DE102012219880B4

DE102012219880B4 - METHOD FOR SOLID PHASE SULPHATING OF POLY (D-GLUCOSAMINE-CO-N-D-ACETYLGLUCOSAMINE) EN

Info

Publication number: DE102012219880B4
Application number: DE102012219880.6A
Authority: DE
Inventors: Susanne Höhne; Thomas Hanke; Hartmut Worch; Frank Simon; Christiane Heinemann
Original assignee: Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV; Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV; Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: DE102012219880A1

Abstract

Verfahren zur Festphasensulfatierung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, bei dem zur Vorbehandlung – zu Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en als Feststoff in Form von Folien, Fasern, textilen Gebilden, Halbzeugen oder Scaffolds – ein polares aprotisches oder protisches Lösungsmittel oder ein Gemisch aus mindestens einem polaren aprotischen oder protischen Lösungsmittel und einem schwach polaren Lösungsmittel – und/oder eine wässrige mehrbasige Säurelösung – und/oder mindestens ein Vernetzungsagens zur Vernetzung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosaminen – unter Erhalt der Festphase der Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e zugegeben werden, und – nachfolgend der Feststoff von der wässrigen mehrbasigen Säurelösung oder dem Vernetzungsagens abgetrennt wird, und – nachfolgend zu den vorbehandelten Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch und mindestens ein Sulfatierungsagens zugegeben werden.Process for the solid phase sulphation of poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) s, in which for pretreatment - to poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) s as a solid in the form of films, fibers, textile structures, semi-finished products or scaffolds - a polar aprotic or protic solvent or a mixture of at least one polar aprotic or protic solvent and a weakly polar solvent - and / or an aqueous polybasic acid solution - and / or at least one crosslinking agent for crosslinking poly (D-glucosamine-co -ND-acetylglucosamines - to give the solid phase of the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) s, and - subsequently the solid is separated from the aqueous polybasic acid solution or the crosslinking agent, and - subsequently to the pretreated poly ( D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) a solvent or solvent mixture and at least one sulfating agent added n become.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Chemie und der Medizin und betrifft ein Verfahren zur Festphasensulfatierung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, vorzugsweise Chitosan, wie es beispielsweise zur Ansiedelung von knochenaufbauenden Zellen oder als Hartgewebeersatz (Knochenersatz) zur Verbesserung der Biokompatibilität zum Einsatz kommen kann.The invention relates to the fields of chemistry and medicine and relates to a process for solid phase sulphation of poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) s, preferably chitosan, as for example for the establishment of bone-building cells or as a hard tissue replacement (bone replacement) can be used to improve biocompatibility.

Es ist bekannt, dass sulfatiertes Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin), insbesondere Chitosan besonders für die Ansiedlung von knochenaufbauenden Zellen (Osteoblasten) förderlich ist, so dass sulfatiertes Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin), vorzugsweise als Hartgewebeersatz (Knochenersatz), Verwendung finden kann. Bekannt ist auch die antithromogene, entzündungshemmende und antibakterielle Wirkung sulfatierten Chitosans, sodass solche Materialien auch als Implantate für Weichgewebe interessant erscheinen. Vorteilhaft ist auch, dass Chitosan und sulfatierte Chitosane im menschlichen Körper schadlos und vollständig resorbiert werden. Abbauprodukte werden schadfrei und vollständig ausgeschieden.It is known that sulfated poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine), in particular chitosan, is particularly conducive to the establishment of bone-building cells (osteoblasts) such that sulfated poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine), preferably as a hard tissue replacement (bone replacement), can be used. Also known is the antithromogeneous, anti-inflammatory and antibacterial effect sulfated chitosan, so that such materials also appear interesting as implants for soft tissue. It is also advantageous that chitosan and sulfated chitosans are completely and harmlessly absorbed in the human body. Degradation products are eliminated without damage and completely.

Seit einigen Jahren stehen Biomaterialien der dritten Generation im Vordergrund der Forschung, die nach Implantation die Selbstheilung des Gewebes unterstützen (Hench, L. L., et al: Science 295 (2002) 1014–1017). Im Falle des Knochenersatzes vereinen sie Resorbierbarkeit, Osteokonduktivität und -induktivität (Salgado, A. J., et al: Macromol. Biosci. 4 (2004) 743–765). Aufgrund seiner guten Bioverträglichkeit verbunden mit osteokonduktiver Wirkung sowie einer guten Verfügbarkeit gilt Chitosan als perspektivreiches Material für das orthopädische Tissue Engineering, wie allgemein für die regenerative Medizin. Bisher bekannte Produkte aus Chitosan oder mit Chitosananteil sind fast ausschließlich offenporige Schäume und Xerogele, die als Scaffold eingesetzt werden. Das Polyaminosaccharid Chitosan ist ein N-deacetyliertes Derivat des natürlich vorkommenden Biopolymers Chitin. Dieses stellt die Hauptkomponente in den Schalen von Krustentieren und im Exoskelett von Insekten, ist aber auch in den Zellwänden einiger Pilze zu finden. In einem Prozess, der bei Temperaturen von etwa 120 °C ein bis drei Stunden in 40-%iger Natronlauge durchgeführt wird, erfolgt eine Deacetylierung des Chitins. Der Grad der Deacetylierung wird durch die Prozessparameter und -dauer bestimmt. Die erhaltene Substanz ist üblicherweise ein Copolymer aus N-acetylierten und deacetylierten Glucosamineinheiten, die über β-1,4-glykosidische Bindungen linear verknüpft sind (Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin). Ab einer 50-%igen Deacetylierung wird von Chitosan gesprochen. For a number of years, biomaterials of the third generation have been in the forefront of research, which support the self-healing of the tissue after implantation (Hench, L.L., et al: Science 295 (2002) 1014-1017). In the case of bone replacement, they combine absorbability, osteoconductivity and inductance (Salgado, A.J., et al: Macromol Biosci 4 (2004) 743-765). Due to its good biocompatibility combined with osteoconductive effect and good availability, chitosan is regarded as a promising material for orthopedic tissue engineering, as well as for regenerative medicine in general. Previously known products of chitosan or chitosan are almost exclusively open-cell foams and xerogels, which are used as a scaffold. The polyaminosaccharide chitosan is an N-deacetylated derivative of the naturally occurring biopolymer chitin. This is the major component in the shells of crustaceans and the exoskeleton of insects, but is also found in the cell walls of some fungi. In a process which is carried out at temperatures of about 120 ° C for one to three hours in 40% sodium hydroxide, there is a deacetylation of chitin. The degree of deacetylation is determined by the process parameters and duration. The substance obtained is usually a copolymer of N-acetylated and deacetylated glucosamine units linked linearly via β-1,4-glucosidic bonds (poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine).) Starting from a 50% deacetylation spoken by Chitosan.

Chitosan wird vor allem aufgrund seiner guten Biokompatibilität und Biodegradierbarkeit ein großes Potential für zahlreiche Anwendungen im Bereich des Gewebeersatzes zugesprochen. Das Vorhandensein von Aminogruppen eröffnet einerseits gute Möglichkeiten zur Derivatisierung und Immobilisierung funktioneller Moleküle und ist selbst ein Grund der Biofunktionalität des Chitosans. Seine physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie Viskosität und Löslichkeit werden beim Chitosan wesentlich durch dessen Molekulargewicht und Deacetylierungsgrad bestimmt. Während reines Chitin in Wasser, verdünnten Säuren und Laugen sowie in vielen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, lässt sich Chitosan in schwach sauren Lösungen je nach Deacetylierungsgrad bis zu einem pH-Wert von etwa 6,5 lösen. Dabei wird das Chitosan zu einem kationischen Polyelektrolyt. Ein höherer Deacetylierungsgrad führt zu einer verbesserten Löslichkeit. Mit steigendem pH-Wert deprotonieren die Aminogruppen, was zur Ausfällung des Chitosans führt. Als Folge der aufgeführten Abhängigkeit der Löslichkeitseigenschaften vom pH-Wert ergibt sich eine vergleichsweise leichte Verarbeitbarkeit des Chitosans und ermöglicht Anwendungen für den membran-, film-, faser-, schaum- und gelbildenden Einsatz.Due to its good biocompatibility and biodegradability, chitosan has great potential for numerous applications in the area of tissue replacement. On the one hand, the presence of amino groups offers good possibilities for the derivatization and immobilization of functional molecules and is itself a reason for the biofunctionality of chitosan. Its physical and chemical properties, such as viscosity and solubility in chitosan are essentially determined by its molecular weight and degree of deacetylation. While pure chitin is insoluble in water, diluted acids and alkalis as well as in many organic solvents, chitosan can be dissolved in weakly acidic solutions depending on the degree of deacetylation up to a pH of about 6.5. The chitosan becomes a cationic polyelectrolyte. A higher degree of deacetylation leads to improved solubility. As the pH increases, the amino groups deprotonate, resulting in precipitation of the chitosan. As a consequence of the mentioned dependence of the solubility properties on the pH, a comparatively easy processability of the chitosan results and permits applications for the membrane-, film-, fiber-, foam- and gel-forming use.

In den vergangenen 20 Jahren wurde Chitosan für Anwendungen im biomedizinischen Bereich erschlossen (Uragami, T., et al: Material Science of Chitin and Chitosan, Kodansha und Springer, Tokyo und Berlin (2006)). Gute Eignungen ergaben sich in Form von Wundauflagen im Hautbereich und als Nahtmaterial. In diesen Fällen kommen besonders die hämostatische Wirkung sowie die bakteriostatischen Eigenschaften des Chitosans zum Tragen. Chitosan has been developed for biomedical applications over the past 20 years (Uragami, T., et al: Material Science of Chitin and Chitosan, Kodansha and Springer, Tokyo and Berlin (2006)). Good suitability resulted in the form of wound dressings in the skin area and as sutures. In these cases, the haemostatic effect and the bacteriostatic properties of chitosan are particularly important.

Ein weiteres bedeutendes Anwendungsgebiet hat sich mit dem Einsatz von Chitosan als Wirkstoffträger eröffnet. So macht man vor allem im pharmazeutischen Bereich von der Möglichkeit des gezielten Transports (Drug delivery) und der kontrollierten Freigabe (Drug release) von Medikamenten Gebrauch (Kumar, M. N. V. R., et al: Chem. Rev. (2004) 6017–6084).Another important field of application has opened up with the use of chitosan as a drug carrier. Thus, the possibility of targeted delivery (drug delivery) and controlled release (drug release) of drugs is used primarily in the pharmaceutical field (Kumar, M.N.V.R., et al. Chem. Rev. (2004) 6017-6084).

Den Einsatz im Bereich des Tissue Engineering verdankt Chitosan der Tatsache, dass es mit Hilfe etablierter Methoden zu porösen Trägerstrukturen verarbeitet werden kann. Darüber hinaus wirkt sich besonders die hydrophile Oberfläche des Chitosans förderlich auf die Zelladhäsion und -proliferation aus (Suh, J. K., et al: Biomaterials 21 (2000) 2589–2598). Bei verschiedenen Zelltypen wie u.a. Chondrozyten, dermalen Fibroblasten und Hepatozyten wird durch die Gegenwart von Chitosan die Adhäsion und Proliferation verbessert. Chitosan owes its use in the area of tissue engineering to the fact that it can be processed into porous carrier structures with the help of established methods. In addition, especially the hydrophilic surface of the chitosan promotes cell adhesion and proliferation (Suh, J.K., et al: Biomaterials 21 (2000) 2589-2598). For various cell types, such as u.a. Chondrocytes, dermal fibroblasts and hepatocytes are enhanced by the presence of chitosan's adhesion and proliferation.

In Bezug auf den Einsatz als Knochenersatzmaterial gelten die osteokonduktiven Eigenschaften des Chitosans sowie seine Fähigkeit zur Förderung der Knochenneubildung in-vitro und in-vivo als bewiesen. Lahiji, A., et al: J Biomed Mater. Res. 51 (2000) 586–595 zeigten, dass humane Osteoblasten auf Chitosanfilmen ihre phänotypische Morphologie beibehalten und die Expression extrazellulärer Proteine gefördert wird. Den Einfluss von Chitosan auf die Differenzierung von Osteoblasten in-vitro ist ebenfalls untersucht worden. Die Ergebnisse belegen eine durch das Chitosan beschleunigte Differenzierung der Osteoprogenitorzellen. With regard to the use as a bone substitute material, the osteoconductive properties apply of chitosan and its ability to promote bone regeneration in vitro and in vivo. Lahiji, A., et al .: J Biomed Mater. Res. 51 (2000) 586-595 showed that human osteoblasts on chitosan films retain their phenotypic morphology and promote the expression of extracellular proteins. The influence of chitosan on the differentiation of osteoblasts in vitro has also been investigated. The results confirm chitosan-accelerated differentiation of the osteoprogenitor cells.

Weiterführende Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Verhalten von Chitosanscaffolds in-vivo. Nach Implantation adhärierten die Vorläufer der knochenbildenden Zellen an den Scaffolds, differenzierten zu Osteoblasten, proliferierten, und bildeten extrazelluläre Matrix, wodurch schließlich knochenähnliches Material in der Defektzone entstand. Außerdem wurde nachgewiesen, dass das Scaffoldmaterial Chitosan vollständig resorbiert wird (Muzzarelli, R. A., et al: Biomaterial 15 (1994) 1075–1081). In einer aktuellen Arbeit wird der Einfluss des Deacetylierungsgrads des Chitosans gegenüber humanen Osteoblasten untersucht. Bei porösen Chitosanscaffolds zeigte sich eine zunehmende Verbesserung der Adhäsion, Zellspreitung und Proliferation mit steigendem Deacetylierungsgrad, was mit dem unterschiedlichen Anteil freier Aminogruppen an der Scaffoldoberfläche begründet wird. Dieser Einfluss wird oftmals auf unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den protonierten Aminogruppen des Chitosans und den negativ geladenen Carboxyl- und Sulfatgruppen in den GAG der Proteoglykane an den Zelloberflächen zurückgeführt. Weitere Untersuchungen wurden zur Kombinationen von gelöstem Chitosan mit anderen Polymeren durchgeführt. Die Wechselwirkungen von Chitosan mit Kollagen wurden hinsichtlich der Mechanismen in Bezug auf die Fibrillogenese eingehend untersucht. Unter anderem wurden Schwämme aus einem Blend gewonnen, die auf ihre Eignung für das Tissue Engineering von Knochen hin untersucht wurden. Fasern aus Kollagen/Chitosan-Blends wurden mit Hilfe des Elektrospinnverfahrens hergestellt. Die biomimetische Bildung von Apatit-Nanostrukturen, die bedeutsam für eine schnelle Knochenneubildung sind, wurde bisher in Chitosan/Xerogelen und offenporigen Chitosansaffolds nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die Hydroxylapatit-Mineralisierung (HAP) das Wachstum von osteoblastenähnlichen Zellen (SAOS-2) befördert. HAP fördert auch die Wirkung von immobilisierten Wachstumsfaktoren, wie das im Vorhaben vorgesehene BMP-2. Für Fasern ist die biomimetische HAP-Bildung noch nicht untersucht. Die einzige bekannte Vorarbeit betrifft die Einarbeitung von HAP in elektroversponnene Nanofasern aus einem PLG/Chitosan-Blend.Further studies focused on the behavior of chitosan scaffolds in vivo. Upon implantation, the precursors of the bone-forming cells adhered to the scaffolds, differentiated into osteoblasts, proliferated, and formed extracellular matrix, eventually forming bone-like material in the defect zone. In addition, it has been demonstrated that the scaffold material chitosan is completely resorbed (Muzzarelli, R.A., et al: Biomaterial 15 (1994) 1075-1081). In a recent work the influence of the degree of deacetylation of chitosan on human osteoblasts is investigated. Porous chitosan scaffolds showed an increasing improvement of adhesion, cell spreading and proliferation with increasing degree of deacetylation, which is explained by the different proportion of free amino groups on the scaffold surface. This influence is often attributed to unspecific electrostatic interactions between the protonated amino groups of chitosan and the negatively charged carboxyl and sulfate groups in the GAG of the proteoglycans at the cell surfaces. Further investigations were carried out on combinations of dissolved chitosan with other polymers. The interactions of chitosan with collagen have been extensively studied for mechanisms related to fibrillogenesis. Among other things, sponges were obtained from a blend, which were examined for their suitability for bone tissue engineering. Fibers of collagen / chitosan blends were made by the electrospinning process. The biomimetic formation of apatite nanostructures, which are important for rapid bone regeneration, has been demonstrated to date in chitosan / xerogels and open-cell chitosan anglosis. Hydroxylapatite mineralization (HAP) has been shown to promote the growth of osteoblast-like cells (SAOS-2). HAP also promotes the effects of immobilized growth factors, such as the projected BMP-2. For fibers, biomimetic HAP formation has not been studied. The only known preliminary work concerns the incorporation of HAP into electrospun nanofibers from a PLG / chitosan blend.

Prinzipiell können textile Scaffolds einerseits mittels Stick- oder Stricktechniken sowohl aus Fasern als auch aus Filamentgarnen, andererseits mittels Elektrospinnverfahren als komplette Faserkonstrukte (Fibre meshs) hergestellt werden. Bei den bisher verwendeten Fasern handelte es sich um kurze Stücke, die für maschinelle Stick- oder Stricktechniken weniger geeignet waren und manuell zu Scaffolds verarbeitet wurden. Dagegen sind Filamentgarne aus mehreren einzelnen Filamenten gesponnen und als sogenannte Endlosgarne maschinell verarbeitbar. In principle, textile scaffolds can be produced on the one hand by means of embroidery or knitting techniques both from fibers and from filament yarns, on the other hand by means of electrospinning processes as complete fiber constructs (fiber meshes). The fibers used so far were short pieces that were less suitable for machine embroidery or knitting techniques and were manually processed into scaffolds. In contrast, filament yarns are spun from several individual filaments and machine-processable as so-called endless yarns.

Textile Scaffolds bieten gegenüber geschäumten oder auf anderem konventionellen Wege hergestellten Strukturen wesentliche Vorteile, weil sich aus ihnen in vorbedachter Weise zwei- und dreidimensionale Architekturen entwickeln lassen. Es ist bekannt, dass die dreidimensionale Architektur von Scaffolds nachhaltig deren Wechselwirkungen mit lebenden Zellen und Geweben beeinflussen. Aus diesem Grund ist deren reproduzierbare Gestalt für exakte zellbiologische Untersuchungen von unschätzbarem Wert. Dies ist erst recht der Fall, wenn Derivatisierungen oder die Zugabe weiterer Komponenten hinzukommen. Von den dreidimensionalen Trägerstrukturen wird weiterhin eine hohe Porosität gefordert, die das Einwachsen von Zellen sowie das Einsprießen von Blutgefäßen zur Versorgung der Gewebszellen gewährleisten soll. Das kann durch die gezielte Einstellung der Maschenweiten (dreistelliger µm-Maßstab) leicht realisiert werden. Weiterhin bieten textile Scaffolds aus Fasermaterialien oder Filamentgarnen prinzipiell die Möglichkeit, kraftflussgerechte Konstrukte aufzubauen. Auch aus diesem Grund erschien der Übergang zu Chitosanfasern und -filamentgarnen, die über bekannte Technologien entsprechend ihrer zu erwartenden mechanischen Beanspruchung formbar sind (z.B. Herstellung kraftflussoptimierter Gesticke), sinnvoll. Textile scaffolds offer significant advantages over foamed or otherwise conventionally produced structures, because they can be used to design two- and three-dimensional architectures. It is well known that the three-dimensional architecture of scaffolds has a lasting influence on their interactions with living cells and tissues. For this reason, their reproducible shape is invaluable for accurate cell biology studies. This is certainly the case when derivatizations or the addition of other components are added. Of the three-dimensional support structures, a high porosity is still required, which is to ensure the ingrowth of cells and the ingress of blood vessels to supply the tissue cells. This can be easily achieved by the targeted setting of the mesh sizes (three-digit μm scale). In addition, textile scaffolds made of fiber materials or filament yarns basically offer the possibility of constructing force-flow-oriented constructs. Also for this reason, the transition to chitosan fibers and filament yarns, which are formable via known technologies according to their expected mechanical stress (e.g., production of flow optimized yarns), appeared expedient.

Trotz der bekannten Vorteile ist die Möglichkeit, textile Scaffolds aus Chitosanfilamenten herzustellen und diese als Trägerstruktur für das Tissue Engineering einzusetzen, bis heute nur in Ansätzen untersucht. So existieren nur wenige Berichte über textile Strukturen aus Filamentgarnen oder über den Einsatz von Chitosan als Fasermaterial für das Tissue Engineering. Meist werden die Filamentgarne nicht allein, sondern gemeinsam mit anderen Fasern verstickt und stellen somit nur eine Modifikation des eigentlichen Matrixgewebes dar. Erste textile Scaffolds aus reinen Chitosanfasern und -garnen wurden an der TU Dresden hergestellt. Ihr großes Potenzial wurde anhand der Besiedlung mit knochenbildenden Zellen demonstriert (Heinemann, C. et al: Biomacromolecules 9 (2008) 2913–2920). Weiterhin wurden Chitosanfaserkonstrukte (Fibre meshs) hergestellt und untersucht. Diese wurden als komplett geformte Scaffolds hergestellt, die Durchmesser der in den Konstrukten enthaltenen Fasern lagen im einstelligen Mikrometer- bis Nanometerbereich. Häufig wurden mit dieser Methode wiederum Kompositmaterialien hergestellt. Einzelne separierbare Nanofasern zum Teil aus Chitosan sind ebenfalls bekannt und dienen zur Herstellung von Non-woven-textiles. Aber auch diese Fibre meshs wurden bisher nur hinsichtlich ihrer Eignung als Knochenersatzmaterial mit bioaktiven Calciumphosphatschichten und mit osteoblastenähnlichen Tumorzellen (SAOS-2) besiedelt, untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass keine toxischen Reaktionen auftreten und die Zellaktivität durch eine Apatitbeschichtung erhöht werden kann. Der Einfluss der Maschenweite und der Porengröße auf die Resorbierbarkeit der Fibre meshs bei einer Besiedlung mit SAOS-Zellen ist auch untersucht worden. Despite the known advantages, the possibility of producing textile scaffolds from chitosan filaments and using them as a support structure for tissue engineering has only been studied to a limited extent. Thus, there are only a few reports on textile structures made of filament yarns or on the use of chitosan as a fiber material for tissue engineering. In most cases, the filament yarns are not reinforced alone but together with other fibers and thus represent only a modification of the actual matrix fabric. The first textile scaffolds made of pure chitosan fibers and yarns were produced at the TU Dresden. Their great potential was demonstrated by colonization with bone-forming cells (Heinemann, C. et al: Biomacromolecules 9 (2008) 2913-2920). Furthermore, chitosan fiber (fiber mesh) constructs were prepared and tested. These were made as completely shaped scaffolds, the diameter of the The fibers contained in the constructs were in the single-digit micrometer to nanometer range. Frequently, composite materials were once again produced using this method. Individual separable nanofibers, some of which are chitosan, are also known and are used to produce non-woven textiles. But even these fibrous meshes have been studied so far only in terms of their suitability as a bone substitute material with bioactive calcium phosphate layers and with osteoblast-like tumor cells (SAOS-2). It was shown that no toxic reactions occur and the cell activity can be increased by an apatite coating. The influence of the mesh size and the pore size on the resorbability of the fibrous meshes in a colonization with SAOS cells has also been investigated.

Chitosanfasern können außerdem zur Stabilisierung von Calciumphosphatzementen und Poly(methylmethacrylat) dienen, die für den Knochenersatz verwendet werden. Hierbei wird Fasermaterial in den abbindenden Knochenzement eingebracht und wirkt verstärkend, d.h. es gibt keine vorgeformte textile Struktur, weder als Faserkonstrukt, noch als Gewebe.Chitosan fibers may also serve to stabilize calcium phosphate cements and poly (methyl methacrylate) used for bone replacement. Here, fiber material is introduced into the setting bone cement and acts reinforcing, i. there is no preformed textile structure, neither as a fiber construct nor as a fabric.

Verfahren zur Herstellung von Filamentgarnen aus Chitosan wurden bereits seit den 80er Jahren bekannt. Diese basieren meist auf einem Nassspinnprozess. Dabei wird sauer gelöstes Chitosan unter Hochdruck durch eine Düse in ein alkalisches Koagulationsbad gespritzt, was zur sofortigen Ausfällung des Chitosans in Filamentform führte. Die verfahrenstechnischen Schritte wurden mit dem Ziel der Filamentoptimierung in den vergangenen Jahren intensiv weiterentwickelt. Trotz der Entwicklungen auf dem Gebiet der Nassspinntechnik sind reine Chitosanfilamentgarne oder -fadengelege, die textiltechnisch verarbeitbar sind, nach wie vor schwer herstellbar. Meist werden die Ausgangslösungen zur Fadenherstellung mit anderen polymeren Substanzen gemischt, wie beispielsweise Kollagen, Gelatine und Alginat. Als weitere Möglichkeit, Chitosanfasern sogar im Nanometermaßstab fertigen zu können, hat sich die so genannte Elektrospinntechnik etabliert. Processes for making filament yarns from chitosan have been known since the 1980's. These are usually based on a wet spinning process. Sourly dissolved chitosan is injected under high pressure through a nozzle into an alkaline coagulation bath, which leads to the immediate precipitation of the chitosan in filament form. The procedural steps have been intensively developed with the aim of optimizing filaments in recent years. Despite the developments in the field of wet spinning technology, pure chitosan filament yarns or thread scrims, which can be processed by textile technology, are still difficult to produce. Most of the starting solutions for filament production are mixed with other polymeric substances, such as collagen, gelatin and alginate. As a further possibility to be able to produce chitosan fibers even on the nanometer scale, the so-called electrospinning technique has become established.

Für den erfolgreichen Einsatz chitosanbasierter Scaffolds für das Tissue Engineering spielen neben der Biokompatibilität die Biodegradierbarkeit und die damit verbundenen Reaktionen eine entscheidende Rolle. Vor allem bei der Entwicklung von Knochenersatzmaterialien wird die Verwendung biodegradierbarer Polymere als entscheidender Ansatz gesehen. Hier empfiehlt sich Chitosan durch seine kontrollierbare Degradierbarkeit und vor allem die Nichttoxizität der dabei entstehenden Abbauprodukte. Der biologische Abbau (Biodegradation) von Chitosan und Chitosanderivaten ist unter unterschiedlichen Bedingungen in-vitro und in-vivo untersucht worden. So konnte bereits im Jahr 1969 gezeigt werden, dass der Deacetylierungsgrad und die Art der Präparation sowie der pH-Wert großen Einfluss auf die Aktivität des Lysozyms haben. Von Bedeutung ist, dass vollständig deacetyliertes Chitosan nicht durch Lysozym abgebaut werden kann. Ein Scaffold, der degradiert werden soll, muss demzufolge noch über acetylierte Einheiten verfügen. So werden unterschiedliche Deacetylierungsgrade des Chitins genutzt, um die In-vivo-Abbaugeschwindigkeit des Materials (pH-Wert ist nicht variabel) zu steuern. Die Abbauprodukte des Chitosans in-vivo sind vielgestaltig. Die identifizierten Produkte sind unbedenkliche Oligosaccharide (vorzugsweise Tetramere, Pentamere und Hexamers; d.h. Lysozym wirkt als Endozym), die einem weiteren Abbau durch Glucosaminidasen unterliegen. Die Abbaueigenschaften von Chitosanderivaten, die durch Umsetzen der Aminogruppen (z.B. N-Acetamide, N-Carboxyethylchitosan, quaternisierte Aminogruppen) oder der OH-Gruppen (z.B. Acylchitosane, O-Acetylchitosane) hergestellt wurden, sind ausführlich beschrieben worden. Weitere für den Chitosanabbau in Frage kommende Enzyme (Hydrolasen) sind Pektinase, Cellulase, Hemicellulase, Lipase, Amylase, Chitinase und Chitosanase.In addition to biocompatibility, biodegradability and the associated reactions play a decisive role in the successful use of chitosan-based scaffolds for tissue engineering. Especially in the development of bone replacement materials, the use of biodegradable polymers is seen as a crucial approach. Chitosan is recommended here for its controllable degradability and, above all, for the non-toxicity of the resulting degradation products. The biodegradation of chitosan and chitosan derivatives has been studied under different conditions in vitro and in vivo. For example, it was shown in 1969 that the degree of deacetylation and the type of preparation as well as the pH value have a major influence on the activity of the lysozyme. Importantly, completely deacetylated chitosan can not be degraded by lysozyme. A scaffold that is to be degraded must therefore still have acetylated units. Thus, different degrees of deacetylation of chitin are used to control the in vivo degradation rate of the material (pH is not variable). The degradation products of chitosan in vivo are multifarious. The identified products are harmless oligosaccharides (preferably tetramers, pentamers and hexamers, i.e. lysozyme acts as an endozyme) which undergo further degradation by glucosaminidases. The degradation properties of chitosan derivatives prepared by reacting the amino groups (e.g., N-acetamides, N-carboxyethyl chitosan, quaternized amino groups) or OH groups (e.g., acyl chitosans, O-acetyl chitosans) have been described in detail. Further enzymes (hydrolases) which are suitable for chitosan degradation are pectinase, cellulase, hemicellulase, lipase, amylase, chitinase and chitosanase.

Die wasserlöslichen Abbauprodukte sowie vornherein wasserlösliche Chitosanderivate sind für ihre entzündungshemmende Wirkung bekannt, z.B. durch den Eingriff in die monozytenbasierte Makrophagenaktivierung. Hierbei spielen Prozesse eine Rolle, die auch die Monozytenfusion zu Osteoklasten betrifft. Weiterhin fördern Chitosanabbauprodukte die Angiogenese. In Wechselwirkung mit verschiedenen GAG wirken sich diese fördernd auf die Bindung und Freisetzung von Wachstumsfaktoren (z.B. Basic fibroblast growth factor, bFGF) aus. Kulturen von Endothelzellen in Medien, die Abbauprodukte des Chitosans enthalten, zeigen die Beeinflussung der Expression von VEGF und MMP-2 in den betreffenden Zellen sowie die Ausbildung von Tube-like structures. Chitosan ist chemisch den Glykosaminoglykanen (GAG) verwandt, die als Bestandteile der extrazellulären Matrix (EZM) eine wichtige Rolle beim Knochenwachstum sowie an der Grenzfläche vom Hart- zum Weichgewebe spielen. Wie die GAG zeichnet sich Chitosan, das als lineares Glukosaminoglycan betrachtet werden kann, durch eine hohe Bindungsfähigkeit für Bestandteile der extrazellulären Matrix, Wachstumsfaktoren und Zytokine aus. The water-soluble degradation products as well as water-soluble chitosan derivatives are known for their anti-inflammatory activity, e.g. by engaging in monocyte-based macrophage activation. In this case processes play a role, which also concerns the monocyte fusion to osteoclasts. Furthermore, chitosan degradation products promote angiogenesis. In interaction with various GAGs, these promote the binding and release of growth factors (e.g., basic fibroblast growth factor, bFGF). Cultures of endothelial cells in media containing degradation products of chitosan show the influence of the expression of VEGF and MMP-2 in the respective cells as well as the formation of tube-like structures. Chitosan is chemically related to glycosaminoglycans (GAGs), which, as components of the extracellular matrix (ECM), play an important role in bone growth and at the interface between the hard and soft tissues. Like GAG, chitosan, which can be considered a linear glucosaminoglycan, is characterized by its high binding capacity for extracellular matrix components, growth factors and cytokines.

Die bekannten positiven Eigenschaften des Chitosans als Knochenersatzwerkstoffe legten den Gedanken nahe, ihr Anwendungsspektrum durch Derivatisierung des Chitosans bedeutend zu erweitern, um auf den Einheilungsprozess in vorbedachter Weise Einfluss zu nehmen. Über die Derivatisierung von Chitosan, meist jedoch mit anderen Zielstellungen, wird in einigen Arbeiten berichtet. Als besonders interessant erscheinen Derivatisierungen mit Phosphat- und Sulfatgruppen (Kim, I. Y., et al: Biotechn. Adv. 26 (2008) 1–21). Zweifelsfrei erweist sich das Einführen von Phosphaten in polymere Scaffolds als außerordentlich vorteilhaft für die Bioaktivität der Implantatmaterialien. Der als Bone Repairing Material beschriebene Knochenzement enthält nur 1,5 Ma.-% eines phosphorylierten Chitosans sowie Anteile von carboxyliertem und sulfatiertem Chitosan. Damit wird klar, dass die primäre Aufgabe des phosphorylierten Chitosans nicht primär im Ersatz des natürlichen Knochengewebes bestehen kann; vielmehr kommt dem derart modifizierten Chitosan die Verbesserung und biomimetische Steuerung der Biomineralisation zu.The well-known positive properties of chitosan as bone substitute materials suggested the idea of broadening their range of application by derivatization of chitosan in order to influence the healing process in a deliberate way. The derivatization of chitosan, but usually with different goals, is reported in several papers. Particularly interesting are derivatizations with Phosphate and sulfate groups (Kim, IY, et al: Biotechn. Adv. 26 (2008) 1-21). Undoubtedly, the introduction of phosphates into polymeric scaffolds proves to be extremely beneficial for the bioactivity of the implant materials. The bone cement described as Bone Repairing Material contains only 1.5% by weight of a phosphorylated chitosan as well as fractions of carboxylated and sulfated chitosan. Thus, it becomes clear that the primary task of the phosphorylated chitosan can not be primarily to replace the natural bone tissue; rather, the modified chitosan undergoes improvement and biomimetic control of biomineralization.

Eine Möglichkeit, die Affinität des Chitosans gegenüber Calciumionen zu erhöhen besteht in der Sulfatierung der Amino- und/oder OH-Gruppen des Chitosans. Ursprüngliches Ziel der Sulfatierung des Chitosans war es allerdings, synthetische Beschichtungsstoffe herzustellen, die die antithrombogen und antikoagulenten Eigenschaften des Heparins besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass schon geringe Mengen von Chitosan mit sulfatierten Aminogruppen ausreichten (0,6 %), um eine Bildung von Blutgerinnseln bei Gebrauch von Polyethylenkathedern vollständig zu unterbinden.One way to increase the affinity of chitosan for calcium ions is the sulfation of the amino and / or OH groups of chitosan. However, the original goal of the sulfation of chitosan was to produce synthetic coating materials that possess the antithrombogenic and anticoagulant properties of heparin. It could be shown that even small amounts of chitosan with sulfated amino groups were sufficient (0.6%) to completely prevent the formation of blood clots when using polyethylene catheters.

Zur Sulfonierung und Sulfatierung von Chitosan wurden eine Reihe von Synthesen beschrieben, bei denen die Reaktionen nicht regioselektiv (Reaktion an den 3-OH, 6-OH und/ oder 2-NH₂-Gruppen)] (Gamzazade, A. et al: Carbohydrate Polymers 34 (1997) 113–116; Xing, R. et al: Carbohydrate Polymers 61 (2005) 148–154) oder auch regioselektiv (Terbojevich, M. et al: Macromolecular Chemistry and Physics 190 (1989) 2847–2855; Baumann, H. et al: Carbohydrate Research 331 (2001)43–57) verlaufen. Allgemein benutzt werden Gemische aus Schwefelsäure und Chlorsulfonsäure (H₂SO₄/ClSO₃H) oder Komplexe mit SO₃ (z.B. Pyridin·SO₃). Die Protonierung der reaktiveren Aminogruppe sollte zwar zur bevorzugten Veresterung der OH-Gruppen führen; für die Steuerung der Reaktion schützt man aber durchaus bestimmte Gruppen und dirigiert so die Reaktion an die gewünschte Stelle (z.B. Schutz der 2-NH₂ und 3-OH Gruppen mit Cu-Ionen → Reaktion an der 6-OH Gruppe). Eine selektive Sulfonierung der Aminogruppe wurde beispielsweise mit dem Natriumsalz der Vinylsulfonsäure erreicht.For sulfonation and sulfation of chitosan a series of syntheses were described in which the reactions do not regioselective (reaction at the 3-OH, 6-OH and / or 2-NH ₂ groups)] (Gamzazade, A. et al: Carbohydrate Polymers 34 (1997) 113-116; Xing, R. et al: Carbohydrate Polymers 61 (2005) 148-154) or regioselectively (Terbojevich, M. et al: Macromolecular Chemistry and Physics 190 (1989) 2847-2855; Baumann , H. et al: Carbohydrate Research 331 (2001) 43-57). Generally used are mixtures of sulfuric acid and chlorosulfonic acid (H ₂ SO ₄ / ClSO ₃ H) or complexes with SO ₃ (eg pyridine · SO ₃ ). Although the protonation of the more reactive amino group should lead to the preferred esterification of the OH groups; For controlling the reaction, however, certain groups are definitely protected, thus directing the reaction to the desired site (eg protection of the 2-NH ₂ and 3-OH groups with Cu ions → reaction at the 6-OH group). Selective sulfonation of the amino group was achieved, for example, with the sodium salt of vinyl sulfonic acid.

Neben den antithrombogen und antikoagulenten Eigenschaften zeigt partiell sulfatiertes Chitosan auch antibakterielle, antivirale und antioxidative Eigenschaften, die den Stoff interessant für implantierbare Scaffolds erscheinen lassen. Der Einbau einer hinreichenden Anzahl von Sulfonat- oder Sulfatgruppen führt im Bereich des physiologischen pH-Werts zum Umladen des Chitosanmoleküls (von positiver zu negativer Nettoladung). Die Kombination von sulfatiertem Chitosan und unmodifiziertem Chitosan kann zum Aufbau supramolekulare Architekturen, zu Nano- oder Mikroobjekten, wie Nanopartikel, Hohlkugeln oder Schalen verwendet werden, die wiederum im medizinischen Bereich Anwendung als biokompatible Werkstoffe oder Drug-Delivery-Systems finden. Sowohl die OH- als auch die Aminogruppen im Chitosan eignen sich für das Ankondensieren von Aminosäuren und Peptiden. Um die Kondensation regioselektiv an der Aminogruppe ausführen zu können, muss die 6-OH Gruppe des Chitosans geschützt werden. Dies gelingt durch das Umsetzen des Chitosans mit Phthalsäureanhydrid in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder N,N-Dimethylformamid (DMF), wobei zunächst sowohl die 2-NH₂-Gruppen (unter Imidbildung) als auch die 6-OH Gruppen (unter Bildung des Phthalsäurehalbester) umgesetzt werden. Wird die Reaktion in einer wässrigen DMF-Lösung (5 Vol.-% Wasser) durchgeführt, so unterbleibt die Veresterung der 6-OH Gruppe vollständig. Die hydrolytisch leicht abspaltbare O-Phthaloylgruppe kann mittels Triphenylmethylchlorid (Umesterung) vollständig durch eine stabile Triphenylmethylschutzgruppe ersetzt werden. Das Abspalten der N-Phthaloylgruppe mittels Hydrazinlösung führt wieder zu primären Aminen, an die nun regioselektiv Amine oder Peptide kondensiert werden können. Weiterhin kann Acyl-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-βAla-OH (βAla ist ein Spacer und Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg ist eine Sequenz des Proteins Laminin, das die Zelladhäsion steuert) an Chitosan gepfropft werden, was anschließend als Antitumormittel Anwendung fand. Versuche mit der Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Sequenz wurden an N-Gly-Chitosan durchgeführt, was zu einer deutlichen Inhibierung der Adhäsion von B16BL6-Melanomzellen führte. Ein Umsetzen der 3-OH und 6-OH Gruppen des Chitosans mit Hexamethyldisilazan oder einem Gemisch aus Hexamethyldisilazan und Chlortrimethylsilan führte beim Chitosan im Gegensatz zum Chitin zu unvollständigen Umsätzen.In addition to the antithrombogenic and anticoagulant properties, partially sulfated chitosan also shows antibacterial, antiviral and antioxidant properties, which make the substance interesting for implantable scaffolds. The incorporation of a sufficient number of sulfonate or sulfate groups leads to the reloading of the chitosan molecule in the region of the physiological pH (from positive to negative net charge). The combination of sulfated chitosan and unmodified chitosan can be used to construct supramolecular architectures, nano- or micro-objects such as nanoparticles, hollow spheres or shells, which in turn find application in the medical field as biocompatible materials or drug delivery systems. Both the OH and the amino groups in chitosan are suitable for the condensation of amino acids and peptides. In order to carry out the condensation regioselectively at the amino group, the 6-OH group of chitosan must be protected. This is achieved by reacting the chitosan with phthalic anhydride in dimethylsulfoxide (DMSO) or N, N-dimethylformamide (DMF), initially both the 2-NH ₂ groups (with imide formation) and the 6-OH groups (to form the phthalic acid half ester ) are implemented. If the reaction is carried out in an aqueous DMF solution (5% by volume of water), the esterification of the 6-OH group is completely eliminated. The hydrolytically easily cleavable O-phthaloyl group can be completely replaced by triphenylmethyl chloride (transesterification) by a stable Triphenylmethylschutzgruppe. The cleavage of the N-phthaloyl group by means of hydrazine solution leads again to primary amines to which regioselectively amines or peptides can now be condensed. Furthermore, acyl-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-βAla-OH (βAla is a spacer and Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg is a sequence of the protein laminin that controls cell adhesion) can be grafted to chitosan, which subsequently used as an antitumor agent. Experiments with the Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg sequence were performed on N-Gly-chitosan, resulting in a marked inhibition of the adhesion of B16BL6 melanoma cells. Reaction of the 3-OH and 6-OH groups of chitosan with hexamethyldisilazane or a mixture of hexamethyldisilazane and chlorotrimethylsilane led to incomplete conversions in chitosan, in contrast to chitin.

Die nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Sulfatierung von Chitosan nutzen ausnahmslos homogene oder quasihomogene Reaktionen, nach denen als Hauptprodukt ein gelöstes Chitosan erhalten wird. Das wird entweder durch ein saures Reaktionsmilieu erreicht oder durch Vorbehandlungsschritte, wie Auflösen oder Ausfällen unmittelbar vor der Umsetzung. Zudem löst sich höher sulfatiertes Chitosan im basischen Milieu auf, so dass im Verlaufe der Sulfatierung im basischen Milieu oder in DMF-Lösung das Chitosan in Lösung übergeht. The processes known from the prior art for the sulfation of chitosan invariably use homogeneous or quasi-homogeneous reactions, according to which a dissolved chitosan is obtained as the main product. This is achieved either by an acidic reaction milieu or by pretreatment steps, such as dissolution or precipitation just prior to reaction. In addition, higher sulfated chitosan dissolves in the basic environment, so that in the course of sulfation in a basic medium or in DMF solution, the chitosan passes into solution.

Bekannt ist, dass Chitosan in mehrbasigen Säuren (z.B. Schwefelsäure) unlöslich ist. Solche Säuren werden sogar als physikalische Vernetzer eingesetzt. Die Protonierung der Aminogruppen (einwertiges Kation) im sauren Milieu führt dabei zu starken elektrostatischen Wechselwirkungen (Salzbildung) zum deprotonierten Säurerest (mehrwertiges Anion), wobei beispielsweise ein zweiwertiges Anion mit zwei einwertigen Kationen in Wechselwirkung tritt. Dem Anion kommt dabei die Funktion eines Ankers zu, der die Chitosanmoleküle inter- und intramolekular verbrückt. Auch die Regioselektivität der Sulfatierungsreaktion lässt sich in gewissem Maße durch die bevorzugte Protonierung der Aminogruppen im sauren Milieu beeinflussen. Liegen die Aminogruppen protoniert vor, findet die Sulfatierung vorrangig an den Hydroxygruppen statt. Hierbei ist aufgrund ihrer sterischen Anordnung die OH-Gruppe am Kohlenstoffatom C6 bevorzugt. Im basischen Milieu findet dagegen vorrangig ein Angriff an stärker nucleophilen Aminogruppen (in C2-Stellung) statt.It is known that chitosan is insoluble in polybasic acids (eg sulfuric acid). Such acids are even used as physical crosslinkers. The protonation of the amino groups (monovalent cation) in an acidic medium leads to strong electrostatic interactions (salt formation) to the deprotonated acid radical (polyvalent anion), for example, a divalent anion with two monovalent cations in Interaction occurs. The anion has the function of an anchor, which bridges the chitosan molecules inter- and intramolecularly. The regioselectivity of the sulfation reaction can also be influenced to some extent by the preferred protonation of the amino groups in an acidic medium. If the amino groups are protonated, sulfation takes place predominantly on the hydroxy groups. In this case, the OH group on the carbon atom C6 is preferred because of their steric arrangement. In the basic environment, on the other hand, an attack on predominantly nucleophilic amino groups (in C2 position) takes place predominantly.

Bekannt ist weiter nach DE 39 03 797 A1 ein Verfahren zur Herstellung von aktivierten Chitosanen und deren Verwendung bei der Herstellung von Chitosanderivaten, bei dem ein Chitosan mit einer Säure zur Salzbildung in einem Suspensionsmittel umgesetzt wird, wobei ein Suspensionsmittel eingesetzt wird, das weitgehend ein In-Lösung-Gehen des Chitosansalzes verhindert. Das Suspensionsmittel ist eine wässrige Lösung eines organischen Salzes, wobei der Salzgehalt derart gehalten wird, dass sichergestellt ist, dass weitgehend keine Chitosansalze in Lösung gehen.It is known further DE 39 03 797 A1 a process for the preparation of activated chitosans and their use in the preparation of chitosan derivatives, in which a chitosan is reacted with an acid to form salts in a suspending agent, using a suspending agent which substantially prevents in-solution migration of the chitosan salt. The suspending agent is an aqueous solution of an organic salt, wherein the salt content is kept such that it is ensured that largely no chitosan salts go into solution.

Aus der DE 10 2007 035 322 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen, niedrig substituierten Cellulosesulfaten und aus der DE 10 2005 011 367 A1 ein Verfahren zur Herstellung von Cellulosesulfaten mit verbesserten Eigenschaften bekannt. From the DE 10 2007 035 322 A1 is a process for the preparation of water-soluble, low-substituted cellulose sulfates and from DE 10 2005 011 367 A1 a method of producing cellulose sulfates having improved properties is known.

Nachteilig bei allen bekannten Verfahren zur Sulfatierung von Chitosan als Festphase ist, dass es während und/oder nach den chemischen Reaktionen zur Sulfatierung zum Auflösen des in der Festphase vorliegenden Chitosans kommt.A disadvantage of all known processes for the sulfation of chitosan as the solid phase is that during and / or after the chemical reactions for sulfation, the chitosan present in the solid phase dissolves.

Die Aufgabe der vorliegenden Lösung besteht in der Angabe eines Verfahrens zur Festphasensulfatierung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, bei dem während und nach der chemischen Reaktion zur Sulfatierung die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e makroskopisch hinsichtlich ihrer ursprünglichen geometrischen Form und ihren ursprünglichen Abmessungen im Wesentlichen unverändert als Festphase vorliegen.The object of the present invention is to provide a method for solid phase sulfation of poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) en, in which during and after the chemical reaction for sulfation the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin ) e are macroscopically substantially unchanged as solid phase with respect to their original geometric shape and original dimensions.

Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.The object is achieved by the invention specified in the claims. Advantageous embodiments are the subject of the dependent claims.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Festphasensulfatierung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en werden zur Vorbehandlung zu Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en als Feststoff ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch und/oder eine wässrige mehrbasige Säurelösung und/oder mindestens ein Vernetzungsagens zur Vernetzung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosaminen unter Erhalt der Festphase der Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e zugegeben, wobei im Falle der Realisierung von mehreren Vorbehandlungen jeweils der Feststoff von der wässrigen mehrbasigen Säurelösung oder dem Vernetzungsagens abgetrennt wird, und wobei als Lösungsmittel mindestens ein polares aprotisches oder protisches Lösungsmittel und als Lösungsmittelgemisch ein Gemisch aus mindestens einem polaren aprotischen oder protischen Lösungsmittel und einem schwach polaren Lösungsmittel zugegeben werden, und nachfolgend zu den vorbehandelten Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch und mindestens ein Sulfatierungsagens zugegeben werden. In the process according to the invention for the solid phase sulphation of poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) s, a solvent or solvent mixture and / or an aqueous polybasic acid solution are used as a solid for the pretreatment to poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) and / or at least one crosslinking agent for crosslinking poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosaminen to give the solid phase of poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) s added, wherein in the case of the realization of several pretreatments each of Solid is separated from the aqueous polybasic acid solution or the crosslinking agent, and wherein at least one polar aprotic or protic solvent and as solvent mixture a mixture of at least one polar aprotic or protic solvent and a weakly polar solvent are added, and subsequently to the pretreated poly (D-glucosamine-co-ND acetylglucos amine) a solvent or solvent mixture and at least one sulfating agent are added.

Vorteilhafterweise wird als Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e Chitosan eingesetzt.Advantageously, chitosan is used as poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine).

Die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e werden als Feststoff in Form von Folien, Fasern, textilen Gebilden, Halbzeugen oder Scaffolds eingesetzt.The poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) s are used as a solid in the form of films, fibers, textile structures, semi-finished products or scaffolds.

Weiterhin vorteilhafterweise werden als Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid (DMF) und als Lösungsmittelgemische DMF mit organischen Lösungsmitteln, wie Dioxan, eingesetzt.Further advantageously, the solvents used are N, N-dimethylformamide (DMF) and as solvent mixtures DMF with organic solvents, such as dioxane.

Und auch vorteilhafterweise werden den Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische und/oder eine wässrige mehrbasige Säurelösung unter Normaldruck bei Temperaturen von 15–30 °C innerhalb von 1 bis 24 h zugegeben.And also advantageously the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamin) s solvents or solvent mixtures and / or an aqueous polybasic acid solution are added under normal pressure at temperatures of 15-30 ° C within 1 to 24 h.

Vorteilhaft ist es auch, wenn als Vernetzungsagenzien Poly(ethylenglycol)diglycidylether (PEG-DE) oder Neopentylglycoldiglycidylether (NG-DE) im Verhältnis Chitosan:Vernetzungsagens von 10:1 bis 1:1 eingesetzt werden, wobei vorteilhafterweise die Vernetzungsagenzien in einem Lösungsmittel, wie DMF, Toluen, Wasser, Aceton oder Gemischen daraus, gelöst eingesetzt werden und/oder vorteilhafterweise zu dem Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin) ein Vernetzungsagens zugegeben wird, diese auf eine Temperatur von 15 °C bis 70 °C erwärmt und 0,1–24 h unter Normaldruck auf der Temperatur gehalten und diese dabei ständig durchmischt werden.It is also advantageous if poly (ethylene glycol) diglycidyl ether (PEG-DE) or neopentyl glycol diglycidyl ether (NG-DE) in the ratio of chitosan: crosslinking agent of 10: 1 to 1: 1 are used as crosslinking agents, advantageously the crosslinking agents in a solvent such DMF, toluene, water, acetone or mixtures thereof are used dissolved and / or advantageously to the poly (D-glucosamine-co-ND- acetylglucosamine), a crosslinking agent is added thereto, heated to a temperature of 15 ° C to 70 ° C and kept at the temperature for 0.1-24 h under normal pressure and these are constantly mixed.

Es ist auch vorteilhaft, wenn als Vernetzungsagenzien Glutaraldehyd (GA) oder Genipin (Gp) im Verhältnis Chitosan:Vernetzungsagens von 100:1 bis 1:1 eingesetzt werden, wobei vorteilhafterweise die Vernetzungsagenzien als wässrige Lösung eingesetzt werden, und/oder wobei vorteilhafterweise zu dem Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin) ein Vernetzungsagens zugegeben wird, diese auf eine Temperatur von 15 °C bis 30 °C erwärmt und 1–24 h unter Normaldruck auf der Temperatur gehalten und diese dabei ständig durchmischt wird.It is also advantageous if, as crosslinking agents, glutaraldehyde (GA) or genipin (Gp) in the ratio chitosan: crosslinking agent of 100: 1 to 1: 1 are used, the crosslinking agents advantageously being used as aqueous solution, and / or advantageously Poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) a crosslinking agent is added, this heated to a temperature of 15 ° C to 30 ° C and kept for 1-24 h under normal pressure at the temperature and this is constantly mixed.

Weiterhin vorteilhaft ist es, wenn im Falle des Einsatzes von Vernetzungsagenzien diese immer zuerst zu dem Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin) zugegeben werden und dem Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin) in einem nachfolgenden Schritt ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch oder eine wässrige mehrbasige Säurelösung zugegeben wird.It is also advantageous if, in the case of the use of crosslinking agents, these are always added first to the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) and the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) in a subsequent step Solvent or solvent mixture or an aqueous polybasic acid solution is added.

Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn die Sulfatierung unter einer Stickstoff- oder Edelgasatmosphäre durchgeführt wird.It is also advantageous if the sulfation is carried out under a nitrogen or inert gas atmosphere.

Und auch vorteilhaft ist es, wenn die Sulfatierung durch Zugabe eines oder mehrerer Sulfatierungsagenzien in Form eines SO₃-Pyridin-Komplexes gelöst in DMF, oder eines SO₃-DMF-Komplexes gelöst in DMF, oder eines SO₃-Trimethylamin-Komplexes gelöst in wässriger 10–30 %iger NaOH-Lösung, oder einem Gemisch dieser NaOH-Lösung mit organischen Lösungsmitteln, wie Dioxan, Isopropanol, Aceton, oder durch Zugabe von Chlorethansulfonsäure-Natrium-Salz (ClESA) gelöst in wässriger 10–30 %iger NaOH-Lösung oder einem Gemisch dieser NaOH-Lösung mit Isopropanol durchgeführt wird, wobei vorteilhafterweise ein SO₃-DMF-Komplex eingesetzt wird, der aus Chlorsulfonsäure und DMF in situ hergestellt worden ist.And it is also advantageous if the sulfation is achieved by adding one or more sulfating agents in the form of an SO ₃ -pyridine complex dissolved in DMF, or an SO ₃ -DMF complex dissolved in DMF, or an SO ₃ -trimethylamine complex dissolved in aqueous 10-30% NaOH solution, or a mixture of this NaOH solution with organic solvents, such as dioxane, isopropanol, acetone, or by adding chloroethanesulfonic acid sodium salt (ClESA) dissolved in aqueous 10-30% NaOH Solution or a mixture of this NaOH solution is carried out with isopropanol, advantageously an SO ₃ -DMF complex is used, which has been prepared in situ from chlorosulfonic acid and DMF.

Es ist auch von Vorteil, wenn die Sulfatierungsagenzien im Verhältnis Chitosan:Sulfatierungsagens = 1:1 bis 1:4 zugegeben werden, im Falle dass Vernetzungsagenzien und/oder Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische zugegeben worden sind.It is also advantageous if the sulfating agents are added in the ratio of chitosan: sulfating agent = 1: 1 to 1: 4, in the case of crosslinking agents and / or solvents or solvent mixtures have been added.

Weiterhin von Vorteil ist es, wenn die Sulfatierungsagenzien im Verhältnis Chitosan:Sulfatierungsagens = 1:1 bis 1:2 zugegeben werden, im Falle dass eine wässrige mehrbasige Säurelösung zugegeben worden ist.It is furthermore advantageous if the sulfating agents are added in the ratio of chitosan: sulfating agent = 1: 1 to 1: 2, in the case where an aqueous polybasic acid solution has been added.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird es erstmals möglich, Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e zu sulfatieren, wobei die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e während und nach der gesamten Reaktion durchgängig makroskopisch hinsichtlich ihrer ursprünglichen geometrischen Form und ihren ursprünglichen Abmessungen im Wesentlichen unverändert in der Festphase vorliegen. Dabei weisen die erfindungsgemäß hergestellten Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e Sulfatgruppen auf.With the method according to the invention, it becomes possible for the first time to sulfate poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) s, the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) s being consistently macroscopically macroscopic during and after the entire reaction original geometric shape and their original dimensions are substantially unchanged in the solid phase. In this case, the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) prepared according to the invention have sulfate groups.

Damit werden mit dem erfindungsgemäße Verfahren bereits geformte Materialien aus Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, insbesondere aus Chitosan, sulfatiert, die während des gesamten erfindungsgemäßen Verfahrens ihre makroskopische Form hinsichtlich ihrer ursprünglichen geometrischen Form und ihren ursprünglichen Abmessungen im Wesentlichen in der Festphase unverändert beibehalten. Sie können dann beispielsweise nachfolgend als Hart-(hier insbesondere als Knochenersatz) oder Weichgewebeimplantatmaterial in der medizinischen Anwendung eingesetzt werden. Auch andere chitosanbasierte Formteile können mit einer durch die erfindungsgemäße Reaktionsführung einstellbaren Menge an Sulfatgruppen versehen werden, ohne dass die vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens vorliegenden makroskopischen Dimensionen und Geometrien der Chitosanformteile oder chitosanbasierten Formteile während des Verfahrens im technischen Sinne verändert werden. Geringe Schrumpfungen durch Flüssigkeitsverluste oder technisch bedingte makroskopische Veränderungen der Dimensionen und Geometrien sind jedoch möglich, können aber bei der Auswahl der Ausgangsprodukte mit berücksichtigt werden.Thus, with the inventive method already shaped materials of poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) en, in particular from chitosan, sulfated, which throughout the process according to the invention, its macroscopic shape in terms of their original geometric shape and their original dimensions substantially unchanged in the solid phase. They can then, for example, subsequently be used as hard (here in particular as bone substitute) or soft tissue implant material in medical applications. Other chitosan-based moldings can also be provided with an amount of sulfate groups which can be adjusted by the reaction procedure according to the invention without the macroscopic dimensions and geometries of the chitosan moldings or chitosan-based moldings present before the beginning of the process being changed during the process in the technical sense. Small shrinkages due to liquid loss or technically related macroscopic changes in dimensions and geometries are possible, but can be taken into account in the selection of the starting materials.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Sulfatierung von Chitosanfäden und -textilen in Form von zwei- und dreidimensionalen Gebilden (Gewebe, Fliese, Gewirke, Gesticke usw.), die aus diesen Fäden vor der Sulfatierung hergestellt wurden.The inventive method is particularly suitable for the sulfation of chitosan threads and textiles in the form of two- and three-dimensional structures (fabric, tile, knitted fabrics, embroidery, etc.), which were prepared from these threads prior to sulfation.

Vor der Sulfatierung wird zu den Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch unter Erhalt der makroskopischen Festphase des Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)s zugegeben und dadurch werden die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e vorgequollen, wobei als Lösungsmittel ein polares aprotisches oder protisches Lösungsmittel und als Lösungsmittelgemisch ein Gemisch aus einem polaren aprotischen oder protischen Lösungsmittel und einem schwach polaren Lösungsmittel eingesetzt wird. Vorteilhaft wird als Lösungsmittel DMF oder besonders vorteilhaft ein Gemisch aus DMF und Dioxan oder mit einem anderen schwach polaren Lösungsmittel (C. Reichardt, Solvents and Solvent effects in Organic Chemistry, 2. Aufl.; VCH, Weinheim, 1988, sowie die darin aufgeführten Referenzen) eingesetzt.Prior to sulfation, a solvent or solvent mixture is added to the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) to give the macroscopic solid phase of the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) and thereby the poly (D glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) pre-swollen, wherein a polar aprotic or protic solvent and a mixture of a polar aprotic or protic solvent and a weakly polar solvent is used as the solvent. Advantageously, the solvent used is DMF or, particularly advantageously, a mixture of DMF and dioxane or with another weakly polar solvent (C. Reichardt, Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry, 2nd edition, VCH, Weinheim, 1988, and the references cited therein ) used.

Es ist aber auch möglich, vor der Sulfatierung den Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en eine wässrige Lösung einer mehrbasigen Säure zuzugeben. Vorteilhaft wird dazu eine 0,1–10 %-ige wässrige Schwefelsäure- oder Phosphorsäurelösung eingesetzt.However, it is also possible to add an aqueous solution of a polybasic acid to the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) s before the sulfation. Advantageously, a 0.1-10% strength aqueous sulfuric acid or phosphoric acid solution is used for this purpose.

Durch den Einsatz der Lösungsmittel, Lösungsmittelgemische und/oder wässrigen mehrbasigen Säurelösungen werden die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e vorgequollen, was aber nicht zu einer irreversiblen Veränderung ihrer geometrischen Form und den Abmessungen ihrer Gestalt führt.Through the use of solvents, solvent mixtures and / or aqueous polybasic acid solutions, the poly (D-glucosamine co-ND-acetylglucosamine) e preswollen, but this does not lead to an irreversible change in their geometric shape and the dimensions of their shape.

Eine weitere Möglichkeit der Behandlung des Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)s vor der Sulfatierung besteht in der Zugabe von Vernetzungsagenzien, was zur Vernetzung der Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e führt. Vorteilhafterweise wird dadurch eine partielle Vernetzung erreicht.Another way of treating the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) before sulfation is to add crosslinking agents, resulting in cross-linking of the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) s. Advantageously, this achieves partial crosslinking.

Alle drei Möglichkeiten der Behandlung des Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)s vor der Sulfatierung können einzeln oder auch zwei Behandlungen oder auch alle drei Behandlungen nacheinander realisiert werden. Dazu ist es erforderlich, dass das Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin) nach den Behandlungsschritten mit wässrigen mehrbasigen Säurelösungen oder Vernetzungsreagenzien als Festphase wieder abgetrennt wird. Sofern Vernetzungsagenzien zugegeben werden, ist es vorteilhaft, diese vor der Zugabe an Lösungsmitteln, Lösungsmittelgemischen und/oder wässrigen mehrbasigen Säurelösungen durchzuführen. Die Behandlung mit Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen ist stets der letzte Schritt vor der Sulfatierung. In allen drei Fällen wird bei Temperaturen zwischen 15 und 30 °C, vorteilhafterweise bei Raumtemperatur, unter Normaldruck, gearbeitet und zwischen 0,1–24,0 h für eine stetige Durchmischung während der Behandlung, beispielsweise durch Schütteln oder Rühren, gesorgt. Im Falle der Zugabe der wässrigen mehrbasigen Säurelösungen und Vernetzungsreagenzien werden danach, beispielsweise durch Zentrifugieren, die überstehenden Lösungen abgetrennt und die Formteile können dann mehrfach mit DMF, Wasser und Ethanol gewaschen werden. Im Falle der Zugabe von Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen kann das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch im Reaktionsgefäß verbleiben.All three ways of treating the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) prior to sulfation can be realized individually or even two treatments or even all three treatments in succession. For this purpose it is necessary that the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) is separated again after the treatment steps with aqueous polybasic acid solutions or crosslinking reagents as the solid phase. If crosslinking agents are added, it is advantageous to carry them out prior to the addition of solvents, solvent mixtures and / or aqueous polybasic acid solutions. Treatment with solvents or solvent mixtures is always the last step before sulfation. In all three cases, at temperatures between 15 and 30 ° C, advantageously at room temperature, under normal pressure, worked and between 0.1 to 24.0 h for a continuous mixing during the treatment, for example by shaking or stirring, provided. In the case of addition of the aqueous polybasic acid solutions and crosslinking reagents thereafter, for example by centrifugation, the supernatant solutions are separated and the moldings can then be washed several times with DMF, water and ethanol. In the case of the addition of solvents or solvent mixtures, the solvent or solvent mixture may remain in the reaction vessel.

In jedem Fall muss erfindungsgemäß mindestens eine der drei Möglichkeiten der Behandlung des Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)s vor der Sulfatierung realisiert werden.In any case, according to the invention at least one of the three possibilities of treatment of the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) must be realized prior to sulfation.

Durch diese Behandlungen werden die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)moleküle intra- und intermolekular aufgrund bekannter Reaktionsmechanismen aufgequollen oder vernetzt. Through these treatments, the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) molecules are swollen or crosslinked intra- and intermolecularly by known reaction mechanisms.

Erfindungsgemäß wird nachfolgend eine Sulfatierungsreaktion durch Zugabe von Sulfatierungsagenzien in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch durchgeführt. Als Lösungsmittel wird ein polares aprotisches oder protisches Lösungsmittel und als Lösungsmittelgemisch ein Gemisch aus einem polaren aprotischen oder protischen Lösungsmittel und einem schwach polaren Lösungsmittel eingesetzt. In einer vorteilhaften Ausführung wird als Lösungsmittel DMF oder besonders vorteilhaft ein Gemisch aus DMF und Dioxan oder einem anderen schwach polaren Lösungsmittel eingesetzt. Dadurch wird erreicht, dass sich das nach der Sulfatierung entstehende Produkt bis zu einem Sulfatierungsgrad von 40–60 % nicht in der Lösung auflöst. Vorteilhafterweise wird eine Sulfatierungsreaktion an den Hydroxygruppen der Chitosanmoleküle ausgenutzt. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Modifizierung und Funktionalisierung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, insbesondere Chitosan. Bei der Durchführung des Verfahrens liegen die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)e als Feststoff vor und bleiben während des gesamten Reaktionsverlaufs hinsichtlich ihrer ursprünglichen geometrischen Form und ihren ursprünglichen Abmessungen im Wesentlichen unverändert als Feststoff makroskopisch erhalten. According to the invention, a sulfation reaction is subsequently carried out by adding sulfating agents in a solvent or solvent mixture. The solvent used is a polar aprotic or protic solvent and the solvent mixture is a mixture of a polar aprotic or protic solvent and a weakly polar solvent. In an advantageous embodiment, the solvent used is DMF or, particularly advantageously, a mixture of DMF and dioxane or another weakly polar solvent. This ensures that the product formed after sulfation does not dissolve in the solution up to a degree of sulfation of 40-60%. Advantageously, a sulfation reaction on the hydroxy groups of the chitosan molecules is utilized. The inventive method leads to the modification and functionalization of poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamin) s, in particular chitosan. In carrying out the process, the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) s are present as a solid and remain macroscopically substantially unchanged as a solid during the entire course of the reaction with regard to their original geometric shape and their original dimensions.

Damit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Sulfatierung von Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, insbesondere Chitosan, in Form von Folien, Fasern, textilen Gebilden, Halbzeugen oder Scaffolds. Vorgefertigte Scaffoldstrukturen und textile Konstruktionen aus oder mit Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)en, insbesondere Chitosan, bleiben durch die erfindungsgemäße Sulfatierung, die als Reaktion in heterogener Phase geführt wird (d.h. der permanenten Koexistenz von fester [Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)]und flüssiger [Lösungsmittel] Phase), erhalten. Das Verfahren dient zur Einführung von Sulfatgruppen in die Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)moleküle, wobei die Sulfatgruppen vorzugsweise als (dissoziierte) Schwefelsäuremono- oder Schwefelsäurediester vorliegen, aber auch als Amide der Schwefelsäure (Sulfoaminogruppen) vorliegen können.Thus, the inventive method for sulfation of poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamin) en, in particular chitosan, in the form of films, fibers, textile structures, semi-finished products or scaffolds. Prefabricated scaffold structures and textile constructions of or with poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) s, in particular chitosan, remain by the sulfation according to the invention, which is performed in a heterogeneous phase reaction (ie the permanent coexistence of solid [poly (D -glucosamine-co-ND-acetylglucosamine)] and liquid [solvent] phase). The process serves to introduce sulfate groups into the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) molecules, the sulfate groups preferably being in the form of (dissociated) sulfuric acid mono- or sulfuric acid diesters but also of being present as amides of sulfuric acid (sulfoamino groups).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es erstmals möglich, bereits geformte Chitosanmaterialien, -implantate und -formkörper, wie z.B. Pulver, Platten, Folien, Schäume und insbesondere Fäden, sowie textile Gebilde aus diesen Fäden, durch den Einbau von Sulfatgruppen zu modifizieren, ohne dass Änderungen in den vorliegenden Dimensionen und Geometrien auftreten. Dabei ist es unerheblich, ob es sich um zwei- oder dreidimensionale Gebilde handelt.With the method according to the invention, it is possible for the first time to prepare already formed chitosan materials, implants and tablets, e.g. Powders, sheets, foils, foams and in particular threads, as well as textile formations from these threads, by the incorporation of sulphate groups to modify without changes in the dimensions and geometries occur. It is irrelevant whether they are two- or three-dimensional structures.

Der Sulfatierungsgrad des Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)s ist durch die Wahl der Reaktionsführung einstellbar. Insbesondere durch die Wahl der Vorbehandlung und des Reagenzes wird der Grad der Sulfatierung an den Sauerstoff- und Stickstoffatomen bestimmt. In einer vorteilhaften Ausführung stehen eine große Anzahl an primären Aminogruppen für nachfolgende Kopplungs-, Funktionalisierungs- und Modifizierungsreaktionen weiterhin zur Verfügung. Dies ist vorteilhaft, da über die Folgereaktionen an der Aminogruppe biologisch aktive Moleküle, wie z.B. Aminosäuren, Peptide und Enzyme, angebunden werden können. Über diese immobilisierten Moleküle können die Verträglichkeit, zelluläre Eigenschaften sowie Abbauprozesse der Implantatmaterialien gezielt gesteuert werden. Die erhaltenen sulfatierten Poly(D-glucosamin-co-N-D-acetylglucosamin)materialien weisen in einer vorteilhaften Ausführung je nach Vorbehandlung Sulfatierungsgrade an der Oberfläche von 0,3–1,0 auf (ermittelt mit Photoelektronenspektroskopie (XPS)) und Gesamtsulfatierungsgrade (ermittelt durch Elementaranalyse) von 0,05 bis 0,5 auf und können demzufolge auch im Innern des Feststoffes kovalent gebundene Sulfatgruppen aufweisen.The degree of sulfation of the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamin) s is adjustable by the choice of reaction. In particular, the choice of pretreatment and the reagent determines the degree of sulfation at the oxygen and nitrogen atoms. In an advantageous embodiment, a large number of primary amino groups are available for subsequent coupling, Functionalization and modification reactions continue to be available. This is advantageous because it is possible to attach biologically active molecules, such as amino acids, peptides and enzymes, via the subsequent reactions on the amino group. The compatibility, cellular properties and degradation processes of the implant materials can be specifically controlled via these immobilized molecules. Depending on the pretreatment, the sulfated poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) materials obtained have degree of sulfation on the surface of 0.3-1.0 (determined by means of photoelectron spectroscopy (XPS)) and total degree of sulfation (determined by Elemental analysis) of from 0.05 to 0.5 and can therefore also have covalently bound sulfate groups in the interior of the solid.

Nachfolgend wird die Erfindung an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert.The invention will be explained in more detail below with reference to several exemplary embodiments.

Referenzbeispiel 1Reference Example 1

1 g Chitosanpulver 300/85 (Heppe Medical Chitosan GmbH, Halle), wurde mit 5 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) versetzt. Die Mischung wurde 5 h gerührt, dann wurden 8 ml Dioxan zugefügt. Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf 0 °C (Eisbad) wurde der zweifache molare Überschuss des SO₃-Pyridin-Komplexes, gelöst in 10 ml DMF, zugetropft. Die Mischung wurde unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt und dann noch 22 h gerührt. Danach wurde die feste Phase von der überstehenden Lösung durch abzentrifugieren getrennt und dreimal mit DMF, viermal mit Wasser und dreimal mit Ethanol gespült. Das Produkt wurde drei Tage bei 40 °C unter Vakuum getrocknet.1 g of chitosan powder 300/85 (Heppe Medical Chitosan GmbH, Halle) was admixed with 5 ml of N, N-dimethylformamide (DMF). The mixture was stirred for 5 h, then 8 ml of dioxane was added. After cooling the reaction mixture to 0 ° C. (ice bath), twice the molar excess of the SO ₃ -pyridine complex dissolved in 10 ml of DMF was added dropwise. The mixture was warmed to room temperature with stirring and then stirred for a further 22 h. Thereafter, the solid phase was separated from the supernatant by centrifugation and rinsed three times with DMF, four times with water, and three times with ethanol. The product was dried at 40 ° C under vacuum for three days.

Das Chitosan lag während der gesamten Reaktion und auch im Endprodukt in fester Phase als Pulver vor. Der ermittelte Gesamtsulfatierungsgrad (ermittelt durch Elementaranalyse) beträgt 0.26The chitosan was present during the entire reaction and in the final product in solid phase as a powder. The determined total degree of sulphation (determined by elemental analysis) is 0.26

Referenzbeispiel 2Reference Example 2

1 g Chitosanpulver 300/85 (Heppe Medical Chitosan GmbH, Halle), wurde über Nacht mit 25 ml 2 %-iger wässriger Schwefelsäurelösung geschüttelt. Das Chitosan wurde durch zentrifugieren abgetrennt, viermal mit je 25 ml Wasser gespült und dreimal mit je 25 ml DMF gespült. Das abgetrennte Chitosan wurde sodann mit 5 ml DMF versetzt, 1 h gerührt, dann wurden 10 ml Dioxan zugefügt. Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf 0 °C (Eisbad) wurde der zweifache molare Überschuss des SO₃-DMF-Komplexes, gelöst in 7,5 ml DMF, zugetropft. Die Mischung wurde unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt und dann noch 22 h gerührt. Danach wurde die feste Phase von der überstehenden Lösung durch abzentrifugieren getrennt und dreimal mit DMF, viermal mit Wasser und dreimal mit Ethanol gespült. Das Produkt wurde drei Tage bei 40 °C unter Vakuum getrocknet. Um nichtkovalent gebundene Sulfatsalze abzutrennen, wurde das Produkt mit 25 ml 1 % iger NaOH-Lösung für 5 h geschüttelt und danach wie oben beschrieben mit Wasser und Ethanol gespült und getrocknet. Das Chitosan lag während der gesamten Reaktion und auch im Endprodukt in fester Phase als Pulver vor. Der ermittelte Gesamtsulfatierungsgrad (ermittelt durch Elementaranalyse) beträgt 0.20, der ermittelte Sulfatierungsgrad an der Oberfläche (ermittelt durch XPS) beträgt 0,571 g of chitosan powder 300/85 (Heppe Medical Chitosan GmbH, Halle) was shaken overnight with 25 ml of 2% aqueous sulfuric acid solution. The chitosan was separated by centrifugation, rinsed four times with 25 ml of water and rinsed three times with 25 ml of DMF. The separated chitosan was then added with 5 ml of DMF, stirred for 1 h, then 10 ml of dioxane were added. After cooling the reaction mixture to 0 ° C. (ice bath), twice the molar excess of the SO ₃ -DMF complex dissolved in 7.5 ml of DMF was added dropwise. The mixture was warmed to room temperature with stirring and then stirred for a further 22 h. Thereafter, the solid phase was separated from the supernatant by centrifugation and rinsed three times with DMF, four times with water, and three times with ethanol. The product was dried at 40 ° C under vacuum for three days. To separate non-covalently bound sulfate salts, the product was shaken with 25 ml of 1% NaOH solution for 5 h and then rinsed with water and ethanol as described above and dried. The chitosan was present during the entire reaction and in the final product in solid phase as a powder. The determined total degree of sulphation (determined by elemental analysis) is 0.20, the determined degree of sulphation on the surface (determined by XPS) is 0.57

Referenzbeispiel 3Reference Example 3

1 g Chitosanpulver 300/85 (Heppe Medical Chitosan GmbH, Halle), wurde 24 h unter Zusatz einer wässrigen Lösung von 0,0676 g Genipin in 15 ml Wasser geschüttelt. Das Chitosan wurde durch zentrifugieren abgetrennt, dreimal mit je 25 ml Wasser gespült und dreimal mit je 25 ml Ethanol gespült. Das durch Zentrifugation abgetrennte Chitosan wurde dann drei Tage bei 40 °C unter Vakuum getrocknet. 0,5 g des so vorvernetzten Chitosanpulvers wurde über Nacht mit 15 ml 2 %-iger wässriger Schwefelsäurelösung geschüttelt. Das Chitosan wurde durch zentrifugieren abgetrennt, viermal mit je 25 ml Wasser gespült und dreimal mit je 25 ml DMF gespült. Das abgetrennte Chitosan wurde sodann mit 5 ml DMF versetzt. Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf 0 °C (Eisbad) wurde der 1,7 fache molare Überschuss des SO₃-DMF-Komplexes, gelöst in 7 ml DMF, zugetropft. Die Mischung wurde unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt und dann noch 22 h gerührt. Danach wurde die feste Phase von der überstehenden Lösung durch abzentrifugieren getrennt und dreimal mit DMF, viermal mit Wasser und dreimal mit Ethanol gespült. Das Produkt wurde drei Tage bei 40 °C unter Vakuum getrocknet. Um nichtkovalent gebundene Sulfatsalze abzutrennen, wurde das Produkt mit 25 ml 1 %-iger NaOH-Lösung für 5 h geschüttelt und danach, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Wasser und Ethanol gespült und getrocknet. Das Chitosan lag während der gesamten Reaktion und auch im Endprodukt in fester Phase als Pulver vor. Der ermittelte Gesamtsulfatierungsgrad (ermittelt durch Elementaranalyse) beträgt 0,47.1 g of chitosan powder 300/85 (Heppe Medical Chitosan GmbH, Halle) was shaken for 24 h with the addition of an aqueous solution of 0.0676 g of genipin in 15 ml of water. The chitosan was separated by centrifugation, rinsed three times with 25 ml of water and rinsed three times with 25 ml of ethanol. The chitosan separated by centrifugation was then dried under vacuum at 40 ° C for three days. 0.5 g of the precrosslinked chitosan powder was shaken overnight with 15 ml of 2% aqueous sulfuric acid solution. The chitosan was separated by centrifugation, rinsed four times with 25 ml of water and rinsed three times with 25 ml of DMF. The separated chitosan was then treated with 5 ml of DMF. After cooling the reaction mixture to 0 ° C. (ice bath), 1.7 times the molar excess of the SO ₃ -DMF complex dissolved in 7 ml of DMF was added dropwise. The mixture was warmed to room temperature with stirring and then stirred for a further 22 h. Thereafter, the solid phase was separated from the supernatant by centrifugation and rinsed three times with DMF, four times with water, and three times with ethanol. The product was dried at 40 ° C under vacuum for three days. To separate non-covalently bound sulfate salts, the product was shaken with 25 ml of 1% NaOH solution for 5 h and then rinsed with water and ethanol as described in Example 2 and dried. The chitosan was present during the entire reaction and in the final product in solid phase as a powder. The determined total degree of sulphation (determined by elemental analysis) is 0.47.

Beispiel 4Example 4

Sechs Stück runde gestickte Chitosanscaffolds (Deacetylierungsgrad des Chitosans = 77 %) mit einer Gesamtmasse von 0,172 g und den Einzelabmessungen Durchmesser 10 mm ± 2 mm, Dicke 2 mm ± 0,5 mm, wurden in 2 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gegeben. Die Mischung wird 5 h gerührt, dann werden 2 ml Dioxan zugefügt. Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf 0 °C (Eisbad) wird der vierfache molare Überschuss des SO₃-Pyridin-Komplexes, gelöst in 3 ml DMF, zugetropft. Die Mischung wird unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt und dann noch 22 h gerührt. Danach wurde das gestickte Chitosanscaffold dreimal mit DMF, viermal mit Wasser und dreimal mit Ethanol gespült. Das modifizierte Chitosanscaffold wurde drei Tage bei 40 °C unter Vakuum getrocknet. Das Chitosanscaffold lag während der gesamten Reaktion und auch im Endprodukt in unveränderter Geometrie vor. Der ermittelte Gesamtsulfatierungsgrad (ermittelt durch Elementaranalyse) beträgt 0.5.Six round round chitosan scaffolds (degree of deacetylation of chitosan = 77%) with a total mass of 0.172 g and the individual dimensions diameter 10 mm ± 2 mm, thickness 2 mm ± 0.5 mm, were dissolved in 2 ml N, N-dimethylformamide (DMF) given. The mixture is stirred for 5 h, then 2 ml of dioxane are added. After cooling the reaction mixture to 0 ° C. (ice bath), the fourfold molar excess of the SO ₃ -pyridine complex, dissolved in 3 ml of DMF, is added dropwise. The mixture is warmed to room temperature with stirring and then stirred for a further 22 h. Thereafter, the embroidered chitosan scaffold was rinsed three times with DMF, four times with water, and three times with ethanol. The modified chitosan scaffold was dried under vacuum for three days at 40 ° C. The chitosan scaffold was present in the same geometry throughout the reaction and also in the final product. The determined total degree of sulphation (determined by elemental analysis) is 0.5.

Claims

Process for the solid phase sulphation of poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) in which for pretreatment To poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) s as a solid in the form of films, fibers, textile structures, semi-finished products or scaffolds A polar aprotic or protic solvent or a mixture of at least one polar aprotic or protic solvent and a weakly polar solvent And / or an aqueous polybasic acid solution And / or at least one crosslinking agent for crosslinking poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamines To obtain the solid phase of the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine) s, and - Subsequently, the solid is separated from the aqueous polybasic acid solution or the crosslinking agent, and - Subsequently to the pretreated poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamin) s a solvent or solvent mixture and at least one sulfating agent are added.

Process according to claim 1, wherein chitosan is used as poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamine).

Process according to Claim 1, in which the solvent used is N, N-dimethylformamide (DMF) and the solvent mixtures DMF are organic solvents, such as dioxane.

The method of claim 1, wherein the poly (D-glucosamine-co-N-D-acetylglucosamin) s solvents or solvent mixtures and / or an aqueous polybasic acid solution are added under normal pressure at temperatures of 15-30 ° C within 1 to 24 h.

Process according to Claim 1, in which poly (ethylene glycol) diglycidyl ether (PEG-DE) or neopentyl glycol diglycidyl ether (NG-DE) in the ratio chitosan: crosslinking agent of 10: 1 to 1: 1 are used as crosslinking agents.

A process according to claim 5, wherein the crosslinking agents are used dissolved in a solvent such as DMF, toluene, water, acetone or mixtures thereof.

A process according to claim 5, wherein a crosslinking agent is added to the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine), heated to a temperature of 15 ° C to 70 ° C and allowed to stand at normal pressure for 0.1-24 hours Keep temperature and these are constantly mixed.

Process according to Claim 1, in which the crosslinking agents used are glutaraldehyde (GA) or glutaraldehyde bis-sodium hydrogen sulfite or genipin (Gp) in the ratio chitosan: crosslinking agent of from 100: 1 to 1: 1.

The method of claim 8, wherein the crosslinking agents are used as an aqueous solution.

A process according to claim 8 wherein a crosslinking agent is added to the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine), heated to a temperature of 15 ° C to 30 ° C and maintained at temperature for 1-24 hours under normal pressure, and this is constantly mixed.

Process according to Claim 1, in which, in the case of the use of crosslinking agents, these are always first added to poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) and the poly (D-glucosamine-co-ND-acetylglucosamine) in a subsequent step Solvent or solvent mixture or an aqueous polybasic acid solution is added.

Process according to claim 1, wherein the sulphation is carried out under a nitrogen or inert gas atmosphere.

The process of claim 1, wherein the sulfation is achieved by adding one or more sulfating agents in the form of an SO ₃ -pyridine complex dissolved in DMF, or a SO ₃ -DMF complex dissolved in DMF, or an SO ₃ -trimethylamine complex dissolved in aqueous 10-30% NaOH solution, or a mixture of this NaOH solution with organic solvents, such as dioxane, isopropanol, acetone, or by adding chloroethanesulfonic acid sodium salt (ClESA) dissolved in aqueous 10-30% NaOH Solution or a mixture of this NaOH solution is carried out with isopropanol.

Process according to claim 1, in which the sulphating agents are added in the ratio chitosan: sulphating agent = 1: 1 to 1: 4 in the case where crosslinking agents and / or solvent or solvent mixture have been added.

The process of claim 1, wherein the sulfating agents are added in the ratio of chitosan: sulfating agent = 1: 1 to 1: 2 in the case where an aqueous polybasic acid solution has been added.

A process according to claim 13, wherein an SO ₃ -DMF complex prepared from chlorosulfonic acid and DMF in situ is used.