DE102013202003B4

DE102013202003B4 - Process and arrangement for the direct and parallel determination of small-molecular substances

Info

Publication number: DE102013202003B4
Application number: DE102013202003.1A
Authority: DE
Inventors: Martin Joksch
Original assignee: Atspiro Aps
Current assignee: Atspiro Aps Dk
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2022-08-25
Anticipated expiration: 2033-02-08
Also published as: DE102013202003A1

Abstract

Verfahren zur direkten, parallelen Bestimmung von kleinmolekularen Stoffen in einer Reaktorbrühe (RB) unter Verwendung der so genannten Cyclovoltammetrie, wobei die kleinmolekularen Stoffe während eines Ablaufes eines biotechnologischen Prozesses in der Reaktorbrühe (RB) gebildet oder verbraucht werden, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Arbeitselektroden (A1, A2) aus unterschiedlichen Materialen sowie eine Gegenelektrode (GE) in eine Messkammer (MK) mit der Reaktorbrühe (RB) eingebracht werden (1), wobei die Materialen der zumindest zwei Arbeitselektroden (A1, A2) derart gewählt werden, dass bei diesen Materialen für die zu bestimmenden kleinmolekularen Stoffe unterscheidbare Strom-/Potentialverläufe und/oder Stromspitzen feststellbar sind, dass eine Referenzelektrode (RE) mit der Reaktorbrühe (RB) verbunden wird (2), dass mit einer Elektronikkomponente (EK) ausgewählte Potentialverläufe an die zumindest zwei Arbeitselektroden (A1, A2) angelegt und zugehörige Stromverläufe zwischen der Gegenelektrode (GE) und den zumindest zwei Arbeitselektroden (A1, A2) sowie zugehörige Spannungsverläufe zwischen der Referenzelektrode (RE) und den zumindest zwei Arbeitselektroden (A1, A2) gemessen werden (3), und dass dann die gemessenen Strom-/Spannungsverläufe mittels einer Analyseeinheit (AN) ausgewertet werden (4).Method for the direct, parallel determination of small molecular substances in a reactor broth (RB) using so-called cyclic voltammetry, the small molecular substances being formed or consumed during the course of a biotechnological process in the reactor broth (RB), characterized in that at least two working electrodes (A1, A2) made of different materials and a counter-electrode (GE) are introduced into a measuring chamber (MK) with the reactor broth (RB) (1), the materials of the at least two working electrodes (A1, A2) being selected in such a way that these materials for the small-molecular substances to be determined distinguishable current/potential curves and/or current peaks can be detected, that a reference electrode (RE) is connected to the reactor broth (RB) (2), that an electronic component (EK) is used to connect selected potential curves to the at least two working electrodes (A1, A2) applied and associated current curves between mixing the counter electrode (GE) and the at least two working electrodes (A1, A2) and associated voltage curves between the reference electrode (RE) and the at least two working electrodes (A1, A2) are measured (3), and that the measured current/voltage curves are then measured be evaluated by means of an analysis unit (AN) (4).

Description

Technisches Gebiettechnical field

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der biochemischen und biotechnologischen Prozesse, insbesondere auf mikrobielle Fermentationsprozesse. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur direkten und parallelen Bestimmung von kleinmolekularen Stoffen - wie z.B. Alkoholen (Methanol, Ethanol, etc.) oder anderer an einem Zellstoffwechsel beteiligter Stoffe (z.B. Glucose, Glutamin, Lactat, Lactose, Acetat, etc.) - in einer Reaktorbrühe unter Verwendung der so genannten Cyclovoltammetrie. Dabei werden diese kleinmolekularen Stoffe während eines Ablaufs eines biotechnologischen Prozesses in einer so genannten Reaktorbrühe gebildet oder verbraucht. Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur direkten und parallelen Bestimmung der kleinmolekularen Stoffe in der Reaktorbrühe.The present invention generally relates to the field of biochemical and biotechnological processes, in particular to microbial fermentation processes. In particular, the present invention relates to a method for the direct and parallel determination of small-molecular substances - such as alcohols (methanol, ethanol, etc.) or other substances involved in cell metabolism (e.g. glucose, glutamine, lactate, lactose, acetate, etc.) - in a reactor broth using the so-called cyclic voltammetry. These small-molecular substances are formed or consumed during the course of a biotechnological process in a so-called reactor broth. Furthermore, the invention also relates to an arrangement for carrying out the method for the direct and parallel determination of the small-molecular substances in the reactor broth.

Stand der TechnikState of the art

In der modernen Biotechnologie werden häufig Mikroorganismen wie z.B. Bakterien, Pilze, Pflanzen und/oder tierische Zellen verwendet, welche meist bereits genau erforscht sind, und dann für biotechnologische und/oder biochemische Prozesse wie z.B. mikrobielle Fermentation eingesetzt werden. Von derartigen Mikroorganismen kann ein Fermentationsprozess - das bedeutet eine Umwandlung eines organischen Stoffes - im Rahmen ihres enzymkatalysierten Stoffwechsels ausgeführt werden. Dazu werden diese Mikroorganismen beispielsweise in einen so genannten Bioreaktor mit einer (Nähr-)Lösung gegeben, um z.B. gewünschte Stoffe (z.B. Antibiotika, Insulin, Hyaluronsäure, etc.) zu bilden oder um derartige Mikroorganismen zu kultivieren.In modern biotechnology, microorganisms such as bacteria, fungi, plants and/or animal cells are often used, which have usually already been researched in detail, and are then used for biotechnological and/or biochemical processes such as microbial fermentation. A fermentation process - meaning a conversion of an organic substance - can be carried out by such microorganisms as part of their enzyme-catalyzed metabolism. For this purpose, these microorganisms are placed in a so-called bioreactor with a (nutrient) solution, for example to form desired substances (e.g. antibiotics, insulin, hyaluronic acid, etc.) or to cultivate such microorganisms.

Ein Bioreaktor, welcher auch als Fermenter bezeichnet wird, ist dabei ein Behälter, in welchem bestimmte Mikroorganismen oder Zellen unter möglichst optimalen Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet werden, oder in welchem so genannte mikrobielle Fermentationsprozesse ablaufen können. In der Lösung im Bioreaktor, welche auch als Reaktorbrühe bezeichnet wird, sind üblicherweise Nährstoffe wie z.B. Zucker, etc. für die Mikroorganismen vorhanden. Vor allem bei Fermentationsprozessen werden diese Nährstoffe in der Reaktorbrühe von den Mikroorganismen zumindest teilweise in kleinmolekulare Stoffe wie z.B. Alkohole (Methanol, Ethanol, etc.) umgesetzt.A bioreactor, which is also referred to as a fermenter, is a container in which certain microorganisms or cells are cultivated or grown under the best possible conditions, or in which so-called microbial fermentation processes can take place. The solution in the bioreactor, which is also referred to as the reactor broth, usually contains nutrients such as sugar, etc. for the microorganisms. Especially in fermentation processes, these nutrients in the reactor broth are at least partially converted by the microorganisms into small-molecular substances such as alcohols (methanol, ethanol, etc.).

Für eine Steuerung von Prozessen wie z.B. einer Fermentation im Bioreaktor ist eine Kenntnis einer Zusammensetzung der Reaktorbrühe von entscheidender Rolle. Die (Nähr-)Lösung bzw. Reaktorbrühe stellt üblicherweise die notwendigen Nährstoffe (z.B. Zucker, Glucose, etc.) für die Mikroorganismen zur Verfügung und nimmt aber z.B. auch Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen wie z.B. Alkohole auf, welche z.B. in hoher Konzentration für die Mikroorganismen toxisch wirken können. Daher ist insbesondere eine Kenntnis des Alkoholgehalts bzw. eines Gehalts z.B. von Methanol, von Ethanol, etc. in der Reaktorbrühe für eine Steuerung von Fermentationsprozessen von großer Bedeutung. Insbesondere bei Methanol ist z.B. nur ein Gehalt von 1g pro Liter zulässig wegen seiner hohen Toxizität für die Mikroorganismen. Daher ist es für eine Prozessführung und eine Steuerung des Prozessverlaufs notwendig, einen Gehalt von kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Methanol, Ethanol, etc. parallel in der Reaktorbrühe zu bestimmen.Knowledge of the composition of the reactor broth is crucial for controlling processes such as fermentation in a bioreactor. The (nutrient) solution or reactor broth usually provides the necessary nutrients (e.g. sugar, glucose, etc.) for the microorganisms and also absorbs, for example, metabolic products of the microorganisms such as alcohols, which are toxic for the microorganisms in high concentrations can work. Therefore, knowledge of the alcohol content or a content, e.g. of methanol, of ethanol, etc. in the reactor broth is of great importance for controlling fermentation processes. In the case of methanol in particular, for example, only a content of 1g per liter is permissible because of its high toxicity for microorganisms. It is therefore necessary for process management and process control to determine the content of small-molecular substances such as methanol, ethanol, etc. in the reactor broth in parallel.

Für eine genaue parallele Bestimmung eines Gehalts von Methanol und Ethanol in einer Reaktorbrühe können beispielsweise Analysegeräte wie z.B. Gaschromatographen, Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) oder Massenspektrometer eingesetzt werden. Als Chromatographie wird in der Chemie üblicherweise ein Verfahren bezeichnet, durch das eine Auftrennung eines Stoffgemisches wie z.B. der Reaktorbrühe durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ermöglicht wird. Bei der Gaschromatographie wird z.B. ein Gemisch (z.B. Reaktorbrühe) in einzelne chemische Verbindung bzw. Bestandteile aufgetrennt, wobei die Gaschromatographie nur für Komponenten anwendbar ist, welche gasförmig oder unzersetzt verdampfbar sind. Es sind damit im Unterschied zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) nur ausreichend flüchtige Substanzen nachweisbar. Die HPLC ist ein Flüssigkeitschromatographie-Verfahren, bei welchen Substanzen wie z.B. eine Probe der Reaktorbrühe nicht nur in Bestandteile getrennt, sondern diese auch über Standard identifiziert und quantifiziert werden - d.h. eine genaue Konzentration bestimmt wird. Dabei können mittels HPLC auch nicht flüchtige Substanzen analysiert werden.Analysis devices such as gas chromatographs, high-performance liquid chromatographs (HPLC) or mass spectrometers can be used, for example, for an exact parallel determination of a content of methanol and ethanol in a reactor broth. In chemistry, chromatography usually refers to a process that enables a mixture of substances, such as the reactor broth, to be separated by distributing its individual components differently between a stationary and a mobile phase. In gas chromatography, for example, a mixture (e.g. reactor broth) is separated into individual chemical compounds or components, whereby gas chromatography can only be used for components that are gaseous or can be vaporized without decomposition. In contrast to high-performance liquid chromatography (HPLC), only sufficiently volatile substances can be detected. HPLC is a liquid chromatography method in which substances such as a sample of the reactor broth are not only separated into components, but these are also identified and quantified using standards - i.e. an exact concentration is determined. Non-volatile substances can also be analyzed using HPLC.

Als Massenspektrometrie werden üblicherweise Verfahren zum Messen von einer Masse von Atomen oder Molekülen bezeichnet. Dazu wird eine zu untersuchende Substanz wie z.B. eine Probe einer Reaktorbrühe in eine Gasphase übergeführt und z.B. ionisiert. Die Ionen werden dann durch ein elektrisches Feld beschleunigt und einem Analysator zugeführt, von welchem sie dann beispielsweise nach einem Masse-zu-Ladung-Verhältnis sortiert werden. Damit können dann z.B. auch Konzentrationen von bestimmten Stoffen in der Substanzprobe bestimmt werden. Weiterhin ist die Massenspektrometrie sehr leicht mit einer HPLC-Anlage oder einem Gaschromatographen koppelbar.Mass spectrometry is commonly referred to as a method of measuring a mass of atoms or molecules. For this purpose, a substance to be examined, such as a sample of a reactor broth, is converted into a gas phase and e.g. ionized. The ions are then accelerated by an electric field and fed to an analyzer, by which they are then sorted according to a mass-to-charge ratio, for example. In this way, for example, concentrations of certain substances in the substance sample can also be determined. Furthermore, mass spectrometry can be coupled very easily with an HPLC system or a gas chromatograph.

Eine Anwendung dieser Verfahren - Gaschromatographie, HPLC und/oder Massenspektrometrie - weisen allerdings den Nachteil auf, dass sie bzw. die dafür notwendigen Analyseanlagen sehr teuer sind. Für eine parallele und aktuelle Bestimmung von Konzentrationen kleinmolekularer Stoffe (z.B. Methanol, Ethanol, etc.) und eine entsprechende Prozesssteuerung im Bioreaktor müssen laufend Proben der Reaktorbrühe mit diesen Verfahren kontrolliert und ausgewertet werden. Eine derartige Vorgehensweise ist allerdings technisch aufwendig und sehr kostenintensiv. Weiterhin muss eine Probenahme steril durchgeführt werden, um eine Kontamination des Reaktorinnern mit anderen Mikroorganismen zu vermeiden.However, an application of these methods—gas chromatography, HPLC and/or mass spectrometry—have the disadvantage that they and the analysis systems required for them are very expensive. For a parallel and up-to-date determination of the concentrations of small-molecular substances (eg methanol, ethanol, etc.) and a corresponding process control in the bioreactor, samples of the reactor broth must be continuously checked and evaluated with these methods. However, such a procedure is technically complex and very cost-intensive. Furthermore, sampling must be carried out in a sterile manner in order to avoid contamination of the reactor interior with other microorganisms.

Weiterhin besteht die Möglichkeit für eine parallele Bestimmung einer Konzentration von kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Alkoholen, etc. in der Reaktorbrühe beispielsweise enzymbasierte Tests bzw. Biosensoren anzuwenden, welche z.B. photometrisch oder elektrochemisch ausgewertet werden. Derartige Sensoren weisen allerdings den Nachteil auf, dass die Enzyme für die jeweiligen Messungen verbraucht werden. Der Sensor muss daher nach einer bestimmten Anzahl an Messungen ausgetauscht werden und ist daher nur eine begrenzte Zeit einsetzbar. Durch einen notwendigen Austausch eines derartigen Sensors kommt es zu zusätzlichen Aufwendungen und Kosten.There is also the option of using enzyme-based tests or biosensors, for example, for a parallel determination of a concentration of small-molecular substances such as alcohols, etc. in the reactor broth, which are evaluated photometrically or electrochemically, for example. However, such sensors have the disadvantage that the enzymes are used up for the respective measurements. The sensor must therefore be replaced after a certain number of measurements and can therefore only be used for a limited time. A necessary replacement of such a sensor results in additional expenditure and costs.

Aus der Schrift „Paixao, Thiago R.L.C et al: Amperometric determination of ethanol in beverages at copper electrodes in alkaline medium, Analytica Chimica Acta 472 (2002) 123-131“ ist allerdings ein Sensor mit einer Kupferelektrode in einem basischen Medium zur Messung eines Ethanolgehalts in Getränken bekannt, bei welchem nach einem Prinzip der so genannten Cyclovolammetrie vorgegangen wird. Der Nachteil des in dieser Schrift beschriebenen Verfahrens bzw. Sensors ist allerdings das nur die Konzentration eines kleinmolekularen Stoffs bzw. von Ethanol bestimmt wird. Für biotechnologische Prozesse wie z.B. Fermentationsprozesse ist es allerdings notwendig mehrere Stoffkonzentrationen - z.B. von Methanol, Ethanol, etc. - parallel zu bestimmen.However, from the document "Paixao, Thiago R.L.C et al: Amperometric determination of ethanol in beverages at copper electrodes in alkaline medium, Analytica Chimica Acta 472 (2002) 123-131" is a sensor with a copper electrode in an alkaline medium for measuring an ethanol content in beverages, which is based on a principle known as cyclovolammetry. However, the disadvantage of the method or sensor described in this document is that only the concentration of a small-molecular substance or of ethanol is determined. For biotechnological processes such as fermentation processes, however, it is necessary to determine several substance concentrations - e.g. methanol, ethanol, etc. - in parallel.

Die so genannte Cyclovoltametrie oder Dreiecksspannungsmethode wird üblicherweise für Messungen von Ionen in wässrigen und anderen leitenden Lösungen sowie zur Untersuchung von Elektrodenvorgängen z.B. in Batterien und Brennstoffzellen eingesetzt. Bei der Cyclovoltametrie werden drei Elektroden eingesetzt, wobei an eine Arbeitselektrode Zyklen ansteigenden und abfallenden Potentials angelegt werden. Es wird dann ein Verlauf eines Stroms zwischen der Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode gegen einen Verlauf des Potentials zwischen der Arbeitselektrode und einer Referenzelektrode aufgezeichnet. Eine elektrochemisch aktive Substanz wird dabei bei steigendem Potential bei Erreichen des für diese Substanz spezifischen Potentials umgesetzt, wodurch ein Strom ansteigt. Eine Konzentration dieser Substanz in Elektrodennähe nimmt damit rasch ab und damit auch der Strom. Ein weiterer Strom fließt dann nur, wenn die Substanz mittels Diffusion nachgeliefert wird. Eine gemessene Spitze im Stromverlauf ist dann charakteristisch für die umgesetzt Substanz, wobei eine Lage dieser Spitze von einem elektrochemischen Potential der Substanz sowie von einer Überspannung der Substanz an einem verwendeten Arbeitselektrodenmaterial abhängt. Aus einer Höhe der Spitze im Stromverlauf kann beispielsweise eine Konzentration der Substanz abgeleitet werden - so ist z.B. gemäß der so genannten Randles-Sevcik-Gleichung die Höhe der Spitze proportional zur Konzentration der Substanz. Bei reversiblen Reaktionen kann auch bei einem abfallenden Potential eine Spitze im Stromverlauf entstehen, welche aufgrund der Überspannungen etwas zur Spitze bei einem steigenden Potential versetzt ist.The so-called cyclic voltammetry or triangular voltage method is commonly used to measure ions in aqueous and other conductive solutions and to investigate electrode processes, e.g. in batteries and fuel cells. In cyclic voltammetry, three electrodes are used, with cycles of increasing and decreasing potential being applied to a working electrode. A course of a current between the working electrode and a counter-electrode is then recorded against a course of the potential between the working electrode and a reference electrode. An electrochemically active substance is converted with increasing potential when the potential specific for this substance is reached, as a result of which a current increases. A concentration of this substance in the vicinity of the electrode thus decreases rapidly and with it the current. A further current then only flows if the substance is subsequently supplied by means of diffusion. A measured peak in the current profile is then characteristic of the converted substance, with the position of this peak depending on an electrochemical potential of the substance and on an overvoltage of the substance on a working electrode material used. For example, a concentration of the substance can be derived from the height of the peak in the current curve - e.g. according to the so-called Randles-Sevcik equation, the height of the peak is proportional to the concentration of the substance. In the case of reversible reactions, a peak in the current curve can also occur with a falling potential, which is slightly offset from the peak with a rising potential due to the overvoltages.

Weiterhin sind aus der Schrift „Liu, Chen-Guang et al: Development of Redox potential-controlled schemes for very-highgravity ethanol fermentation, Journal of Biotechnology 153 (2011), 42-47“ Überlegungen bekannt, Messungen so genannter Redoxpotentiale für eine Steuerung biotechnologischer Prozesse, insbesondere Fermentationsprozesse einzusetzen. Redoxpotential ist dabei ein Begriff aus der Elektrochemie und durch ihn wird eine Messgröße von chemischen Redoxreaktionen charakterisiert, wobei Redox für Reduktion-Oxidation steht. Diese Messgröße wird üblicherweise unter Standardbedingungen gegen eine so genannte Standard-Referenz-Halbzelle gemessen. In einem biologischen System ist das Standardredoxpotential beispielsweise definiert bei einem pH-Wert von /,0 gegen eine Standard-Wasserstoffelektrode und dem Partialdruck von Wasserstoff von einem 1 bar. Eine Messung des Redoxpotentials, wie in der oben angeführten Schrift von Liu, Chen-Guang et al beschrieben, weist allerdings den Nachteil auf, dass eine Reaktorbrühe nur durch einen einzigen Messwert charakterisiert werden kann. Damit können beispielsweise nicht Konzentrationen von verschiedenen Stoffen wie z.B. Alkoholen oder für den Prozess wichtigen Zucker, etc. in der Reaktorbrühe getrennt, aber parallel ermittelt werden.Furthermore, considerations are known from the document "Liu, Chen-Guang et al: Development of redox potential-controlled schemes for very high-gravity ethanol fermentation, Journal of Biotechnology 153 (2011), 42-47", measurements of so-called redox potentials for control biotechnological processes, in particular fermentation processes. Redox potential is a term from electrochemistry and is used to characterize a measured variable of chemical redox reactions, with redox standing for reduction-oxidation. This parameter is usually measured under standard conditions against a so-called standard reference half-cell. In a biological system, for example, the standard redox potential is defined at a pH value of 1.0 against a standard hydrogen electrode and the partial pressure of hydrogen of 1 bar. However, a measurement of the redox potential, as described in the publication by Liu, Chen-Guang et al cited above, has the disadvantage that a reactor broth can only be characterized by a single measured value. This means, for example, that concentrations of different substances such as alcohols or sugars that are important for the process, etc. in the reactor broth cannot be determined separately, but can be determined in parallel.

Die US 2005 / 0 244 811 A1 beschreibt eine Vorrichtung zum Nachweis mehrerer Analyten, die ein Array von Nanobiosensoren umfasst, die jeweils eine auf Kohlenstoffnanoröhren immobilisierte biologische Einheit umfassen, wobei mehrere der Nanobiosensoren in dem Array einzigartige biologische Einheiten aufweisen, wobei ein erster der mehreren Nanobiosensoren eine erste biologische Einheit aufweist auf Kohlenstoffnanoröhren immobilisiert ist, und wobei ein zweiter der mehreren Nanobiosensoren eine zweite biologische Einheit aufweist, die auf Kohlenstoffnanoröhren immobilisiert ist, wobei die erste biologische Einheit relativ zu der zweiten biologischen Einheit einzigartig ist.the U.S. 2005/0 244 811 A1 describes a device for detecting multiple analytes comprising an array of nanobiosensors, each comprising a biological entity immobilized on carbon nanotubes, wherein a plurality of the nanobiosensors in the array have unique biological entities, wherein a first of the plurality of nanobiosensors comprises a first biological entity comprises immobilized on carbon nanotubes, and wherein a second of the plurality of nanobiosensors comprises a second biological entity immobilized on carbon nanotubes, wherein the first biological entity is unique relative to the second biological entity.

Die US 8 197 650 B2 beschreibt Substrate, Sensoren und Systeme, die sich auf die Messung der Konzentration eines Analyten, wie z. B. eines Wasserstoffions, in einer Probe beziehen. Redoxaktive Einheiten, deren Reduktions- und/oder Oxidationspotentiale empfindlich auf die Anwesenheit eines Analyten reagieren, werden auf einer Siliziumoberfläche immobilisiert. Als Referenz können immobilisierte redoxaktive Einheiten verwendet werden, deren Reduktions- und/oder Oxidationspotential gegenüber dem Analyten unempfindlich sind. Die elektrochemischen Siliziumsensoren sind robust und können so hergestellt werden, dass sie keine Kalibrierung oder Neukalibrierung erfordern.the U.S. 8,197,650 B2 describes substrates, sensors and systems related to the measurement of the concentration of an analyte, such as. a hydrogen ion, in a sample. Redox-active moieties whose reduction and/or oxidation potentials are sensitive to the presence of an analyte are immobilized on a silicon surface. Immobilized redox-active units whose reduction and/or oxidation potential are insensitive to the analyte can be used as a reference. The silicon electrochemical sensors are robust and can be manufactured to not require calibration or recalibration.

Die DE 101 02 657 A1 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren in Form amperometrischer Biosensorarrays in Dickschichttechnik zur simultanen Bestimmung mehrerer Parameter in der Prozesskontrolle.the DE 101 02 657 A1 describes a device and a method in the form of amperometric biosensor arrays in thick-film technology for the simultaneous determination of several parameters in process control.

In „MOHAN, S. Venkata; BABU V. Lalit; SRIKANTH, S.; SARMA, P. N.: Bio-electrochemical evaluation of fermentative hydrogen production process with the function of feeding pH. In: International Journal of Hydrogen Energy (2008), 33(17), p. 4533-4546“ wird der Prozess der fermentativen Wasserstoffproduktion (H2) in Abhängigkeit vom pH-Wert der Fütterung [acidophil (pH 6,0) und neutral (pH 7,0)] und der Betriebsart des Reaktors (kontinuierlich und im Batch-Betrieb) in einem Reaktor mit Biofilm-Konfiguration [Aufwärtsströmung; Verweilzeit, 24 h; Betriebstemperatur, 28 ± 2 °C; organische Belastungsrate, 3,4 kg CSB/m3 Tag] unter Verwendung anaerober gemischter Konsortien untersucht.In “MOHAN, S. Venkata; BABU V. Lalit; SRIKANTH, S.; SARMA, P.N.: Bio-electrochemical evaluation of fermentative hydrogen production process with the function of feeding pH. In: International Journal of Hydrogen Energy (2008), 33(17), p. 4533-4546” describes the process of fermentative hydrogen (H2) production depending on the pH of the feed [acidophilic (pH 6.0) and neutral (pH 7.0)] and the mode of operation of the reactor (continuous and batch mode ) in a reactor with biofilm configuration [upflow; residence time, 24 h; operating temperature, 28 ± 2 °C; organic load rate, 3.4 kg COD/m3 day] using anaerobic mixed consortia.

Die US 5 720 870 A beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines oder mehrerer Gase, z.B. O2 oder CO2 oder eines Anästhesiegases, in einer Flüssigkeit, z.B. einer Körperflüssigkeit oder einem Gasgemisch.the U.S. 5,720,870 A describes a method and a device for determining the concentration of one or more gases, eg O2 or CO2 or an anesthetic gas, in a liquid, eg a body fluid or a gas mixture.

Die US 2013 / 0 015 064 A1 beschreibt Sensoren für Kohlendioxid und andere Verwendungszwecke.the U.S. 2013/0 015 064 A1 describes sensors for carbon dioxide and other uses.

Darstellung der ErfindungPresentation of the invention

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Anordnung zur Durchführung dieses Verfahrens anzugeben, durch welche auf einfache und kostengünstige Weise Konzentrationen von zumindest zwei kleinmolekularen Stoffen in einer Reaktorbrühe direkt und parallel bestimmt werden können.The invention is therefore based on the object of specifying a method and an arrangement for carrying out this method, by means of which concentrations of at least two small-molecular substances in a reactor broth can be determined directly and in parallel in a simple and inexpensive manner.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren sowie durch eine Anordnung der eingangs genannten Art mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.This object is achieved by a method and by an arrangement of the type mentioned with the features according to the independent patent claims. Advantageous embodiments of the present invention are described in the dependent claims.

Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe mit einem Verfahren der eingangs erwähnten Art, bei welchem zumindest zwei Arbeitselektroden aus unterschiedlichen Materialen sowie eine Gegenelektrode in eine Messkammer eingebracht werden, in welcher ein Kontakt dieser Elektroden mit einer Reaktorbrühe, in welcher Konzentrationen von kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Methanol, Ethanol, Glukose, etc. festgestellt werden sollen, hergestellt wird. Die Materialen der zumindest zwei Arbeitselektroden werden dabei derart ausgewählt, dass bei diesen Materialen für die jeweils zu bestimmenden kleinmolekularen Stoffe unterscheidbare Strom-/Spannungsverläufe und/oder Stromspitzen feststellbar bzw. messbar sind. Dann wird eine Referenzelektrode mit der Reaktorbrühe verbunden bzw. ebenfalls in Kontakt gebracht. Mittels einer Elektronikkomponente werden sowohl ausgewählte Potentialverläufe an die zumindest zwei Arbeitselektroden angelegt als auch die jeweils zugehörigen Stromverläufe zwischen jeder der zumindest zwei Arbeitselektroden und der Gegenelektrode sowie die zugehörigen Spannungsverläufe zwischen jeder der zumindest zwei Arbeitselektroden und der Referenzelektrode gemessen. Die gemessenen Strom- bzw. Spannungsverläufe werden dann mittels einer Analyseeinheit ausgewertet.According to the invention, the object is achieved with a method of the type mentioned at the outset, in which at least two working electrodes made of different materials and a counter-electrode are placed in a measuring chamber in which these electrodes come into contact with a reactor broth in which concentrations of small-molecular substances such as methanol , ethanol, glucose, etc. are to be determined is produced. The materials of the at least two working electrodes are selected in such a way that distinguishable current/voltage curves and/or current peaks can be determined or measured with these materials for the small-molecular substances to be determined in each case. Then a reference electrode is connected to the reactor broth or also brought into contact. An electronic component is used to apply selected potential curves to the at least two working electrodes and to measure the associated current curves between each of the at least two working electrodes and the counter-electrode and the associated voltage curves between each of the at least two working electrodes and the reference electrode. The measured current or voltage curves are then evaluated using an analysis unit.

Der Hauptaspekt der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lösung besteht darin, dass durch eine Kombination von mehreren Arbeitselektroden und einer gezielten Auswahl ihrer Materialen auf sehr einfache Weise das Prinzip der Cyclovoltammetrie mit Analyseverfahren zur Bestimmung von Konzentrationen mehrerer kleinmolekularer Stoffe (z.B. Methanol, Ethanol, Glukose, etc.) in einer Reaktorbrühe, welche sich z.B. elektrochemisch nur geringfügig unterscheiden, herangezogen werden kann. Die Konzentration dieser kleinmolekularen Stoffe kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr einfach und kostengünstig laufend und parallel bestimmt werden - d.h. eine aktuelle Konzentrationen der Stoffe in einer Probe der Reaktorbrühe wird beispielsweise mit einem Messvorgang bzw. einem Durchlauf des erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt. Die jeweiligen Elektroden, welche für die Messungen eingesetzt werden, haben z.B. gegenüber Biosensoren den großen Vorteil, dass keine Enzyme verwendet werden, welche aufgebraucht werden, und können daher für eine große Anzahl an Messungen verwendet werden. Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren mit wesentlich geringerem technischen Aufwand und kostengünstiger durchführbar als z.B. eine Bestimmung der Stoff-Konzentrationen mit Gaschromatographie, HPLC und Massenspektroskopie.The main aspect of the solution proposed according to the invention is that through a combination of several working electrodes and a targeted selection of their materials, the principle of cyclic voltammetry can be combined with analysis methods for determining the concentrations of several small-molecular substances (e.g. methanol, ethanol, glucose, etc.) in a reactor broth which, for example, differ only slightly electrochemically. The concentration of these small-molecular substances can be determined very simply and inexpensively continuously and in parallel using the method according to the invention - ie a current concentration of the substances in a sample of the reactor broth is determined, for example, with a measuring process or a run of the method according to the invention. The respective electrodes, which are used for the measurements, have the great advantage over biosensors, for example, that no enzymes are used, which are used up, and can therefore be used for a large number of measurements gene are used. Furthermore, the method according to the invention can be carried out with significantly less technical effort and more cost-effectively than, for example, determining the substance concentrations using gas chromatography, HPLC and mass spectroscopy.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es auch von Vorteil, wenn als Schutz der zumindest zwei Arbeitselektroden sowie der Gegenelektrode ein Ultra- oder Nanofilter bzw. eine Membran in der Messkammer angebracht wird. Durch einen Ultra- oder Nanofilter bzw. eine Schutzmembran können beispielsweise in der Reaktorbrühe befindliche großmolekulare Stoffe von den Elektroden ferngehalten werden. Nur die kleinmolekularen Stoffe wie z.B. Alkohole, etc. diffundieren durch den Filter bzw. die Membran und können mit den Elektroden, insbesondere den jeweiligen Arbeitselektroden, reagieren. Auf diese Weise werden sehr einfach Querempfindlichkeiten, durch welche eine Analyse bzw. die Bestimmung der Konzentrationen der kleinmolekularen Stoffe gestört werden könnte, verhindert.It is also advantageous for the method according to the invention if an ultrafilter or nanofilter or a membrane is installed in the measuring chamber to protect the at least two working electrodes and the counterelectrode. For example, large-molecular substances present in the reactor broth can be kept away from the electrodes by means of an ultra- or nano-filter or a protective membrane. Only the small-molecular substances such as alcohols, etc. diffuse through the filter or the membrane and can react with the electrodes, especially the respective working electrodes. In this way, cross-sensitivities, which could interfere with an analysis or the determination of the concentrations of the small-molecular substances, are very easily prevented.

Insbesondere für eine parallele Analyse der Konzentration von Methanol und Ethanol in einer Reaktorbrühe ist es wichtig, dass keine anderen elektrochemisch aktiven Substanzen/Stoffe in hoher Konzentration in der Reaktorbrühe vorhanden sind. Dies ist bei einer Durchführung von biotechnologischen Prozessen üblicherweise erfüllt, da diese generell in einem Kulturmedium wie z.B. dem so genannten DMEM oder Dulbecco's Modified Eagle's Medium durchgeführt werden. In einem derartigen Kulturmedium befinden sich beispielsweise neben Zucker (z.B. Glukose) keine weiteren Substanzen außer Kochsalz (NaCl) und Kaliumchlorid (KCl) mit einer Konzentration größer als 0,5 g/l. Von diesen Substanzen (Zucker, NaCl, KCl) wird allerdings eine Analyse von kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Methanol und Ethanol bzw. eine Messung der entsprechenden Strom- und Spannungsverläufe zwischen den jeweiligen Elektroden in der Reaktorbrühe, welche im Bioreaktor aus dem Kulturmedium beim Ablauf eines biotechnologischen Prozesses gebildet wird, nicht beeinflusst oder gestört.In particular for a parallel analysis of the concentration of methanol and ethanol in a reactor broth, it is important that no other electrochemically active substances/substances are present in high concentrations in the reactor broth. This is usually the case when carrying out biotechnological processes, since these are generally carried out in a culture medium such as the so-called DMEM or Dulbecco's Modified Eagle's Medium. In addition to sugar (e.g. glucose), such a culture medium does not contain any other substances apart from common salt (NaCl) and potassium chloride (KCl) with a concentration greater than 0.5 g/l. Of these substances (sugar, NaCl, KCl), however, an analysis of small-molecular substances such as methanol and ethanol or a measurement of the corresponding current and voltage curves between the respective electrodes in the reactor broth, which is produced in the bioreactor from the culture medium during the course of a biotechnological Process is formed, not affected or disturbed.

Weitere in der Reaktorbrühe befindliche großmolekulare Substanzen wie z.B. Zellen, große organische Moleküle (z.B. Proteine, Aminosäure, etc.) können dann durch einen Ultra- oder Nanofilter bzw. eine Schutzmembran von den Arbeitselektroden wie von der Gegenelektrode in der Messkammer ferngehalten werden. Je nach Größe dieser großmolekularen Stoffe kann dann entweder ein Ultrafilter oder ein Nanofilter eingesetzt werden. Mittels eines Ultrafilters können beispielsweise Partikel mit einer Größe von 0,1 bis 0,01 µm abgetrennt werden, mit einem Nanofilter sind es z.B. Partikel mit einer Größe von 0,01 bis 0,001 µm.Other large-molecular substances in the reactor broth, such as cells, large organic molecules (e.g. proteins, amino acids, etc.) can then be kept away from the working electrodes and the counter-electrode in the measuring chamber by means of an ultra- or nanofilter or a protective membrane. Depending on the size of these large-molecular substances, either an ultrafilter or a nanofilter can then be used. For example, particles with a size of 0.1 to 0.01 µm can be separated with an ultrafilter, with a nanofilter, for example, particles with a size of 0.01 to 0.001 µm can be separated.

Zweckmäßiger Weise wird auch einen Referenzelektrode für die Messung von Spannungsverläufen mit der Reaktorbrühe in Kontakt gebracht. Die Referenzelektrode kann dazu in die Messkammer eingebracht werden und wird dort ebenfalls wie die Arbeitselektroden und die Gegenelektroden mittels einem Ultra- oder Nanofilter oder eine Schutzmembran vor großmolekularen Stoffen geschützt. Dies stellt eine besonders einfache und kostengünstige Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens dar und die Bestimmung der jeweiligen Stoff-Konzentrationen kann mit sehr geringem technischen Aufwand durchgeführt werden.A reference electrode for measuring voltage curves is also expediently brought into contact with the reactor broth. For this purpose, the reference electrode can be placed in the measuring chamber and, like the working electrodes and the counter-electrodes, is protected there from large-molecular substances by means of an ultra- or nano-filter or a protective membrane. This represents a particularly simple and inexpensive variant of the method according to the invention and the determination of the respective substance concentrations can be carried out with very little technical effort.

Alternativ ist es auch möglich, die Referenzelektrode außerhalb der Messkammer anzubringen und über einen so genannten Ionenleiter mit der Messkammer zu verbinden. Ein Ionenleiter ist in der Elektrochemie üblicherweise ein Gas, ein Festkörper oder eine Flüssigkeit, bei welchem/welcher ein Transport von elektrischer Ladung mittels Ionen durchgeführt wird. Typische Ionenleiter sind z.B. ionisierte Gase, Elektrolyte, etc. Die Referenzelektrode kann beispielsweise in einer eigenen Zelle angebracht werden und als Ionenleiter kann die Reaktorbrühe verwendet werden, dadurch wird die Referenzelektrode auf einfache Weise mit der Reaktorbrühe in Kontakt gebracht und es liegt z.B. eine räumliche Trennung zwischen Gegen- und Referenzelektrode für die Messungen von Strom- und Spannungsverläufen vor.Alternatively, it is also possible to attach the reference electrode outside of the measuring chamber and to connect it to the measuring chamber via a so-called ion conductor. In electrochemistry, an ion conductor is usually a gas, a solid or a liquid in which an electrical charge is transported by means of ions. Typical ion conductors are e.g. ionized gases, electrolytes, etc. The reference electrode can, for example, be installed in a separate cell and the reactor broth can be used as the ion conductor, which means that the reference electrode is easily brought into contact with the reactor broth and there is a spatial separation, for example between the counter and reference electrode for measuring current and voltage curves.

Eine zweckmäßige Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass das erfindungsgemäße Verfahren sozusagen „off-line“ durchgeführt. Das bedeutet, die Messkammer wird dabei mit Probe der Reaktorbrühe beschickt, um die Konzentrationen von gewünschten kleinmolekularen Stoffen zu ermitteln. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die Messung der Stoff-Konzentrationen kann dann unabhängig von dem zu überwachenden biotechnologischen Prozesse durchführt werden.An expedient embodiment of the invention provides that the method according to the invention is carried out “off-line”, so to speak. This means that the measuring chamber is loaded with a sample of the reactor broth in order to determine the concentrations of the desired small-molecular substances. The method according to the invention and the measurement of the substance concentrations can then be carried out independently of the biotechnological process to be monitored.

Es ist aber auch möglich, dass die Messkammer mit zumindest den Arbeitselektroden und der Gegenelektrode von der Reaktorbrühe umspült wird. Die Bestimmung der Stoff-Konzentrationen erfolgt dann sozusagen „on-line“ während des biotechnologischen Prozesses und die Stoff-Konzentrationen können dabei z.B. laufend ermittelt und überwacht werden. Diese On-line-Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise bei sehr heiklen Prozessen eingesetzt werden, welche ein kontinuierliche Überwachung z.B. einer Methanol- und/oder Ethanol-Konzentration in der Reaktorbrühe bedürfen. Dazu wird beispielsweise die Messkammer, welche dann sowohl Arbeitselektroden und Gegenelektrode als auch die Referenzelektrode umfasst, direkt in den Reaktor eingebracht. Ein problematisches Ziehen einer Probe aus der Reaktorbrühe, wodurch gegebenenfalls Verunreinigungen in den Reaktor eingebracht werden können, kann dabei entfallen.However, it is also possible that the measuring chamber with at least the working electrodes and the counter-electrode is flushed with the reactor broth. The substance concentrations are then determined “on-line”, so to speak, during the biotechnological process and the substance concentrations can be continuously determined and monitored. This on-line variant of the method according to the invention can be used, for example, in very delicate processes which require continuous monitoring, for example of a methanol and/or ethanol concentration in the reactor broth. For this purpose, for example, the measuring chamber, which then includes both the working electrodes and the counter electrode as well as the reference electrode, is introduced directly into the reactor. A problematic drawing of a sample from the Reactor broth, as a result of which impurities can possibly be introduced into the reactor, can be omitted in this case.

Es ist günstig, wenn als Materialen für die Arbeitselektroden Platin und Palladium verwendet werden. Idealer Weise ist dabei eine erste Arbeitselektrode aus Platin (Pt) und eine zweite Arbeitselektrode aus Palladium (Pd) hergestellt. Mit einer derartigen Kombination von Arbeitselektroden können auf sehr einfache Weise Konzentrationen von Methanol und Ethanol in der Reaktorbrühe ermittelt werden.It is favorable if platinum and palladium are used as materials for the working electrodes. Ideally, a first working electrode is made of platinum (Pt) and a second working electrode is made of palladium (Pd). With such a combination of working electrodes, concentrations of methanol and ethanol in the reactor broth can be determined in a very simple manner.

Methanol und Ethanol werden z.B. als potentieller Brennstoff von Brennstoffzellen eingesetzt und sind daher im Bezug auf ihre elektrochemischen Eigenschaften genau charakterisiert und untersucht. Aus der Schrift „Xu, Changwei et al: Methanol and ethanol electrooxidation on Pt and Pd supported on carbon microspheres in alkaline media, Electrochemistry Communications 9 (2007), 997-1001“ ist bekannt, dass Methanol auf Platin etwas besser reagiert als auf Palladium, während sich Ethanol genau umgekehrt verhält. Eine Stromspitze ist bei Methanol bei einer Platin-Elektrode beispielsweise höher als bei einer Palladium-Elektrode. Bei Ethanol ist die Stromspitze hingegen z.B. bei einer Palladium-Elektrode größer als bei einer Platin-Elektrode. Durch unterschiedliche Überspannungen die sowohl vom Elektrodenmaterial als auch vom umgesetzten Stoff abhängen, sind die Stromspitzen auch in ihrer Lage versetzt. Aufgrund dieser unterschiedlichen Spitzenhöhen und -formen von Methanol und Ethanol bei Elektroden aus unterschiedlichen Materialen ist es durch Einsatz entsprechender Arbeitselektroden möglich, eine Gehalt der beiden Alkohole in einer Reaktorbrühe einfach und kostengünstig parallel zu bestimmen.Methanol and ethanol are used, for example, as potential fuels in fuel cells and are therefore precisely characterized and investigated with regard to their electrochemical properties. From the publication "Xu, Changwei et al: Methanol and ethanol electrooxidation on Pt and Pd supported on carbon microspheres in alkaline media, Electrochemistry Communications 9 (2007), 997-1001" it is known that methanol reacts somewhat better on platinum than on palladium , while ethanol behaves in exactly the opposite way. For example, a current peak with methanol is higher with a platinum electrode than with a palladium electrode. With ethanol, on the other hand, the current peak is greater with a palladium electrode than with a platinum electrode, for example. Due to different overvoltages, which depend on both the electrode material and the converted substance, the current peaks are also shifted in their position. Due to these different peak heights and shapes of methanol and ethanol with electrodes made of different materials, it is possible to determine the content of the two alcohols in a reactor broth easily and inexpensively in parallel by using appropriate working electrodes.

Um beispielsweise Konzentrationen von weiteren für einen Zellstoffwechsel und/oder für eine Prozesskontrolle wichtigen kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Glukose, Glutamin, Lactat, Acetat, Glycerin, Arabinose, Lactose, etc. ermitteln zu können, können z.B. weitere oder andere Arbeitselektroden in die Messkammer eingebracht werden. Für diese Arbeitselektroden sind dann ebenfalls die entsprechenden Materialen (z.B. Kupfer (Cu), dotierter Diamant, etc.), welche z.B. charakteristische Strom-/Potentialverläufe und/oder Stromspitzen für den jeweiligen Stoff aufweisen, auszuwählen.For example, in order to be able to determine concentrations of other small-molecular substances important for cell metabolism and/or for process control, such as glucose, glutamine, lactate, acetate, glycerol, arabinose, lactose, etc., additional or different working electrodes can be introduced into the measuring chamber . The corresponding materials (e.g. copper (Cu), doped diamond, etc.) which, for example, have characteristic current/potential curves and/or current peaks for the respective substance must then also be selected for these working electrodes.

Zweckmäßiger Weise werden für eine Auswertung der gemessenen Strom-/Spannungsverläufe eine so genannte multivariate Analysemethoden, insbesondere Partial Least Square Regression oder Artificial Neural Networks, eingesetzt. Die Analyseeinheit kann dazu idealer Weise auf einem Mikrokontroller oder einem Personal Computer (PC) ausgeführt sein, von welchem für eine Auswertung eine entsprechende Rechenleistung zur Verfügung gestellt wird. Durch die Kombination der multivariaten Analysemethoden mit mehreren Arbeitselektroden aus unterschiedlichen Materialen ist es mit geringem technischen Aufwand und kostengünstig möglich, Konzentrationen von mehreren kleinmolekularen Stoffen (z.B. Methanol, Ethanol, etc.) parallel zu bestimmen, welche sich elektrochemisch nur wenig unterscheiden.So-called multivariate analysis methods, in particular partial least square regression or artificial neural networks, are expediently used to evaluate the measured current/voltage curves. For this purpose, the analysis unit can ideally be implemented on a microcontroller or a personal computer (PC), from which appropriate computing power is made available for an evaluation. By combining the multivariate analysis methods with several working electrodes made of different materials, it is possible to determine the concentrations of several small molecular substances (e.g. methanol, ethanol, etc.) in parallel with little technical effort and at low cost, which electrochemically differ only slightly.

Die Partial Least Square Regression (PLS Regression) ist dabei eine statistische Methode. Mit dieser Methode wird eine Regression von unabhängigen so genannten x-Variablen auf eine oder mehrere so genannte y-Variable berechnet. Damit können beim erfindungsgemäßen Verfahren dann auf Basis der gemessenen Strom- und Spannungsverläufe z.B. Zusammenhänge und Abhängigkeiten von Spannung und Strom analysiert und gesuchte Stoffkonzentrationen wie z.B. von Alkoholen in der Reaktorbrühe abgeschätzt werden.The partial least square regression (PLS regression) is a statistical method. This method is used to calculate a regression from independent so-called x-variables to one or more so-called y-variables. With the method according to the invention, relationships and dependencies between voltage and current can then be analyzed on the basis of the measured current and voltage curves, and substance concentrations sought, such as alcohols in the reactor broth, can be estimated.

Artificial Neural Networks oder künstliche neuronale Netze sind Netze aus künstlichen Neuronen. Die künstlichen neuronalen Netze werden aufgrund ihrer Eigenschaften insbesondere für Anwendungen interessant, bei welchen kein oder nur ein geringes explizites/systematisches Wissen über ein zu lösendes Problem vorliegt wie z.B. Mustererkennung, Analyse von komplexen Prozessen, etc. Damit können ebenfalls die gemessenen Strom- und Spannungsverläufe ausgewertet und daraus Stoff-Konzentrationen abgeschätzt werden.Artificial neural networks or artificial neural networks are networks of artificial neurons. Due to their properties, the artificial neural networks are of particular interest for applications in which there is little or no explicit/systematic knowledge about a problem to be solved, such as pattern recognition, analysis of complex processes, etc evaluated and the substance concentrations estimated.

Bei einer bevorzugten Fortbildung der Erfindung ist auch vorgesehen, dass Ergebnisse der Analyseeinheit auf einer Ausgabeeinheit ausgegeben und angezeigt werden. Die Ergebnisse können dabei in Form von Zahlen und/oder grafisch dargestellt werden. Auf diese Weise ist sehr einfach feststellbar, ob ein bestimmter Grenzwert (z.B. 1g/l Methanol, etc.) für eine Konzentration eines Stoffes in der Reaktorbrühe über- oder unterschritten worden ist. Eine Grenzwert-Überschreitung wird z.B. wegen der toxischen Wirkung auf Mikroorganismen bei Alkoholen wie z.B. Methanol, Ethanol überwacht. Bei Nährstoffen für die Mikroorganismen wie z.B. Glukose, etc. kann beispielsweise eine Grenzwert-Unterschreitung kontrolliert werden, um zu überwachen, ob noch genügend Nährstoffe für den biotechnologischen Prozess in der Reaktorbrühe vorhanden sind.In a preferred development of the invention, it is also provided that the results of the analysis unit are output and displayed on an output unit. The results can be presented in the form of numbers and/or graphically. In this way it is very easy to determine whether a certain limit (e.g. 1g/l methanol, etc.) for a concentration of a substance in the reactor broth has been exceeded or fallen below. Exceeding the limit value is monitored, for example, because of the toxic effect on microorganisms in the case of alcohols such as methanol, ethanol. In the case of nutrients for the microorganisms, such as glucose, etc., for example, a drop below the limit value can be checked in order to monitor whether there are still enough nutrients for the biotechnological process in the reactor broth.

Weiterhin wird die Aufgabe mit einer Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst. Diese Anordnung umfasst dabei zumindest zwei in einer Messkammer angebrachte Arbeitselektroden, wobei jede Arbeitselektrode aus einem unterschiedlichen Material besteht, welches für einen jeweils zu messenden kleinmolekularen Stoff einen unterscheidbaren Strom-/Potentialverlauf und eine unterscheidbare Stromspitze aufweist. Weiterhin umfasst die Anordnung eine in der Messkammer angebrachte Gegenelektrode für Messungen von Stromverläufen sowie eine mit der Reaktorbrühe in Kontakt befindliche Referenzelektrode für Messungen von Spannungsverläufen, welche entweder ebenfalls in der Messkammer angebracht sein kann oder über einen Ionenleiter wie z.B. die Reaktorbrühe mit der Messkammer verbunden ist. Dann weist die erfindungsgemäße Anordnung noch eine Elektronikkomponente, welche als so genanntes Potentiostat fungiert - damit sowohl zum Anlegen gewünschter Potentialverläufe an die Arbeitselektroden als auch als Messeinheit für Strom-/Spannungsverläufe zwischen den Arbeitselektroden und der Gegenelektrode bzw. der Referenzelektrode einsetzbar ist. Das Anlegen der Potentialverläufe sowie die Messvorgänge erfolgen dabei parallel. Außerdem ist eine Analyseeinheit zum Auswerten der gemessenen Strom-/Spannungsverläufe vorgesehen.Furthermore, the object is achieved with an arrangement for carrying out the method according to the invention. This arrangement comprises at least two working electrodes mounted in a measuring chamber, each working electrode being made of a different material has a distinguishable current/potential course and a distinguishable current peak for each small-molecular substance to be measured. The arrangement also includes a counter-electrode fitted in the measuring chamber for measurements of current curves and a reference electrode which is in contact with the reactor broth for measurements of voltage curves and which can either also be fitted in the measuring chamber or is connected to the measuring chamber via an ion conductor such as the reactor broth . The arrangement according to the invention also has an electronic component which acts as a so-called potentiostat - so that it can be used both for applying desired potential curves to the working electrodes and as a measuring unit for current/voltage curves between the working electrodes and the counter-electrode or the reference electrode. The application of the potential curves and the measurement processes take place in parallel. In addition, an analysis unit is provided for evaluating the measured current/voltage curves.

Die mit dieser erfindungsgemäßen Anordnung erzielbaren Vorteile bestehen insbesondere darin, dass die Anordnung für einen längeren Zeitraum und mehrfache Messungen/Stoff-Konzentrationsbestimmungen ohne Austausch und/oder Verbrauch von Komponenten einsetzbar ist. Sie ist mit geringem technischen Aufwand und kostengünstig bereitstellbar und ermöglicht sehr einfach eine Bestimmung von Stoffen wie z.B. Alkoholen, etc., welche sich elektrochemisch nur geringfügig unterscheiden, durch eine Kombination von mehreren Arbeitselektroden für Messungen unterschiedlicher Strom-/Spannungsverläufe und eine Analyse der Messungen mittels multivariater Analysemethoden.The advantages that can be achieved with this arrangement according to the invention consist in particular in the fact that the arrangement can be used for a longer period of time and multiple measurements/substance concentration determinations without replacing and/or consuming components. It can be provided with little technical effort and cost-effectively and enables substances such as alcohols, etc., which differ only slightly electrochemically, to be determined very easily using a combination of several working electrodes for measurements of different current/voltage curves and an analysis of the measurements using multivariate analysis methods.

Es ist dabei vorteilhaft, wenn in der Messkammer ein Ultra- oder Nanofilter oder eine Membran als Schutz der zumindest zwei Arbeitselektroden und der Gegenelektrode angebracht ist. Durch diese Filter bzw. Membran werden große Moleküle (z.B. Zellen, Proteine, Aminosäuren, etc.) vor allem von den Arbeitselektroden ferngehalten. Dadurch werden Messungen von Strom-/Spannungsverläufen und deren Analyse nicht durch Querempfindlichkeiten oder gegebenenfalls auftretenden Reaktionen dieser großen Moleküle an den Arbeitselektroden gestört oder verfälscht.It is advantageous if an ultra- or nano-filter or a membrane is fitted in the measuring chamber to protect the at least two working electrodes and the counter-electrode. These filters or membranes keep large molecules (e.g. cells, proteins, amino acids, etc.) away from the working electrodes in particular. As a result, measurements of current/voltage curves and their analysis are not disturbed or falsified by cross-sensitivities or reactions that may occur from these large molecules at the working electrodes.

Es ist auch günstig, wenn die erfindungsgemäße Anordnung eine Ausgabeeinheit zum Anzeigen und Ausgeben der Ergebnisse der Analyseeinheit aufweist. Auf diese Weise sind die Ergebnisse der Analyseeinheit, welche als Mikrokontroller oder PC ausgeführt sein kann, einfach und übersichtlich z.B. in Form von Zahlen oder grafisch darstellbar und können rasch und einfach ausgewertet werden.It is also advantageous if the arrangement according to the invention has an output unit for displaying and outputting the results of the analysis unit. In this way, the results of the analysis unit, which can be designed as a microcontroller or PC, can be presented simply and clearly, e.g. in the form of numbers or graphically, and can be evaluated quickly and easily.

Kurzbeschreibung der ZeichnungBrief description of the drawing

Die Erfindung wird nachfolgend in beispielhafter Weise anhand der beigefügten Figur erläutert. 1 zeigt dabei beispielhaft und schematisch eine Anordnung zur Durchführung eines Verfahrens zur direkten und parallelen Bestimmung kleinmolekularer Stoffe in einer Reaktorbrühe sowie einen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens.The invention is explained below in an exemplary manner with reference to the attached figure. 1 shows, by way of example and diagrammatically, an arrangement for carrying out a method for the direct and parallel determination of small-molecular substances in a reactor broth and a sequence of the method according to the invention.

Ausführung der Erfindungimplementation of the invention

1 zeigt beispielhaft und in schematischer Weise die erfindungsgemäße Anordnung sowie einen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens zur direkten und parallelen Bestimmung von kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Methanol, Ethanol, etc. in einer Reaktorbrühe RB. Die Anordnung weist eine Messkammer MK auf, in welche über eine Zuleitung ZL die Reaktorbrühe RB mit den Analyten (z.B. Methanol, Ethanol) eingebracht wird, und die Messkammer MK wird dann von der Reaktorbrühe RB durchströmt. Auf diese Weise kann die erfindungsgemäße Anordnung sozusagen „off-line“ betrieben werden, wobei die Messkammer über die Zuleitung ZL mit der Reaktorbrühe RB bzw. mit Proben der Reaktorbrühe RB beschickt wird. Alternativ besteht die Möglichkeit eines so genannten „On-line“-Betriebs der Anordnung, bei welchem die Messkammer MK sowie eine Referenzelektrode RE, welche beispielsweise in der Messkammer MK angebracht sein kann, direkt in einem Bioreaktor oder Fermenter eingebracht werden. Die Messkammer MK mit den Elektroden A1, A2, GE, RE wird dann von der Reaktorbrühe RB umspült. 1 shows, by way of example and in a schematic manner, the arrangement according to the invention and a sequence of the method according to the invention for the direct and parallel determination of small-molecular substances such as methanol, ethanol, etc. in a reactor broth RB. The arrangement has a measuring chamber MK, into which the reactor liquid RB with the analytes (eg methanol, ethanol) is introduced via a feed line ZL, and the measuring chamber MK is then flowed through by the reactor liquid RB. In this way, the arrangement according to the invention can be operated “off-line”, so to speak, with the measuring chamber being charged with the reactor liquid RB or with samples of the reactor liquid RB via the feed line ZL. Alternatively, there is the possibility of so-called “on-line” operation of the arrangement, in which the measuring chamber MK and a reference electrode RE, which can be installed in the measuring chamber MK, for example, are introduced directly into a bioreactor or fermenter. The measuring chamber MK with the electrodes A1, A2, GE, RE is then flushed with the reactor broth RB.

In einem ersten Verfahrensschritt 1 werden zumindest zwei Arbeitselektroden A1, A2 aus unterschiedlichen Materialen sowie eine Gegenelektrode GE eingebracht. In der beispielhaft dargestellten Anordnung werden z.B. zwei Arbeitselektroden A1, A2 für eine Bestimmung eines Gehalts von Methanol und Ethanol in einer Reaktorbrühe verwendet. Dazu werden die Materialen der Arbeitselektrode A1, A2 derart ausgewählt, dass sie für die zu bestimmenden kleinmolekularen Stoffe unterscheidbare Strom-/Potentialverläufe und/oder unterscheidbare Stromspitzen aufweisen. Für eine parallele Bestimmung eines Methanol- und Ethanolgehalts in der Reaktorbrühe RB wird beispielsweise als Material für eine erste Arbeitselektrode A1 Platin und als Material für eine zweite Arbeitselektrode A2 Palladium gewählt.In a first method step 1, at least two working electrodes A1, A2 made of different materials and a counter-electrode GE are introduced. In the arrangement shown by way of example, two working electrodes A1, A2 are used, for example, to determine the content of methanol and ethanol in a reactor broth. For this purpose, the materials of the working electrode A1, A2 are selected in such a way that they have distinguishable current/potential curves and/or distinguishable current peaks for the small-molecular substances to be determined. For a parallel determination of a methanol and ethanol content in the reactor broth RB, for example, platinum is selected as the material for a first working electrode A1 and palladium is selected as the material for a second working electrode A2.

Um beispielsweise Konzentrationen von weiteren für einen Zellstoffwechsel und/oder für eine Prozesskontrolle biotechnologischer Prozesse wichtigen kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Glukose, Glutamin, Lactat, Acetat, Glycerin, Arabinose, Lactose, etc. ermitteln zu können, können z.B. weitere oder andere Arbeitselektroden A1, A2 in die Messkammer MK eingebracht werden. Für diese Arbeitselektroden A1, A2 sind dann ebenfalls die entsprechenden Materialen (z.B. Kupfer, dotierter Diamant, etc.) auszuwählen, welche z.B. charakteristische Strom-/Potentialverläufe und/oder eine charakteristische Stromspitze für den jeweiligen zu bestimmenden Stoff aufweisen.For example, in order to be able to determine concentrations of other small-molecular substances important for cell metabolism and/or for process control of biotechnological processes, such as glucose, glutamine, lactate, acetate, glycerol, arabinose, lactose, etc., further or other working electrodes A1, A2 into the measuring chamber MK are introduced. For these working electrodes A1, A2, the corresponding materials (eg copper, doped diamond, etc.) must then also be selected, which have eg characteristic current/potential curves and/or a characteristic current peak for the respective substance to be determined.

Zum Schutz der Arbeitselektroden A1, A2 sowie der Gegenelektrode GE ist in der Messkammer ein Ultra- oder Nanofilter F bzw. eine Schutzmembran F angebracht. Durch diesen Filter F bzw. diese Membran F werden beispielsweise in der Reaktorbrühe RB befindliche Zellen und/oder große organische Moleküle (z.B. Proteine, Aminosäuren, etc.) von den Arbeitselektroden A1, A2 bzw. von der Gegenelektrode GE ferngehalten, um eine Querempfindlichkeit der Elektroden A1, A2, GE gegenüber diesen zu verringern und Störungen der Messungen zu reduzieren. An den Elektroden A1, A2, GE kann es damit nur zu Reaktionen von kleinmolekularen Stoffen wie z.B. dem zumessenden Methanol und Ethanol kommen. Diese kleinmolekularen Stoffe können mittels Diffusion D den Filter F bzw. die Membran F passieren.To protect the working electrodes A1, A2 and the counter-electrode GE, an ultra- or nano-filter F or a protective membrane F is installed in the measuring chamber. This filter F or this membrane F keeps cells and/or large organic molecules (e.g. proteins, amino acids, etc.) in the reactor broth RB away from the working electrodes A1, A2 and the counter-electrode GE, for example, in order to prevent cross-sensitivity of the To reduce electrodes A1, A2, GE compared to these and to reduce interference in the measurements. At the electrodes A1, A2, GE, only small-molecular substances such as the measured methanol and ethanol can react. These small-molecular substances can pass through the filter F or the membrane F by means of diffusion D.

In einem zweiten Verfahrensschritt 2 wird eine Referenzelektrode RE mit der Reaktorbrühe RB in Kontakt gebracht. Die Referenzelektrode kann dazu direkt in die Messkammer MK eingebracht werden. Alternativ kann die Referenzelektrode - wie beispielhaft in 1 dargestellt - in einer eigenen Kammer K untergebracht sein, welche über die Zuleitung ZL mit der Messkammer MK verbunden ist. Das bedeutet, die Referenzelektrode RE ist damit über die Reaktorbrühe RB als so genannter Ionenleiter mit der Messkammer MK verbunden. Weiterhin kann auch die Referenzelektrode RE durch eine Membran z.B. vor Zellen und/oder großen Molekülen geschützt werden.In a second method step 2, a reference electrode RE is brought into contact with the reactor broth RB. The reference electrode can be inserted directly into the measuring chamber MK. Alternatively, the reference electrode - as exemplified in 1 shown - be housed in a separate chamber K, which is connected to the measuring chamber MK via the supply line ZL. This means that the reference electrode RE is connected to the measuring chamber MK via the reactor broth RB as a so-called ion conductor. Furthermore, the reference electrode RE can also be protected by a membrane, for example from cells and/or large molecules.

Die erfindungsgemäße Anordnung umfasst weiterhin eine Elektronikkomponente EK, an welche die Arbeitselektroden A1, A2, die Gegenelektrode GE und die Referenzelektrode RE angebunden sind. In einem dritten Verfahrensschritt 3 werden von der Elektronikkomponente EK abwechselnd ausgewählte Potentialverläufe (z.B. dreiecksförmig, etc.) an die Arbeitselektroden A1, A2 angelegt. Parallel dazu werden entsprechende, zugehörige Stromverläufe zwischen den Arbeitselektroden A1, A2 und der Gegenelektrode GE sowie entsprechende, zugehörige Spannungsverläufe zwischen den Arbeitselektroden A1, A2 und der Referenzelektrode RE von der Elektronikkomponente EK gemessen. Von der Elektronikkomponente EK wird dabei quasi als so genanntes Potentiostat fungiert. Ein Potentiostat ist ein in der Elektrochemie häufig genutztes Gerät, welches im einfachsten Fall als präzise Gleichspannungsquelle oder auch als Quelle für zeitlich veränderliche Spannungsverläufe (z.B. Dreieck, etc.) oder als Voltmeter oder als Amperemeter dienen kann.The arrangement according to the invention also includes an electronic component EK, to which the working electrodes A1, A2, the counter-electrode GE and the reference electrode RE are connected. In a third method step 3, the electronic component EK alternately applies selected potential curves (e.g. triangular, etc.) to the working electrodes A1, A2. In parallel, corresponding, associated current curves between the working electrodes A1, A2 and the counter-electrode GE and corresponding, associated voltage curves between the working electrodes A1, A2 and the reference electrode RE are measured by the electronic component EK. The electronic component EK acts as a so-called potentiostat. A potentiostat is a device that is frequently used in electrochemistry, which in the simplest case can be used as a precise DC voltage source or as a source for voltage curves that change over time (e.g. triangle, etc.) or as a voltmeter or ammeter.

Ein Anlegen eines Potentialverlaufs sowie die zugehörige Messung werden dabei parallel durchgeführt. Ein Potentiostat ist dabei üblicherweise so ausgelegt, dass eine Potentialveränderung kontinuierlich erfolgt. Andererseits ist es auch möglich, mittels eines Mikrokontrollers eine stufenförmige Potentialveränderung mit hoher Frequenz vorzugeben. Damit kann z.B. ein Effekt ähnlich einer so genannten Pulspolarorthographie erzielt werden, welche sich gegebenenfalls positiv auf die Messung auswirken kann.An application of a potential profile and the associated measurement are carried out in parallel. A potentiostat is usually designed in such a way that the potential changes continuously. On the other hand, it is also possible to use a microcontroller to specify a stepped potential change with a high frequency. In this way, for example, an effect similar to what is known as pulse polar orthography can be achieved, which can have a positive effect on the measurement.

Bei der Messung der entsprechenden, zugehörigen Stromverläufe zwischen den Arbeitselektroden A1, A2 und der Gegenelektrode GE sowie der entsprechenden, zugehörigen Spannungsverläufe zwischen den Arbeitselektroden A1, A2 und der Referenzelektrode RE sind insbesondere die Stromverläufe charakteristisch für eine zu bestimmende Stoffkonzentration in der Reaktorbrühe RB. Die zwischen Arbeitselektroden A1, A2 und der Referenzelektrode RE gemessenen Spannungsverläufe werden weitgehend durch die mit der Elektronikkomponente EK angelegten ausgewählten Potentialverläufe vorgegeben.When measuring the corresponding, associated current curves between the working electrodes A1, A2 and the counter-electrode GE and the corresponding, associated voltage curves between the working electrodes A1, A2 and the reference electrode RE, the current curves are particularly characteristic of a substance concentration to be determined in the reactor broth RB. The voltage curves measured between the working electrodes A1, A2 and the reference electrode RE are largely predetermined by the selected potential curves applied with the electronic component EK.

In einem vierten Verfahrensschritt 4 werden dann die Messergebnisse der Elektronikkomponente EK - d.h. die gemessenen Strom- und Spannungsverläufe an eine Analyseeinheit AN der erfindungsgemäßen Anordnung weitergeleitet. Von der Analyseeinheit AN, welche auf einem Mikrokontroller oder einem Personal Computer ausgeführt sein kann, werden dann die gemessenen Strom- und Spannungsverläufe mittels so genannter multivariater Analysemethoden wie z.B. Partial Least Square Regression oder Artificial Neuronal Networks, ausgewertet. Durch die entsprechende Auswertung der an Arbeitselektroden A1, A2, welche aus unterschiedlichem Material - z.B. Platin, Palladium - bestehen, gemessenen Strom- und Spannungsverläufe mit multivariaten Analysemethoden kann dann eine Konzentration der zu analysierenden kleinmolekularen Stoffe (z.B. Methanol, Ethanol, etc.) in der Reaktorbrühe RB parallel bestimmt werden. Dazu werden beispielsweise Zusammenhänge von Strom- und Spannungsverläufen abgeschätzt und z.B. anhand auftretender Stromspitzen die Konzentration des jeweiligen kleinmolekularen Stoffs ermittelt.In a fourth method step 4, the measurement results of the electronic component EK - i.e. the measured current and voltage curves - are then forwarded to an analysis unit AN of the arrangement according to the invention. The measured current and voltage curves are then evaluated by the analysis unit AN, which can be implemented on a microcontroller or a personal computer, using so-called multivariate analysis methods such as partial least square regression or artificial neuronal networks. Through the appropriate evaluation of the current and voltage curves measured at the working electrodes A1, A2, which consist of different materials - e.g. platinum, palladium - with multivariate analysis methods, a concentration of the small molecular substances to be analyzed (e.g. methanol, ethanol, etc.) can then be determined in of the reactor broth RB can be determined in parallel. For this purpose, for example, the relationships between current and voltage curves are estimated and, for example, the concentration of the respective small-molecular substance is determined on the basis of current peaks.

In einem fünften Verfahrensschritt 5 können dann die Analyseergebnisse auf einer Ausgabeeinheit AE ausgegeben und angezeigt werden.In a fifth method step 5, the analysis results can then be output and displayed on an output unit AE.

Anstelle einer kombinierten Messung von Strom- und Spannungsverläufen durch die Elektronikkomponente EK im dritten Verfahrensschritt 3 ist es auch möglich, ein rein amperometrisches Verfahren zu verwenden. Dabei werden nur zeitliche Verläufe eines Stroms bei zwei Potentialen gemessen. Allerdings kann durch die kombinierte Messung von Strom- und Spannungsverläufen bei zwei Potentialen bzw. Potentialverläufen an zumindest zwei Arbeitselektroden A1, A2 wesentlich einfacher ein parallele Bestimmung von zumindest kleinmolekularen Stoffen wie z.B. Methanol und Ethanol in einer Reaktorbrühe RB durchgeführt werden.Instead of a combined measurement of current and voltage curves by the electronic component EK in the third method step 3, it is also possible to use a purely amperometric method. In this case, only the time characteristics of a current are measured at two potentials. However, the combined measurement of current and voltage curves at two potentials or potential curves at at least two working electrodes A1, A2 makes it much easier to carry out a parallel determination of at least small-molecular substances such as methanol and ethanol in a reactor broth RB.

Claims

Method for the direct, parallel determination of small molecular substances in a reactor broth (RB) using so-called cyclic voltammetry, the small molecular substances being formed or consumed during the course of a biotechnological process in the reactor broth (RB), characterized in that at least two working electrodes (A1, A2) made of different materials and a counter-electrode (GE) are introduced into a measuring chamber (MK) with the reactor broth (RB) (1), the materials of the at least two working electrodes (A1, A2) being selected in such a way that current/potential curves and/or current peaks that are distinguishable for these materials for the small-molecular substances to be determined, that a reference electrode (RE) is connected to the reactor broth (RB) (2), that an electronic component (EK) is used to connect selected potential curves to the at least two working electrodes (A1, A2) created and associated current curves z between the counter-electrode (GE) and the at least two working electrodes (A1, A2) and associated voltage curves between the reference electrode (RE) and the at least two working electrodes (A1, A2) are measured (3), and that the measured current/voltage curves are then measured be evaluated by means of an analysis unit (AN) (4).

procedure after claim 1 , characterized in that to protect the at least two working electrodes (A1, A2) and the counter-electrode (GE), an ultra- or nano-filter (F) or a membrane (F) is fitted in the measuring chamber (MK).

Procedure according to one of Claims 1 until 2 , characterized in that the reference electrode (RE) is also mounted in the measuring chamber (2).

Procedure according to one of Claims 1 until 2 , characterized in that the reference electrode (RE) is connected to the measuring chamber (MK) via a so-called ion conductor (RB) (2).

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the measuring chamber (MK) is charged with samples of the reactor broth (RB).

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the measuring chamber (MK) is flushed with the reactor broth (RB).

Method according to one of the preceding claims, characterized in that platinum and palladium are used as materials for the at least two working electrodes (A1, A2).

Method according to one of the preceding claims, characterized in that what are known as multivariate analysis methods, in particular partial least square regression or artificial neural networks, are used by the analysis unit (AN) to evaluate the measured current/voltage curves (4).

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the analysis unit (AN) runs on a microcontroller or a personal computer.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the results of the analysis unit (AN) are output and displayed (5) on an output unit (AE).

Order to carry out a method according to claims 1 until 10 at least comprising: - at least two working electrodes (A1, A2) fitted in a measuring chamber (MK), wherein the working electrodes (A1, A2) consist of different materials which have a different current/potential curve and/or has a different current peak, - a counter-electrode (GE) installed in the measuring chamber (MK) for measurements of current curves, - a reference electrode (RE) connected to the reactor broth (RB) for measurements of voltage curves, - an electronic component (EK), which for Applying desired potential curves to the working electrodes (A1, A2) and can be used as a measuring unit for current curves between the working electrodes (A1, A2) and the counter electrode (GE) and as a measuring unit for voltage curves between the working electrodes (A1, A2) and the reference electrode (RE). - and an analysis unit (AN) for evaluating the measured current/voltage curves.

arrangement according to claim 11 , characterized in that an ultra or nano filter (F) or a membrane (F) is also fitted in the measuring chamber (MK) to protect the at least two working electrodes (A1, A2) and the counter-electrode (GE).

Arrangement according to one of Claims 11 until 12 , characterized in that an output unit (AE) for displaying and outputting the results of the analysis unit (AN) is provided.