µM–1 mM Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase: 5 nM–5 mM, bevorzugt 10 µM–2 mM, insbesondere 50 µM–1 mM ATP: 5 µM–250 mM, bevorzugt 100 µM–1 mM, insbesondere 250 µM–750 µM NAD⁺/NADP⁺: 5 µM–250 mM, bevorzugt 100 µM–1 mM, insbesondere 250 µM–750 µM Luciferin: 5 µM–250 mM, bevorzugt 100 µM–1 mM, insbesondere 250 µM–750 µM For the method according to the invention and for use in or on the sensor according to the invention, the following concentration ranges are particularly suitable for the various enzymes and substrates, for example buffered (see below) and / or unbuffered aqueous solutions and / or all as solvents for the reaction solution other solvents can be used that are not too denaturing the enzymes. The concentration data are described in terms of molarity (M), where M = mol / L. luciferase: 5 nM-10 mM, preferably 10 μM-5 mM, especially 100 μM-2 mM hexokinase: 5 nM-5 mM, preferably 10 μM-2 mM, in particular 50 μM-1 mM Glucose-6-phosphate dehydrogenase: 5 nM-5 mM, preferably 10 μM-2 mM, in particular 50 μM-1 mM ATP: 5 μM-250 mM, preferably 100 μM-1 mM, in particular 250 μM-750 μM NAD ⁺ / NADP ⁺ : 5 μM-250 mM, preferably 100 μM-1 mM, in particular 250 μM-750 μM luciferin: 5 μM-250 mM, preferably 100 μM-1 mM, in particular 250 μM-750 μM

Die Wahl des geeigneten Luciferins ist insbesondere abhängig von der jeweils eingesetzten Luciferase.The choice of the appropriate luciferin is particularly dependent on the particular luciferase used.

Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Glucosebestimmung in einer Körperflüssigkeit, bei dem das beschriebene Verfahren eingesetzt wird. Diese Glucosebestimmung kann beispielsweise in vitro durchgeführt werden, wobei insbesondere eine Blutprobe entnommen wird und die Reaktionen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in üblicher Weise beispielsweise in einem Reaktionsgefäß oder auf einem Teststreifen durchgeführt werden. Andererseits eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur indirekten Blutzuckerbestimmung, wobei der Glucosespiegel in der Interstitialflüssigkeit erfindungsgemäß gemessen wird und hieraus auf den Blutzuckergehalt geschlossen wird. Diese Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich in besonderer Weise für eine invivo-Messung, insbesondere im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Sensor, der in einem Patienten implantiert sein kann. The invention further comprises a method for determining glucose in a body fluid, in which the described method is used. This glucose determination can be carried out, for example, in vitro, wherein in particular a blood sample is taken and the reactions are carried out according to the method according to the invention in a conventional manner, for example in a reaction vessel or on a test strip. On the other hand, the method according to the invention is suitable for the indirect determination of blood sugar, wherein the glucose level in the interstitial fluid is measured according to the invention and from this the blood sugar content is deduced. This application of the method according to the invention is particularly suitable for an in vivo measurement, in particular in connection with the sensor according to the invention, which may be implanted in a patient.

Die Erfindung umfasst schließlich ein Testkit zur Messung von Glucose, wobei das Testkit die Enzyme Hexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase umfasst. Weiterhin ist erfindungsgemäß wenigstens ein Enzym zum Nachweis von NADH und/oder von NADPH enthalten. Zum enzymatischen Nachweis von NADH und/oder NADPH wird in bevorzugter Weise eine Luciferase eingesetzt, wobei eine Chemolumineszenz in Abhängigkeit von NADH und/oder NADPH erzeugt werden kann, die eine quantitative Bestimmung der Glucose in der Probe erlaubt. Weiterhin sind vorzugsweise verschiedene Substanzen enthalten, die für die enzymatischen Reaktionen erforderlich sind, insbesondere ATP und/oder NAD⁺ und/oder NADP⁺ und gegebenenfalls geeignete Substrate für die Luciferase-Reaktion, insbesondere wenigstens ein Luciferin. Weiterhin können Salze (z.B. NaCl) und/oder Puffersubstanzen (z.B. Citratpuffer, K₃PO₄-Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung, PBS), Borat-Puffer, 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (MES), 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsäure-Puffer (HEPES), Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)) zur Einstellung der optimalen Bedingungen für die enzymatischen Reaktionen vorgesehen sein. Durch die Einstellung des pH-Wertes kann die Reaktionsrate im Ansatz gesteuert werden. Beispielsweise können pH-Werte zwischen 4 bis 10, vorzugsweise zwischen 5 bis 9 und insbesondere zwischen 6 und 8, je nach den Bedürfnissen der eingesetzten Enzyme, eingestellt werden. Der pH-Bereich zwischen 6 und 8 ist besonders vorteilhaft, da in diesem Bereich alle eingesetzten Enzyme in der Regel eine ausreichende Aktivität entfalten. Zu beachten ist hierbei, dass sich bei einer Immobilisierung der Enzyme, wie sie vor allem im Hinblick auf den erfindungsgemäßen Sensor vorgenommen werden kann, das pH-Optimum der Enzyme verschieben kann. Als Salze können bei spielsweise Mg²⁺- und/oder Ca²⁺-Ionen enthalten sein, wenn diese Ionen für eine optimale Aktivität beispielsweise der Luciferase vorteilhaft sind. Finally, the invention comprises a test kit for measuring glucose, wherein the test kit comprises the enzymes hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. Furthermore, according to the invention at least one enzyme for the detection of NADH and / or NADPH is included. For the enzymatic detection of NADH and / or NADPH, a luciferase is preferably used, it being possible to produce chemiluminescence as a function of NADH and / or NADPH, which allows a quantitative determination of the glucose in the sample. Furthermore, various substances are preferably contained which are required for the enzymatic reactions, in particular ATP and / or NAD ⁺ and / or NADP ⁺ and optionally suitable substrates for the luciferase reaction, in particular at least one luciferin. Furthermore, salts (eg NaCl) and / or buffer substances (eg citrate buffer, K ₃ PO ₄ buffer (phosphate buffered saline, PBS), borate buffer, 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer (MES), 2- (4 - (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid buffer (HEPES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES)) to set the optimal conditions for the enzymatic reactions. By adjusting the pH, the reaction rate can be controlled in the approach. For example, pH values between 4 to 10, preferably between 5 to 9 and in particular between 6 and 8, depending on the needs of the enzymes used, can be adjusted. The pH range between 6 and 8 is particularly advantageous since in this range all the enzymes used generally have sufficient activity. It should be noted in this case that the pH optimum of the enzymes can shift when the enzymes are immobilized, as can be carried out with regard to the sensor according to the invention. ²⁺ ions and / or Ca be contained, when these ions are beneficial for an optimal activity, for example luciferase - as salts can be used as game Mg ^2+.

Es kann vorgesehen sein, dass die verschiedenen enzymatischen Reaktionen des Verfahrens in einem Ansatz durchgeführt werden, wodurch die Durchführung sehr einfach ist. Dies ist vor allem dann sinnvoll, wenn die verschiedenen Reaktionen in etwa gleiche Reaktionsbedingungen, z.B. in Bezug auf den pH-Wert, erlauben. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die verschiedenen Reaktionen mehrstufig durchgeführt werden. It can be provided that the various enzymatic reactions of the process are carried out in one batch, whereby the implementation is very simple. This is particularly useful when the different reactions in approximately the same reaction conditions, e.g. in terms of pH, allow. However, it can also be provided that the various reactions are carried out in multiple stages.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.Further features and advantages of the invention will become apparent from the following description of embodiments in conjunction with the drawings. In this case, the individual features can be implemented individually or in combination with each other.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Brief description of the drawings

In den Zeichnungen zeigen:In the drawings show:

1 schematische Darstellung des Funktionsprinzips eines erfindungsgemäßen Sensors zur interstitiellen Glucosemessung; 1 schematic representation of the principle of operation of a sensor according to the invention for interstitial glucose measurement;

2 schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors; 2 schematic representation of a first embodiment of a sensor according to the invention;

3 schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors; 3 schematic representation of another embodiment of a sensor according to the invention;

4 schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors und 4 schematic representation of another embodiment of a sensor according to the invention and

5 schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors. 5 schematic representation of another embodiment of a sensor according to the invention.

Beschreibung von AusführungsbeispielenDescription of exemplary embodiments

1 illustriert in schematischer Weise das Funktionsprinzip eines erfindungsgemäßen implantierbaren Sensors (Mikrosensor), mit dem gekoppelte enzymatische Reaktionen zur Bestimmung der Glucosekonzentration in der Interstitialflüssigkeit, somit entsprechend eine Blutzuckerbestimmung, durchgeführt werden. Der Sensor 10, hier dargestellt in bildlicher Weise als leuchtende Glühbirne, ist im Ohrläppchen eines menschlichen Ohres 20 implantiert. Der Nachweis der in der Interstitialflüssigkeit enthaltenen Glucose 30 erfolgt durch eine Kopplung enzymatischer Reaktionen, die letztendlich in der Erzeugung einer Chemolumineszenz 40 münden. Die Intensität der erzeugten Chemolumineszenz 40 ist proportional zum Glucosegehalt 30, sodass durch die Intensität der erzeugten Chemolumineszenz der Glucosegehalt in der Interstitialflüssigkeit gemessen werden kann. Der Glucosegehalt in der Interstitialflüssigkeit entspricht in etwa dem Blutzuckergehalt, sodass aus dem gemessenen Wert der Blutzuckergehalt abgeleitet werden kann. Die für die Reaktionen erforderlichen Enzyme sind auf oder in dem Sensor 10 enthalten, beispielsweise auf dem Sensor 10 immobilisiert. Es sind keine weiteren externen Eingriffe für die Reaktion oder für die Auswertung der Reaktion erforderlich. Es muss beispielsweise keine externe Anregung einer Fluoreszenz durch eine UV-Bestrahlung oder Ähnliches vorgenommen werden, da der Sensor 10 in Abhängigkeit von der Glucosereaktion in unterschiedlichem Ausmaß sichtbares Licht emittiert. Bildlich gesprochen wird durch den erfindungsgemäßen Sensor in gewisser Weise eine Art Glühbirne im Ohr erzeugt, die in Abhängigkeit von dem Glucosespiegel von sich aus unterschiedlich stark leuchtet, woraus die Glucosekonzentration abgeleitet werden kann. Zur Auswertung des erzeugten Lichtes wird zweckmäßigerweise ein geeigneter Photosensor eingesetzt, der beispielsweise mittels eines Clips am Ohr angebracht werden kann oder der als kleines handliches Gerät zur Messung an das Ohr gehalten werden kann. Es sind auch andere Implantationsorte möglich, wobei der Photosensor in entsprechender Weise in die Nähe des implantierten Sensors gebracht wird. Alternativ kann ein Photosensor in den implantierbaren Sensor integriert sein. In dieser Ausgestaltung können die Daten beispielsweise über eine Drahtlosverbindung an eine Auswerteeinheit außerhalb des Körpers, beispielsweise an ein Smartphone mit entsprechender Applikation oder an ein anderes Gerät gesendet werden. 1 Illustrates schematically the functional principle of an implantable sensor (microsensor) according to the invention, with the coupled enzymatic reactions for determining the glucose concentration in the interstitial fluid, thus according to a blood sugar determination, are performed. The sensor 10 pictured here as a glowing lightbulb, is in the earlobe of a human ear 20 implanted. The detection of the glucose contained in the interstitial fluid 30 occurs through a coupling of enzymatic reactions, which ultimately results in the generation of chemiluminescence 40 lead. The intensity of chemiluminescence generated 40 is proportional to the glucose content 30 so that the intensity of the chemiluminescence produced allows the glucose content in the interstitial fluid to be measured. The glucose content in the interstitial fluid roughly corresponds to the blood sugar content, so that the blood sugar content can be derived from the measured value. The enzymes required for the reactions are on or in the sensor 10 included, for example on the sensor 10 immobilized. No further external intervention is required for the reaction or for the evaluation of the reaction. For example, there must be no external excitation of fluorescence by UV irradiation or the like, since the sensor 10 emitted visible light to varying degrees depending on the glucose reaction. Figuratively speaking, a kind of light bulb in the ear is generated by the sensor according to the invention in some way, depending on the glucose level of different degrees lit, from which the glucose concentration can be derived. To evaluate the light generated, a suitable photosensor is expediently used, which can be attached to the ear, for example, by means of a clip, or which can be held to the ear as a small handy device for measurement. There are also other implantation sites possible, wherein the photosensor is brought in a similar manner in the vicinity of the implanted sensor. Alternatively, a photosensor may be integrated in the implantable sensor. In this embodiment, the data can be sent, for example, via a wireless connection to an evaluation unit outside the body, for example to a smartphone with a corresponding application or to another device.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das die Basis für den Sensor bildet, koppelt einen Hexokinase-Assay zur Glucosebestimmung, der eine enzymatische Umsetzung der Glucose mit ATP zu Glucose-6-Phosphat mittels des Enzyms Hexokinase und eine weitere Umsetzung des Glucose-6-Phosphats und NAD⁺ (und/oder NADP⁺) zu 6-Phosphogluconolacton und NADH + H⁺ (und/oder NADPH) mittels des Enzyms Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase umfasst, mit einem NADH- und/oder NADPH-Quantifizierungs-Assay. Insbesondere wird hierfür ein enzymatischer Nachweis von NADH und/oder NADPH eingesetzt, insbesondere unter Verwendung einer Luciferase und einem geeigneten Luciferin als Substrat. Bei der NADH- und/oder NADPH-abhängigen Reaktion der Luciferase wird durch den Zerfall eines oxidierten Reaktionszwischenproduktes Licht emittiert, dessen Intensität in einfacher Weise ausgewertet werden kann. Hierbei handelt es sich um eine Redoxreaktion. Beispielsweise reagieren Firefly-Luciferasen in einer zweistufigen Reaktion vereinfacht z.B. gemäß dem folgenden Schema: Luciferol + O₂ + ATP (bzw. NADH oder NADPH) → Oxyluciferol + CO₂ + AMP + Diphosphat + Licht The method according to the invention, which forms the basis for the sensor, couples a hexokinase assay for determining glucose, which involves an enzymatic conversion of the glucose with ATP to glucose-6-phosphate by means of the enzyme hexokinase and a further conversion of the glucose-6-phosphate and NAD ⁺ (and / or NADP ⁺ ) to 6-phosphogluconolactone and NADH + H ⁺ (and / or NADPH) by means of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase, with an NADH and / or NADPH quantification assay. In particular, an enzymatic detection of NADH and / or NADPH is used for this purpose, in particular using a luciferase and a suitable luciferin as substrate. In the case of the NADH- and / or NADPH-dependent reaction of the luciferase, the decay of an oxidized reaction intermediate emits light whose intensity can be evaluated in a simple manner. This is a redox reaction. For example, Firefly luciferases react in a two-step reaction simplified, for example according to the following scheme: Luciferol + O ₂ + ATP (or NADH or NADPH) → oxyluciferol + CO ₂ + AMP + diphosphate + light

Da bei Firefly-Luciferasen die Lichtreaktion auch unabhängig von NADH oder NADPH allein mit ATP ausgelöst werden kann, kann die Auswertung der Messergebnisse relativ aufwendig sein. Besonders bevorzugt für den erfindungsgemäßen Einsatz sind deshalb Renilla-Luciferasen, die kein ATP für die NADH- (oder NADPH-)abhängige Reaktion benötigen. Renilla-Luciferasen reagieren vereinfacht gemäß folgendem Schema: Luciferol + O₂ → Oxyluciferol + CO₂ + Licht Since in Firefly luciferases the light reaction can be triggered independently of NADH or NADPH alone with ATP, the evaluation of the measurement results can be relatively expensive. Therefore, Renilla luciferases which do not contain ATP for the NADH (or NADPH-) dependent reaction. Renilla luciferases react in a simplified manner according to the following scheme: Luciferol + O ₂ → oxyluciferol + CO ₂ + light

Weiterhin können bakterielle Luciferasen eingesetzt werden, die optional mit einer NAD(P)H:FMN-Oxidoreduktase gekoppelt werden können. Furthermore, bacterial luciferases can be used, which can optionally be coupled with an NAD (P) H: FMN oxidoreductase.

So wird in Abhängigkeit von der zuvor umgesetzten Menge von Glucose eine Chemolumineszenz erzeugt, die zur Emission von sichtbarem Licht führt, sodass durch die Messung der Intensität des sichtbaren Lichtes auf die Glucosekonzentration geschlossen werden kann. Je höher der Glucosegehalt ist, umso höher ist also die detektierbare Intensität des sichtbaren Lichtes, das von dem Sensor beispielsweise im Ohr emittiert wird. Thus, depending on the previously converted amount of glucose, a chemiluminescence is generated, which leads to the emission of visible light, so that it can be concluded by measuring the intensity of the visible light on the glucose concentration. The higher the glucose content, the higher the detectable intensity of the visible light emitted by the sensor in the ear, for example.

Die Erfindung ist nicht auf Luciferasen zum enzymatischen Nachweis von NADH und/oder NADPH beschränkt. Es eignen sich im Prinzip auch andere enzymatische oder nicht-enzymatische Systeme zum quantitativen Nachweis des gebildeten NADH und/oder NADPH, wobei ein Nachweis über die Auswertung mindestens eines Parameters einer Chemolumineszenz besonders bevorzugt ist, da dies im Hinblick auf eine Auswertung der Messung besonders einfach und bequem ist.The invention is not limited to luciferases for the enzymatic detection of NADH and / or NADPH. In principle, other enzymatic or non-enzymatic systems are also suitable for the quantitative detection of the NADH and / or NADPH formed, detection of the evaluation of at least one parameter of chemiluminescence being particularly preferred since this is particularly simple with regard to an evaluation of the measurement and comfortable.

2 zeigt in schematischer Weise einen erfindungsgemäßen implantierbaren Sensor (Mikrosensor) 100, der ein Sol-Gel als Träger 101 und eine umhüllende Glucose-durchlässige Membran 102 umfasst. Das Sol-Gel 101 ist als innere Hülle geformt und befindet sich unterhalb der Glucose-permeablen Membran 102. In dem Sol-Gel 101 sind verschiedene Enzyme zur Durchführung der gekoppelten Reaktionen immobilisiert, die letztendlich zur Erzeugung einer Chemolumineszenz in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration in der Körperflüssigkeit, insbesondere in der Interstitialflüssigkeit, führen. Im Einzelnen sind dies eine Hexokinase, eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, eine Luciferase und in Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Luciferase gegebenenfalls eine NAD(P)H:FMN-Oxidoreduktase. Das Sol-Gel 101 umschließt einen inneren Raum, in dem weitere für die Reaktionen benötigten Substanzen, insbesondere ATP, NAD(P)+ und Luciferin, in einer gepufferten Lösung vorliegen. Ein Sol-Gel ist im Allgemeinen physiologisch gut verträglich. Für das Sol-Gel können beispielsweise Tetramethylorthosilikate oder kohlenhydratmodifizierte Silikate eingesetzt werden. 2 schematically shows an implantable sensor (microsensor) according to the invention 100 who uses a sol-gel as a carrier 101 and an enveloping glucose-permeable membrane 102 includes. The sol-gel 101 is shaped as an inner shell and is located below the glucose-permeable membrane 102 , In the sol-gel 101 For example, various enzymes are immobilized to carry out the coupled reactions, which ultimately lead to the production of chemiluminescence as a function of the glucose concentration in the body fluid, in particular in the interstitial fluid. In detail, these are a hexokinase, a glucose-6-phosphate dehydrogenase, a luciferase and, depending on the particular luciferase used, optionally an NAD (P) H: FMN oxidoreductase. The sol-gel 101 encloses an internal space in which further substances required for the reactions, in particular ATP, NAD (P) + and luciferin, are present in a buffered solution. A sol-gel is generally physiologically well tolerated. For example, tetramethylorthosilicates or carbohydrate-modified silicates can be used for the sol-gel.

In einer konkreten Ausführungsform enthält der Sensor 1 ml Reaktionslösung. Es werden folgende Mengen bzw. Konzentrationen der beteiligten Enzyme eingesetzt: 2 mg einer 36 kDa Luciferase aus Renilla reniformis, 0,1 mg einer 50 kDa Hefe-Hexokinase und 0,1 mg einer Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Hefe, jeweils einschlussimmobilisiert (nach Li, Y.; Yip, W. T. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 12756–12757 ). Die Reaktionslösung selbst besteht aus einem 0,1 M K₃PO₄-Puffer mit pH = 7,4, in dem pro Milliliter Pufferlösung 500 µg ATP, 650 µg NAD⁺ und 500 µg Coelenterazin gelöst sind. Die Glucosekonzentration wird über die Änderung der bei 480 nm gemessenen Lichtintensität bestimmt. In a specific embodiment, the sensor contains 1 ml of reaction solution. The following amounts or concentrations of the enzymes involved are used: 2 mg of a Renilla reniformis 36 kDa luciferase, 0.1 mg of a 50 kDa yeast hexokinase and 0.1 mg of a glucose-6-phosphate dehydrogenase from yeast, each inclusion-immobilized (to Li, Y .; Yip, WTJ Am. Chem. Soc. 2005, 127, 12756-12757 ). The reaction solution itself consists of a 0.1 MK ₃ PO ₄ buffer at pH = 7.4, in which 500 μg of ATP, 650 μg of NAD ⁺ and 500 μg of coelenterazine are dissolved per milliliter of buffer solution. The glucose concentration is determined by the change in the light intensity measured at 480 nm.

Durch die äußere Umhüllung des Sensors 100 mit der Glucose-permeablen Membran 102 können Abstoßungsreaktionen nach der Implantation des Sensors 100 verhindert werden. Als Membran 102 wird vorzugsweise eine biokompatible Polymermembran auf der Basis von beispielsweise pHEMA, PMMA, Parylene oder Polyisobutylen eingesetzt. Die Membran 102 kann beschichtet (z.B. mit Platin) oder unbeschichtet sein. Through the outer envelope of the sensor 100 with the glucose-permeable membrane 102 can rejection reactions after implantation of the sensor 100 be prevented. As a membrane 102 For example, a biocompatible polymer membrane based on, for example, pHEMA, PMMA, parylene or polyisobutylene is used. The membrane 102 can be coated (eg with platinum) or uncoated.

Diese Ausgestaltung des Sensors umfasst keine weiteren technischen und damit in der Regel teuren Komponenten, sodass der Sensor ohne Weiteres als Wegwerfartikel in kostengünstiger Weise realisiert werden kann. This embodiment of the sensor does not include any further technical and thus usually expensive components, so that the sensor can easily be realized as a disposable item in a cost-effective manner.

Der Sensor wird in die Gewebeschicht 1010 unter der Haut (Cutis) 1020 des Patienten implantiert (subcutane Implantation). Der Sensor 100 ist ohne scharfe Kanten in Form einer abgerundeten und/oder zylindrischen Kapsel ausgebildet, um die Verletzungsgefahr für das umgebende Gewebe 1010 nach der Implantation zu verringern. Die Länge des Sensors kann beispielsweise 0,5 cm und der Durchmesser kann beispielsweise 2 mm betragen. Es sind auch andere Größen möglich, sodass mehr oder weniger Inhaltsstoffe enthalten sein können. Die Größe des Sensors 100 beeinflusst damit die Lebensdauer bzw. die Dauer der Funktionsfähigkeit des Sensors 100. The sensor gets into the tissue layer 1010 under the skin (cutis) 1020 implanted by the patient (subcutaneous implantation). The sensor 100 is formed without sharp edges in the form of a rounded and / or cylindrical capsule to the risk of injury to the surrounding tissue 1010 reduce after implantation. For example, the length of the sensor may be 0.5 cm and the diameter may be 2 mm. Other sizes are possible, so more or fewer ingredients may be included. The size of the sensor 100 thus influences the life or the duration of the functioning of the sensor 100 ,

Abhängig von der interstitiellen Glucosekonzentration 1030 wird durch die gekoppelten Enzymreaktionen im Sensor 100 Chemolumineszenz erzeugt. Die Chemolumineszenz dringt als sichtbares Licht durch die Gewebeschicht 1010 und durch die Haut 1020 nach außen und ist dort durch einen externen Photosensor 150 detektierbar. Der Photosensor 150 kann beispielsweise in einem Clip am Ohr integriert sein, sofern der Sensor 100 beispielsweise im Ohrläppchen implantiert ist. Der externe Photosensor 150 kann mit einem optischen Filter für die Verstärkung der Wellenlängen der Chemolumineszenz sowie einer Antenne gekoppelt sein, um die Messergebnisse drahtlos an ein Empfängergerät, beispielsweise an ein Smartphone mit entsprechender Applikation oder ähnliches, übertragen zu können. Bei dem Photosensor kann es sich beispielsweise um eine kommerziell erhältliche Photodiode handeln. Die drahtlose Verbindung kann beispielsweise über Bluetooth erfolgen. Weiterhin kann vorgesehen sein, dass der Photosensor mit einer Antenne in einer Einrichtung zusammengefasst ist. In diesem Fall muss keine Übertragung der Messergebnisse über eine Antenne an ein weiteres Gerät erfolgen. Die Auswertung und Anzeige der Messergebnisse kann beispielsweise direkt in dem entsprechend ausgestatteten Ohrclip erfolgen. Das Messergebnis kann dann beispielsweise direkt am Ohrclip elektronisch angezeigt werden. Depending on the interstitial glucose concentration 1030 is due to the coupled enzyme reactions in the sensor 100 Chemiluminescence generated. Chemiluminescence penetrates the tissue layer as visible light 1010 and through the skin 1020 to the outside and is there by an external photosensor 150 detectable. The photosensor 150 may for example be integrated in a clip on the ear, provided that the sensor 100 for example, is implanted in the earlobe. The external photosensor 150 can be coupled with an optical filter for the amplification of the wavelengths of the chemiluminescence and an antenna in order to be able to transmit the measurement results wirelessly to a receiver device, for example to a smartphone with a corresponding application or the like. The photosensor may, for example, be a commercially available photodiode. The wireless connection can be made for example via Bluetooth. Furthermore, it can be provided that the photosensor is combined with an antenna in a device. In this case, there is no need to transmit the measurement results via one antenna to another device. The evaluation and display of the measurement results can for example be done directly in the appropriately equipped ear clip. The measurement result can then be displayed electronically, for example, directly on the ear clip.

3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors 200. Vergleichbar mit der Ausführungsform aus 2 umfasst der Sensor ein Sol-Gel 201 und eine umhüllende Glucose-durchlässige Membran 202. In dem Sol-Gel 201 sind die erforderlichen Enzyme und gegebenenfalls weitere Substanzen enthalten. Im Unterschied zu der Ausführungsform in 2 ist in diesem Sensor 200 ein Photosensor 250, der beispielsweise eine kommerziell erhältliche Photodiode umfasst, integriert. Der Photosensor 250 ist in einer internen transparenten Kapsel enthalten und kann mit einer Drahtlosverbindungs-Antenne kombiniert sein, die sich ebenfalls innerhalb der transparenten Kapsel befindet. Die Umhüllung des Photosensors 250 durch die transparente Kapsel gewährleistet eine Abgrenzung gegenüber der Reaktantenlösung in dem Sensor 200. Die transparente Schutzhülle des Photosensors 250 kann beispielsweise von transparenten Polymeren (pHEMA, Poly(2-hydroxypropylmethacrylat), PMMA, Parylene, Polyisobutylen, Polycarbonat) oder einer Gelatinekapsel gebildet sein. Die erforderliche Stromversorgung des Photosensors 250 kann beispielsweise durch eine integrierte Batterie oder über Induktion erfolgen. Weiterhin kann innerhalb der Photosensoreinheit 250 ein Temperatursensor vorgesehen sein. Durch den Temperatursensor können temperaturabhängige Veränderungen der Lichtintensität (gemäß Prinzip von Le Chatelier) bei der Auswertung der Messergebnisse berücksichtigt werden, wodurch die Genauigkeit der Messergebnisse weiter erhöht werden kann. Die innerhalb der Photosensoreinheit 250 erfassten Messergebnisse, die sich abhängig von der interstitiellen Glucosekonzentration 1030 ergeben, werden über die integrierte Antenne an eine externe Auswerteeinheit 260 weitergeleitet. Die Auswerteeinheit 260 ist mit einem entsprechenden Empfänger ausgestattet. Bei der Auswerteeinheit 260 kann es sich beispielsweise um ein Smartphone mit entsprechender Applikation oder um ein anderes Gerät handeln. 3 shows a further embodiment of a sensor according to the invention 200 , Comparable with the embodiment of 2 The sensor includes a sol-gel 201 and an enveloping glucose-permeable membrane 202 , In the sol-gel 201 are the required enzymes and possibly other substances. Unlike the embodiment in 2 is in this sensor 200 a photosensor 250 which includes, for example, a commercially available photodiode integrated. The photosensor 250 is contained in an internal transparent capsule and may be combined with a wireless connection antenna also located within the transparent capsule. The serving of the photosensor 250 through the transparent capsule provides a barrier to the reactant solution in the sensor 200 , The transparent protective cover of the photosensor 250 For example, it may be formed from transparent polymers (pHEMA, poly (2-hydroxypropyl methacrylate), PMMA, parylene, polyisobutylene, polycarbonate) or a gelatin capsule. The required power supply of the photosensor 250 can be done for example by an integrated battery or induction. Furthermore, within the photosensor unit 250 a temperature sensor may be provided. The temperature sensor allows temperature-dependent changes in light intensity (according to the Le Chatelier principle) to be taken into account in the evaluation of the measurement results, which can further increase the accuracy of the measurement results. The inside of the photosensor unit 250 recorded measurement results, which depend on the interstitial glucose concentration 1030 result from the integrated antenna to an external evaluation unit 260 forwarded. The evaluation unit 260 is equipped with a corresponding receiver. At the evaluation unit 260 it may, for example, be a smartphone with a corresponding application or another device.

4 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors 300. Vergleichbar mit der Ausführungsform in 3 ist in den Sensor 300 eine Einheit 350 mit einem Photosensor und einer Antenne für eine Drahtlosübertragung der Messdaten integriert. Die Einheit 350 befindet sich als transparente Kapsel innerhalb des Sensors 300. Der gesamte Sensor 300 ist von der Glucosepermeablen Membran 302 umgeben. Im Unterschied zu der Ausführungsform in 3 ist bei dem Sensor 300 das Sol-Gel 301 in oder auf die transparente Schutzhülle der Einheit 350 integriert. Im Raum zwischen der umhüllenden Membran 301 und dem Sol-Gel 301 befindet sich die gepufferte Lösung mit den für die Enzymreaktionen erforderlichen Substanzen. Diese Anordnung des Sol-Gels 301 mit den immobilisierten Enzymen in unmittelbarer Nähe zu der Einheit 350 mit dem Photosensor hat den Vorteil, dass die Erfassung der Chemolumineszenz, die in Abhängigkeit von der interstitiellen Glucosekonzentration 1030 erzeugt wird, direkter und gegebenenfalls genauer erfolgen kann. Die Messergebnisse werden über die Antenne der Sensoreinheit 350 nach außen auf eine externe Auswerteeinheit 360 mit einem entsprechenden Empfänger weitergeleitet. 4 shows a further embodiment of the sensor according to the invention 300 , Comparable with the embodiment in FIG 3 is in the sensor 300 one unity 350 integrated with a photosensor and an antenna for wireless transmission of measurement data. The unit 350 is located as a transparent capsule inside the sensor 300 , The entire sensor 300 is from the glucose permeable membrane 302 surround. Unlike the embodiment in 3 is at the sensor 300 the sol-gel 301 in or on the transparent protective cover of the unit 350 integrated. In the space between the enveloping membrane 301 and the sol-gel 301 is the buffered solution with the substances required for the enzyme reactions. This arrangement of sol gel 301 with the immobilized enzymes in close proximity to the unit 350 with the photosensor has the advantage that the detection of chemiluminescence, which depends on the interstitial glucose concentration 1030 is generated, more direct and possibly more accurate. The measurement results are transmitted via the antenna of the sensor unit 350 to the outside to an external evaluation unit 360 forwarded with a corresponding recipient.

5 illustriert eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sensors 400. In dieser Ausgestaltung ist der Sensor 400 nicht als implantierbarer, kapselförmiger Sensor ausgestaltet, sondern der Sensor 400 ist mit einem üblichen zentralvenösen Katheter (ZVK) 4000 assoziiert, der in ein venöses Blutgefäß (z.B. Hals- oder Schlüsselbeinvene) 1040 eingebracht wird. Der Sensor 400 kann beispielsweise als zylindrischer Hohlkörper ausgestaltet sein, der auf die Spitze des ZVK 4000 aufgesetzt wird. Vergleichbar mit den anderen beschriebenen Ausführungsformen umfasst der Sensor 400 eine Glucose-permeable Membran 402 und innerhalb der Membran 402 ein Sol-Gel (nicht näher dargestellt) mit den erforderlichen immobilisierten Enzymen. Weiterhin sind innerhalb des Sensors die erforderlichen weiteren Substanzen enthalten. Der Sensor 400 kann mit einer transparenten Umhüllung ausgestaltet sein, sodass die in Abhängigkeit von dem Blut-Glucosespiegel gebildete Chemolumineszenz von einem externen Photosensor in einer externen Mess- und Auswerteeinheit 460 erfasst werden kann. In anderen Ausführungsformen kann es vorgesehen sein, dass innerhalb des Sensors 400 ein interner Photosensor und eine Antenne zur drahtlosen Weiterleitung der Messdaten an die externe Einheit 460 vorgesehen sind. Weiterhin kann ein Temperatursensor vorgesehen sein, um temperaturabhängige Veränderungen der Lichtintensität bei der Auswertung berücksichtigen zu können. Die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors 400 in Assoziation mit einem Katheter 4000 kann beispielsweise in solchen Fällen vorteilhaft sein, in denen ohnehin ein ZVK 4000 für eine kontinuierliche intravenöse Zufuhr von Medikamenten oder Infusionen gelegt wird, z. B. routinemäßig bei Intensivpatienten. Die Kombination des ZVKs 4000 mit einem erfindungsgemäßen Sensor 400 zur Messung des Blutzuckers hat dann den Vorteil, dass der Sensor 400 nicht zusätzlich implantiert werden muss, sodass kein weiterer Eingriff hierfür erforderlich ist. 5 illustrates another embodiment of a sensor according to the invention 400 , In this embodiment, the sensor 400 not designed as an implantable, capsule-shaped sensor, but the sensor 400 is with a standard central venous catheter (CVC) 4000 associated with a venous blood vessel (eg cervical or subclavian vein) 1040 is introduced. The sensor 400 For example, it may be configured as a cylindrical hollow body which is at the top of the ZVK 4000 is put on. Similar to the other described embodiments, the sensor comprises 400 a glucose-permeable membrane 402 and inside the membrane 402 a sol-gel (not shown) with the required immobilized enzymes. Furthermore, the required further substances are contained within the sensor. The sensor 400 can be designed with a transparent envelope, so that the chemiluminescence formed as a function of the blood glucose level of an external photosensor in an external measuring and evaluation unit 460 can be detected. In other embodiments, it may be provided that within the sensor 400 an internal photosensor and an antenna for wireless transmission of measurement data to the external unit 460 are provided. Furthermore, a temperature sensor can be provided in order to be able to take into account temperature-dependent changes in the light intensity in the evaluation. The embodiment of the sensor according to the invention 400 in association with a catheter 4000 can for example, be advantageous in such cases, in which anyway a ZVK 4000 for continuous intravenous administration of drugs or infusions, e.g. B. routinely in intensive care patients. The combination of the ZVKs 4000 with a sensor according to the invention 400 to measure blood sugar then has the advantage that the sensor 400 does not require additional implantation, so no further intervention is required.

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Hussain et al., Analytical Biochemistry, 2005, 137-143 [0003]
Li, Y .; Yip, WTJ Am. Chem. Soc. 2005, 127, 12756-12757 [0042]

Claims

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) for detecting glucose, in particular for detecting glucose in a body fluid, wherein in or on a carrier ( 101 ; 201 ; 301 ) of the sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) contains the enzyme hexokinase, characterized in that the sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) further comprises the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase and at least one means for detecting NADH and / or NADPH, wherein for the detection of NADH and / or NADPH an evaluation of at least one parameter of an electromagnetic radiation generated by a chemical reaction is provided ,

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to claim 1, characterized in that the at least one means for detecting NADH and / or NADPH is an enzyme, in particular a luciferase.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to claim 1 or claim 2, characterized in that at least one of the enzymes is immobilized.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ) according to one of claims 1 to 3, characterized in that the sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ) is intended for implantation in the human or animal body, in particular for implantation in the ear ( 20 ), Upper arm, wrist, abdomen, thigh or the like.

Sensor ( 400 ) according to one of claims 1 to 3, characterized in that the sensor ( 400 ) for attachment to a catheter, in particular to a central venous catheter ( 4000 ), is provided.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the carrier ( 101 ; 201 ; 301 ) is a sol-gel and / or based on a natural or a synthetic polymer, for example tetramethyl orthosilicates and / or carbohydrate-modified silicates.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the carrier ( 101 ; 201 ; 301 ) has a hollow fiber structure and / or a microcapsule structure.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) a glucose-permeable outer membrane ( 102 ; 202 ; 302 ; 402 ), in particular a biocompatible membrane, preferably a membrane based on pHEMA and / or PMMA and / or parylene and / or polyisobutylene.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to claim 8, characterized in that the sensor, in particular the outer membrane ( 102 ; 202 ; 302 ; 402 ), a coating, in particular a platinum coating.

Sensor ( 200 ; 300 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the sensor ( 200 ; 300 ) an integrated photosensor ( 250 ; 350 ) and preferably comprises an integrated wireless data transmission device.

Sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) comprises a temperature sensor.

Using a sensor ( 10 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 ) according to one of the preceding claims for measuring the level of glucose ( 30 ; 1030 ) in a body fluid, whereby the generation of visible light ( 40 ) is detected.

A method of measuring glucose, wherein the glucose is converted to glucose-6-phosphate by catalysis by the enzyme hexokinase and the glucose-6-phosphate is converted to 6-phosphogluconolactone by catalysis by the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase in which NADH and / or NADPH is formed, characterized in that the formed NADH and / or NADPH is detected enzymatically.

A method according to claim 13, characterized in that the glucose is quantitatively measured by the detection of NADH and / or NADPH.

A method according to claim 13 or claim 14, characterized in that the detection of NADH and / or NADPH by generating electromagnetic radiation, in particular by generating a chemiluminescence is carried out, wherein a luciferase is preferably used to generate the chemiluminescence.

A method for detection of glucose in a body fluid, characterized in that a method according to any one of claims 13 to 15 is used.

Test kit for measuring glucose, wherein the test kit comprises the enzymes hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, characterized in that further at least one enzyme, in particular a luciferase, for the detection of NADH and / or NADPH is included.

Test kit according to claim 17, characterized in that further substances required for the reactions are contained, in particular ATP and / or NAD ⁺ and / or NADP ⁺ and / or at least one luciferin and / or salts and / or buffer substances.