DE102013104880B3 - Structure adjustment of three-dimensional collagen-based biomaterial matrices, comprises adjusting the control variables e.g. average pore size for freeze-drying from predetermined structural target sizes of collagen matrix - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung dreidimensionaler Matrices aus fibrillären Kollagensuspensionen für ein breites Anwendungsfeld in Medizin, Zellkulturforschung und In-Vitro-Diagnostik. In dem Prozess können als Ausgangsstoffe auch fibrilläre Kollagensuspensionen mit Zusätzen anderer suspendierbarer oder löslicher Proteine, Polysaccharide oder anorganischer Stoffe eingesetzt werden.The invention relates to a method for producing three-dimensional matrices of fibrillar collagen suspensions for a broad field of application in medicine, cell culture research and in-vitro diagnostics. Fibrillar collagen suspensions with additions of other suspendible or soluble proteins, polysaccharides or inorganic substances can also be used as starting materials in the process.
In biologischen Systemen wird eine Zwischenzellsubstanz als Matrix bezeichnet, die Mehrzahl als Matrices. Im Falle der Kollagenmatrices besteht die Zwischenzellsubstanz aus Kollagen, einem fibrillären, das heißt faserigen Strukturprotein, das hauptsächlich im Bindegewebe vielzelliger Tieren vorkommt. Die Zellen der Matrix beinhalten primär keine festen Substanzen und werden deshalb auch als Poren bezeichnet.In biological systems, an intermediate cell substance is referred to as matrix, the majority as matrices. In the case of collagen matrices, the intercellular substance consists of collagen, a fibrillar, ie fibrous, structural protein found mainly in the connective tissue of multicellular animals. The cells of the matrix primarily contain no solid substances and are therefore also referred to as pores.
Eine Suspension ist ein heterogenes Stoffgemisch aus einer Flüssigkeit und darin fein verteilten Festkörpern. Werden diese nicht mit geeigneten Methoden, wie beispielsweise Rühren, in der Flüssigkeit in der Schwebe gehalten, tendiert die Suspension langfristig zur Phasentrennung und Sedimentation. In Abgrenzung dazu bezeichnet der Oberbegriff der Dispersion ein heterogenes Gemisch aus mindestens zwei Stoffen, meist Flüssigkeiten, die sich nicht oder kaum ineinander lösen oder chemisch miteinander verbinden.A suspension is a heterogeneous mixture of a liquid and finely divided solids. If these are not suspended in the liquid with suitable methods, such as, for example, stirring, the suspension tends in the long term to phase separation and sedimentation. In contrast to this, the generic term dispersion describes a heterogeneous mixture of at least two substances, usually liquids, which do not dissolve or barely dissolve or chemically bond with each other.
Die Herstellung von Kollagenmatrices basiert auf der gezielten Einstellung, Einfrierung und anschließender Gefriertrocknung einer wässrigen Suspension fibrillären Kollagens. Der Gefrierprozess der Suspension erfolgt in einem Kammergefriergerät, in dem das enthaltene Wasser als homogene Phase ausfriert und die homogen suspendierten Feststoffe durch Gefrierkonzentration zwischen den aufwachsenden Eiskristallen zu einer zellularen Matrixstruktur verdichtet werden. Nachdem die Suspension vollständig gefroren ist, wird das Gefriergut in ein Gefriertrocknungsgerät überführt und die Kollagensuspension bei –30°C im Vakuum gefriergetrocknet. Das kristalline Eis wird der erstarrten Suspension durch Sublimation entzogen und es verbleibt eine dreidimensionale Kollagenmatrix mit definierter Materialstruktur, welche vornehmlich durch das fibrilläre Kollagen gebildet wird. Die Strukturparameter der Matrix sind dabei in einem komplexen Beziehungsnetz von den Prozessparametern im Gefrierprozess abhängig.The production of collagen matrices is based on the targeted setting, freezing and subsequent freeze-drying of an aqueous suspension of fibrillar collagen. The freezing process of the suspension is carried out in a chamber freezer in which the water contained freeze as a homogeneous phase and the homogeneously suspended solids are compacted by freezing concentration between the growing ice crystals into a cellular matrix structure. After the suspension is completely frozen, the frozen food is transferred to a freeze-drying apparatus and the collagen suspension is freeze-dried at -30 ° C in vacuo. The crystalline ice is removed from the solidified suspension by sublimation and there remains a three-dimensional collagen matrix with a defined material structure, which is mainly formed by the fibrillar collagen. The structure parameters of the matrix are dependent on the process parameters in the freezing process in a complex network of relationships.
Im Stand der Technik sind mehrere Patente zur Herstellung dreidimensionaler Kollagenmatrices bekannt, wobei der Kerninhalt der meisten die Gewinnung, Reinigung und Aufbereitung von fibrillärem Kollagen aus tierischen Rohprodukten sowie deren Prozessierung zu medizinischen Matrixmaterialien betrifft.Several patents for the preparation of three-dimensional collagen matrices are known in the prior art, the core content of most of which relates to the recovery, purification and processing of fibrillar collagen from crude animal products and their processing into medical matrix materials.
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Bei den bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik ist es als nachteilig zu betrachten, dass all diese Verfahren lediglich für die Produktion einer Kollagenmatrix mit einem speziellen Satz von Zielgrößen optimiert wurden. Sobald sich eine Rahmenbedingung der Produktion ändert oder ein Zielparameter variiert werden soll, muss der komplette Prozess neu optimiert werden. Dadurch bleiben die bisherigen Verfahren sehr inflexibel und den Veränderungen des Marktes kann nur verspätet und mit großem Aufwand gefolgt werden.It is disadvantageous in the known methods of the prior art that all these methods have been optimized only for the production of a collagen matrix with a specific set of target values. As soon as a basic condition of the production changes or a target parameter is to be varied, the entire process must be re-optimized. Thus, the previous procedures remain very inflexible and the changes in the market can be followed only late and with great effort.
Es ist noch kein Optimierungsverfahren offenbart worden, was das komplexe Beziehungsnetz zwischen Regelgrößen und Zielgrößen als Ganzes abbildet und eine schnelle Reaktion auf Variationen von Zielgrößen oder Rahmenbedingungen ermöglicht.No optimization method has yet been disclosed, which depicts the complex network of relationships between the control variables and the target variables as a whole and enables a rapid response to variations of target parameters or framework conditions.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, dem Hersteller von Kollagenmatrices ein Verfahren in die Hand zu geben, welches ihm ermöglicht, im Prozess der Gefriertrocknung die vorgegebenen Zielgrößen der Kollagenmatrix definiert einzustellen und somit eine hohe Ausbeute an Material zu produzieren, welches die spezifizierten Kriterien erfüllt.The object of the invention is to provide the manufacturer of collagen matrices with a method which enables him, in the process of freeze-drying, to set the predetermined target values of the Set collagen matrix defined and thus produce a high yield of material that meets the specified criteria.
Die Aufgabe wird durch die Merkmale im Patentanspruch 1 gelöst. Weiterbildungen sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.The object is solved by the features in
Das Verfahren basiert auf drei aufeinander folgenden Verfahrensschritten: die gezielte Einstellung der Suspensionseigenschaften, der definierte Einfrierprozess und die schonende Gefriertrocknung der Suspension. Die Verfahrensschritte 2 und 3 lassen sich bei Schaffung geeigneter technischer Voraussetzungen, das heißt bei einem stabilen Übergang zwischen den Verfahrensschritten, zur Effizienzsteigerung der Fertigung miteinander kombinieren.The process is based on three consecutive process steps: the targeted adjustment of the suspension properties, the defined freezing process and the gentle freeze-drying of the suspension. The
Die besondere Aufgabe des Verfahrens zur Struktureinstellung dreidimensionaler Biomaterialmatrices auf Kollagenbasis besteht darin, dass sich die Regelgrößen für den Prozess der Gefriertrocknung in einem komplexen Beziehungsnetz auf die strukturellen Zielgrößen der Kollagenmatrix auswirken. Das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt über Methoden der statistischen Versuchsplanung die Einstellung der Regelgrößen für eine Serie von Vorversuchen, deren Ergebnisse in ein statistisches Prozessmodell einfließen, welches die Beziehungen zwischen den Zielgrößen und den Regelgrößen beschreibt. Diese Beziehungen geben für jede vorgegebene Kombination der strukturellen Zielgrößen eine konkrete Einstellung der Regelgrößen vor.The special task of the procedure for the structural adjustment of three-dimensional biomaterial matrices based on collagen is that the controlled variables for the process of freeze drying in a complex network of relationships affect the structural target parameters of the collagen matrix. The method according to the invention determines the setting of the controlled variables for a series of preliminary experiments by methods of statistical experimental design, the results of which are incorporated into a statistical process model which describes the relationships between the target variables and the controlled variables. These relationships specify a concrete setting of the controlled variables for each predefined combination of the structural target variables.
Das Verfahren zur Struktureinstellung ist für den Prozess des Einfrierens in allen handelsüblichen Industrieeinfriergeräten geeignet, in welchen eine Luftumwälzung und eine Temperaturregelung ausgebildet ist, und für alle wässrigen Dispersionen partikulär aufbereiteter Biopolymere, die den Zusatz anorganischer oder organischer Säuren erlauben.The structural adjustment method is suitable for the freezing process in all commercial industrial freezers in which air recirculation and temperature control are formed, and for all aqueous dispersions of particulate recycled biopolymers which permit the addition of inorganic or organic acids.
Die Besonderheit des Verfahrens besteht darin, dass es ermöglicht, verschiedene Struktureigenschaften der Kollagenmatrices durch gezielte Vorgabe von Regelgrößen festzulegen. Zu diesen Struktureigenschaften gehört etwa die räumliche Porenstruktur, die entweder in tubulär gerichteter oder polygonal ungerichteter Form ausgebildet werden kann. Tubulär gerichtete Poren sind im Schnittbild tunnelförmig und im Winkel von 90° zu den Oberflächen der erzeugten Matrix angeordnet. Bei Materialien, welche eine Sperrschicht enthalten, stehen die Poren näherungsweise senkrecht auf der Sperrschicht.The peculiarity of the method is that it makes it possible to determine various structural properties of the collagen matrices by specific specification of controlled variables. These structural properties include, for example, the spatial pore structure, which can be formed in either tubular or polygonal undirected form. Tubular pores are tunnel-shaped in the sectional view and are arranged at an angle of 90 ° to the surfaces of the matrix produced. For materials that include a barrier layer, the pores are approximately perpendicular to the barrier layer.
Die Alternative bilden die polygonal ungerichteten Poren, die von polygonaler, näherungsweise kugelförmiger Gestalt sind und eine ungerichtete schwammartige Matrixstruktur bilden, die morphologisch einem Polyederschaum entspricht. Ähnliche Strukturen finden sich bei der überwiegenden Mehrzahl der im Handel angebotenen Kollagenmatrices.The alternative is formed by the polygonal non-directional pores, which are of polygonal, approximately spherical shape and form a non-directional sponge-like matrix structure that morphologically corresponds to a polyhedron foam. Similar structures can be found in the vast majority of commercially available collagen matrices.
Die unterschiedlichen Materialstrukturen resultieren aus den verschiedenen Erstarrungsverhalten der wässrigen Suspension. Dendritische Eisbildung führt zu einer tubulären Porenstruktur, während globulitische Eisbildung in einer polygonalen Porenstruktur resultiert. Der Kristallisationsprozess wird bei ansonsten identischen Randbedingungen von der Unterkühlung der Suspension bestimmt und kann beim Einfrieren einer wässrigen Suspension über die Steuerung der Initialphase des Gefrierprozesses beeinflusst werden. Erfolgt vor dem Gefriertrockenprozess ein Ausgleichsschritt in Form einer kurzen Aufwärmehase, so resultiert eine tubuläre Materialstruktur, ohne diesen bilden sich – unter der Voraussetzung einer ausreichend hoch gewählten Gefrierrate – polygonale Poren. Der Ausgleichsschritt bedeutet, dass die Kollagensuspension anfänglich bis auf eine Temperatur zwischen –50°C bis –60°C abgekühlt wird, bevor die Temperatur im Gefriertrockner mit geringer Heizrate wieder auf etwa –30°C angehoben wird.The different material structures result from the different solidification behavior of the aqueous suspension. Dendritic ice formation leads to a tubular pore structure, while globulitic ice formation results in a polygonal pore structure. The crystallization process is determined under otherwise identical conditions by the supercooling of the suspension and can be influenced by the freezing of an aqueous suspension on the control of the initial phase of the freezing process. If a compensating step in the form of a short warm-up hare takes place before the freeze-drying process, a tubular material structure results, without which, assuming a sufficiently high rate of freezing, polygonal pores are formed. The equalizing step means that the collagen suspension is initially cooled down to a temperature between -50 ° C to -60 ° C before the temperature in the freeze-rate freeze dryer is raised again to about -30 ° C.
Von zentraler Bedeutung für den Einsatz einer Biopolymermatrix in der regenerativen Medizin oder Zeltkultur ist deren mittlere Porengröße. Diese beeinflusst das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Kultureigenschaften sogar in noch erheblicherem Maße als die eigentliche Materialstruktur. Die Porengröße wird von folgenden Prozessparametern in Kombination bestimmt: dem pH-Wert der Kollagensuspension, dem Material, aus dem die Einfrierbehälter gefertigt sind und die Gefrierrate, das heißt die Abkühlgeschwindigkeit der Suspension. Dabei können die als flache Schalen ausgebildeten Einfrierbehälter aus Materialien wie Metallen oder Kunststoffen bestehen, welche für den medizinischen Einsatz geeignet sind, wobei sich die thermischen Eigenschaften von Boden- und Deckelfläche gezielt variieren lassen. Andererseits kann auch die Abkühlgeschwindigkeit der Suspension gezielt eingestellt werden, sodass die Einfrierung beispielsweise mit einer exponentiellen oder konstanten Kühlrate erfolgt. Durch Einstellung dieser Prozessparameter sind üblicherweise Porengrößen von etwa 75 μm bis 375 μm zu erreichen.Of central importance for the use of a biopolymer matrix in regenerative medicine or tent culture is their mean pore size. This influences cell growth, cell differentiation and cultural properties even more than the actual material structure. The pore size is determined by the following process parameters in combination: the pH of the collagen suspension, the material from which the freezing containers are made, and the freezing rate, that is, the cooling rate of the suspension. In this case, designed as a flat shells Einfrierbehälter may consist of materials such as metals or plastics, which are suitable for medical use, with the thermal properties of the bottom and top surfaces can vary specifically. On the other hand, the cooling rate of the suspension can also be adjusted in a targeted manner, so that the freezing takes place, for example, with an exponential or constant cooling rate. By adjusting these process parameters usually pore sizes of about 75 microns to 375 microns can be achieved.
Eine bedeutende Eigenschaft dreidimensionaler Biomaterialien ist deren Porosität, das heißt das Verhältnis des Porenvolumens zu dem Gesamtvolumen der Kollagenmatrix. Die Porosität hat einen bedeutenden Anteil an der mechanischen Stabilität einer Matrix, bestimmt aber auch gleichzeitig wichtige Zellkultureigenschaften, wie die hydrolytische und enzymatische Degradationsbeständigkeit und damit die Zugänglichkeit für einwachsende Zellen sowie die Abbaudauer unter Kulturbedingungen. In der medizinischen Anwendung als regeneratives Biomaterial hat die Porosität Einfluss auf die Defektstabilität, Resorptionsgeschwindigkeit und Remodellingeigenschaften. Die Porosität wird allein über den Trockensubstanzgehalt der Suspension festgelegt und kann in der Regel in den Prozessgrenzen zwischen 95% und 99,5% eingestellt werden. An important property of three-dimensional biomaterials is their porosity, that is the ratio of the pore volume to the total volume of the collagen matrix. The porosity has a significant part in the mechanical stability of a matrix, but at the same time determines important cell culture properties, such as the hydrolytic and enzymatic degradation resistance and thus the accessibility for ingrowing cells and the degradation time under culture conditions. In medical application as a regenerative biomaterial, the porosity has an influence on the defect stability, absorption rate and remodeling properties. The porosity is determined solely by the dry matter content of the suspension and can usually be adjusted in the process limits between 95% and 99.5%.
Eine weitere Struktureigenschaft der Kollagenmatrix ist von diskreter Natur und betrifft die Matrixkontinuität und damit das Kriterium, ob die Matrix homogen strukturiert oder aus mehreren verschieden ausgebildeten Bereichen aufgebaut ist. Eine homogene Matrix weist eine durchgängige Materialstruktur auf, wobei die erzeugte Porenstruktur und Porengröße weitgehend unabhängig von der Position in der Kollagenmatrix im gesamten Materialquerschnitt gleich verteilt sind. Ein Großteil der marktgängigen Kollagenmatrices besitzt eine homogene Materialstruktur, Haupteinsatzfelder sind Wirkstoffapplikation, Wunddrainage, Blutstillung und unspezifischer Gewebeersatz.Another structural property of the collagen matrix is of a discrete nature and concerns the matrix continuity and thus the criterion of whether the matrix is homogeneously structured or composed of several different areas. A homogeneous matrix has a continuous material structure, wherein the generated pore structure and pore size are largely uniformly distributed throughout the material cross-section, largely independent of the position in the collagen matrix. Most of the commercially available collagen matrices have a homogenous material structure, the main fields of application are drug application, wound drainage, haemostasis and unspecific tissue replacement.
Bei der sogenannten Bi-Layer-Matrix ist hingegen der Gesamtkörper durch eine horizontale Schicht stark verdichteten, mikroporösen Materials in einen oberen und einen unteren Bereich getrennt. Sowohl die Lage dieser Trennschicht als auch die Porengrößen im oberen und unteren Materialbereich können getrennt voneinander definiert eingestellt werden. Sperrschichten können für einen begrenzten Zeitraum als Wachstumsbarriere für Zellen dienen und gestatten einen Einsatz derart hergestellter Kollagenmatrices in der gesteuerten Geweberegeneration, in der Co-Kultur verschiedener Zelltypen oder als Basis für die Herstellung von Gewebemodellen.In the case of the so-called bi-layer matrix, on the other hand, the entire body is separated into an upper and a lower region by a microporous material which is highly compressed in a horizontal layer. Both the position of this separating layer and the pore sizes in the upper and lower material region can be set to be defined separately from each other. Barrier layers may serve as a growth barrier for cells for a limited period of time, and allow for the use of such prepared collagen matrices in the controlled tissue regeneration, in the co-culture of various cell types, or as a basis for the production of tissue models.
Sperrschichten werden durch Gefrierkonzentration des Kollagens im sogenannten Ice Templating-Prozess an glatten Grenzflächen aufeinander treffender Eisfronten gebildet. Die Grenzflächeneigenschaften lassen sich durch die zur Einstellung des pH-Wertes verwendete Säure beeinflussen, wobei die Matrixkontinuität mit der Größe des Anions der Säure korreliert. Die Verwendung von hochmolekularer Essigsäure unterbindet eine Gefrierkonzentration und führt zu homogen strukturierten Materialien, während die Verwendung starker anorganischer Säuren, wie Salzsäure, zu einer Bi-Layer-Struktur führt.Barrier layers are formed by freeze concentration of the collagen in the so-called ice templating process at smooth interfaces of meeting ice fronts. The interfacial properties can be influenced by the acid used to adjust the pH, the matrix continuity correlating with the size of the anion of the acid. The use of high molecular weight acetic acid inhibits freezing concentration and results in homogeneously structured materials, while the use of strong inorganic acids, such as hydrochloric acid, results in a bi-layer structure.
Wichtig für den Einsatzzweck von Bi-Layer-Matrices ist die vertikale Lage der Sperrschicht; sie entscheidet in der Co-Kultur von Zellen über die Raumverhältnisse, welche verschiedenen Zelltypen für Wachstum und Gewebebildung zur Verfügung stehen. Im sogenannten Tissue Engineering definiert sie die resultierenden Gewebeeigenschaften und in der gesteuerten Geweberegeneration das Resultat des rekonstruktiven Eingriffs.Important for the use of bi-layer matrices is the vertical position of the barrier layer; In the co-culture of cells, it determines the spatial relationships available to various cell types for growth and tissue formation. In tissue engineering, she defines the resulting tissue properties and, in controlled tissue regeneration, the result of reconstructive surgery.
Technologisch gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten zur Variationen der Sperrschichtlage: Entweder werden materialspezifische Unterschiede in der Wärmeleitfähigkeit zur Erzeugung verschiedener Temperaturgradienten genutzt, sodass die Sperrschichtlage durch eine Kombination geeigneter Boden- und Deckmaterialien des Packmittels verschoben wird. Oder die Sperrschichtlage wird durch Ausnutzung unterschiedlicher Wärmeübergänge und unter Ausnutzung von Grenzflächeneffekten bei der Prozessierung im offenen Behälter beeinflusst. Dazu können die Schalen alternativ ohne Deckel oder mit Deckel aus demselben oder einem anderen, geeigneten Material eingefroren werden. Der Deckel der Schale kann auf der Außenseite zusätzlich mit einer Schicht eines isolierenden Materials versehen sein. Insgesamt kann somit die Kombination der Prozessparameter Gefrierrate, Packmaterial und Deckelung über die vertikale Lage der Sperrschicht entscheiden, welche üblicherweise zwischen 20% und 80% der Matrixhöhe ausgebildet sein kann.Technologically, there are two different ways to vary the barrier layer location: Either material-specific differences in thermal conductivity are used to produce different temperature gradients, so that the barrier layer layer is displaced by a combination of suitable bottom and cover materials of the packaging. Or the barrier layer is influenced by utilizing different heat transfer and by utilizing interface effects during processing in the open container. For this purpose, the shells can alternatively be frozen without a lid or with a lid made of the same or another suitable material. The cover of the shell may be additionally provided on the outside with a layer of insulating material. Overall, therefore, the combination of the process parameters freezing rate, packing material and capping can decide on the vertical position of the barrier layer, which can usually be formed between 20% and 80% of the matrix height.
Bei der Herstellung von Matrices mit horizontaler Sperrmembran können mit dem beschriebenen Verfahren in beiden durch die Sperrschicht räumlich getrennten Materialbereichen entweder Poren gleicher Größe oder Poren unterschiedlicher Größe hergestellt werden. Damit lassen sich bei der Herstellung von Trägermaterialien für die Co-Kultur verschiedener humaner Zelltypen die Poren im oberen und unteren Matrixbereich innerhalb gewisser Grenzen gezielt an die Bedürfnisse des jeweiligen Zelltyps anpassen, ohne gleichzeitig die Position der Sperrschicht zu beeinflussen. Technologisch gelingt dies wiederum durch die Kombination einer geeigneten Materialauswahl für die Gefrierschalen mit der Entscheidung für eine Prozessführung im offenen oder geschlossenen Behälter sowie durch eine geeignete Einstellung der Gefrierrate. Durch Variation dieser Prozessparameter konnten Porengrößenverhältnisse von etwa 1:1 bis 1:2 zwischen den beiden Seiten der Sperrschicht erzielt werden.In the production of matrices with a horizontal barrier membrane, either pores of the same size or pores of different sizes can be produced in the two regions of material spatially separated by the barrier layer using the described method. In this way, in the production of support materials for the co-culture of various human cell types, the pores in the upper and lower matrix region can be specifically adapted to the needs of the respective cell type within certain limits, without simultaneously influencing the position of the barrier layer. Technologically, this in turn is achieved by combining a suitable selection of materials for the freezers with the decision for a process in open or closed container and by a suitable adjustment of the freezing rate. By varying these process parameters, pore size ratios of about 1: 1 to 1: 2 could be achieved between the two sides of the barrier layer.
In der Planung des Prozesses erfolgt zunächst die Festlegung der diskreten Struktureigenschaften Matrixkontinuität und Porenstruktur. Beide Struktureigenschaften sind unabhängig von anderen Struktureigenschaften der zu erzeugenden Matrix auf zwei Niveaus beeinflussbar. Die Festlegung der gewünschten Matrixkontinuität erfolgt durch die Wahl des zur Aufbereitung des neutralen Rohkollagens eingesetzten Säuretyps. Die Porenstruktur wird über das Einschalten eines Vorkühlschrittes festgelegt, der dem Ice Templating-Prozess vorgeschaltet ist. Als dritte Struktureigenschaft wird der kontinuierliche Prozessparameter Porosität über den Trockensubstanzgehalt der Kollagensuspension festgelegt, der keinen Einfluss auf weitere Struktureigenschaften hat. In the planning of the process, the determination of the discrete structural properties of matrix continuity and pore structure takes place. Both structural properties can be influenced independently of other structural properties of the matrix to be generated at two levels. The desired matrix continuity is determined by the choice of the type of acid used for processing the neutral raw collagen. The pore structure is determined by switching on a pre-cooling step, which precedes the ice templating process. As a third structural property, the continuous process parameter porosity is determined by the dry matter content of the collagen suspension, which has no influence on further structural properties.
Bei den Parametern Säuretyp, Vorkühlprozess und Trockenmassegehalt der Kollagensuspension handelt es sich jeweils um frei wählbare Prozessparameter, deren Änderung jeweils nur eine Zielgröße spezifisch beeinflusst. Alle weiteren Struktureigenschaften sind nicht unabhängig beeinflussbar, sondern korrelieren jeweils mit mehreren Prozessgrößen, wobei sich wechselseitige Abhängigkeiten ergeben.The parameters acid type, pre-cooling process and dry matter content of the collagen suspension are each freely selectable process parameters, the change of which only specifically influences one target variable at a time. All other structural properties can not be influenced independently, but correlate with several process variables, with mutual dependencies.
In der folgenden Tabelle ist eine Prozesseinflussmatrix dargestellt, in der alle Einflussgrößen zur Prozesssteuerung und die von ihnen beeinflussten Struktureigenschaften unter Berücksichtigung bestehender Wechselwirkungen, dargestellt sind. Zu beachten ist, dass vier kontinuierlichen Prozessgrößen ein komplexes Beziehungsnetz zu vier weiteren strukturellen Zielgrößen ausbilden.The following table shows a process influence matrix, in which all influencing factors for process control and the structural properties influenced by them are shown taking into account existing interactions. It should be noted that four continuous process variables form a complex network of relationships with four further structural targets.
Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Struktureinstellung dreidimensionaler Biomaterialmatrices auf Kollagenbasis, wobei die Matrices durch Gefriertrocknung von Kollagensuspensionen hergestellt werden. Ihr liegt die Konzeption zu Grunde, dass das Verfahren auf einem statistischen Prozessmodell basiert, durch das aus vorgegebenen strukturellen Zielgrößen der Kollagenmatrix die Einstellung von Regelgrößen für den Prozess der Gefriertrocknung erfolgt, wobei die Zielgrößen eine oder mehrere der folgenden Größen umfassen:
- • die räumliche Struktur der Poren,
- • die mittlere Porengröße,
- • das Verhältnis des Porenvolumens zum Gesamtvolumen der Matrix,
- • das Vorhandensein einer Sperrschicht in der Kollagenmatrix,
- • die vertikale Lage der Sperrschicht, falls vorhanden und
- • das Porengrößenverhältnis auf beiden Seiten der Sperrschicht, falls vorhanden.
- • the spatial structure of the pores,
- The average pore size,
- The ratio of the pore volume to the total volume of the matrix,
- The presence of a barrier layer in the collagen matrix,
- • the vertical position of the barrier layer, if present and
- • the pore size ratio on both sides of the barrier, if any.
Gekennzeichnet ist die Lösung dadurch, dass das Verfahren Methoden der statistischen Versuchsplanung enthält, welche auch als DoE, Design of Experiment, bezeichnet wird und durch welche die Einstellung der Regelgrößen für eine Serie von Vorversuchen erfolgen. Anhand der interessierenden Zielgrößen und des Typs der zu variierenden Regelgrößen, ob kontinuierlich oder diskret variierbar, wird entweder ein zusammengesetztes orthogonales oder ein D-optimales DoE gewählt. Nach diesem DoE wird eine Serie von etwa 25 Vorversuchen gefahren, wobei die Prozessparameter von Versuch zu Versuch geändert werden. Die gefertigten Produktchargen werden in Bezug auf die resultierenden Struktureigenschaften bewertet.The solution is characterized by the fact that the method contains methods of statistical experimental design, which is also referred to as DoE, Design of Experiment, and by which the adjustment of the controlled variables for a series of preliminary tests. Based on the target quantities of interest and the type of control variable to be varied, whether continuously or discretely variable, either a composite orthogonal or a D-optimal DoE is selected. After this DoE, a series of about 25 preliminary tests is run, with the process parameters being changed from experiment to experiment. The manufactured product batches are evaluated in terms of the resulting structural properties.
Es hat sich als zweckmäßig und vorteilhaft erwiesen, dass das Verfahren aus den strukturellen Zielgrößen der Kollagenmatrix die Einstellung einer oder mehrerer der folgenden Regelgrößen für die Serie von Vorversuchen bestimmt:
- • den Säuretyp in der Kollagensuspension,
- • den pH-Wert der Kollagensuspension,
- • die Trockensubstanzgehalt der Kollagensuspension,
- • das Vorhandensein einer Unterkühlung,
- • die Gefrierrate des Gefriertrocknungsprozesses,
- • das Material des Kollagenbehälters und
- • den Öffnungszustand des Behälters.
- The type of acid in the collagen suspension,
- The pH of the collagen suspension,
- The dry matter content of the collagen suspension,
- The presence of hypothermia,
- The freezing rate of the freeze-drying process,
- • the material of the collagen container and
- • the opening condition of the container.
Besonders vorteilhaft ist es, dass das Verfahren ein statistisches Prozessmodell enthält, in das die Ergebnisse der Vorversuche einfließen, und welches die Beziehungen zwischen den Regelgrößen und den Zielgrößen für den Prozess der Gefriertrocknung beschreibt. Das statistische Prozessmodell basiert auf das gewählte DoE und bildet die Beziehungen als mathematischen Zusammenhang ab.It is particularly advantageous that the method contains a statistical process model, in which the results of the preliminary tests are incorporated, and which describes the relationships between the controlled variables and the target variables for the process of freeze-drying. The statistical process model is based on the chosen DoE and depicts the relationships as a mathematical relationship.
Als besonderer Vorteil der erfinderischen Lösung ist anzuführen, dass die Beziehungen zwischen den Regelgrößen und den Zielgrößen, welche durch das statistische Prozessmodell beschrieben werden, für jede vorgegebene Kombination der strukturellen Zielgrößen eine konkrete Einstellungen der Regelgrößen vorgibt. Mit anderen Worten: zur Beschreibung jedes neuen Prozessraumes ist die einmalige Erstellung eines DoE's notwendig, damit erhält das aufgestellte Modell unbegrenzte Gültigkeit für den beschriebenen Prozessraum.A particular advantage of the inventive solution is that the relationships between the controlled variables and the target variables, which are described by the statistical process model, specify a specific setting of the controlled variables for each predefined combination of the structural target variables. In other words: for the description of each new process space, the unique creation of a DoE is necessary, so that the established model receives unlimited validity for the described process space.
Das beschriebene Verfahren führt zu Verbesserungen gegenüber Lösungen aus dem Stand der Technik, indem das Verfahren erlaubt, den Prozess des Einfrierens in handelsüblichen Industrieeinfriergeräten stattfinden zu lassen, in welchen eine Luftumwälzung und eine Temperaturregelung ausgebildet ist. Die Einfrierung der Kollagensuspensionen erfordert keinerlei patentierte oder kostenintensive Spezialtechnik. Eine einzige Anforderung an die Gerfiergeräte betrifft den Wärmeaustrag aus den Kollagensuspensionen, welcher derart über einen kühlenden Luftstrom erfolgen soll, dass den Boden- und Deckflächen der Behälter gleichmäßig Wärme entzogen wird, um einen symmetrischen Gefrierprozess zu ermöglichen.The method described leads to improvements over prior art solutions by allowing the process to take place the process of freezing in commercial industrial freezers in which air circulation and temperature control are formed. The freezing of the collagen suspensions does not require any patented or expensive special technique. A single requirement of the Gerfiergeräte relates to the heat emanation from the collagen suspensions, which should be such a cooling air flow that the bottom and top surfaces of the container is uniformly removed heat to allow a symmetrical freezing process.
Die Erfindung wird vorteilhaft dadurch komplettiert, dass das Verfahren zur Struktureinstellung für alle wässrigen Dispersionen partikulär aufbereiteter Biopolymere und alle wässrigen Lösungen makromolekularer Substanzen, die den Zusatz anorganischer oder organischer Säuren erlauben, anwendbar ist. Ebenso ist das Verfahren auf alle Biopolymer-Komposite anwendbar, die sich aus der Herstellung von Kollagensuspensionen mit Zusätzen löslicher Biopolymere oder aus einer Lösung aus mehreren Biopolymeren ergeben.The invention is advantageously completed by the fact that the method for structural adjustment for all aqueous dispersions particulate recycled biopolymers and all aqueous solutions macromolecular substances that allow the addition of inorganic or organic acids, is applicable. Similarly, the method is applicable to all biopolymer composites resulting from the preparation of collagen suspensions with additions of soluble biopolymers or from a solution of several biopolymers.
Mittels geeigneter DoE-Software, beispielsweise Design-Expert, STAVEX oder MODDE, können für jede gewünschte Kombination von Zielgrößen passende Einstellwerte der Regelgrößen aus dem Modell ermittelt werden. Bei der gezielten Einstellung der gewünschten Materialstruktur unter den beschriebenen Bedingungen lassen sich technische oder wirtschaftliche Grenzen der Prozessführung berücksichtigen. Diese gezielte Einstellung kann ohne Beeinflussung der chemischen Eigenschaften der Matrix und ohne eine Änderung des grundlegenden Herstellungsverfahrens durch die Vorauswahl geeigneter Packmittel und die Variation der Prozessparameter vorgenommen werden.By means of suitable DoE software, for example Design-Expert, STAVEX or MODDE, suitable setting values of the controlled variables can be determined from the model for each desired combination of target variables. The targeted setting of the desired material structure under the conditions described allows technical or economical limits of the process to be taken into account. This targeted adjustment can be made without affecting the chemical properties of the matrix and without changing the basic manufacturing process through the pre-selection of suitable packaging and the variation of the process parameters.
Der Begriff Prozessraum umfasst hier die Grenzen des gesamten Herstellungsverfahrens. Dazu gehören: ein definiertes Rohkollagen konstanter Qualität, eine definierte Verfahrensstrecke und ein definiertes technisches Verfahren zur Herstellung von Kollagen- oder Kompositmaterialien. Dies ist also die üblicherweise ohnehin unveränderte Rohstoffbasis und technische Ausstattung eines Herstellers sowie das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren, welches an die technischen Gegebenheiten des Herstellers angepasst wird. Auf diese Weise lassen sich innerhalb der benannten Grenzen beliebige Strukturänderungen der hergestellten Kollagenmatrix durchführen, ohne zulassungspflichtige Änderungen am Herstellungsverfahren oder den verwendeten Rohstoffen oder technischen Mitteln durchzuführen.The term process space here encompasses the limits of the entire manufacturing process. These include: a defined raw collagen of constant quality, a defined process path and a defined technical process for the production of collagen or composite materials. So this is the usually already unchanged raw material base and technical equipment of a manufacturer as well as the manufacturing method according to the invention, which is adapted to the technical conditions of the manufacturer. In this way, any structural changes of the collagen matrix produced can be carried out within the specified limits without carrying out changes in the manufacturing process or the raw materials or technical means which are subject to approval.
Es ist für die Praxis von besonderem Vorteil, dass das Verfahren die Produktion strukturell sehr verschiedenartiger und bedarfsangepasster dreidimensionaler Kollagenmatrices durch die Prozesssteuerung über ein statistisches Prozessmodell ermöglicht, insbesondere unter einfachen und industrieüblichen Prozessbedingungen. Dieses wird über einen festgelegten statistischen Versuchsplan erstellt und bildet erstmals die Zusammenhänge zwischen den benannten Regelgrößen und strukturellen Zielgrößen ab. Die modellbasierte Prozesskontrolle ermöglicht bei Anwendung auf das beschriebene Herstellungsverfahren die Variation von Struktureigenschaften in einem äußerst breiten Rahmen und mit einer sehr hohen Reproduzierbarkeit. Da die Herstellung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem einzigen, geschlossen zulassungsfähigen Produktionsprozess erfolgt, kann die Produktpalette schnell ohne weitgehenden Forschungsaufwand und ohne mehrfache neue Verfahrenszulassungen an die aktuelle Marktsituation angepasst werden.It is of particular advantage in practice that the method enables the production of structurally very diverse and demand-adapted three-dimensional collagen matrices by process control via a statistical process model, in particular under simple and industry-standard process conditions. This is created using a defined statistical test plan and for the first time maps the relationships between the named controlled variables and structural targets. The model-based process control, when applied to the described manufacturing method, allows the variation of structural properties in a very wide range and with a very high reproducibility. Because the Manufactured by the process according to the invention in a single, closed zulassungsfähigen production process, the product range can be adapted quickly without extensive research and without multiple new process approvals to the current market situation.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile von Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:Further details, features and advantages of embodiments of the invention will become apparent from the following description of exemplary embodiments with reference to the accompanying drawings. Show it:
Die
In der
In
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- 11
- Kollagenmatrixcollagen matrix
- 22
- homogene Matrixhomogeneous matrix
- 33
- Sperrschichtjunction
- 44
- gerichtete Porenstrukturdirected pore structure
- 55
- tubuläre Porentubular pores
- 1010
- vorgegebene Zielgrößepredetermined target size
- 1111
- Methoden der statistischen Versuchsplanung, Design of Experiment (DoE)Methods of Statistical Experiment Design, Design of Experiment (DoE)
- 1212
- Regelgrößen für die Serie der VorversucheControlled variables for the series of preliminary tests
- 1313
- Serie der VorversucheSeries of preliminary tests
- 1414
- Ergebnisse der VorversucheResults of the preliminary tests
- 1515
- statistisches Prozessmodellstatistical process model
- 1616
- Beziehungsnetz zwischen Zielgrößen und RegelgrößenRelationship network between target variables and controlled variables
- 1717
- Einstellung der RegelgrößenSetting the controlled variables
- 2020
- Gefrierratefreezing rate
- 2121
- pH-WertPH value
- 2222
- mittlere Porengrößeaverage pore size
Claims (7)
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
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|---|---|
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Family
ID=50235604
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE201310104880 Active DE102013104880B3 (en) | 2012-10-23 | 2013-05-13 | Structure adjustment of three-dimensional collagen-based biomaterial matrices, comprises adjusting the control variables e.g. average pore size for freeze-drying from predetermined structural target sizes of collagen matrix |
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|---|---|
| DE (1) | DE102013104880B3 (en) |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| DE4028622A1 (en) * | 1990-09-08 | 1992-03-12 | Suwelack Nachf Dr Otto | Prepn. of collagen sponges for cosmetic and pharmaceutical use - by alkali treatment to denature surface, acid treatment, washing comminution, freezing and freeze drying |
| DE60125099T2 (en) * | 2000-06-23 | 2007-06-28 | Ethicon, Inc. | Process for producing microstructured foams |
| US20090186408A1 (en) * | 2008-01-18 | 2009-07-23 | National Taiwan University | Biocompatible bilayer porous matrix and preparation thereof |
-
2013
- 2013-05-13 DE DE201310104880 patent/DE102013104880B3/en active Active
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|---|---|---|---|
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