DE10201228A1

DE10201228A1 - New 10-benzylidene-9(10H)-anthracenones, are tubulin polymerization inhibitors useful for treating proliferative diseases, e.g. psoriasis, protozoal infections or especially cancer

Info

Publication number: DE10201228A1
Application number: DE10201228A
Authority: DE
Inventors: Helge Prinz; Kazuo Umezawa; Eberhard Unger; Angelika Burger; Jochen Prehn
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-15
Filing date: 2002-01-15
Publication date: 2003-07-24

Abstract

10-(Optionally substituted benzylidene)-9(10H)-anthracenones (I) are new. Benzylidene-anthracenones of formula (I) are new. R1 - R4 = H, 1-6C alkoxy, 1-6C alkyl, aryloxy, COOH, SO3H, SO3M', ester or thioester residue, CN, acyl, aryloxy, phenylmethoxy, NO2, OH, NH2, imino, SH, halo,OP(O)(OM')2, NP(O)(OM')2 or NP(O)(OR)2; M' = cation; and R = 1-8C alkyl, benzyl or aryl.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Hemmstoffe der Tubulinpolymerisation. Es handelt sich um Benzyliden-9(10H)anthracenone und deren Derivate als anti-Tumor wirksame Verbindungen. The present invention relates to novel inhibitors of tubulin polymerization. It is benzylidene-9 (10H) anthracenone and its derivatives as an anti-tumor effective connections.

Background of the Invention

Krebs stellt eine der größten Gesundheitsbedrohungen der Menschheit dar, und, deshalb werden beträchtliche Anstrengungen hinsichtlich der Entwicklung neuer Chemotherapeutika für eine potentere und spezifischere anti-Krebs-Therapie unternommen. Das augenfälligste und medizinisch bedeutsamste Merkmal von Krebszellen ist deren unkontrollierte Vermehrung. Die zelluläre Proliferation ist ein Resultat der Zellteilung oder Mitose. Cancer is one of the greatest health threats to humanity, and, therefore will make considerable efforts to develop new chemotherapy drugs for a more potent and specific anti-cancer therapy. The most striking and the most medically significant characteristic of cancer cells is their uncontrolled Proliferation. Cellular proliferation is a result of cell division or mitosis.

Mikrotubuli besitzen eine herausragende Bedeutung für verschiedenste Funktionen der Zelle, darunter etwa die Mitose, die Bewegung der Zelle, Zellform sowie auch für den Transport von Organellen innerhalb der Zelle. Bei den Mikrotubuli handelt es sich um eine eigene Klasse von Zytoskelett-Bestandteilen. Die Bedeutung der Mikrotubuli für das zelluläre Leben und speziell für die Zellteilung und damit verbunden für die Induktion und das Fortschreiten der Apoptose machen sie zu einem der attraktivsten therapeutischen Targets für die Entwicklung neuer Verbindungen mit Bedeutung für die anti-Krebs-Chemotherapie. Tubulin zusammen mit seinen Isoformen bildet den Hauptbestandteil der Mikrotubuli und existiert seinerseits als Heterodimer der beiden globulären Polypeptiduntereinheiten α- und β-Tubulin. Beide Peptide besitzen eine molekulare Masse zwischen 50-55. Unter physiologischen Bedingungen polymerisiert das Tubulin zu Mikrotubuli. Im Zuge des Einbaus des αβ-Dimers in den Mikrotubulus bindet das Hetrodimer zwei Moleküle Guanosintriphosphat (GTP) und hydrolysiert eines davon zu GDP und anorganischem Phosphat. Elektronenmikroskopische Untersuchungen und Röntgenstrukturanalysen belegten den Aufbau des Mikrotubulus aus 13 parallelen, versetzt angeordneten Protofilamenten, die einen Hohlraum umschließen. Mikrotubuli werden ständig auf- und abgebaut, sie zeigen eine dynamische Instabilität. Für zahlreiche natürlich vorkommende antimitotisch wirksame Verbindungen konnte gezeigt werden, dass sie ihren Effekt durch eine Bindung an das Tubulin ausüben. Die sogenannten MAPs ("mikrotubuli-assoziierte Proteine") oder andere in das Geschehen der Mitose involvierte Proteine spielen hier eine eher untergeordnete Rolle. Allgemein kennt man drei Hauptklassen antimitotisch wirksamer Verbindungen. Es handelt sich einmal um Mikrotubuli- stabilisierende Verbindungen, um Substanzen die an die Vinca-Alkaloid-Bindestelle binden sowie um Substanzen die an der Colchicin-Bindestelle angreifen. Erstere wirken durch Bindung und somit Blockade der Depolymerisation, die beiden zuletzt genannten Verbindungsklassen entfalten ihre Wirkung dagegen primär durch eine Hemmung der Tubulin-Polymerisation. Einige klinisch vielversprechende Substanzen mit dokumentierter zytotoxischer und anti-Tumor-Wirkung wirken durch eine Interaktion mit dem Prozess der Mikrotubuli-Assemblierung-Disassemblierung oder der Mikrotubulidynamik, was letztlich zu einer Blockade des Zellzyklus in der Mitosephase sowie zur Induktion von Apoptose führt. Unter den bedeutendsten anti-Mikrotubuli wirksamen Substanzen zur Krebstherapie befinden sich die Vinca-Alkaloide, so z. B. das Vinblastin und das Vincristin sowie die neueren Taxane wie das Paclitaxel (Taxol) und das Docetaxel (Taxotere), welche erfolgreich in die klinische Onkologie eingeführt wurden. Beim Colchicin handelt es sich um eine, weitere wichtige, antimitotisch wirksame Substanz. Obwohl Colchicin auf Grund des sehr kleinen therapeutischen Fensters eine nur sehr eingeschränkte medizinische Anwendbarkeit besitzt, spielte die Substanz eine fundamentale Rolle bei der Aufklärung der Eigenschaften und Funktionen des Tubulins und der Mikrotubuli. Weiterhin üben die Naturstoffe Rhizoxin¹, Combretastatin A-4 and A-2^2,3, Curacin A, Podophyllotoxin⁴, die Epothilone A and B⁵ und das Dolastatin⁶ sowie einige synthetische Verbindungen wie das Phenstatin, die 2- Styrylchinazolin-4(3H)-one⁷ und hoch oxygenierte Derivate von cis- and trans-Stilbenen⁸ ihre zytotoxischen Eigenschaften über eine Bindungsinteraktion mit dem Tubulin aus. Die spezifischen Interaktionen mit der Bindungsstelle sind in vielen Fällen nicht vollständig bekannt und für eine ganze Anzahl von Tubulin-bindenden Substanzen weitestgehend unbekannt. Microtubules are extremely important for a wide variety of cell functions, including mitosis, cell movement, cell shape and the transport of organelles within the cell. The microtubules are a separate class of cytoskeletal components. The importance of microtubules for cellular life and especially for cell division and the associated induction and progression of apoptosis make them one of the most attractive therapeutic targets for the development of new compounds with importance for anti-cancer chemotherapy. Tubulin together with its isoforms forms the main component of the microtubules and in turn exists as a heterodimer of the two globular polypeptide subunits α- and β-tubulin. Both peptides have a molecular mass between 50-55. Under physiological conditions the tubulin polymerizes to microtubules. As the αβ dimer is incorporated into the microtubule, the heterodimer binds two molecules of guanosine triphosphate (GTP) and hydrolyzes one of them to form GDP and inorganic phosphate. Electron microscopic examinations and X-ray structure analyzes confirmed the structure of the microtubule from 13 parallel, staggered protofilaments that enclose a cavity. Microtubules are constantly being built up and broken down, they show dynamic instability. It has been shown for numerous naturally occurring antimitotic compounds that they exert their effect by binding to the tubulin. The so-called MAPs ("microtubule-associated proteins") or other proteins involved in the occurrence of mitosis play a rather subordinate role here. There are three main classes of antimitotic compounds. On the one hand, there are microtubule-stabilizing compounds, substances which bind to the Vinca alkaloid binding site and substances which attack the colchicine binding site. The former act by binding and thus blocking the depolymerization, the latter two classes of compounds, on the other hand, exert their effect primarily by inhibiting tubulin polymerization. Some clinically promising substances with documented cytotoxic and anti-tumor effects act through an interaction with the process of microtubule assembly-disassembly or microtubule dynamics, which ultimately leads to a blockage of the cell cycle in the mitotic phase and the induction of apoptosis. Vinca alkaloids are among the most important anti-microtubule active substances for cancer therapy. B. vinblastine and vincristine and the newer taxanes such as paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere), which have been successfully introduced into clinical oncology. Colchicine is another important anti-mitotic substance. Although colchicine has only very limited medical applicability due to the very small therapeutic window, the substance played a fundamental role in elucidating the properties and functions of tubulin and microtubules. The natural substances rhizoxin ¹ , combretastatin A-4 and A-2 ^2,3 , curacin A, podophyllotoxin ⁴ , epothilones A and B ⁵ and dolastatin ⁶ as well as some synthetic compounds such as phenstatin, 2-styrylquinazolin-4 3H) -one ⁷ and highly oxygenated derivatives of cis- and trans-stilbenes ⁸ exert their cytotoxic properties through a binding interaction with the tubulin. In many cases, the specific interactions with the binding site are not fully known and are largely unknown for a large number of tubulin-binding substances.

Subject of the invention

Die gegenwärtige Erfindung betrifft neue Inhibitoren der Tubulinpolymerisation mit Anthracenonstruktur sowie deren Analoga. Es wurde nun gefunden, dass bestimmte Benzyliden-9(10H)anthracenone potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind und daher zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die mit einer erhöhten zellulären Proliferation einhergehen. Die erfindungsgemäßen Tubulin-bindenden Substanzen können somit beispielsweise als wirkungsvolle anti-Krebs wirksame Verbindungen fungieren. The present invention relates to new inhibitors of tubulin polymerization Anthracenone structure and its analogues. It has now been found that certain Benzylidene-9 (10H) anthracenone are potent inhibitors of tubulin polymerization and are therefore suitable for the treatment of diseases with an increased cellular Proliferation. The tubulin-binding substances according to the invention can thus, for example, act as effective anti-cancer compounds.

Brief description of the pictures

Die folgenden Abbildungen sind Bestandteil der vorliegenden Patentschrift und dienen dem besseren Verständnis sowie der Spezifizierung der gegenwärtigen Erfindung. The following images are part of the present specification and serve the better understanding and specification of the present invention.

Abb. 1 zeigt ein representatives Reaktionsschema, für die Synthese der erfindungsgemäßen Benzyliden-9(10H)-anthracenone. Fig. 1 shows a representative reaction scheme for the synthesis of the benzylidene-9 (10H) -anthracenones according to the invention.

Abb. 2 zeigt den Effekt von Verbindung 8 auf das Wachstum humaner chronisch myelogener K562 Zellen. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindung über einen Zeiraum von 48 h behandelt und die zellzahl mittels Coulter Counter bestimmt. Der 100% Wert entspricht einer Zellzahl von 1.20 × 10⁶ K562-Zellen pro ml. Die Werte repräsentieren das Mittel ±SD (Standardabweichung) aus sechs Proben; Balken, SD. Fig. 2 shows the effect of compound 8 on the growth of human chronic myelogenic K562 cells. The cells were treated with different concentrations of the compound over a period of 48 h and the cell number was determined using a Coulter Counter. The 100% value corresponds to a cell number of 1.20 × 10 ⁶ K562 cells per ml. The values represent the mean ± SD (standard deviation) from six samples; Bars, SD.

Abb. 3 zeigt den Effekt der Verbindungen 7 and 8 auf die Zellviabilität von K562- Zellen. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen über einen Zeitraum von 24 h and 48 h inkubiert. Nach dem Ende der Inkubationszeit wurde die Zellviabilität mittels der Trypan Blau-Ausschlussmethode bestimmt. Die Werte repräsentieren die Mittelwerte ±SD von vier Proben; Balken, SD. Fig. 3 shows the effect of compounds 7 and 8 on the cell viability of K562 cells. The cells were incubated with different concentrations of the compounds to be tested over a period of 24 h and 48 h. At the end of the incubation period, cell viability was determined using the Trypan blue exclusion method. The values represent the mean ± SD of four samples; Bars, SD.

Abb. 4 zeigt die Induktion morphologischer Veränderungen in K562-Zellen. K562 Zellen wurden ohne (A) inkubiert, mit 0.1 µg/ml 8 (B) oder mit 0.1 µg/ml Vinblastinsulfat (C) über einen Zeitraum von 24 h bei 37°C inkubiert und anschließend unter einem Phasenkontrastmikroskop fotografiert. Fig. 4 shows the induction of morphological changes in K562 cells. K562 cells were incubated without (A), with 0.1 µg / ml 8 (B) or with 0.1 µg / ml vinblastine sulfate (C) over a period of 24 h at 37 ° C and then photographed under a phase contrast microscope.

Abb. 5 zeigt den Effekt von Verbindung 8 sowie des Standards Vinblastinsulfat auf die DNA-Verteilung in K562 Zellen (24 h Experiment). K562 Zellen wurden mit 0.1 µg/ml Vinblastinsulfat (A) behandelt bzw. mit 0.1 µg/ml und 0.01 µg/ml an Verbindung 8 (B, C) inkubiert oder unbehandelt belassen (D). Die Zellen wurden anschließend isoliert und die Verteilungsmuster des DNA-Gehaltes durch Durchflusszytometrie mittels eines Epics Systems bestimmt (Coulter Electronics, Hialeah, FL. U.S.A.). Fig. 5 shows the effect of compound 8 and the standard vinblastine sulfate on the DNA distribution in K562 cells (24 h experiment). K562 cells were treated with 0.1 µg / ml vinblastine sulfate (A) or incubated with 0.1 µg / ml and 0.01 µg / ml of compound 8 (B, C) or left untreated (D). The cells were then isolated and the distribution pattern of the DNA content was determined by flow cytometry using an Epics system (Coulter Electronics, Hialeah, FL. USA).

Abb. 6 zeigt den Effekt von Verbindung 8 auf die Verteilung des Tubulins in K562 Zellen. K562 Zellen wurden mit 0.1 µg/ml und 0.03 µg/ml von Verbindung 8 über eine Zeitraum von 24 h behandelt. Vinblastinsulfat wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann in Gegenwart von 4 µg/ml Paclitaxel isoliert, wie inj Beispiel 7 beschrieben in lösliche und unlösliche Fraktionen getrennt; und eine Western Blot Analyse für α-Tubulin durchgeführt.
P: Pellet (polymerisierte Fraktion), S: Überstand (lösliche Fraktion). Fig. 6 shows the effect of compound 8 on the distribution of tubulin in K562 cells. K562 cells were treated with 0.1 µg / ml and 0.03 µg / ml of compound 8 over a period of 24 h. Vinblastine sulfate was used as a positive control. The cells were then isolated in the presence of 4 µg / ml paclitaxel, as described in Example 7, separated into soluble and insoluble fractions; and a Western blot analysis was carried out for α-tubulin.
P: pellet (polymerized fraction), S: supernatant (soluble fraction).

Abb. 7 zeigt den dosisabhängigen Effekt von Verbindung 8 auf die Verteilung des Tubulins in K562 Zellen. K562 Zellen wurden mit 0.1, 0.01 and 0.001 µg/ml von Verbindung 8 über einen Zeitraum von 24 h behandelt. Die Zellen wurden dann in Gegenwart von 4 µg/ml Paclitaxel isoliert, wie in Beispiel 7 beschrieben in lösliche und unlösliche Fraktionen separiert und dann eine Western Blot Analyse für das α-Tubulin durchgeführt. P: Pellet (polymerisierte Fraktion), S: Überstand (lösliche Fraktion). Fig. 7 shows the dose-dependent effect of compound 8 on the distribution of tubulin in K562 cells. K562 cells were treated with 0.1, 0.01 and 0.001 µg / ml of compound 8 over a period of 24 h. The cells were then isolated in the presence of 4 μg / ml paclitaxel, separated into soluble and insoluble fractions as described in Example 7, and a Western blot analysis was then carried out for the α-tubulin. P: pellet (polymerized fraction), S: supernatant (soluble fraction).

Abb. 8 zeigt die Assemblierung des Tubulins in PIPES-Puffer bei pH = 6.8 und 37°C. Die Tubulinkonzentration beträgt 1.1 × 10^-5 M. Fig. 8 shows the assembly of the tubulin in PIPES buffer at pH = 6.8 and 37 ° C. The tubulin concentration is 1.1 × 10 ^-5 M.

Detailed description of the invention

Gegenstand der Erfindung sind 10-Benzyliden-Verbindungen der allgemeinen Formel I,

worin die erfindungsgemäßen Verbindungen einen oder mehrere Substituenten (R1-R4) enthalten. Bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung sind die in Tabelle I dargestellten sowie die in den Beispielen exemplarisch aufgeführten Verbindungen. Eine besonders bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel I ist diejenige mit R1 = OH and R2 = OCH₃. The invention relates to 10-benzylidene compounds of the general formula I,

wherein the compounds of the invention contain one or more substituents (R1-R4). Preferred compounds according to the invention are the compounds shown in Table I and the compounds listed by way of example in the examples. A particularly preferred compound of general formula I is that with R1 = OH and R2 = OCH ₃ .

Representativ für die erfindungsgemäßen Verbindungen stehen die im Folgenden aufgeführten:
10-Benzylidene-9(10H)-anthracenon (1); 10-[(4-Methoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (2); 10-[(3,4-Dimethoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (3); 10-[(3,4-Dihydroxy- benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (4); 10-[(3,5-Dimethoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (5); 10-[(3,4,5-Trimethoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (6); 10-[(2-Hydroxy-4- methoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (7); 10-[(3-Hydroxy-4-methoxy-benzyliden)]- 9(10H)-anthracenon (8); 10-[(2-Hydroxy-3-methoxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (9) 10-[(3-Methoxy-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (10) 10-[(3,5-Dimethoxy-4- hydroxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (11); 10-[(3,5-Dimethyl-4-hydroxy-benzyliden)]- 9(10H)-anthracenon (12); 10-[(3-Carbomethoxy-4-hydroxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (13); 10-[(3,5-Dibromo-4-hydroxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (14); 10-[(3,4-Dichlorobenzyliden)]-9(10H)-anthracenon (15); 10-[(2,4-Dimethoxy-3-Hydroxy-benzyliden)]-9(10H)- anthracenon (16); 10-[(3,5-bis-tert.Butyl-4-hydroxy-benzyliden)]-(10H)-anthracenon (17); 10-[(3,4-Methylenedioxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (18); 10-[(4-Benzyloxy- benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (19); 10-[(4-Hydroxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (20); 10-[(3,4,5-Trihydroxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (21); 10-[(4-Trifluormethyl- benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (22); 10-[(4-Nitro-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (23); 10-[(4-Ethoxycarbonyl-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (24) The following are representative of the compounds according to the invention:
10-benzylidene-9 (10H) anthracenone (1); 10 - [(4-methoxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (2); 10 - [(3,4-dimethoxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (3); 10 - [(3,4-dihydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (4); 10 - [(3,5-dimethoxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (5); 10 - [(3,4,5-trimethoxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (6); 10 - [(2-Hydroxy-4-methoxy-benzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (7); 10 - [(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (8); 10 - [(2-hydroxy-3-methoxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (9) 10 - [(3-methoxy-4-hydroxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenones (10) 10 - [(3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (11); 10 - [(3,5-dimethyl-4-hydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (12); 10 - [(3-carbomethoxy-4-hydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (13); 10 - [(3,5-dibromo-4-hydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (14); 10 - [(3,4-dichlorobenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (15); 10 - [(2,4-dimethoxy-3-hydroxybenzylidene)] - 9 (10H) - anthracenone (16); 10 - [(3,5-bis-butyl-4-hydroxy-benzylidene)] - (10H) -anthracenone (17); 10 - [(3,4-methylenedioxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (18); 10 - [(4-benzyloxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (19); 10 - [(4-hydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (20); 10 - [(3,4,5-trihydroxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (21); 10 - [(4-trifluoromethylbenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (22); 10 - [(4-nitro-benzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (23); 10 - [(4-ethoxycarbonylbenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (24)

Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung kann die beschriebene Phenylalkyliden C-10 Einheit (Benzylidenstruktur)durch eine Struktur mit terminaler heterocyclischer Gruppe wie Pyrrol oder Imidazol ersetzt (modifiziert) werden. In accordance with the present invention, the phenylalkylidene C-10 described Unit (benzylidene structure) by a structure with a terminal heterocyclic group such as Pyrrole or imidazole can be replaced (modified).

Antineoplastic effect

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine anti-Tubulin-Wirkung durch Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation). Die erfindungsgemäßen tubulinbindenden Verbindungen sind daher brauchbar als neue anti-Krebs wirksame Verbindungen. The compounds according to the invention have an anti-tubulin effect by inhibition the tubulin assembly (polymerization). The tubulin binding agents according to the invention Compounds are therefore useful as new anti-cancer compounds.

salts

Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die pharmazeutisch verträglichen Säuren- und Basenadditionssalze der Verbindungen zur pharmazeutischen Anwendung. Die pharmazeutisch verträglichen Salze können Basenadditionssalze sein. Dazu zählen Salze der Verbindungen mit Metallen und Aminen, wie Alkali- oder Erdalkalimetallen oder organischen Aminen. Beispiele für brauchbare Metallkationen wären Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen. Eingeschlossen sind auch Schwermetallsalze mit den Kationen Silber, Zink, Kobalt, und Cer. Beispiele für brauchbare Amine sind N,N'- Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N- Methylglucamin, und Procain. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der Verbindungen werden diejenigen, die mit organischen und anorganischen Säuren gebildet werden. Beispiele geeigneter Säuren zur Salzbildung sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Salicylsäure, Äpfelsäure, Gluconsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, und dergleichen. Die Salze können durch Behandlung der freien basischen Form mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Säure unter Bildung eines Monosalzes, Disalzes, etc. auf herkömmliche Art und Weise erhalten werden. Die freie basische Form kann durch Behandeln eines Salzes mit einer Base regeneriert werden. Es können z. B. verdünnte Lösungen der wässrigen Base verwendet werden. Verdünntes wässriges Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat, Ammoniak und Natriumhydrogencarbonat sind für diesen Zweck brauchbar. Die freien basischen Formen unterscheiden sich von den Salzen in einigen physikalischen Eigenschaften wie z. B. der Löslichkeit in polaren Solventien, die Salze verhalten sich jedoch entsprechend den basischen Formen im Sinne der Erfindung. The invention also includes the pharmaceutically acceptable acids and Base addition salts of the compounds for pharmaceutical use. The pharmaceutically acceptable salts can be base addition salts. These include salts of Compounds with metals and amines, such as alkali or alkaline earth metals or organic amines. Examples of usable metal cations would be sodium, potassium, Magnesium, calcium and the like. Heavy metal salts are also included with the Cations silver, zinc, cobalt, and cerium. Examples of useful amines are N, N'- Dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, ethylenediamine, N- Methylglucamine, and procaine. Pharmaceutically acceptable acid addition salts of Compounds are those formed with organic and inorganic acids become. Examples of suitable acids for salt formation are hydrochloric acid, sulfuric acid, Phosphoric acid, acetic acid, citric acid, oxalic acid, malonic acid, salicylic acid, malic acid, Gluconic acid, fumaric acid, succinic acid, ascorbic acid, maleic acid, methanesulfonic acid, and the same. The salts can be treated by treating the free basic form with a sufficient amount of the desired acid to form a mono salt, disalt, etc. can be obtained in a conventional manner. The free basic form can by Treating a salt with a base can be regenerated. It can e.g. B. diluted Solutions of the aqueous base are used. Dilute aqueous sodium hydroxide, Potassium carbonate, ammonia and sodium hydrogen carbonate are useful for this purpose. The free basic forms differ from the salts in some physical ones Properties such as B. the solubility in polar solvents, but the salts behave corresponding to the basic forms in the sense of the invention.

Depolymerization of tubulin

Die erfindungsgemäßen Verbindungen binden an Tubulin. Durch Bindung der erfindungsgemäßen tubulinbindenden Substanzen kommt es zu einer Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation). Geeignete Assays zur Feststellung der Tubulinwirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen finden sich in den angegegeben Beispielen. The compounds according to the invention bind to tubulin. By binding the tubulin-binding substances according to the invention are inhibited Tubulin assembly (polymerization). Appropriate assays to determine the Tubulin activity of the compounds according to the invention can be found in the Examples.

Treatment of proliferative diseases

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich als potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation erwiesen. Sie sind daher auch geeignet zur Hemmung der Zellteilung und Proliferation von nicht-Krebszellen. Solche Krankheiten umfassen EBV-induzierte lymphoproliferative Erkrankungen und Lymphome, proliferative Sekundäreffekte im Zusammenhang mit Diabetes, einschließlich vaskulärer Proliferation und Retinopathie und Psoriasis; desweiteren benigne Tumore, einschließlich Angiome, Fibrome, Myome, Osteoporose, Mastozytose und myeloproliferative Erkrankungen. The compounds of the invention have proven to be potent inhibitors of Tubulin polymerization proven. They are therefore also suitable for inhibiting cell division and proliferation of non-cancer cells. Such diseases include EBV-induced lymphoproliferative diseases and lymphomas, proliferative secondary effects in the Associated with diabetes, including vascular proliferation and retinopathy and Psoriasis; further benign tumors, including angiomas, fibromas, fibroids, Osteoporosis, mastocytosis and myeloproliferative diseases.

Anti-tumor effect

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar zum Zwecke der Tumorbehandlung, um beispielsweise eine Hemmung der Tubulinassemblierung des Tumorzelltubulins zu erreichen, eine Hemmung des Tumorzellwachstums zu erzielen, Tumorzellen abzutöten, Apoptose zu induzieren und/oder die Lebensdauer eines Patienten zu verlängern. The compounds according to the invention are useful for the purpose of tumor treatment, to inhibit, for example, the tubulin assembly of the tumor cell tubulin achieve an inhibition of tumor cell growth, kill tumor cells, To induce apoptosis and / or to extend the life span of a patient.

Die krebswirksamen, tubulinbindenden erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar zur Anwendung in Säugetieren. Säugetier bezeichnet im Sinne dieser Erfindung jede Klasse höherer Vertebraten, die ihre Jungen mit Milch, produziert in Milchdrüsen ernähren, einschließlich dem Menschen, Kaninchen und Affen. The carcinogenic, tubulin-binding compounds of the invention are useful for Use in mammals. For the purposes of this invention, mammal means any class higher vertebrates who feed their young with milk produced in the mammary glands, including humans, rabbits and monkeys.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind geeignet zur Behandlung jeder Krankheit, bei der die Polymerisation von Tubulin von Bedeutung ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind außerdem geeignet zur Behandlung von Krankheiten, welche durch parasitische Protozoen, wie Sporozoen (z. B. Plasmodium, Toxoplasma), Amöben (z. B. Acanthamoeba, Entamoeba), Flagellaten (z. B. Trypanosoma, Leishmania), Ciliaten (z. B. Balantidium) hervorgerufen werden und für die die Tubulinpolymerisation von Bedeutung für deren Bewegung ist. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind insbesondere nützlich zur Behandlung der Chagas-Krankheit oder von Krankheiten, die durch Würmer hervorgerufen werden. The inhibitors of tubulin polymerization according to the invention are suitable for treatment any disease in which the polymerization of tubulin is important. The Compounds according to the invention are also suitable for the treatment of diseases, which are caused by parasitic protozoa, such as sporozoa (e.g. Plasmodium, Toxoplasma), Amoebas (e.g. Acanthamoeba, Entamoeba), flagellates (e.g. Trypanosoma, Leishmania), Ciliates (e.g. Balantidium) and for which the tubulin polymerization of Meaning for their movement. The inhibitors of the invention Tubulin polymerization is particularly useful for treating Chagas disease or of diseases caused by worms.

Methods for the administration of the compounds according to the invention

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder als einzelne therapeutische Wirkstoffe oder als Mischung mit anderen therapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Im allgemeinen werden sie in Form pharmazeutischer Mittel verabreicht, das heißt als Mischungen der Wirkstoffe mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln. Die Verbindungen oder Mittel können oral, parenteral (z. B. intravenös, intraperitoneal), durch Inhalation oder topisch (einschließlich dermal, transdermal, buccal, und sublingual) verabreicht werden. The compounds of the invention can be used either as individual therapeutic agents Active ingredients or as a mixture with other therapeutic agents. Generally they are administered in the form of pharmaceutical agents, i.e. as Mixtures of the active ingredients with suitable carriers or diluents. The Compounds or agents can be administered orally, parenterally (e.g. intravenously, intraperitoneally) Inhalation or topical (including dermal, transdermal, buccal, and sublingual) be administered.

Die Art des pharmazeutischen Mittels und des pharmazeutischen Trägers bzw. Verdünnungsmittels hängt von der gewünschten Verabreichungsart ab. Orale Mittel können beispielsweise als Tabletten oder Kapseln, auch in retardierter Form, vorliegen und können übliche Exzipienzien enthalten wie Bindemittel (z. B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z. B. Lactose, Saccharose, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talcum, Polyethylenglykol oder Siliciumdioxid), desintegrierende Mittel (z. B. Stärke) oder Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat). Orale flüssige Präparate können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren oder Sprays usw. vorliegen oder können als Trockenpulver zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vorliegen. Derartige flüssige Präparate können übliche Additive, beispielsweise Suspendiermittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel oder Emulgatoren enthalten. Für die parenterale Verabreichung kann man Lösungen oder Suspensionen mit üblichen pharmazeutischen Trägern einsetzen. Für die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen in wässriger oder teilweise wässriger Lösung vorliegen, die in Form eines Aerosols angewendet werden kann. Mittel für die topische Anwendung können z. B. als pharmazeutisch verträgliche Puder, Lotionen, Salben, Cremes, Gele oder als therapeutische Systeme vorliegen, die therapeutisch wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten. Die erforderliche Dosierung ist abhängig von der Form des angewendeten pharmazeutischen Mittels, von der Art der Anwendung, der Schwere der Symptome und dem speziellen Subjekt (Mensch oder Tier), das behandelt wird. Die Behandlung wird üblicherweise mit einer Dosis begonnen, die unterhalb der optimalen Dosis liegt. Danach wird die Dosis erhöht, bis der für die angegebene Bedingungen optimale Effekt erzielt wird. Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen am besten in Konzentrationen verabreicht, mit welchen sich effektive Wirkungen erzielen lassen, ohne dass schädliche oder nachteilige Wirkungen auftreten. Sie können in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. The type of pharmaceutical agent and the pharmaceutical carrier or Diluent depends on the desired route of administration. Oral agents can for example as tablets or capsules, also in a delayed form, and can be Common excipients contain such as binders (e.g. syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinylpyrrolidone), fillers (e.g. lactose, sucrose, corn starch, Calcium phosphate, sorbitol or glycine), lubricants (e.g. magnesium stearate, talc, Polyethylene glycol or silicon dioxide), disintegrating agents (e.g. starch) or wetting agents (e.g. sodium lauryl sulfate). Oral liquid preparations can be in the form of watery or oily Suspensions, solutions, emulsions, syrups, elixirs or sprays etc. are present or can be used as dry powder for reconstitution with water or other suitable Carrier available. Such liquid preparations can be conventional additives, for example Containing suspending agents, flavors, diluents or emulsifiers. For the Parenteral administration can be done using solutions or suspensions with conventional use pharmaceutical carriers. For inhalation administration, the Compounds are present in aqueous or partially aqueous solution in the form of a Aerosols can be applied. Agents for topical application can e.g. B. as pharmaceutically acceptable powders, lotions, ointments, creams, gels or as therapeutic Systems are present, the therapeutically effective amounts of the invention Connections included. The required dosage depends on the form of the pharmaceutical agent used, the type of application, the severity of the Symptoms and the specific subject (human or animal) that is being treated. The Treatment is usually started at a dose below the optimal dose lies. Then the dose is increased until the optimal effect for the specified conditions is achieved. In general, the compounds of the invention are best described in Concentrations administered with which effective effects can be achieved without harmful or adverse effects occur. You can take it in a single dose or in multiple doses.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen lässt sich anhand verschiedener Testsysteme bestimmen. Nähere Angaben erfolgen in den angegebene Beispielen. The effectiveness of the compounds according to the invention can be determined on the basis of various Determine test systems. Further details are given in the examples given.

Methods for the preparation of the compounds according to the invention

Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen kann wie untenstehend in Beispiel 1 beschrieben erfolgen. Tabelle 1 Wachstumshemmende Aktivität der substituierten Benzyliden-9(10H)- anthracenone gegenüber dem Wachstum von K562 Zellen und Hemmung der Tubulinpolymerisation in vitro

Tabelle 2 Wachstumshemmende Aktivität ausgewählter Verbindungen gegenüber humanen Tumorzell-Linien und Xenografts

Tabelle 3 Effekt ausgewählter Verbindungen auf die Viabilität von K562 Zellen

Tabelle 5 Chemische Daten der Benzyliden-9(10H)-anthracenone

^aAlle neuen Verbindungen geben ¹H NMR, FTIR, UV, and MS Spektren in Übereinstimmung mit den angegegeben Strukturen. Die Werte der Elementaranalysen befinden sich innerhalb ±0.4% der kalkulierten Werte.
^bSiehe experimentelle Angaben.
^cAusbeuten wurden nicht optimiert.
^dSolventien für die Chromatographie (Vol %): E = Diethylether; EE = Ethylacetat; H = Hexan; M = Methanol; MC = Methylenchlorid; PE = Petrolether.
^eZersetzung. The compounds of the invention can be synthesized as described in Example 1 below. Table 1 Growth-inhibitory activity of the substituted benzylidene-9 (10H) -anthracenone against the growth of K562 cells and inhibition of tubulin polymerization in vitro

Table 2 Growth inhibitory activity of selected compounds against human tumor cell lines and xenografts

Table 3 Effect of selected compounds on the viability of K562 cells

Table 5 Chemical data of the benzylidene-9 (10H) -anthracenones

^a All new compounds give ¹ H NMR, FTIR, UV, and MS spectra in accordance with the given structures. The values of the elementary analyzes are within ± 0.4% of the calculated values.
^b See experimental information.
^c Yields were not optimized.
^d Chromatography solvents (vol%): E = diethyl ether; EE = ethyl acetate; H = hexane; M = methanol; MC = methylene chloride; PE = petroleum ether.
^e decomposition.

Examples

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung sowie dem besseren Verständnis der Erfindung. The following examples serve to explain and to better understand the Invention.

Einige, vom 9(10H)Anthracenon abgeleitete Benzylidene mit biologischer Aktivität finden sich in der Literatur.^9, ¹⁰, ¹¹, ¹², ¹³, ¹⁴, ¹⁵, ¹⁶, ¹⁷ Für das N-[4-[(10-Oxo-9(10H)- anthracenyliden)-methyl]phenyl]-acetamid konnte kürzlich eine Unterdrückung der HER- 2/neu-induzierten zellulären Transformation gezeigt werden.¹⁸ Müller et al. beschreiben die Synthese und die biologischen Aktivitäten von 1,8-Dihydroxy-9(10H)-anthracenonen mit Acyl-, Alkyl-, oder Benzylidensubstitutionsmuster in der 10-Position des antipsoriatrisch wirksamen Dithranols.¹⁹ Einige einfache, vom Indanon abgeleitete Benzylidene erwiesen sich als potente und selektive Inhibitoren der Lymphozytenkinase p56^lck.²⁰ Some benzylidenes with biological activity derived from 9 (10H) anthracenone can be found in the literature. ^9, ¹⁰ , ¹¹ , ¹² , ¹³ , ¹⁴ , ¹⁵ , ¹⁶ , ¹⁷ For the N- [4 - [(10-oxo-9 (10H) - anthracenylidene) methyl] phenyl] acetamide it was recently possible to suppress HER - 2 / newly-induced cellular transformation are shown. ¹⁸ Müller et al. describe the synthesis and the biological activities of 1,8-dihydroxy-9 (10H) -anthracenones with acyl, alkyl or benzylidene substitution patterns in the 10-position of the antipsoriatric dithranol. ¹⁹ Some simple indyl derived benzylidenes have been shown to be potent and selective inhibitors of p56 ^lck lymphocyte ^kinase . ²⁰

example 1 Synthesis of inhibitors of tubulin polymerization Chemical methods

Die Schmelzpunkte wurden mittels eines Kofler Schmelzpunktbestimmungsapparates ermittelt und sind nicht korrigiert. Spektren wurden wie folgt erhalten:
¹H NMR Spektren wurden mit einem Varian Gemini 200 (50,3 MHz) Spektrometer, unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard, aufgenommen. Fouriertransformierte IR-Spektren wurden mit einem Bio-Rad Laboratorien Typ FTS 135 Spectrometer aufgenommen und mittels WIN-IR Foundation Software analysiert. Verbrennungsanalysen wurden im mikroanalytischen Labor der Universität Münster unter Verwendung eines Heraeus CHN-O-Rapid analyser 240 durchgeführt. Alle Werte befinden sich innerhalb ±0.4% der berechneten Zusammensetzung. Massenspektren (EI) wurden im EI Modus mittels eines MAT 44S Finnigan Massenspektrometers aufgenommen. Alle organischen Lösungsmittel wurden vor dem Gebrauch sorgfältig getrocknet bzw. gereinigt. Aromatische Aldehyde waren überwiegend kommerziell erhältlich. Analytische Dünnschichtchromatographie wurde auf mit Kieselgel bezogenen Aluminiumplattten (Merck Kieselgel 60 F₂₅₄, E. Merck, Darmstadt) durchgeführt. Säulenchromatographie mit Kieselgel wurde unter Verwendung von Kieselgel der Firma Merck (70-230 mesh) durchgeführt. The melting points were determined using a Kofler melting point determination apparatus and are not corrected. Spectra were obtained as follows:
¹ H NMR spectra were recorded on a Varian Gemini 200 (50.3 MHz) spectrometer using tetramethylsilane as the internal standard. Fourier-transformed IR spectra were recorded with a Bio-Rad laboratory type FTS 135 spectrometer and analyzed using WIN-IR Foundation software. Combustion analyzes were carried out in the microanalytical laboratory at the University of Münster using a Heraeus CHN-O-Rapid analyzer 240. All values are within ± 0.4% of the calculated composition. Mass spectra (EI) were recorded in EI mode using a MAT 44S Finnigan mass spectrometer. All organic solvents have been carefully dried or cleaned before use. Aromatic aldehydes were predominantly commercially available. Analytical thin layer chromatography was carried out on aluminum plates covered with silica gel (Merck Kieselgel 60 F ₂₅₄ , E. Merck, Darmstadt). Column chromatography with silica gel was carried out using Merck silica gel (70-230 mesh).

Es ist bekannt, dass das 9(10H)-Anthracenon (Anthron) mit Aldehyden Kondensationsreaktionen eingeht.^16, ²¹ Die substituierten 9(10H)-Anthracenone konnten durch eine aldolartige Umsetztung von 9(10H)-Anthracenon mit entsprechend substituierten Benzaldehyden unter basischen Beduingungen in Gegenwart von Pyridin/Piperidin erhalten werden (Methode A, Schema 1).¹⁶ In einer effizienteren Variante wurde die Kondensationsreaktion unter sauren Bedingungen durch Einleiten von Chlorwasserstoffgas durchgeführt (Methode B).²⁰ Im Allgemeinen liefert diese Vorgehensweise die besseren Ausbeuten. Die hier beschriebenen strukturellen Variationen betreffen in erster Linie den Benzylidenteil der Moleküle sowie die Umwandlung einiger Methoxyverbindungen in die freien phenolischen Derivate. Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Benzaldehyde waren kommerziell erhältlich. Zur Herstellung der Derivate 4 und 19, wurden die Ethergruppen der Verbindungen 3 und 6 mittels Bortribromid in Dichlormethan gespalten. The 9 (10H) -anthracenone (anthrone) is known to undergo condensation reactions with aldehydes. ^16, ²¹ The substituted 9 (10H) -anthracenones could be obtained by an aldol-like reaction of 9 (10H) -anthracenone with appropriately substituted benzaldehydes under basic conditions in the presence of pyridine / piperidine (Method A, Scheme 1). ¹⁶ In a more efficient variant, the condensation reaction was carried out under acidic conditions by introducing hydrogen chloride gas (method B). ²⁰ In general, this approach gives better yields. The structural variations described here primarily concern the benzylidene part of the molecules and the conversion of some methoxy compounds into the free phenolic derivatives. The benzaldehydes used as starting compounds were commercially available. To prepare derivatives 4 and 19, the ether groups of compounds 3 and 6 were cleaved in dichloromethane using boron tribromide.

General instructions for the preparation of 10-benzylidene-9 (10H) -anthracenones Method A

9(10H)-Anthracenon (2.33 g, 12 mmol) und der entsprechende Benzaldehyd (14.4 mmol) werden in 50 ml trockenem Pyridin und unter Stickstoff suspendiert. Man fügt 15 ml Piperidin zu und erhitzt anschließend auf dem Ölbad (130°C) bis zur vollständigen Umsetzung (DC-Kontrolle). Danach lässt man auf Raumtemperatur abkühlen, gießt auf Wasser (700 ml) und säuert mit 70 ml 6 N HCl an. Man extrahiert gründlich mit Dichlormethan (3 × 50 ml), trocknet die organische Phase über Na₂SO₄ und engt im Wasserstrahlvakuum ein. Der Rückstand wird säulenchromatographisch unter Verwendung von Kieselgel gereinigt. Beim Einengen der Reinfraktionen kristallisiert das Produkt nach Zugabe von Hexan und Stehenlassen im Eisbad aus. 9 (10H) -anthracenone (2.33 g, 12 mmol) and the corresponding benzaldehyde (14.4 mmol) are suspended in 50 ml of dry pyridine and under nitrogen. 15 ml of piperidine are added and the mixture is then heated on an oil bath (130 ° C.) until the reaction is complete (TLC control). Then allowed to cool to room temperature, poured onto water (700 ml) and acidified with 70 ml of 6N HCl. The mixture is extracted thoroughly with dichloromethane (3 × 50 ml), the organic phase is dried over Na ₂ SO ₄ and concentrated in a water jet vacuum. The residue is purified by column chromatography using silica gel. When the pure fractions are concentrated, the product crystallizes out after adding hexane and leaving to stand in an ice bath.

Method B. ²⁰

9(10H)-Anthracenon (1.94 g, 10 mmol) und der entsprechend substituierte Aldehyd (10 mmol) werden in absolutem Ethanol (25 ml) bei Raumtemperatur suspendiert. Die Suspension wird über 5 min mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt. Die Mischung färbt sich dunkel und wird im Anschluss für die Dauer von 1 h unter Rückfluss zum Sieden erhitzt (DC-Kontrolle). Man lässt auf Raumtemperatur abkühlen, gießt dann auf 300 ml Wasser und extrahiert mit CH₂Cl₂ oder Ethylacetat (bei freien Phenolen). Das Lösungsmittel wird im Wasserstrahlvakuum entfernt, der Rückstand wird säulenchromatographisch unter Verwendung von Kieselgel gereinigt. Beim Einengen der Reinfraktionen kristallisiert das Produkt nach Zugabe von Hexan und Stehenlassen im Eisbad aus. 9 (10H) -anthracenone (1.94 g, 10 mmol) and the correspondingly substituted aldehyde (10 mmol) are suspended in absolute ethanol (25 ml) at room temperature. The suspension is saturated with gaseous hydrogen chloride over 5 minutes. The mixture turns dark and is then heated to boiling under reflux for 1 h (DC control). The mixture is allowed to cool to room temperature, then poured onto 300 ml of water and extracted with CH ₂ Cl ₂ or ethyl acetate (in the case of free phenols). The solvent is removed in a water jet vacuum, the residue is purified by column chromatography using silica gel. When the pure fractions are concentrated, the product crystallizes out after adding hexane and leaving to stand in an ice bath.

Ether cleavage with boron tribromide

Die jeweilige Verbindung (0.58 mmol) wird in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst, die Lösung dann auf -78°C abgekühlt. Eine 1-molare Lösung von Bortribromid in Dichlormethane (5 ml, 5 mmol) wird tropfenweise unter Rühren zugegeben. Es wird über Nacht gerührt und lässt dabei das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen. Man beendet die Umsetzung durch Eingießen in Wasser (300 ml) und extrahiert die Produkte mit Etylacetat. Die organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschließend im Wasserstrahlvakuum entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch unter Verwendung von Ethylacetat als Eluens gereinigt. 10-Benzyliden-9(10H)-anthracenon[Bergmann, 1966 #1179; Rappoport, 1980 #1184] (1) FTIR 1657 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃): δ 8.35-7.19 (m; 1H; Ph₂C=CH-Ph and 13H aromat.); MS m/z 282 (65.5, M^+.) Anal. (C₂₁H₁₄O) C, H. 10-[(4-Methoxy-benzyliden)]-(10H)-anthracenon (2) FTIR 1654 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-6.82 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 12H aromat.), 5.61 (s; 1H, 3'-OH), 3.89 (s; 3H, 4'-H₃CO-Ph), 3.83 (s; 3H, 4'-H₃CO-Ph); MS m/z 312 (100, M^+.). Anal. (C₂₂H₁₆O₂) C, H. 10-[(3,4-Dimethoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon (3) FTIR 1654 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-7.26 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 11H aromat.), 3.69 (s; 3H, 4'-H₃CO-Ph), 3.68 (s; 3H, 3'-H₃CO-Ph); MS m/z 342 (100, M^+.). Anal. (C₂₃H₁₈O₃) C, H. 10-[(3,4-Dihydroxy-benzylidene)]-(10H)-anthracenon (4) FTIR 1651 cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ; MS m/z 314 (100, M^+.). Anal. (C₂₁H₁₄O₃) C, H. 10-[(3,5-Dimethoxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (5) FTIR 1664 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-6.39 (in; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 11H aromat.), 3.69 (s; 6H, 3',5'-H₃CO-Ph); MS m/z 342 (100, M^+.). Anal. (C₂₃H₁₈O₃) C, H. 10-[(3,4,5-Trimethoxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (6) FTIR 3345, 1643 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-7.26 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 8H aromat.), 6.55 (s; 2H, 2',6'-H), 3.89 (s; 3H, 4^'-H₃CO-Ph), 3.72 (s; 6H, 3',5'-H₃CO-Ph); MS m/z 372 (100, M^+.). Anal. (C₂₄H₂O₄) C, H. 10-[(2-Hydroxy-4-methoxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenone (7) FTIR 3345, 1643 cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8.21-6.27 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 11H aromat.), 3.71 (s; 3H, 4'-H₃CO-Ph); MS m/z 328 (100, M^+.). Anal. (C₂₂H₁₆O₃) C, H. 10-[(3-Hydroxy-4-methoxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (8) FTIR 1654 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.30-7.26 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 11H aromat.), 5.61 (s; 1H, 3'-OH), 3.89 (s; 3H, 4'-H₃CO-Ph), 3.72 (s; 6H, 3',5'-H₃CO-Ph); MS m/z 328 (100, M^+.). Anal. (C₂₂H₁₆O₃) C, H. 10-[(2-Hydroxy-3-methoxy-benzylidene)]-(10H)-anthracenone (9) FTIR 3453, 1646 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.30-6.79 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 8H aromat.), 6.81-6.67 (m; 3H aromat.), 5.97 (s; 1H, OH), 3.95 (s; 3H, OCH₃); MS m/z (100, M^+.). Anal. (C₂₂H₁₆O₃) C, H. 10-[(3-Methoxy-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenone (10) FTIR 3399, 1651 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.29-7.29 (m; 1H, Ph₂C =CH-Ph and 8H aromat.), 6.90-6.79 (m; 3H aromat.), 5.74 (s; 1H, OH), 3.69 (s; 3H, OCH₃); MS m/z (100, M^+.). Anal. (C₂₂H₁₆O₃) C, H. 10-[(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (11) FTIR 1650 cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8.84 (s(br); 1H, OH), 8.16-6.73 (m; 1H, Ph₂C=CH- Ph and 10H aromat.), 3.35 (s; 6H, 3',5'-H₃CO-Ph); MS m/z (, M^+.). Anal. (C₂₃H₁₈O₄), C, H. 10-[(3,5-Dimethyl-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (12) FTIR cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8.31-7.21 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 10H aromat.), 6.98 (s; 2H aromat.), 2.19 (s; 6H aromat.); MS m/z 326 (100, M^+.). Anal. (C₂₃H₁₈O₄), C, H. 10-[(3-Carbomethoxy-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (13) FTIR 1680, 1659 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 10.87 (s; 1H, OH), 8.31-6.88 (m; 1H, Ph₂C=CH- Ph and 11H aromat.), 3.93 (s; 3H, CO-OCH₃); MS m/z = 356 (100, M^+.). Anal. (C₂₃H₁₆O₄) C, H. 10-[(3,5-Dibromo-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (14) FTIR 1645 cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8.26-7.42 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 10H aromat.); MS m/z 456 (100%, M^+.); Anal (C₂₁H₁₂Br₂O₂), C, H. 10-[(3,4-Dichloro-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (15) FTIR 1662 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-7.18 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 11H aromat.); MS m/z 350 (100, M^+.); Anal. (C₂₁H₁₂Cl₂O) C, H. 10-[(2,4-Dimethoxy-3-Hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (16) FTIR 1654 cm^-1 (CO); ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.32-6.48 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 10H aromat.), 5.65 (s; 1H, OH), 4.01 (s; 3H, 4'-H₃CO-Ph), 3.90 (s; 3H, 2'-H₃CO-Ph); MS m/z 358 (100, M^+.); Anal. (C₂₃H₁₈O₄) C, H. 10-[(3,5-bis-tert.Butyl-4-hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (17) FTIR 2957 (OH), 1668 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-7.18 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 10H aromat.), 5.35 (s; 1H, OH), 1.36 (s; 18H; 3',5'-C(CH₃)₃); MS m/z = (100, M^+.). Anal. C₂₉H₃₀O₂, C, 84.84, H, 7.37, found C, 84.45, H, 7.55. 10-[(3,4-Methylenedioxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (18) FTIR 1646 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31-6.75 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 11H aromat.), 5.99 (s; 2H, OCH₂O); MS m/z 326 (100, M^+.). Anal. (C₂₂H₁₄O₃) C, H. 10-[(4-Benzyloxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (19) FTIR 1656 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.35-6.90 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 17H aromat.), 5.08 (s; 2H, OCH₂Ph); MS m/z 388 (72, M^+.). Anal. (C₂₈H₂₀O₂) C, H. 10-[(4-Hydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (20) FTIR 3346, 1640 cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 9.80 (s(br); 1H, OH), 8.28-6.71 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 12H aromat.); MS m/z (72, Mr). Anal. (C₂₁H₁₄O₂) C, H. 10-[(3,4,5-Trihydroxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (21) FTIR cm^-1; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ; MS m/z 330 (100, M^+.). Anal. (C₂₁H₁₄O₄) C, H. 10-[(4-Trifluormethyl-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (22) FTIR 1660 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.32-7.22 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 12H aromat.); MS m/z 350 (100, M^+.); Anal. (C₂₂H₁₃F₃O) C, H. 10-[(4-Nitro-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (23) FTIR 1661 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.32-7.22 (m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 12H aromat.); MS m/z 327 (100, M^+.); Anal. (C₂₁H₁₃NO₃), C, H. 10-[(4-Ethoxycarbonyl-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon (24) FTIR 1712, 1656 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃) δ 8.43-7.14 1H, m; 1H, Ph₂C=CH-Ph and 12H aromat.), 4.40 (q; 2H), 1.41 (t; 3H); MS m/z 354 (72, M^+.); Anal. (C₂₄H₁₈O₃), C, H. The respective compound (0.58 mmol) is dissolved in CH ₂ Cl ₂ (10 ml), the solution is then cooled to -78 ° C. A 1 molar solution of boron tribromide in dichloromethane (5 ml, 5 mmol) is added dropwise with stirring. The mixture is stirred overnight and the mixture is allowed to warm to room temperature. The reaction is terminated by pouring it into water (300 ml) and the products are extracted with ethyl acetate. The organic phases are dried over sodium sulfate and the solvent is then removed in a water jet vacuum. The residue is purified by column chromatography using ethyl acetate as the eluent. 10-benzylidene-9 (10H) anthracenone [Bergmann, 1966 # 1179; Rappoport, 1980 # 1184] (1) FTIR 1657 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ): δ 8.35-7.19 (m; 1H; Ph ₂ C = CH-Ph and 13H aromat.); MS m / z 282 (65.5, M ^+. ) Anal. (C ₂₁ H ₁₄ O) C, H. 10 - [(4-methoxybenzylidene)] - (10H) -anthracenone (2) FTIR 1654 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-6.82 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 12H aromat.), 5.61 (s; 1H, 3'-OH), 3.89 (s; 3H, 4'- H ₃ CO-Ph), 3.83 (s; 3H, 4'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 312 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₂ H ₁₆ O ₂ ) C, H. 10 - [(3,4-dimethoxybenzylidene)] - 9 (10H) -anthracenone (3) FTIR 1654 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-7.26 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromat.), 3.69 (s; 3H, 4'-H ₃ CO-Ph), 3.68 (s; 3H , 3'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 342 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₃ H ₁₈ O ₃ ) C, H. 10 - [(3,4-dihydroxybenzylidenes)] - (10H) -anthracenone (4) FTIR 1651 cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ; MS m / z 314 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₁ H ₁₄ O ₃ ) C, H. 10 - [(3,5-dimethoxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (5) FTIR 1664 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-6.39 (in; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromat.), 3.69 (s; 6H, 3 ', 5'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 342 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₃ H ₁₈ O ₃ ) C, H. 10 - [(3,4,5-trimethoxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (6) FTIR 3345, 1643 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-7.26 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 8H aromat.), 6.55 (s; 2H, 2 ', 6'-H), 3.89 (s; 3H, 4 ^' -H ₃ CO-Ph), 3.72 (s; 6H, 3', 5'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 372 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₄ H ₂ O ₄ ) C, H. 10 - [(2-Hydroxy-4-methoxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (7) FTIR 3345, 1643 cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 8.21-6.27 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromatic), 3.71 (s; 3H, 4'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 328 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₂ H ₁₆ O ₃ ) C, H. 10 - [(3-Hydroxy-4-methoxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (8) FTIR 1654 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.30-7.26 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromat.), 5.61 (s; 1H, 3'-OH), 3.89 (s; 3H, 4'- H ₃ CO-Ph), 3.72 (s; 6H, 3 ', 5'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 328 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₂ H ₁₆ O ₃ ) C, H. 10 - [(2-Hydroxy-3-methoxy-benzylidenes)] - (10H) -anthracenone (9) FTIR 3453, 1646 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.30-6.79 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 8H aromat.), 6.81-6.67 (m; 3H aromat.), 5.97 (s; 1H, OH), 3.95 (s; 3H, OCH ₃ ); MS m / z (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₂ H ₁₆ O ₃ ) C, H. 10 - [(3-methoxy-4-hydroxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (10) FTIR 3399, 1651 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.29-7.29 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 8H aromat.), 6.90-6.79 (m; 3H aromat.), 5.74 (s; 1H, OH), 3.69 (s; 3H, OCH ₃ ); MS m / z (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₂ H ₁₆ O ₃ ) C, H. 10 - [(3,5-dimethoxy-4-hydroxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (11) FTIR 1650 cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 8.84 (s (br); 1H, OH), 8.16-6.73 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 10H aromat.), 3.35 (s; 6H, 3 ', 5'-H ₃ CO-Ph); MS m / z (, M ^+. ). Anal. (C ₂₃ H ₁₈ O ₄ ), C, H. 10 - [(3,5-dimethyl-4-hydroxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (12) FTIR cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 8.31-7.21 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 10H aromatic), 6.98 (s; 2H aromatic), 2.19 (s; 6H aromatic); MS m / z 326 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₃ H ₁₈ O ₄ ), C, H. 10 - [(3-carbomethoxy-4-hydroxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (13) FTIR 1680, 1659 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 10.87 (s; 1H, OH), 8.31-6.88 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromat.), 3.93 (s; 3H, CO-OCH ₃ ); MS m / z = 356 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₃ H ₁₆ O ₄ ) C, H. 10 - [(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (14) FTIR 1645 cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 8.26-7.42 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 10H aromat.); MS m / z 456 (100%, M ^+. ); Anal (C ₂₁ H ₁₂ Br ₂ O ₂ ), C, H. 10 - [(3,4-dichlorobenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (15) FTIR 1662 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-7.18 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromatic); MS m / z 350 (100, M ^+. ); Anal. (C ₂₁ H ₁₂ Cl ₂ O) C, H. 10 - [(2,4-dimethoxy-3-hydroxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (16) FTIR 1654 cm ^-1 (CO); ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.32-6.48 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 10H aromat.), 5.65 (s; 1H, OH), 4.01 (s; 3H, 4'-H ₃ CO -Ph), 3.90 (s; 3H, 2'-H ₃ CO-Ph); MS m / z 358 (100, M ^+. ); Anal. (C ₂₃ H ₁₈ O ₄ ) C, H. 10 - [(3,5-bis-butyl-4-hydroxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (17) FTIR 2957 (OH), 1668 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-7.18 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 10H aromat.), 5.35 (s; 1H, OH), 1.36 (s; 18H; 3 ', 5'- C (CH ₃ ) ₃ ); MS m / z = (100, M ^+. ). Anal. C ₂₉ H ₃₀ O ₂ , C, 84.84, H, 7.37, found C, 84.45, H, 7.55. 10 - [(3,4-methylenedioxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (18) FTIR 1646 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.31-6.75 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 11H aromatic), 5.99 (s; 2H, OCH ₂ O); MS m / z 326 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₂ H ₁₄ O ₃ ) C, H. 10 - [(4-Benzyloxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (19) FTIR 1656 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.35-6.90 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 17H aromatic), 5.08 (s; 2H, OCH ₂ Ph); MS m / z 388 (72, M ^+. ). Anal. (C ₂₈ H ₂₀ O ₂ ) C, H. 10 - [(4-hydroxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (20) FTIR 3346, 1640 cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ 9.80 (s (br); 1H, OH), 8.28-6.71 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 12H aromat.); MS m / z (72, Mr). Anal. (C ₂₁ H ₁₄ O ₂ ) C, H. 10 - [(3,4,5-trihydroxybenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (21) FTIR cm ^-1 ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) δ; MS m / z 330 (100, M ^+. ). Anal. (C ₂₁ H ₁₄ O ₄ ) C, H. 10 - [(4-trifluoromethyl-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (22) FTIR 1660 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.32-7.22 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 12H aromat.); MS m / z 350 (100, M ^+. ); Anal. (C ₂₂ H ₁₃ F ₃ O) C, H. 10 - [(4-nitro-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (23) FTIR 1661 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.32-7.22 (m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 12H aromat.); MS m / z 327 (100, M ^+. ); Anal. (C ₂₁ H ₁₃ NO ₃ ), C, H. 10 - [(4-ethoxycarbonylbenzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone (24) FTIR 1712, 1656 cm ^-1 ; ¹ H NMR (CDCl ₃ ) δ 8.43-7.14 1H, m; 1H, Ph ₂ C = CH-Ph and 12H aromat.), 4.40 (q; 2H), 1.41 (t; 3H); MS m / z 354 (72, M ^+. ); Anal. (C ₂₄ H ₁₈ O ₃ ), C, H.

Example 2 Testing for growth-inhibiting properties on K562 cells

Wir prüften die neu synthetisierten Verbindungen auf wachstumshemmende Eigenschaften an der K562 Leukämie Zell-Linie.²² Der IC₅₀-Wert (definiert als die effektive Konzentration, die für eine 50%ige Hemmung des Zellwachstums benötigt wird) von 10-[(3-Hydroxy-4- methoxy-benzylidene)]-9(10H)-anthracenon beträgt in diesem Assay 0.007 µg/ml (Abb. 2). Humane chronisch myelogene K562 Leukämie-Zellen wurden von Dr. H. Tapiero, ICLG, Villejuif, France, bezogen und in RPMI 1640 Medium (Zusätze: 10% Rinderserum (FBS), Kanamycin (0.1 mg/ml), Penicillin G (100 units/ml), and L-Glutamine (30 mg/liter)) bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. We tested the newly synthesized compounds for growth-inhibiting properties on the K562 leukemia cell line. ²² The IC ₅₀ (defined as the effective concentration required for 50% inhibition of cell growth) of 10 - [(3-hydroxy-4-methoxy-benzylidenes)] - 9 (10H) -anthracenone is in this assay 0.007 µg / ml ( Fig. 2). Human chronic myelogenic K562 leukemia cells were developed by Dr. H. Tapiero, ICLG, Villejuif, France, purchased and in RPMI 1640 medium (additives: 10% bovine serum (FBS), kanamycin (0.1 mg / ml), penicillin G (100 units / ml), and L-glutamine (30 mg / liter)) cultivated at 37 ° C and 5% CO ₂ .

Die K562-Zellen wurden in einer Zelldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml in Platten zu je 48 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) ausgesäät. Unbehandelte Kontrollen wurden dabei als 100% betrachtet. Die zu prüfenden Verbindungen wurden in DMSO/Methanol im Verhältnis 1 : 1 gelöst, den Kontrollen wurde lediglich das Lösungsmittel zugesetzt. In jede Vertiefung wurden jeweils 5 µL der gelösten Verbindung pipettiert, das Gesamtvolumen im Endbehältnis betrug somit 500 µl. Die Zellzahl wurde mittels eines Model ZM Coulter Counters (Coulter Electronics, Luton, England) nach Inkubation mit den zu prüfenden Verbindungen über einen Zeitraum von 48 h ermittelt. The K562 cells were sown at a cell density of 2 × 10 ⁵ cells / ml in 48-well plates (Costar, Cambridge, MA). Untreated controls were considered 100%. The compounds to be tested were dissolved in DMSO / methanol in a ratio of 1: 1, only the solvent was added to the controls. 5 µL of the dissolved compound was pipetted into each well, so the total volume in the final container was 500 µl. The cell number was determined using a Model ZM Coulter Counter (Coulter Electronics, Luton, England) after incubation with the compounds to be tested over a period of 48 h.

Eine Übersicht über die synthetisierten Benzylidene-9(10H)-anthracenone sowie über deren wachstumshemmende Eigenschaften (IC₅₀-Werte) gibt Tabelle 1. Table 1 provides an overview of the synthesized benzylidene-9 (10H) -anthracenones and their growth-inhibiting properties (IC ₅₀ values).

Die beobachteten antiproliferativen Effekte hängen vom Substitutionsmuster ab. The observed antiproliferative effects depend on the substitution pattern.

10-[(3-Hydroxy-4-methoxy-benzyliden)]-9(10H)- anthracenon. 8 zeigte stark wachstumshemmende Eigenschaften (IC₅₀ (K562) 0.02 µM). Der IC₅₀-Wert liegt hier im Bereich des antiproliferativ gut wirksamen Anthracyclins Adriamycin. Ebenfalls sehr gut wirksam waren die Verbindungen 2, 4 und 7 mit IC₅₀ Werten < 0,1 µM. 10 - [(3-Hydroxy-4-methoxybenzylidene)] - 9 (10H) - anthracenone. 8 showed strongly growth-inhibiting properties (IC ₅₀ (K562) 0.02 µM). The IC ₅₀ value is in the range of the antiproliferative anthracycline adriamycin. Compounds 2, 4 and 7 with IC ₅₀ values <0.1 µM were also very effective.

Example 3 Determination of cell viability - Trypan blue test

Zur Bestimmung zytotoxischer Effekte sowie zur Ermittlung geeigneter Konzentrationen für die nachfolgenden Experimente, führten wir eine Zellviabilitätsbestimmung nach der Trypan Blau-Ausschlussmethode unter Verwendung einer Neubauer-Kammer durch. durch. Die Viabilitätsstudien mit K562 Zellen wurden Platten zu jeweils 24 Vertiefungen durchgeführt. Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät und mit den Verbindungen über einen Zeitraum von 24 h und 48 h inkubiert. Anschließend wurde die Zellviabilität wurde mittels der Trypan Blau-Ausschlussmethode bestimmt. To determine cytotoxic effects and to determine suitable concentrations for the subsequent experiments, we carried out a cell viability determination according to the Trypan blue exclusion method using a Neubauer chamber. by. The viability studies with K562 cells were carried out in 24-well plates. The cells were seeded at a cell density of 2 × 10 ⁵ cells / ml and incubated with the compounds over a period of 24 h and 48 h. The cell viability was then determined using the Trypan blue exclusion method.

Der ED₅₀-Wert gibt diejenige Konzentration der zu prüfenden Verbindung an, die zu einer 50%igen Induktion von Zelltod führt. Die ED₅₀-Werte wurden graphisch ermittelt, wie für die Beispiele 7 and 8 (Figure 3) gezeigt. Die Ergebnisse fasst Tabelle 3 zusammen. The ED ₅₀ value indicates the concentration of the compound to be tested which leads to a 50% induction of cell death. The ED ₅₀ values were determined graphically, as shown for Examples 7 and 8 (Figure 3). The results are summarized in Table 3.

Die ED₅₀ Werte wurden für die Verbindungen 1, 3, 4, 7 and 8 nach Inkubationszeiten von 24 h and 48 h bestimmt. Die ED₅₀ Werte für 7 and 8 betrugen jeweils 6 µM, die unsubstituierte Verbindung 1 dagegen war mit einem ED₅₀ von 60 µM etwa um den Faktor 10 weniger potent. The ED ₅₀ values were determined for the compounds 1, 3, 4, 7 and 8 after incubation times of 24 h and 48 h. The ED ₅₀ values for 7 and 8 were 6 µM each, while the unsubstituted compound 1, on the other hand, was less potent by a factor of 10 with an ED ₅₀ of 60 µM.

Example 4 Morphological changes in K562 cells

Interessanterweise kam es nach Inkubation der K562 Zellen mit den Benzylidenen sehr rasch zu morphologischen Veränderungen (Abb. 4), die den durch Vinblastin hervorgerufenen typischen Elongationen sehr ähnlich waren. Da es sich beim Vinblastin um einen bekannten Hemmstoff der Tubulinpolymerisation handelt, vermuteten wir für unsere Verbindungen ebenfalls eine Interaktion mit der Tubulinasssemblierung. Interestingly, after incubation of the K562 cells with the benzylidenes, morphological changes occurred very quickly ( Fig. 4), which were very similar to the typical elongations caused by vinblastine. Since vinblastine is a well-known inhibitor of tubulin polymerization, we also suspected that our compounds would interact with the tubulin assembly.

Example 5 Growth-inhibiting properties compared to other tumor cell lines

Wir prüften die aktivsten unserer Verbindungen (2, 4, 7, and 8) auf wachstumshemmende Eigenschaften (Table 2) unter Verwendung eines Propidiumiodid-Fluoreszenzassays nach einer von Dengler et al. etablierten Methode.²³ Wiederum erwies sich 10-[3-Hydroxy-4- Methoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon 8 als die, aktivste Verbindung innerhalb dieser Serie und zeigte stark wachstumshemmende Eigenschaften gegenüber allen verwendeten Zell- Linien. Insbesondere erwies sich die Verbindung sehr aktiv gegenüber der OVCAR-3 Zell- Linie (IC₅₀ = 0.06 µM). We tested the most active of our compounds (2, 4, 7, and 8) for growth-inhibiting properties (Table 2) using a propidium iodide fluorescence assay according to one of Dengler et al. established method. ²³ Again, 10- [3-hydroxy-4-methoxy-benzylidene]] - 9 (10H) -anthracenone 8 proved to be the most active compound in this series and showed strong growth-inhibiting properties compared to all cell lines used. In particular, the compound was found to be very active against the OVCAR-3 cell line (IC ₅₀ = 0.06 µM).

Example 6 Flow cytometric studies (FACS analysis)

Beim Tubulin handelt es sich um das intrazelluläre Target bekannter krebswirksamer Verbindungen, wie z. B. Vinblastin, Colchicin, Podophyllotoxin oder Combretastatin A4. Paclitaxel (Taxol®) und Vinblastin stellen beispielsweise krebswirksame Verbindungen mit signifikanter klinischer Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Tumoren dar. Beide Substanzen bedingen eine Blockade des Zellzyklus in der G2/M-Phase. In der Folge kommt es zur DNA-Fragmentierung und den morphologischen Merkmalen der Apoptose²⁴. Tubulin is the intracellular target of known carcinogenic compounds, such as. B. vinblastine, colchicine, podophyllotoxin or Combretastatin A4. Paclitaxel (Taxol®) and vinblastine, for example, are carcinogenic compounds with significant clinical activity against a large number of tumors. Both substances block the cell cycle in the G2 / M phase. As a result, DNA fragmentation and the morphological features of apoptosis ^{24 occur} .

Wir untersuchten den Einfluss von Verbindung 8 auf die zelluläre DNA-Verteilung in K562- Zellen im Vergleich mit Vinblastin als Referenzsubstanz. K562 Zellen wurden mit 8 über einen Zeitraum von 24 h inkubiert. Das Verteilungsmuster des DNA-Gehaltes auf die verschiedenen Abschnitte des Zellzyklus wurde mittels der Durchflusszytometrie untersucht. Für Verbindung 8 fanden wir eine Blockade des Zellzyklus in der G2/M-Phase bei einer Konzentration von 0.1 µg/ml (Abb. 5). We examined the influence of compound 8 on the cellular DNA distribution in K562 cells in comparison with vinblastine as reference substance. K562 cells were incubated with 8 over a period of 24 h. The distribution pattern of the DNA content over the different sections of the cell cycle was examined by means of flow cytometry. For compound 8 we found a blockage of the cell cycle in the G2 / M phase at a concentration of 0.1 µg / ml ( Fig. 5).

Example 7 Western blotting studies to inhibit tubulin assembly

Eine Interaktion mit dem Tubulinsystem kann mittels verschiedener in vitro Assays nachgewiesen werden. Wir verwendeten eine von Minotti et al. etablierte Methode²⁵, die wir leicht modifizierten. Interaction with the tubulin system can be demonstrated using various in vitro assays. We used one of Minotti et al. established method ²⁵ , which we modified slightly.

Bei den Mikrotubuli handelt es sich um hochdynamische Strukturen, die sich in einem instabilen Gleichgewicht mit dem Pool an löslichen Tubulindimeren in der Zelle befinden. Es kommt zu einem permanenten Einbau freier Dimere in polymerisierte Strukturen sowie zu einer Freisetzung von Dimeren in den löslichen Tubulinpool. Daher können Tubulinassays unter Verwendung von Western Blotting Methoden zur Bestimmung des Verhältnisses von polymerisiertem zu unpolymerisiertem Tubulin herangezogen werden.²⁶ Antimikrotubuli-wirksame Verbindungen wie z. B. das Vinblastin führen zu einer Disintegration der Mikrotubuli in Untereinheiten oder bedingen eine Stabilisierung der Mikrotubuli im Falle des Taxols. The microtubules are highly dynamic structures that are in an unstable equilibrium with the pool of soluble tubulin dimers in the cell. There is a permanent incorporation of free dimers in polymerized structures and a release of dimers in the soluble tubulin pool. Therefore, tubulin assays can be used using Western blotting methods to determine the ratio of polymerized to unpolymerized tubulin. ²⁶ antimicrotubule-active compounds such. B. vinblastine lead to disintegration of the microtubules in subunits or cause stabilization of the microtubules in the case of taxol.

Die Zellen wurden in Schalen von 60 mm Durchmesser (Costar) mit einer Zelldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät. Die Gesamtzell-Zahl betrug 10⁶ Zellen. Die Zellen wurden mit den zu prüfenden Verbindungen über einen Zeitraum von 24 h inkubiert. The cells were seeded in dishes of 60 mm diameter (Costar) with a cell density of 2 × 10 ⁵ cells / ml. The total number of cells was 10 ⁶ cells. The cells were incubated with the compounds to be tested over a period of 24 hours.

Danach wurden die Zellen 2× mit PBS-Puffer gewaschen (ohne Ca²⁺ and Mg²⁺) und anschließend in 70 µl hypotonischem Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 0.5% NP-40, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Benzamidin] unter Zusatz von 4 µg/ml Paclitaxel^{25, 26}, bei 37°C im Dunkeln, lysiert. Nach kräftigem Durchmischen (Vortex) wurden jeweils 60 µl Suspension aus jedem Eppendorff Gefäß in ein neues überführt und zunächst eine Proteinbestimmung durchgeführt (Bio-Rad Protein Assay®). Aliquots von jeweils 50 µl der Zell-Lysate wurden bei Raumtemperatur zentrifugiert (14,000 rpm, für 15 min). Die Überstände mit zytosolischem (löslichem) Tubulin wurden sehr sorfältig von den Pellets mit zytosolischem (polymerisiertem) Tubulin separiert. Die Pellets wurden in Lysepuffer resuspendiert [50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 125 mM NaCl, 0.5% NP-40, 0.1 mg/ml Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid] und kräftig durchmischt (Vortex). Nach Zentrifugation bei Raumtemperatur (14,000 rpm for 15 min) wurden die Überstände sorgfältig abgenommen und dann in neue Eppendorff-Gefäße überführt. Fraktionen von löslichem und polymerisiertem Tubulin wurden jeweils mit 22.5 µl von 3× SDS-PAGE Probenpuffer (3× Probenpuffer: 150 mM Tris-HCl (pH 6.8), 30% (m/v) Glycerol, 3% SDS, Bromophenol Blau 3%, 150 µl/ml 2-Mercaptoethanol) versetzt, für 5 min bei 95°C erhitzt und dann mittels SDS-PAGE auf einem 9% Gel analysiert. Die Zell-Lysate wurden anschließend auf Hybond-P PVDF Membranen transferiert, unspezifische Bindungsstellen mittels Trockenmilch (10%, non fat) in TBS-Tween über 1 h blockiert. Anschließend wurde mit einem primären anti-α-Tubulin-Antikörper inkubiert. Die Membranen wurden mehrmals mit TBS-Tween gewaschen. Dann wurde mit einem sekundären Meerettich-Peroxidase gekoppelten anti-Maus IgG (in TBS-Tween) inkubiert. Das Substrat wird anschließend mit einem Western Blot Chemolumineszenz Reagenz visualisiert. The cells were then washed twice with PBS buffer (without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ ) and then in 70 μl hypotonic buffer [20 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1 mM MgCl ₂ , 2 mM EGTA, 0.5% NP-40, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM benzamidine] with the addition of 4 μg / ml paclitaxel ^{25, 26} , at 37 ° C. in the dark, lysed. After vigorous mixing (vortex), 60 µl suspension was transferred from each Eppendorff tube to a new one and a protein determination was first carried out (Bio-Rad Protein Assay®). Aliquots of 50 μl each of the cell lysates were centrifuged at room temperature (14,000 rpm, for 15 min). The supernatants with cytosolic (soluble) tubulin were separated very carefully from the pellets with cytosolic (polymerized) tubulin. The pellets were resuspended in lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 125 mM NaCl, 0.5% NP-40, 0.1 mg / ml leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride] and mixed vigorously (vortex). After centrifugation at room temperature (14,000 rpm for 15 min), the supernatants were carefully removed and then transferred to new Eppendorff tubes. Fractions of soluble and polymerized tubulin were each mixed with 22.5 µl of 3 × SDS-PAGE sample buffer (3 × sample buffer: 150 mM Tris-HCl (pH 6.8), 30% (m / v) glycerol, 3% SDS, bromophenol blue 3% , 150 µl / ml 2-mercaptoethanol), heated for 5 min at 95 ° C and then analyzed by SDS-PAGE on a 9% gel. The cell lysates were then transferred to Hybond-P PVDF membranes, and non-specific binding sites were blocked using dry milk (10%, non-fat) in TBS-Tween for 1 h. It was then incubated with a primary anti-α-tubulin antibody. The membranes were washed several times with TBS-Tween. Then was incubated with a secondary horseradish peroxidase coupled anti-mouse IgG (in TBS-Tween). The substrate is then visualized with a Western blot chemiluminescent reagent.

Das Experiment wurde auch konzentrationsabhängig durchgeführt, wobei die zuvor gemachten Beobachtungen bestätigt werden konnten. The experiment was also performed depending on the concentration, the previous ones observations made could be confirmed.

Example 8 Microtubule assembly-turbidimetric assay Principle of the method

Bei physiologischer Temperatur und in Gegenwart von Kofaktoren (GTP und Mg²⁺-Ionen) assembliert das Mikrotubuliprotein (MTP) in vitro unter Mikrotubulibildung. Dieser Prozess ist umkehrbar. Antagonisten der Assemblierung, wie z. B. Ca²⁺-Ionen oder auch niedrige Temperaturen (für Mikrotubuli aus Säugerhirn Temperaturen < 10°C) bedingen eine Disassemblierung, Promotoren dagegen bedingen eine Stabilisierung. Die Kinetiken und "steady state"-Bedingungen der MT-Bildung sowie der MT-Disintegration könnendurch Zeit- und temperaturabhängige turbidimetrische Messungenbei 360 nm verfolgt werden. At physiological temperature and in the presence of cofactors (GTP and Mg ²⁺ ions), the microtubule protein (MTP) assembles in vitro to form microtubules. This process is reversible. Assembly antagonists such as B. Ca ²⁺ ions or low temperatures (for microtubules from mammalian brain temperatures <10 ° C) cause disassembly, promoters, however, require stabilization. The kinetics and steady state conditions of MT formation and MT disintegration can be followed by time and temperature dependent turbidimetric measurements at 360 nm.

Isolation of MTP and inhibition of MT assembly

Mikrotubuliprotein wurde aus Schweinehirn durch Zyklen temperaturabhängiger Disassemblierung/Reassemblierung nach einer von Shelanski et al. etablierten Methode gewonnen.²⁷. Zur Steigerung der Ausbeute wurden die Schritte der Reassemblierungin Gegenwart von Glycerol durchgeführt. Eine zufriedenstellende Reinheit des Mikrotubuliproteins war nach zwei Zyklen von Disassemblierung/Reassemblierung gewährleistet. Microtubuliprotein was extracted from pig brain by cycles of temperature-dependent disassembly / reassembly according to a method developed by Shelanski et al. established method. ²⁷ To increase the yield, the reassembly steps were carried out in the presence of glycerol. A satisfactory purity of the microtubule protein was ensured after two cycles of disassembly / reassembly.

Mikrotubuli zur Bestimmung antimikrotubulärer Effektoraktivitäten wurden durch in vitro Assemblierung von Mikrotubuliprotein erhalten. Die Mikrotubulikonzentration in den Assemblierungsstudien betrug 1 mg/ml (bestimmt nach dem Lowry Verfahren unter Verwendung von bovinem Serumalbumin). Die Mikrotubuli assemblierten in einem Puffer der Zusammensetzung 20 mM PIPES (1,4-Piperazinediethansulfonsäure, pK_a 6.8), 80 mM NaCl, 0.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (Ethyleneglykole-bis-(2-aminoethylen)-tetraessigsäure) nach Zugabe von 0.25 mM GTP (Guanosin-5'-triphosphat) und Erwärmung der Proben auf 37°C. Der Gleichgewichtszustand, erkennbar an der nicht weiter zunehmenden Menge an polymerisiertem Tubulin, wurde in den Turbiditätsmessungen nach einer Inkubationsdauer von 20 min erreicht. Microtubules for the determination of antimicrotubular effector activities were obtained by in vitro assembly of microtubuliprotein. The microtubule concentration in the assembly studies was 1 mg / ml (determined by the Lowry method using bovine serum albumin). The microtubules assembled in a buffer of the composition 20 mM PIPES (1,4-piperazine diethanesulfonic acid, pK _a 6.8), 80 mM NaCl, 0.5 mM MgCl ₂ , 1 mM EGTA (ethylene glycol bis (2-aminoethylene) tetraacetic acid) after addition of 0.25 mM GTP (guanosine 5'-triphosphate) and heating the samples to 37 ° C. The equilibrium state, recognizable by the no further increasing amount of polymerized tubulin, was reached in the turbidity measurements after an incubation period of 20 min.

Turbidimetric measurement

Die turbidimetrischen Messungen wurden spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 360 nm durchgeführt. Die Temperatur in der Assemblierungs-/Disassemblierungs Küvette wurde mittels einer Kryostat/Thermostat-Kombination reguliert. Die zu prüfenden Verbindungen wurden zu einer kalten MTP-Lösung (MTP Konzentration 1 mg/ml, Temperatur 2 bis 4°C) in PIPES Puffer (zur Zusammensetzung siehe oben) bei pH = 6.8 gegeben. Unmittelbar mit Beginn der Messung wurde die Temperatur auf 37°C erhöht. Nach einer kurzen "Gap-Phase" kommt es zur Assemblierung des MTP zu MT. Die Lösung trübt sich und erreicht nach ca. 20 min einen Gleichgewichtszustand. Um die Trübung von unspezifischen Proteinpräzipitaten zu unterscheiden, wird die Lösung auf 2°C gekühlt und für 5 min bei dieser Temperatur gehalten, was eine MT Disassemblierung bedingt. Die MTP Lösung wird erneut transparent. Bindet oder interferiert die zu prüfende Verbindung mit Tubulin, so nimmt der "steady state"-Zustand für Inhibitoren der Assemblierung ab bzw. zu für MT stabilisierende Substanzen. Der IC₅₀ Wert gibt diejenige Konzentration an, die eine 50%ige Abweichung vom "steady-state" Zustand bedingt. The turbidimetric measurements were carried out spectrophotometrically at a wavelength of 360 nm. The temperature in the assembly / disassembly cuvette was regulated using a cryostat / thermostat combination. The compounds to be tested were added to a cold MTP solution (MTP concentration 1 mg / ml, temperature 2 to 4 ° C.) in PIPES buffer (for the composition see above) at pH = 6.8. Immediately with the start of the measurement, the temperature was raised to 37 ° C. After a short gap phase, the MTP is assembled to MT. The solution becomes cloudy and reaches an equilibrium state after about 20 minutes. In order to distinguish the turbidity from non-specific protein precipitates, the solution is cooled to 2 ° C. and kept at this temperature for 5 minutes, which requires MT disassembly. The MTP solution becomes transparent again. If the compound to be tested binds or interferes with tubulin, the "steady state" state for inhibitors of the assembly decreases or increases for substances stabilizing for MT. The IC ₅₀ value indicates the concentration that causes a 50% deviation from the "steady-state" state.

Claims

1. A benzylidene-9 (10H) -anthracenone of the general formula I,

wherein the substituents R1-R4 can independently of one another stand for the following substituents: for hydrogen, for alkoxy (C1-C6), for alkyl (C1-C6), for aryloxy, for COOH, for SO ₃ H, for SO ₃ ^- M ⁺ (where M is a cation), for an ester group, for a thioester group, for CN; for an acyl radical, for an aryloxy group, for phenylmethoxy, nitro, hydroxy, amino, imino, mercapto, halogen; for a phosphate ester structure (-OP (O) (OM ⁺ ) 2) or a phosphoramidate (-NP (O) (OM ⁺ ) ₂ ), where M stands for a cation, or (-NP (O) (OR) ₂ ) where R is an alkyl radical with up to 8 carbon atoms (the two radicals R can be identical or different, it can be benzyl or aryl radicals).

2. A connection of claim 1 with the structure:

3. A connection of claim 1 with the structure:

4. A connection of claim 1 with the structure

5. A connection of claim 1 with the structure

6. A connection of claim 1 with the structure

7. A therapeutic composition with a pharmaceutically effective amount of one of the compounds according to claim 1 and a pharmaceutical effective carrier.

8. A pharmaceutical preparation according to claim 7, wherein the pharmaceutically active compound is the compound

is.