DE102012201268B4 - Process for the production of hollow bodies from microbial cellulose - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst:a) in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates, das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst,b) Unterbrechen des Kontakts zwischen dem Template und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,c) in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,d) in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gemischvorrat,e) Unterbrechen des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,f) in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, dadurch gekennzeichnet, dassdas Template zumindest während Schritt c) und Schritt f), um mehrere Raumachsen rotiert wird.A method for producing a preliminary product of a hollow body made of microbial cellulose, which comprises the following steps: a) bringing the surface of a template, which is a negative form of the cavity of the hollow body to be produced and the inner walls of the cavity, into contact with a mixture supply, which is a liquid Culture medium and a cellulose-forming microorganism comprises, b) interrupting the contact between the template and the mixture supply, a liquid film remaining on the surface of the template, which comprises the liquid culture medium and the microorganism, c) bringing the liquid film into contact with an oxygen-containing atmosphere and the formation of microbial cellulose in and / or on the liquid film, d) bringing the microbial cellulose obtained in step c) into contact with the mixture supply, e) interrupting the contact between the microbial cellulose and the mixture supply being on the surface of the microbial cellulose e a liquid film remains, which comprises the liquid culture medium and the microorganism, f) bringing the liquid film into contact with an oxygen-containing atmosphere and the formation of microbial cellulose in and / or on the liquid film, characterized in that the template at least during step c) and step f) is rotated around several spatial axes.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose und einen Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, der nach dem Verfahren erhältlich ist.The invention relates to a method for producing a hollow body made of microbial cellulose and a hollow body made of microbial cellulose which can be obtained by the method.
Um Blutgefäße und andere Hohlorgane im menschlichen oder tierischen Körper zu ersetzen, werden heute in der klinischen Praxis neben körpereigenen Gefäßen Prothesen aus synthetischen Polymeren eingesetzt. Die Präparation körpereigener Gefäße bedeutet für den Patienten einen zusätzlichen operativen Eingriff, welcher ebenfalls mit beachtlichem Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Außerdem verfügen viele, vor allem ältere Patienten, nicht über ein ausreichendes Maß an gesundem, zur Revaskularisation geeignetem Gefäßmaterial. Kommerzielle, synthetische Prothesematerialien aus Dacron® und Teflon®, die in der allgemeinen Gefäß- und Thoraxchirurgie für den Ersatz von großlumigen Gefäßen (Gefäßdurchmesser > 6mm) wie der Aorta oder der Beckenbeinarterien (Iliacalarterien) Verwendung finden, unterliegen aufgrund von deutlicher Thrombogenität, unzureichender mechanischer Belastbarkeit, geringer Elastizität/ verminderter Compliance sowie unzureichender Resistenz gegenüber Infektionen bezüglich ihres Einsatzgebietes und ihrer Einsatzdauer starken Beschränkungen. Für den kleinkalibrigen Gefäßersatz (Gefäßdurchmesser 3,0-6,0 mm) z. B. der Herzkranzgefäße sowie für den Mikrogefäßersatz (Gefäßdurchmesser 1,0-3,0 mm) können diese Materialien bisher nicht verwendet werden.In order to replace blood vessels and other hollow organs in the human or animal body, prostheses made of synthetic polymers are used in clinical practice in addition to the body's own vessels. The preparation of the body's own vessels means an additional surgical procedure for the patient, which is also associated with considerable expenditure of time and money. In addition, many, especially older patients, do not have a sufficient amount of healthy vascular material suitable for revascularization. Commercial, synthetic prosthesis materials made of Dacron® and Teflon®, which are used in general vascular and thoracic surgery for the replacement of large-lumen vessels (vessel diameter> 6mm) such as the aorta or the iliac arteries (iliac arteries), are subject to insufficient mechanical due to their significant thrombogenicity Resilience, low elasticity / reduced compliance and insufficient resistance to infections with regard to their area of application and their duration of use, severe restrictions. For small-caliber vascular grafts (vascular diameter 3.0-6.0 mm) e.g. B. the coronary arteries as well as for the microvessel replacement (vessel diameter 1.0-3.0 mm) these materials can not be used so far.
Alle natürlichen Blutgefäße sind mehr oder weniger elastische Röhren mit einer endothelialen Auskleidung. Der Aufbau der Gefäßwände entspricht in ihrer quantitativen und qualitativen Beschaffenheit den unterschiedlichen Funktionen der einzelnen Blutkreislaufabschnitte. Grundlegend sind die Wände aller natürlichen Arterien und Venen durch einen 3-Schichten-Aufbau gekennzeichnet:
- - Die Tunica intima besteht aus einer glatten, lumenseitigen Endothelschicht aus langgestreckten, parallel zur Blutstromrichtung angeordneten Zellen und einem daruntergelegenen Bindegewebe. Sie wird direkt über den Blutstrom mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt.
- - Die Tunica media ist die mittlere Wandschicht. Sie besteht aus dicht gefügten glatten Muskelzellen mit zirkulärem oder spiralförmigem Verlauf und elastischen und kollagenen Fasern.
- - Die Tunica externa (Adventicia) ist die äußere dünne Bindegewebsschicht, die das Gefäß in dem umgebenden Gewebe verankert. In dieser Schicht befinden sich kleinere Blutgefäße für die Ernährung der Gefäßwand (Ausnahme Intima) und Nervengeflechte.
- - The tunica intima consists of a smooth, lumen-sided endothelial layer of elongated cells arranged parallel to the direction of the blood flow and a connective tissue underneath. It is supplied with nutrients and oxygen directly from the bloodstream.
- - The tunica media is the middle layer of the wall. It consists of tightly knit smooth muscle cells with a circular or spiral course and elastic and collagen fibers.
- - The tunica externa (adventicia) is the thin outer layer of connective tissue that anchors the vessel in the surrounding tissue. In this layer there are smaller blood vessels that nourish the vascular wall (with the exception of the intima) and nerve plexuses.
Während die Venen durch nur undeutlich voneinander abgrenzbare Schichten charakterisiert sind, existieren bei den Arterien elastische Schichten zwischen Intima und Media (Membrana elastica interna) und zwischen Media und Adventitia (Membrana elastica externa). Da Venen im Blutkreislauf nur geringen Druckbelastungen ausgesetzt sind, sind ihre Gefäßwände dünner und muskuläre Elemente zugunsten des Bindegewebes reduziert. Der Wandaufbau ermöglicht eine starke Dehnung der Venen, Venenklappen verhindern einen Rückfluß des Blutes und gewährleisten einen herzwärts gerichteten Blutstrom.While the veins are characterized by only indistinctly differentiated layers, elastic layers exist between the intima and media (internal elastic membrane) and between media and adventitia (external elastic membrane) in the arteries. Since veins in the blood circulation are only exposed to low pressure loads, their vessel walls are thinner and muscular elements are reduced in favor of the connective tissue. The wall structure allows the veins to stretch strongly, venous valves prevent the blood from flowing back and ensure a blood flow directed towards the heart.
Herznahe Arterien müssen sehr hohen Druckbelastungen standhalten. Sie sind vom „elastischen“ Typ, d.h. ihre Media besteht aus wechselnden Lagen von elastischen Membranen und glatter Muskulatur. Die Anordnung der elastischen Elemente in einander überkreuzenden Spiralsystemen ermöglicht die zirkuläre und longitudinale, rhythmische Dehnung des Gefäßes (elastische Verformbarkeit). In den herzferneren Arterien ändert sich entsprechend der andersartigen Funktion der Bau der Gefäßwände. In den Gefäßen vom „muskulären“ Typ verringern sich die elastischen Bauelemete, die muskulären nehmen zu bis das elastische Material auf die Lamina elastica interna und externa beschränkt ist.Arteries close to the heart have to withstand very high pressure loads. They are of the "elastic" type, i.e. their media consists of alternating layers of elastic membranes and smooth muscles. The arrangement of the elastic elements in crossing spiral systems enables the circular and longitudinal, rhythmic expansion of the vessel (elastic deformability). In the arteries distant from the heart, the structure of the vessel walls changes according to the different function. In the vessels of the “muscular” type, the elastic components decrease, the muscular ones increase until the elastic material is limited to the lamina elastica interna and externa.
Die Gefäße sind so in der Lage, sich den jeweils herrschenden Blutdruckverhältnissen anzupassen (Roche Lexikon Medizin, Hrg. Hoffmann-La Roche AG und Urban & Schwarzenberg, U & S München, Wien, Baltimore, 1998, 4. Auflage; K. Sommer (Hrsg.) Der Mensch-Anatomie, Physiologie, Ontogenie. Volk und Wissen, Berlin, 1983, 5. Auflage).The vessels are thus able to adapt to the prevailing blood pressure conditions (Roche Lexikon Medizin, Ed. Hoffmann-La Roche AG and Urban & Schwarzenberg, U & S Munich, Vienna, Baltimore, 1998, 4th edition; K. Sommer ( Ed.) Der Mensch-Anatomie, Physiologie, Ontogenie. Volk und Wissen, Berlin, 1983, 5th edition).
Ein Blutgefäßimplantat, auch bezeichnet als „vascular graft“, sollte deshalb den folgenden Anforderungen entsprechen:
- - Es soll eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur (biomimetische Struktur) aufweisen.
- - Es soll biokompatibel sein, d.h. es darf keine Thrombogenität und Immunogenizität besitzen. Es sollte resistent gegenüber Infektionen sein und in den Körper integriert werden, so dass im Idealfall das Blutgefäßimplantat nicht mehr vom nativen Gefäß unterschieden werden kann.
- - Es soll über die biologische Funktionalität der nativen Blutgefäße verfügen und den Aufbau körpereigener Strukturen anregen (Bioaktivität). Die innere Oberfläche des Implantats soll so beschaffen sein, dass sie keine thrombogenen Eigenschaften aufweist, die Anlagerung von körpereigenen Endothelzellen und die Ausbildung einer glatten konfluierenden Endothelschicht im künstlichen Gefäß ermöglicht. Die Wandung des Implantats soll einen Stoffaustausch, vergleichbar mit den natürlichen Austauschprozessen, gestatten.
- - Es soll eine angemessene mechanische Stabilität aufweisen, um den statischen, dynamischen und punktuellen Belastungen (z.B. Blutdruck, Körperbewegungen, Kräfte an der Verbindungsstelle zu den natürlichen Gefäßen) standzuhalten. Darüber hinaus soll es in einem Hochdrucksystem dauerhaft funktionieren.
- - Es soll ausreichend elastisch, einfach sterilisierbar und chirurgisch sehr gut handhabbar sowie in den erforderlichen Abmessungen verfügbar und lagerfähig sein.
- - It should have a structure (biomimetic structure) that comes as close as possible to the natural blood vessel.
- - It should be biocompatible, ie it must not have any thrombogenicity or immunogenicity. It should be resistant to infections and integrated into the body so that, ideally, the blood vessel implant can no longer be distinguished from the native vessel.
- - It should have the biological functionality of the native blood vessels and stimulate the development of the body's own structures (bioactivity). The inner surface of the implant should be designed in such a way that it does not have any thrombogenic properties, enables the body's own endothelial cells to accumulate and a smooth confluent endothelial layer to form in the artificial vessel. The wall of the implant should allow an exchange of substances, comparable to the natural exchange processes.
- - It should have adequate mechanical stability to withstand static, dynamic and punctual loads (e.g. blood pressure, body movements, forces at the connection point to the natural vessels). In addition, it should work permanently in a high pressure system.
- It should be sufficiently elastic, easy to sterilize and very easy to handle surgically, and it should be available and storable in the required dimensions.
Derartige Gefäßimplantate, die hinsichtlich Struktur, Eigenschaften und Funktionalität einem biomimetischen und bioaktiven Implantat entsprechen und deren Dimensionen (innerer Durchmesser von etwa 1 - 30 mm, Länge von 5 - 500 mm) hinsichtlich des Einsatzgebietes variiert werden können, sind bisher nicht bekannt.Vascular implants of this type, which correspond to a biomimetic and bioactive implant in terms of structure, properties and functionality and whose dimensions (inner diameter of about 1–30 mm, length of 5–500 mm) can be varied with regard to the area of application, are not known to date.
Bakterielle Nanocellulose (BNC) - auch mikrobielle Cellulose genannt und nachfolgend in dieser Beschreibung noch erläutert - bietet aufgrund ihrer exzellenten Materialeigenschaften ideale Voraussetzungen für den Einsatz als Gefäßimplantat mit dem vorstehend beschriebenen Anforderungsbild.Bacterial nanocellulose (BNC) - also called microbial cellulose and explained below in this description - offers ideal conditions for use as a vascular implant with the requirements described above due to its excellent material properties.
BNC unterscheidet sich in ihrer Morphologie deutlich von der Cellulose pflanzlichen Ursprungs. Sie besteht aus Fasern mit einem Durchmesser im Nanometerbereich (20-100nm), die 100mal feiner als herkömmliche Pflanzencellulosefasern (Zellstoff) sind. Das natürliche Nanofaser-Netzwerk zeigt eine dem menschlichen Gewebe (Kollagen) vergleichbare Gerüststruktur. Es enthält bis zu 99% Wasser und ist in der Lage, intensive Wechselwirkungen mit der Umgebung einzugehen. BNC ist auch im feuchten Zustand mechanisch stabil. BNC ist ein hochreines Polymer, frei von pflanzlichen Begleitkomponenten wie Lignin, Pektin und Hemicellulosen. Sie zeichnet sich durch ein hohes Molekulargewicht (Polymerisationsgrad von ca. 4.000 - 10.000) und hohe Kristallinität (80-90%) aus. BNC wird im menschlichen und Säugetierorganismus nicht abgebaut, löst keine Abwehrreaktionen des Körpers aus und wird von körpereigenen Zellen wirksam besiedelt
Es sind mehrere Methoden bekannt, bakterielle Nanocellulose (BNC) insbesondere als Hohlkörper für chirurgische Anwendungen wie Blutgefäße oder Gewebeimplantate zu formen. Entsprechend den beschriebenen Formgebungsverfahren werden unterschiedliche BNC-Hohlkörper mit unterschiedlicher Dimension, Struktur und Oberflächengüte sowie mechanischer Belastbarkeit und Festigkeit erhalten.There are several known methods of forming bacterial nanocellulose (BNC), in particular as hollow bodies for surgical applications such as blood vessels or tissue implants. According to the shaping process described, different BNC hollow bodies with different dimensions, structure and surface quality as well as mechanical load capacity and strength are obtained.
Es ist bekannt, dass mikrobielle Cellulose direkt im Herstellungsprozess, insbesondere zu einem Hohlkörper geformt werden kann. Folgende Methoden der Herstellung hohlzylindrischer Celluloseformkörper werden beschrieben:
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EP 396 344 A2
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EP 396 344 A2
Der Nachteil dieser Methode besteht zum einen im Herstellungsaufwand. Zunächst wird eine übliche statische Kultivierung zum Aufbau einer Celluloseschicht
Die strukturellen Gegebenheiten des Formkörpers variieren sowohl längs als auch senkrecht zur Achse. Diffussionsprozesse der Kulturlösung zum Biosyntheseort durch die primär aufgebaute Celluloseschicht sowie die sich aufbauende sekundäre Celluloseschicht innerhalb des Formkörpers führen zur Ausbildung zusätzlicher struktureller Inhomogenitäten. Die isolierten Cellulosehohlkörper sind dadurch vermindert formstabil sowie unzureichend mechanisch stabil, was zu großen Problemen z.B. der Druckstabilität führt. Auch die innere und äußere Begrenzung des Cellulosehohlkörpers sind deshalb als inhomogen und instabil anzusehen, so dass die innere und äußere Wand einem angelegten Druck gar nicht oder nicht gleichmäßig entgegenwirken kann. Das Lumen wird geweitet, es entstehen Beulen und Mulden, was die Bildung von Thromben begünstigen sollte. Darüber hinaus ist der im Patent beschriebene Bildungsprozess nur sehr schwer reproduzierbar zu gestalten und kaum für die Produktion großer Stückzahlen zu realisieren.The structural features of the shaped body vary both along and perpendicular to the axis. Diffusion processes of the culture solution to the biosynthesis site through the primary cellulose layer and the secondary cellulose layer that builds up within the molded body lead to the formation of additional structural inhomogeneities. The isolated cellulose hollow bodies are therefore less dimensionally stable and insufficiently mechanically stable, which leads to major problems, e.g. pressure stability. The inner and outer boundaries of the cellulose hollow body are therefore also to be regarded as inhomogeneous and unstable, so that the inner and outer wall cannot counteract an applied pressure at all or cannot counteract it evenly. The lumen is widened, bumps and hollows appear, which should promote the formation of thrombi. In addition, the formation process described in the patent can only be made reproducible with great difficulty and can hardly be implemented for the production of large quantities.
Desweiteren gibt es Schriften, die sich mit der Herstellung von BNC-Hohlkörpern an gaspermeablen Oberflächen beschäftigen.There are also publications that deal with the production of BNC hollow bodies on gas-permeable surfaces.
Nach
Der in
Die oben zitierte Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen ist vergleichbar mit der statischen Horizontal-Kultivierung. Abweichend davon erfolgt die Biosynthese nicht unmittelbar an der Grenzfläche Nährmedium-Luft sondern an der Grenzfläche Nährmediumsauerstoffpermeabler Hohlträger. Die BNC-Bildung ist nicht mehr auf nur eine Richtung beschränkt, sondern erfolgt in alle Raumrichtungen. Der Aufbau von BNC-Körpern mit fast unbegrenzter Hohlkörperlänge/ Dimension wird somit möglich, allerdings sind aufgrund des diffusionsbestimmten Nährstofftransports und der Material-bestimmten Sauerstoffversorgung Limitierungen der Wandstärken zu erwarten. Im Vergleich zur Nährmedium-Luft Grenzflächenkultivierung geben Putra et al. eine Reduzierung der Celluloseschichtdicke um Zweidrittel an (A Putra, A Kakugo, H Furukawa, JP Gong, Y Osada: Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface. Polymer (2008) 49, 1885-1891).The above-cited biosynthesis of bacterial cellulose on the surface of oxygen-permeable membranes is comparable to the static horizontal cultivation. In contrast to this, the biosynthesis does not take place directly at the nutrient medium-air interface but rather at the nutrient-oxygen-permeable hollow carrier interface. The BNC formation is no longer restricted to just one direction, but takes place in all spatial directions. The construction of BNC bodies with an almost unlimited hollow body length / dimension is thus possible, however, due to the diffusion-determined nutrient transport and the material-determined oxygen supply, limitations of the wall thickness are to be expected. In comparison to culture medium-air interface cultivation, Putra et al. a reduction of the cellulose layer thickness by two thirds (A Putra, A Kakugo, H Furukawa, JP Gong, Y Osada: Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface. Polymer (2008) 49, 1885-1891).
Bekannt ist auch die BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben „rotating disc reactors“ (
In
Die
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein verbessertes Verfahren anzugeben, womit Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose hergestellt werden können. Die Hohlkörper sollten möglichst in beliebiger Form herstellbar sein. Weiterhin war es eine Aufgabe, einen verbesserten Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose bereitzustellen, insbesondere für medizinische Anwendungen.The invention is based on the object of specifying an improved method with which hollow bodies can be produced from microbial cellulose. The hollow bodies should, if possible, be producible in any shape. It was also an object to provide an improved hollow body made of microbial cellulose, in particular for medical applications.
Eine oder mehrere dieser Aufgaben werden gelöst mit einem Verfahren und einem Hohlkörper, wie in den unabhängigen Ansprüchen angegeben, oder mit vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung, wie in den Unteransprüchen angegeben.One or more of these objects are achieved with a method and a hollow body as specified in the independent claims, or with advantageous embodiments of the invention as specified in the subclaims.
Angegeben wird ein Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst:
- a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates, das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst,
- b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Template und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,
- c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,
- d) das in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gem ischvorrat,
- e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,
- f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,
- a) bringing the surface of a template into contact, which is a negative form of the cavity of the hollow body to be produced and the inner walls of the cavity, with a mixture supply comprising a liquid culture medium and a cellulose-forming microorganism,
- b) the interruption of the contact between the template and the mixture supply, a liquid film remaining on the surface of the template, which comprises the liquid culture medium and the microorganism,
- c) bringing the liquid film into contact with an oxygen-containing atmosphere and the formation of microbial cellulose in and / or on the liquid film,
- d) bringing the microbial cellulose obtained in step c) into contact with the mixture stock,
- e) the interruption of the contact between the microbial cellulose and the mixture supply, whereby a liquid film remains on the surface of the microbial cellulose which comprises the liquid culture medium and the microorganism,
- f) bringing the liquid film into contact with an oxygen-containing atmosphere and the formation of microbial cellulose in and / or on the liquid film,
Die Folge der Schritte d), e) und f) kann optional ein- oder mehrmals wiederholt werden.The sequence of steps d), e) and f) can optionally be repeated one or more times.
Als weiteren optionalen Schritt weist das Verfahren auf:
- g) die Trennung der mikrobiellen Cellulose von dem Template.
- g) the separation of the microbial cellulose from the template.
Der Begriff „mikrobielle Cellulose“ bezeichnet eine Cellulose, die durch einen Mikroorganismus produziert wird. Beispielhafte Mikroorganismen sind Pilze, Bakterien und Algen. Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Cellulose herzustellen. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Algen wie Valonia und Boergesenia, Pilze wie Dictyostelium discoideum und Bakterien wie Gluconacetobacter, Enterobacter, Agrobacterium, Sarcina, Pseudomonas, Rhizobium und Zoogloea. Beispiele von Gluconacetobacter spezies sind Acetobacter xylinum, Acetobacter pasturianus, Acetobacter aceti, Acetobacter ransens. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus ist Gluconacetobacter, insbesondere Gluconacetobacter xylinus.The term "microbial cellulose" describes a cellulose that is produced by a microorganism. Exemplary microorganisms are fungi, bacteria and algae. A number of microorganisms are able to produce cellulose. These include, but are not limited to, algae such as Valonia and Boergesenia, fungi such as Dictyostelium discoideum and bacteria such as Gluconacetobacter, Enterobacter, Agrobacterium, Sarcina, Pseudomonas, Rhizobium and Zoogloea. Examples of Gluconacetobacter species are Acetobacter xylinum, Acetobacter pasturianus, Acetobacter aceti, Acetobacter ransens. A particularly suitable microorganism is Gluconacetobacter, in particular Gluconacetobacter xylinus.
Mikrobielle Cellulose wird herkömmlich durch Mikroorganismen an der Grenzfläche zwischen Luft und einem z.B. D-Glucose-haltigen Nährmedium in Form eines Biofilms (Vlies) hergestellt. Die Bakterien stoßen die Cellulose als Fibrillen aus. Diese lagern sich zu Fasern zusammen. Durch die Verflechtung der Fasern entsteht ein dreidimensionales, hoch wasserhaltiges Nanofaser-Netzwerk, das aus ca. 99% Wasser und 1% Cellulose besteht
Das Kulturmedium, auch bezeichnet als „Nährlösung“ oder „Nährmedium“ enthält übliche Bestandteile zur Kultivierung eines Cellulose produzieren Mikroorganismus, wie z.B. Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Natriumhydrogenphosphat und Citronensäure in wässriger Lösung (Hestrin-Schramm-Medium). Ein alternatives saures Medium besteht aus einer wässrigen Lösung von Glucose, Pepton, Hefe, Essigsäure und Ethanol.The culture medium, also referred to as "nutrient solution" or "nutrient medium", contains the usual components for cultivating a cellulose-producing microorganism, such as glucose, peptone, yeast extract, sodium hydrogen phosphate and citric acid in aqueous solution (Hestrin-Schramm medium). An alternative acidic medium consists of an aqueous solution of glucose, peptone, yeast, acetic acid and ethanol.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40°C durchgeführt.The process is preferably carried out at a temperature of 20 to 40 ° C.
Mikrobielle Cellulose wird, sofern sie von Bakterien hergestellt wird, auch mit den Begriffen „bakterielle Cellulose“ und „bakterielle Nanocellulose“ (BNC) bezeichnet. Der Begriff „bakterielle Nanocellulose“ (BNC) ist daraus hergeleitet, dass bakteriell produzierte Cellulose wie oben erwähnt ein Nanofasernetzwerk bildet.If it is produced by bacteria, microbial cellulose is also referred to using the terms “bacterial cellulose” and “bacterial nanocellulose” (BNC). The term “bacterial nanocellulose” (BNC) is derived from the fact that bacterially produced cellulose, as mentioned above, forms a nanofiber network.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach dem Stand der Technik sind unter anderem folgende:
- I. Wird die Cellulose an der inneren Seite eines permeablen Hohlträgers synthetisiert, wird die innere Formkörperwandung ohne Begrenzung aber in ständigem Kontakt zur Kulturlösung „frei“ im Raum entwickelt und stellt die ursprünglich erste (älteste) und lockerere Cellulosegelschicht dar. Im Verlauf der Kultivierung steht der an der inneren Hohlträgeroberfläche gebildeten Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt, immer weniger Platz zur Verfügung. Die Ausbildung von Störstellen (Faltungen, Verdichtungen) innerhalb des Schichtsystems und am Lumen ist die Folge. Weitere wesentliche Nachteile dieser Methoden bestehen demnach darin, dass die auf diese Weise hergestellten Hohlzylinder keine hinreichend glatte, homogene innere Oberfläche aufweisen. Da neben der Ausbildung von gravierenden Oberflächeninhomogenitäten durch Falten- oder Muldenbildung auch die Gefahr der Ablösung von Teilen der Cellulose gegeben ist, bergen diese Hohlzylinder ein sehr großes Thromboserisiko. Die Qualität des inneren Lumens kann den Anforderungen an einen Blutgefäßersatz nicht entsprechen.
- II. Wird die Cellulose an der äußeren Seite eines permeablen Hohlträgers synthetisiert, wird die jüngste Celluloseschicht immer zwischen bereits gebildeten Celluloseschichten und der äußeren Oberfläche des Hohlträgers gebildet. Daher entspricht das Lumen des BNC-Hohlkörpers, wenn der Hohlträgers entfernt wurde, der aktuell synthetisierten jüngsten, festeren Celluloseschicht, die eine hohe Bakterienzahl enthält
(Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (2011) 31, 14-21 Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech Bioeng (2007) 97, 425-434) - III. Außerdem kann davon ausgegangen werden, dass die Oberflächentopgraphie (Rauhigkeit) des inneren Lumens sehr stark von der Oberflächenstruktur des eingesetzten gas-permeablen Materials (Poren, Spalten, Kanäle und andere Unregelmäßigkeiten) bestimmt wird. Poröses Material erlaubt nur die Passage von Mikrosauerstoffblasen, die die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen nicht gleichmäßig über die gesamte Wachstumsebene gewährleisten und somit die Cellulosebildung stören und zu Defekten/Inhomogenitäten in der gesamten aufgebauten hohlen Cellulose, insbesondere aber auch im Lumen der hohlen Cellulose führen können.
- IV. Nicht-poröses Material soll die gleichmäßige Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen gewährleisten und die Gasblasenbildung unterbinden. Als mögliche Folge kann eine zu starke Haftung der BNC am Trägermaterial angenommen werden. Die Isolierung des Cellulosetubes führt zu Verletzungen der inneren Oberfläche.
- V. Durch die Erhöhung des angelegten partiellen Sauerstoffdrucks an der äußeren Wandung eines gaspermeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie in
WO 2008/040729 A2 - VI. Die hohe Konzentration an Cellulose-synthetisierenden Bakterien über die gesamte innere Oberfläche der Cellulosehohlkörper stellt hohe Anforderungen an eine sich an Produktion und Isolierung anschließende Reinigung, da bei Verwendung der so hergestellten Cellulosehohlkörper als Blutgefäßersatz diese innere Oberfläche der Kontaktfläche mit dem Blut entspricht. Trotz intensiver Reinigung können Reaktionen des Immunsystems auf Verunreinigungen nicht ausgeschlossen werden.
- VII. Wird BNC an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen kultiviert, ist von verminderter Biokompatibilität, -stabilität sowie fehlender Bioaktivität des Materials auszugehen. Außerdem ist das Kultivierungsverfahren an sich nur sehr eingeschränkt steuerbar. Lediglich die Sauerstoffzufuhr und der Durchmesser der Hohlkörper-Membranen bieten die Möglichkeit, auf die Morphologie des BNC-Hohlkörpers und damit auf mechanische Eigenschaften Einfluss zu nehmen.
- I. If the cellulose is synthesized on the inner side of a permeable hollow carrier, the inner wall of the molded body is “freely” developed in space without limitation but in constant contact with the culture solution and represents the originally first (oldest) and looser cellulose gel layer The cellulose layer formed on the inner surface of the hollow carrier and moving into the nutrient solution has less and less space available. The result is the formation of imperfections (folds, densities) within the layer system and on the lumen. Further significant disadvantages of these methods consist in the fact that the hollow cylinders produced in this way do not have a sufficiently smooth, homogeneous inner surface. Since, in addition to the formation of serious surface inhomogeneities due to the formation of folds or hollows, there is also the risk of parts of the cellulose becoming detached, these hollow cylinders involve a very high risk of thrombosis. The quality of the inner lumen cannot meet the requirements for a blood vessel replacement.
- II. If the cellulose is synthesized on the outer side of a permeable hollow carrier, the youngest cellulose layer is always formed between already formed cellulose layers and the outer surface of the hollow carrier. Therefore, the lumen corresponds to the BNC hollow body when the hollow beam is removed the newest, firmer cellulose layer currently being synthesized, which contains a high number of bacteria
(Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (2011) 31, 14-21 Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech Bioeng (2007) 97, 425-434) - III. It can also be assumed that the surface topography (roughness) of the inner lumen is very much determined by the surface structure of the gas-permeable material used (pores, crevices, channels and other irregularities). Porous material only allows the passage of micro-oxygen bubbles, which do not ensure the oxygen supply of the microorganisms evenly over the entire growth plane and thus disrupt cellulose formation and can lead to defects / inhomogeneities in the entire hollow cellulose, but especially in the lumen of the hollow cellulose.
- IV. Non-porous material should ensure the uniform supply of oxygen to the microorganisms and prevent the formation of gas bubbles. As a possible consequence, too strong an adhesion of the BNC to the carrier material can be assumed. The isolation of the cellulose tube leads to damage to the inner surface.
- V. By increasing the applied partial oxygen pressure on the outer wall of a gas-permeable, non-porous hollow support as in
WO 2008/040729 A2 - VI. The high concentration of cellulose-synthesizing bacteria over the entire inner surface of the cellulose hollow body places high demands on subsequent cleaning in terms of production and isolation, since when the cellulose hollow body produced in this way is used as a blood vessel substitute, this inner surface corresponds to the contact surface with the blood. Despite intensive cleaning, reactions of the immune system to contamination cannot be ruled out.
- VII. If BNC is cultivated on the surface of oxygen-permeable membranes, reduced biocompatibility and stability as well as a lack of bioactivity of the material can be assumed. In addition, the cultivation process itself can only be controlled to a very limited extent. Only the oxygen supply and the diameter of the hollow body membranes offer the possibility of influencing the morphology of the BNC hollow body and thus the mechanical properties.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Kultivierung nicht rein statisch, sondern in sogenannter „bewegt-statischer“ Form, wobei das Template oder das Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus, oder beides, gesteuert so bewegt werden, dass die Oberfläche des Templates benetzt wird. Ein dauerhafter Kontakt des Templates mit dem Gemischvorrat wird jedoch ausgeschlossen. Das Template und der Gemischvorrat, der das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, werden relativ zueinander bewegt und dabei zeitweise, aber nicht ständig, in Kontakt gebracht. In the method according to the invention, the cultivation does not take place purely statically, but in what is known as “moving-static” form, with the template or the mixture containing culture solution and microorganism, or both, being moved in a controlled manner so that the surface of the template is wetted. A permanent contact of the template with the mixture supply is excluded. The template and the mixture supply, which comprises the culture medium and the microorganism, are moved relative to one another and, in the process, are brought into contact at times, but not constantly.
Kennzeichen des Verfahrens sind ein periodisch aber nicht dauerhaft mit Kulturlösung und Mikroorganismus in Kontakt gebrachtes Template, die Ausbildung eines Films, der Kulturmedium und Mikroorganismus enthält, auf dem Template und die Biosynthese der Cellulose auf dem Template ausschließlich in und/oder auf dem Film - außerhalb des Gemischvorrats. Der Begriff „Unterbrechung des Kontakts“ bedeutet, dass der Kontakt zwischen Template und Gemischvorrat so unterbrochen wird, dass kein Teil der Oberfläche des Templates während der Unterbrechung Kontakt zum Gemischvorrat hat.Characteristics of the process are a template that is periodically but not permanently brought into contact with culture solution and microorganism, the formation of a film containing culture medium and microorganism on the template and the biosynthesis of cellulose on the template exclusively inside and / or on the film - outside of the mixture supply. The term “interruption of contact” means that the contact between template and mixture supply is interrupted in such a way that no part of the surface of the template has contact with the mixture supply during the interruption.
Es wird in dem Verfahren die Innenkontur des Hohlkörpers durch ein geeignet geformtes Template vorgegeben, auf dessen Oberfläche sich bei Durchführung des Verfahrens ein Flüssigkeitsfilm befindet, in welchem die Biosynthese der Cellulose abläuft. Somit bildet die direkt auf der Templateoberfläche erzeugte Cellulose später die innere Oberfläche des Hohlkörpers. Auf dieser auf der Templateoberfläche erzeugten Cellulose kann durch das Verfahren weitere Cellulose erzeugt werden.In the process, the inner contour of the hollow body is given by a suitably shaped template, on the surface of which there is a liquid film in which the biosynthesis of the cellulose takes place when the process is carried out. Thus, the cellulose produced directly on the template surface later forms the inner surface of the hollow body. The process can produce further cellulose on this cellulose produced on the template surface.
Durch periodischen, aber vorzugsweise kurzzeitigen Kontakt mit dem Kulturmedium wird eine Versorgung der Mikroorganismen mit Nährstoffen etc. sichergestellt. Die äußere Formung des Hohlkörpers erfolgt erfindungsgemäß berührungsfrei, ausschließlich durch den Einfluss der Schwerkraft. Nach dem Benetzungsvorgang befindet sich das benetzte Template frei in der umgebenden Sauerstoff-haltigen Atmosphäre und der Cellulosebildungsprozess erfolgt in und/oder auf dem Film.A supply of the microorganisms with nutrients etc. is ensured through periodic, but preferably short-term contact with the culture medium. According to the invention, the outer shaping of the hollow body takes place without contact, exclusively through the influence of gravity. After the wetting process, the wetted template is free in the surrounding oxygen-containing atmosphere and the cellulose formation process takes place in and / or on the film.
Bei dem Verfahren ist kein äußerer Formkörper vonnöten wie z.B. bei Verfahren der statischen Kultivierung, wo mikrobielle Cellulose durch Kultivierung eines Cellulose-bildenden Mikroorganismus in einem Raum zwischen zwei Wandungen gebildet wird. Die äußere Formgebung des Hohlkörpers wird ausschließlich durch die Wahl der Kultivierungsbedingungen definiert. Zu den Kultivierungsbedingungen zählen beispielsweise die Richtung der Schwerkrafteinwirkung, die Häufigkeit und der Abstand einzelner Drehungen, das Zeitintervall zwischen den Benetzungen, die Benetzungszeit, die Verweilzeit, wie nachfolgend noch erläutert, die Temperatur, und die Kultivierungsdauer. Während des Verfahrens ist ein Kulturlösungs- und Sauerstoffaustausch zwischen der sich bildenden Schicht des Hohlkörpers und dem Kultivierungsmillieu gegeben, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und Mikroorganismen gewährleistet ist.The process does not require an external molded body, as is the case, for example, with processes of static cultivation, where microbial cellulose is formed by cultivating a cellulose-forming microorganism in a space between two walls. The external shape of the hollow body is defined exclusively by the choice of cultivation conditions. The cultivation conditions include, for example, the direction of the action of gravity, the frequency and the distance between individual rotations, the time interval between wetting, the wetting time, the residence time, as will be explained below, the temperature and the cultivation time. During the process, there is an exchange of culture solution and oxygen between the layer of the hollow body that is forming and the cultivation medium, so that an optimal supply of nutrient medium, air and microorganisms is guaranteed.
Bei dem Verfahren werden Prozesse vermieden, bei welchen Stoffe durch eine bereits gebildete Celluloseschicht hindurchtreten müssen, was zu Störungen im Aufbau dieser Schichten führen kann.The method avoids processes in which substances have to pass through an already formed cellulose layer, which can lead to disturbances in the structure of these layers.
Erfindungsgemäß erfolgen eine kurzzeitige Benetzung und damit die erforderliche Zufuhr der Kulturlösung an den Ort der Biosynthese. Damit ist die Zufuhr der Kulturlösung im Gegensatz zu den genannten und diskutierten Publikationen nicht mehr diffusionsbestimmt. Bei der Benetzung werden alle für die Biosynthese notwendigen Nährstoffe sowie Bakterien übertragen.According to the invention, there is brief wetting and thus the necessary supply of the culture solution to the site of biosynthesis. Thus, in contrast to the publications mentioned and discussed, the supply of the culture solution is no longer determined by diffusion. When wetting, all nutrients and bacteria necessary for biosynthesis are transferred.
Bei der BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben wird zwar die Diffusionsbarriere überwunden, was durch eine ständige rotierende Bewegung des Templates in der Kulturlösung erreicht wird. Der dauerhafte Kontakt der Mikroorganismen mit der Kulturlösung führt aber zu BNC-Produkten mit strukturellen Nachteilen, wie bei der Würdigung des Standes der Technik genannt. Durch die gesteuerte Zufuhr der Kulturlösung wird erfindungsgemäß die Cellulosebildungsgeschwindigkeit so geregelt, dass optimale Verdichtungs- und Verfestigungsprozesse ermöglicht werden.In the case of BNC production using reactors with rotating disks, the diffusion barrier is indeed overcome, which is achieved by a constant rotating movement of the template in the culture solution. The permanent contact of the microorganisms with the culture solution leads to BNC products with structural disadvantages, as mentioned in the appraisal of the prior art. By the controlled supply of the culture solution, the cellulose formation rate is regulated according to the invention so that optimal compression and solidification processes are made possible.
Überraschend bietet das erfindungsgemäße Verfahren optimale Bedingungen für die Anlagerung von Bakterien an ein Template und deren gleichmäßige Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff. Gleichzeitig wird die BNC mit in der Kulturlösung freibeweglichen Bakterienzellen beladen.Surprisingly, the method according to the invention offers optimal conditions for the accumulation of bacteria on a template and their uniform supply with nutrients and oxygen. At the same time, the BNC is loaded with freely moving bacterial cells in the culture solution.
Der Ort der Biosynthese und damit der Ort der höchsten Bakterienkonzentration befinden sich in der äußeren Grenzschicht des Hohlkörpers und damit nicht auf der Seite des Hohlraums, der bei einem künstlichen Blutgefäß das perspektivisch mit Blut in Kontakt stehende Lumen bildet.The location of the biosynthesis and thus the location of the highest bacterial concentration are located in the outer boundary layer of the hollow body and thus not on the side of the cavity which, in an artificial blood vessel, forms the lumen in contact with the blood.
Das erfindungsgemäße Verfahren, kann in der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden. Es wird vorzugsweise in einer zuvor sterilisierten Vorrichtung durchgeführt und mit sterilem Kulturmedium. In einer Variante können das Kulturmedium und die Vorrichtung getrennt voneinander sterilisiert werden. In einer anderen Variante werden das Kulturmedium und die Vorrichtung gemeinsam sterilisiert und anschließend der Mikroorganismus zugeführt.The method according to the invention can be carried out in the device described in the exemplary embodiments. It is preferably carried out in a previously sterilized device and with sterile culture medium. In a variant, the culture medium and the device can be sterilized separately from one another. In another variant, the culture medium and the device are sterilized together and then the microorganism is added.
Mit dem Verfahren wird die Herstellung von Cellulosehohlkörpern mit verschiedenen Mikro- und Nanostrukturen ermöglicht. Es ist möglich, Mikro- und Nanostrukturen gezielt aufzubauen. Es können biomimetische Hohlkörper erzeugt werden. Der Begriff „biomimetisch“ bedeutet, dass ein menschliches oder tierisches Hohlorgan, beispielsweise ein Blutgefäß, durch den erfindungsgemäß hergestellten Hohlkörper strukturell und/oder funktionell nachgebildet wird, wobei die strukturellen/funktionellen Eigenschaften der natürlichen Vorlage nicht notwendigerweise exakt erfüllt sein müssen. Der Begriff „biomimetische Struktur“ bezeichnet insbesondere eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur.The process enables the production of hollow cellulose bodies with various micro and nanostructures. It is possible to build up micro and nano structures in a targeted manner. Biomimetic hollow bodies can be produced. The term “biomimetic” means that a human or animal hollow organ, for example a blood vessel, is modeled structurally and / or functionally by the hollow body produced according to the invention, the structural / functional properties of the natural template not necessarily having to be met exactly. The term “biomimetic structure” particularly refers to a structure that comes as close as possible to the natural blood vessel.
Mit dem Verfahren hergestellte BNC-Implantate sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet.BNC implants manufactured using this process are characterized by improved mechanical properties and bioactive surfaces.
Unter einem Hohlkörper ist ein Körper zu verstehen, der eine Wand aufweist, die einen Hohlraum umgibt. Die Wand kann eine oder mehrere Öffnungen haben, durch welche der Hohlraum zugänglich ist.A hollow body is understood to mean a body that has a wall that surrounds a cavity. The wall can have one or more openings through which the cavity is accessible.
Grundsätzlich kann der Hohlkörper beliebig geformt sein. Die Form wird dem späteren Einsatzzweck angepasst. Für medizinische Verwendungen als Implantat kann der Hohlkörper z.B. die Form eines Blutgefäßes, einer Speiseröhre, eines Teils des Verdauungstrakts, einer Luftröhre, einer Harnröhre, eines Gallengangs, eines Harnleiters, eines Lymphgefäßes oder einer Manschette (cuff) haben. Diese natürlichen Formen können exakt oder annähernd erreicht sein.In principle, the hollow body can be shaped as desired. The shape is adapted to the later application. For medical uses as an implant, the hollow body can, for example, have the shape of a blood vessel, an esophagus, part of the digestive tract, a windpipe, a urethra, a bile duct, a ureter, a lymphatic vessel or a cuff. These natural forms can be achieved exactly or approximately.
In einer Ausführungsform hat der Hohlkörper die Form einer Röhre oder eines Hohlzylinders. Ferner kann der Hohlkörper eine oder mehrere Biegungen aufweisen, beispielsweise eine Röhre mit einer oder mehreren Biegungen sein. Weiterhin kann der Hohlkörper eine oder mehrere Verzweigungen bzw. Verästelungen aufweisen, beispielsweise kann der Hohlkörper eine Y-Form haben.In one embodiment, the hollow body has the shape of a tube or a hollow cylinder. Furthermore, the hollow body can have one or more bends, for example a tube with one or more bends. Furthermore, the hollow body can have one or more branches or ramifications, for example the hollow body can have a Y-shape.
Länge und Innendurchmesser des Hohlkörpers sind variabel und variabel miteinander kombinierbar. Beispielhafte Innendurchmesser sind 1-30 mm, vorzugsweise 2 bis 8 mm, und beispielhafte Längen sind 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Das Längen-Durchmesser-Verhältnis ist vorzugsweise größer 1. Der Innendurchmesser kann auch innerhalb eines Hohlkörpers variieren.The length and inner diameter of the hollow body can be variably and variably combined with one another. Exemplary inner diameters are 1-30 mm, preferably 2 to 8 mm, and exemplary lengths are 5-500 mm, preferably 100-200 mm. The length / diameter ratio is preferably greater than 1. The inside diameter can also vary within a hollow body.
Der Hohlkörper, insbesondere sein Hohlraum, kann statt eines runden auch einen anders geformten Querschnitt, beispielsweise einen quadratischen, rechteckigen, dreieckigen, oder sternförmigen Querschnitt aufweisen.The hollow body, in particular its hollow space, can also have a differently shaped cross section, for example a square, rectangular, triangular or star-shaped cross section, instead of a round one.
Das Template, oder auch „Templat“, ist wie bereits erwähnt die Negativform des Hohlraums des Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums. Der Begriff „Negativform“ bezeichnet das Hilfsmittel, die Positivform ist das gewünschte Ergebnis, in diesem Fall der/die Hohlkörper/Hohlraum/Hohlraumwand. Das Template ist komplementär zur Form des gewünschten herzustellenden Hohlraums geformt und wird entsprechend vorgegeben. Entsprechend ist über die Form der oben angegebenen Hohlkörper auch die Form des Templates definiert. Das Template gibt die Innengeometrie des Hohlkörpers vor. Beispielsweise ist das Template zylinderförmig, mit einem Durchmesser von 1-30 mm, vorzugsweise 2-8 mm, und einer Länge von 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Wie der Hohlkörper oder Hohlraum kann das Template aber einen beliebigen Querschnitt besitzen, wie rund, eckig, insbesondere quadratisch, rechteckig, dreieckig, oder stern- oder schneeflockenförmig. Ebenso wie der Hohlkörper kann das Template Verzweigungen aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform hat das Template eine 2-dimensionale oder 3-dimensionale gitterartige Struktur.As already mentioned, the template, or “template”, is the negative form of the cavity of the hollow body and the inner walls of the cavity. The term “negative form” describes the aid, the positive form is the desired result, in this case the hollow body / cavity / cavity wall. The template is shaped complementary to the shape of the desired cavity to be produced and is specified accordingly. Correspondingly, the shape of the template is also defined via the shape of the hollow bodies specified above. The template specifies the internal geometry of the hollow body. For example, the template is cylindrical, with a diameter of 1-30 mm, preferably 2-8 mm, and a length of 5-500 mm, preferably 100-200 mm. Like the hollow body or cavity, however, the template can have any cross-section, such as round, angular, in particular square, rectangular, triangular, or star-shaped or snowflake-shaped. Just like the hollow body, the template can have branches. In a further embodiment, the template has a 2-dimensional or 3-dimensional grid-like structure.
In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist. Die Strukturen sind beispielsweise Erhebungen oder Vertiefungen oder beides. Die Strukturen können verschiedene Geometrien aufweisen. Über eine Templateoberfläche können gleichartige oder verschiedene Strukturen regelmäßig oder unregelmäßig verteilt sein.In one embodiment, the template has a surface which has structures in the millimeter, micrometer and / or nanometer range. The structures are, for example, elevations or depressions or both. The structures can have different geometries. Similar or different structures can be distributed regularly or irregularly over a template surface.
Die Templateoberfläche kann so ausgeführt sein, dass die bei dem Hohlkörper erzeugte innere Oberflächenstruktur, d.h. die Struktur der Oberfläche, die an den Hohlraum angrenzt, der späteren Funktion des Hohlkörpers angepasst ist. Sollen z.B. Hohlkörper als Blutgefäßersatz synthetisiert werden, so kann die Oberfläche des Templates so strukturiert sein, dass die innere Oberfläche des synthetisierten Hohlkörpers später eine gute Endothelisierung ermöglicht.The template surface can be designed in such a way that the internal surface structure generated in the hollow body, i.e. the structure of the surface that adjoins the cavity, is adapted to the later function of the hollow body. If, for example, hollow bodies are to be synthesized as blood vessel replacements, the surface of the template can be structured in such a way that the inner surface of the synthesized hollow body later enables good endothelialization.
Das Material, woraus die Oberfläche des Templates gefertigt ist, ist prinzipiell nicht beschränkt. In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, wie Aluminium, Edelstahl oder Titan, Kunststoff, Keramik, synthetischen Polymeren wie Polypropylen, Polyestern, Polyamiden oder Teflon, Papier Textilgewebe oder Glas. Es kann auch das gesamte Template aus einem der genannten Stoffe bestehen. Das Template selbst kann ein Hohlkörper oder massiv (Vollkörper) sein.The material from which the surface of the template is made is in principle not restricted. In one embodiment, the template has a surface made of wood, metal such as aluminum, stainless steel or titanium, plastic, ceramic, synthetic polymers such as polypropylene, polyesters, polyamides or Teflon, paper, textile fabric or glass. The entire template can also consist of one of the substances mentioned. The template itself can be a hollow body or solid (solid body).
Die Oberfläche des Templates kann unbehandelt sein oder vorbehandelt sein. Beispielsweise kann die Vorbehandlung eine Veränderung der Oberflächenmorphologie sein, z.B. durch ätzen, polieren, aufrauen. Die Oberfläche kann beschichtet oder mit chemischen Verbindungen vorbehandelt oder überzogen seinThe surface of the template can be untreated or pretreated. For example, the pretreatment can be a change in the surface morphology, e.g. by etching, polishing or roughening. The surface can be coated or pretreated or coated with chemical compounds
Das Template ist so beschaffen, dass zum einen optimale Bedingungen für die Bindung und Versorgung des Mikroorganismus an seiner Oberfläche und eine Haftung der Cellulose erreicht werden. Zum anderen wird das Template so gewählt, dass das Produkt auf einfache Weise vom Template gelöst werden kann, um den Hohlkörper zu erhalten. Die Oberfläche des Templates ist so beschaffen, dass die Oberflächenqualität der bei Implantation in Kontakt mit Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, tretenden Oberfläche des Hohlkörpers reproduzierbar ist.The template is designed in such a way that, on the one hand, optimal conditions for binding and supplying the microorganism to its surface and adhesion of the cellulose are achieved. On the other hand, the template is chosen so that the product can be easily detached from the template in order to obtain the hollow body. The surface of the template is such that the surface quality of the surface of the hollow body which comes into contact with body fluid, in particular blood, during implantation is reproducible.
In einer speziellen Ausführungsform wird in dem Verfahren eine Anordnung aus mehreren Templates eingesetzt, auch bezeichnet als Template-Matrix. Es können Templates mit gleicher oder unterschiedlicher Geometrie, insbesondere unterschiedlicher Querschnitte, und/oder aus gleichem oder unterschiedlichem Material eingesetzt werden. Dadurch können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere gleiche oder unterschiedliche Hohlkörper erhalten werden. Ein Beispiel für eine Anordnung aus mehreren Templates ist eine Anordnung aus mehreren zylinderförmigen Templates zur Herstellung mehrerer hohlzylinderförmiger bzw. röhrenförmiger Hohlkörper. Mehrere Templates gleicher oder unterschiedlicher Geometrie können in einer Einspannvorrichtung fixiert sein (Template-Matrix), welche mit einer Benetzungseinrichtung und/oder Bewegungseinrichtung verbunden ist, wie in den Ausführungsbeispielen erläutert.In a special embodiment, an arrangement of several templates is used in the method, also referred to as a template matrix. Templates with the same or different geometry, in particular different cross-sections, and / or made of the same or different material can be used. As a result, several identical or different hollow bodies can be obtained in the method according to the invention. An example of an arrangement made up of several templates is an arrangement made up of several cylindrical templates for producing several hollow cylindrical or tubular hollow bodies. Several templates of the same or different geometry can be fixed in a clamping device (template matrix) which is connected to a wetting device and / or moving device, as explained in the exemplary embodiments.
In dem Verfahren wird das Template periodisch, vorzugsweise kurzzeitig, mit dem Gemisch, das die Kulturlösung und den Mikroorganismus umfasst, benetzt. Hierbei bildet sich ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates. Die Form dieses Flüssigkeitsfilmes wird durch die Lage des Templates im Raum bestimmt, da die Schwerkraft auf diesen Film einwirkt.In the method, the template is periodically, preferably briefly, wetted with the mixture comprising the culture solution and the microorganism. A liquid film forms on the surface of the template. The shape of this liquid film is determined by the position of the template in space, since gravity acts on this film.
Auf der Oberfläche des Templates wird ein Flüssigkeitsfilm gebildet, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst. In und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm wird mikrobielle Cellulose gebildet. Der Flüssigkeitsfilm wird auf dem Template verteilt, indem das Template um mehrere Raumachsen rotiert wird, z.B. mittels der Bewegungseinrichtung wie in den Beispielen erläutert. Durch eine vorgegebene Bewegung des Templates wird eine noch bessere Verteilung der Flüssigkeit auf der Oberfläche des Templates erreicht. Die Verteilung der Flüssigkeit kann durch die Art der vorgegebenen Rotationsbewegung des Templates beeinflusst werden, wobei die Rotationsbewegung auch unterbrochen werden kann. Die äußere Geometrie des Hohlkörpers wird somit durch eine definierte Verteilung eines Flüssigkeitsfilmes und durch eine definierte Bewegung unter dem Einfluss der Schwerkraft bestimmt.A liquid film is formed on the surface of the template, which includes the liquid culture medium and the microorganism. Microbial cellulose is formed in and / or on the liquid film. The liquid film is distributed on the template by rotating the template around several spatial axes, e.g. by means of the movement device as explained in the examples. A predetermined movement of the template achieves an even better distribution of the liquid on the surface of the template. The distribution of the liquid can be influenced by the type of predetermined rotational movement of the template, with the rotational movement also being able to be interrupted. The outer geometry of the hollow body is thus determined by a defined distribution of a liquid film and by a defined movement under the influence of gravity.
Vorzugsweise hat das Template eine Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1. Beispielsweise hat das Template eine stab-, kegel- oder zylinderförmige Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1, zur Herstellung eines röhren- oder hohlzylinderförmigen Hohlkörpers, wobei Verzweigungen vorgesehen sein können. Bei dieser Geometrie weist das Template eine Längsachse auf. Das Verfahren wird dann so durchgeführt, dass das Template um mehrere Raumachsen rotiert wird, die vorzugsweise quer, mehr bevorzugt senkrecht zur Längsachse des Templates ist/sind.The template preferably has a geometry with a length-to-diameter ratio of greater than 1. For example, the template has a rod-shaped, conical or cylindrical geometry with a length-to-diameter ratio of greater than 1, for the production of a tubular or hollow-cylindrical hollow body, branches can be provided. With this geometry, the template has a longitudinal axis. The method is then carried out in such a way that the template is rotated around a plurality of spatial axes which are preferably transverse, more preferably perpendicular, to the longitudinal axis of the template.
Wie erwähnt, wird ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates gebildet. Der Flüssigkeitsfilm wird dadurch gebildet, dass das Template und das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, relativ zueinander bewegt und dabei in Kontakt gebracht werden. Grundsätzlich kann die Relativbewegung derart sein, dass das Template, oder das Gemisch, welches Kulturmedium und Mikroorganismus aufweist, oder das Template und das Gemisch bewegt werden.As mentioned, a liquid film is formed on the surface of the template. The liquid film is formed in that the template and the mixture, which comprises the culture medium and the microorganism, are moved relative to one another and thereby brought into contact. In principle, the relative movement can be such that the template, or the mixture comprising the culture medium and microorganism, or the template and the mixture are moved.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Template in das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht wird. Eine Bewegung des Templates um mehrere Raumachsen kann einer Ein- und Austauchbewegung des Templates überlagert sein.In one variant, the surface of a template is brought into contact with the mixture in such a way that the template is immersed in and out of the mixture which comprises the culture medium and the microorganism. A movement of the template around several spatial axes can be superimposed on an inward and outward movement of the template.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt Bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Gemisch aus dem ersten Gemischvorrat über das Template gegossen wird. Nach dem Gießen des Gemisches über das Template wird vorzugsweise nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch aufgefangen und für ein weiteres Übergießen wieder verwendet.In one variant, the surface of a template is brought into contact with the mixture in such a way that the mixture from the first mixture supply is poured over the template. After the mixture has been poured over the template, the mixture that does not remain on the surface of the template is preferably collected and reused for further pouring.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt Bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Gemisch aus Kulturmedium und Mikroorganismus auf das Template gesprüht wird.In one variant, the surface of a template is brought into contact with the mixture in such a way that the mixture of culture medium and microorganism is sprayed onto the template.
Die sauerstoffhaltige Atmosphäre ist vorzugsweise Luft oder reiner Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gasgemisch. Mikrobielle Cellulose wird in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm gebildet wird, wenn dieser mit Sauerstoff in Kontakt kommt.The oxygen-containing atmosphere is preferably air or pure oxygen or an oxygen-containing gas mixture. Microbial cellulose is formed in and / or on the liquid film when it comes into contact with oxygen.
Der Kontakt zwischen dem Template und dem Gemischvorrat wird bei dem Verfahren unterbrochen und die Synthese der Cellulose erfolgt nur in oder auf dem Flüssigkeitsfilm, der von dem Gemischvorrat getrennt wurde. Dadurch spielen etwaige Diffussionsprozesse von Kulturlösung und Sauerstoff eine untergeordnete oder gar keine Rolle. Überraschenderweise wurde gefunden, dass keinerlei Cellulose-Bildung innerhalb bzw. auf der Flüssigkeitsoberfläche des Gemischvorrats stattfindet.The contact between the template and the mixture supply is interrupted in the process and the synthesis of the cellulose takes place only in or on the liquid film which was separated from the mixture supply. As a result, any diffusion processes of culture solution and oxygen play a subordinate or no role at all. Surprisingly, it has been found that no cellulose formation takes place within or on the liquid surface of the mixture reservoir.
Am Ende des Verfahrens können Template und Cellulose voneinander getrennt werden, um den Hohlhörper ohne Kern zu erhalten. Daher erfolgt als optionaler Schritt die Trennung des Templates von der gebildeten Cellulose, sodass ein Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose ohne Template erhalten wird. In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Verfahren als „Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose“ bezeichnet. Nach Trennung von dem Template kann der BNC-Hohlkörper gereinigt und sterilisiert werden.At the end of the process, the template and cellulose can be separated from one another in order to obtain the hollow body without a core. Therefore, as an optional step, the template is separated from the cellulose formed so that a hollow body made of microbial cellulose without a template is obtained. In this case, the method according to the invention is referred to as a “method for producing a hollow body from microbial cellulose”. After separation from the template, the BNC hollow body can be cleaned and sterilized.
Die mikrobille Cellulose kann alternativ auf dem Template verbleiben, ohne dass der beschriebene optionale Trennungsschritt durchgeführt wird. In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Verfahren als „Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose“ bezeichnet. Das Vorprodukt bezeichnet das Template mit darauf befindlicher mikrobieller Cellulose. Die mikrobielle Cellulose kann auf dem Template gereinigt und sterilisiert werden, ohne dass sie zuvor von dem Template entfernt wird. Desweiteren kann die mikrobielle Cellulose mit dem Template zusammen gelagert werden, ohne dass sie von dem Template entfernt wird. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon. Zur endgültigen Verwendung kann dann die mikrobielle Cellulose vom Template getrennt werden, um einen Hohlkörper zu erhalten. Die Trennung erfolgt z.B. dadurch, dass die gebildete Cellulose von dem Template abgezogen wird oder das Template auf andere Art und Weise entnommen wird. Beispielsweise wird die Cellulose von einem zylinderförmigen Template abgestreift und ein Hohlzylinder ohne Template-Kern erhalten. Durch eine Reinigungsflüssigkeit kann, wenn die Cellulose damit auf dem Template gereinigt wird, die Ablösung der Cellulose von dem Template befördert werden. Je nach verwendetem Material kann das Template nach schonender Reinigung seiner Oberfläche wieder verwendet werden. Es ist aber auch möglich, das Template zum Zweck der Trennung von der Cellulose zu zerstören.Alternatively, the microbial cellulose can remain on the template without the described optional separation step being carried out. In this case, the method according to the invention is referred to as a “method for producing a preliminary product of a hollow body from microbial cellulose”. The preliminary product describes the template with microbial cellulose on it. The microbial cellulose can be cleaned and sterilized on the template without first being removed from the template. Furthermore, the microbial cellulose can be stored together with the template without it being removed from the template. The cleaning is preferably carried out with water, an aqueous acidic or alkaline solution, or an organic solvent, or a combination thereof. For the final use, the microbial cellulose can then be separated from the template in order to obtain a hollow body. The separation takes place, for example, in that the cellulose formed is removed from the template or the template is removed in another way. For example, the cellulose is stripped from a cylindrical template and a hollow cylinder without a template core is obtained. When the cellulose is cleaned on the template, the detachment of the cellulose from the template can be promoted by a cleaning liquid. Depending on the material used, the template can be reused after carefully cleaning its surface. But it is also possible to destroy the template for the purpose of separating it from the cellulose.
Das Template wird zumindest während Schritt c) und/oder dem Schritt f), oder einem oder mehreren der Schritte f), wenn der Schritt f) mehrmals durchgeführt wird, um mehrere Raumachsen rotiert. Mit dieser Maßnahme kann die Form und Verteilung des Flüssigkeitsfilms und die Form des sich bildenden Produktes beeinflusst werden. Anders ausgedrückt wird dabei das Template mit einem definierten Flüssigkeitsfilm überzogen, was wiederum zu einer definierten Form des sich bildenden Produktes führt. Die Rotation kann auch bereits während Schritt a) und b) und/oder während der Schritte d) und e), erfolgen. Wenn beispielsweise das Template zur Benetzung relativ zu dem Gemischvorrat bewegt und mit diesem in Kontakt gebracht wird, dann kann zusätzlich eine der Bewegung des Templates überlagerte Relativbewegung um mehrere Raumachsen erfolgen.The template is rotated about several spatial axes at least during step c) and / or step f), or one or more of steps f) if step f) is carried out several times. With this measure, the shape and distribution of the liquid film and the shape of the product being formed can be influenced. In other words, the template is covered with a defined liquid film, which in turn leads to a defined shape of the product being formed. The rotation can also take place during steps a) and b) and / or during steps d) and e). If, for example, the template is moved relative to the mixture supply for wetting and is brought into contact with it, then a relative movement about several spatial axes superimposed on the movement of the template can also take place.
Diese Folge der Schritte d)-f) kann ein- oder mehrmals wiederholt werden, bis eine gewünschte Menge Cellulose auf der Oberfläche des Templates erzeugt ist und die Cellulose eine gewünschte Gesamtschichtdicke erreicht hat. Die sogenannte Gesamtschicht kann aus mehreren Einzelschichten bzw.-Phasen zusammengesetzt sein. Bei dieser Verfahrensvariante erfolgt eine Synthese weiterer mikrobieller Cellulose auf bereits gebildeter Cellulose.This sequence of steps d) -f) can be repeated one or more times until a desired amount of cellulose has been produced on the surface of the template and the cellulose has reached a desired total layer thickness. The so-called total layer can be composed of several individual layers or phases. In this process variant, further microbial cellulose is synthesized on cellulose that has already formed.
Die oben beschriebene Rotation kann bei jedem der Schritte f) (erster Schritt f und Wiederholungen davon, wenn die Schrittfolge d)-f) wiederholt wird) erfolgen. Anders ausgedrückt, erfolgt das Rotieren um mehrere Raumachsen nicht zwingend nach jedem Benetzungsvorgang. In einer Verfahrensvariante wird die Folge der Schritte d)-f) 1-40 mal, vorzugsweise 1 - 30 mal durchlaufen ohne dass eine Rotationsbewegung des Templates zur Verteilung des Flüssigkeitsfilms erfolgt und in zumindest einem darauffolgenden Schritt f), wenn die Folge der Schritte d)-f) erneut durchlaufen wird, erfolgt eine Rotation um mehrere Raumachsen.The rotation described above can take place in each of the steps f) (first step f and repetitions thereof if the sequence of steps d) -f) is repeated). In other words, the rotation about several spatial axes does not necessarily take place after each wetting process. In one variant of the method, the sequence of steps d) -f) is run through 1-40 times, preferably 1-30 times, without a rotational movement of the template for distributing the liquid film taking place and in at least one subsequent step f) when the sequence of steps d ) -f) is run through again, there is a rotation around several spatial axes.
Die Zeiten des in Kontakt Bringens der Oberfläche eines Templates (Schritt a) mit einem Gemischvorrat und des in Kontakt Bringens des in Schritt c) erzeugter mikrobieller Cellulose mit dem Gemischvorrat (Schritt d) werden als „Benetzungszeiten“ bezeichnet. Die Zeiten des in Kontakt Bringens des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre (Schritte c und f) werden als „Verweilzeiten“ bezeichnet. Benetzungszeiten und Verweilzeiten können von einander unabhängig gesteuert werden. Die Verweilzeit beträgt in einer Ausführungsform 1-60 Minuten, vorzugsweise 5-40 min.The times of bringing the surface of a template into contact (step a) with a mixture supply and of bringing the microbial cellulose produced in step c) into contact with the mixture supply (step d) are referred to as “wetting times”. The times when the liquid film is brought into contact with an oxygen-containing atmosphere (steps c and f) are referred to as “residence times”. Wetting times and dwell times can be controlled independently of each other. In one embodiment, the residence time is 1-60 minutes, preferably 5-40 minutes.
Die Gesamtkultivierungszeit beträgt vorzugsweise 1-7 Tage. Die Gesamtkultivierungszeit entspricht der gesamten Prozesszeit, innerhalb welcher alle Schritte des Verfahrens, wie Dreh-, Benetzungs- und sonstige Schritte ablaufen. Die Dauer des Verfahrens bestimmt die Dicke der auf dem Template gebildeten Cellulose-Gesamtschicht, die der Wandstärke des isolierten Hohlkörpers entspricht und die wie oben erwähnt aus mehreren Einzelschichten zusammengesetzt sein kann.The total cultivation time is preferably 1-7 days. The total cultivation time corresponds to the total process time, within which all steps of the process, such as turning, wetting and other steps, take place. The duration of the process determines the thickness of the total cellulose layer formed on the template, which corresponds to the wall thickness of the insulated hollow body and which, as mentioned above, can be composed of several individual layers.
Die mit dem Verfahren hergestellten Hohlkörper können gereinigt werden, um Reste und Bestandteile des Kulturmediums und Mikroorganismen zu entfernen. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon.The hollow bodies produced with the method can be cleaned in order to remove residues and components of the culture medium and microorganisms. The cleaning is preferably carried out with water, an aqueous acidic or alkaline solution, or an organic solvent, or a combination thereof.
Die mit dem Verfahren erhaltenen Hohlkörper können ohne Trocknung nach einem Reinigungsprozess und Sterilisation als feuchte Implantate eingesetzt werden. The hollow bodies obtained with the method can be used as moist implants after a cleaning process and sterilization without drying.
Andererseits können die Hohlkörper zur Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Kritischpunkttrocknung, schonend getrocknet werden, wobei die Struktur und die Wiederquellbarkeit von Nanocellulose erhalten bleiben. Vor einer chirurgischen Anwendung kann das Implantat beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder auch patienteneigenem oder allogenem (pharma-grade) Serum wieder gequollen werden.On the other hand, the hollow bodies can be gently dried for storage, for example by freeze drying or critical point drying, the structure and the resellability of nanocellulose being retained. Before a surgical application, the implant can be swollen again, for example in physiological saline solution or the patient's own or allogeneic (pharma-grade) serum.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, der durch das vorangehend beschriebene Verfahren erhältlich ist.In a further aspect, the invention relates to a hollow body made of microbial cellulose, which can be obtained by the method described above.
Wie bereits zuvor beschrieben unterscheidet sich das Verfahren grundsätzlich von den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Der Aufbau von Cellulose findet nach einem gänzlich verschiedenen Mechanismus statt. Bei der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach
Abweichend davon erfolgt die Biosynthese im vorliegenden Verfahren auf der Außenseite des Hohlkörpers, an der Grenzfläche von Gemischfilm zu umgebender sauerstoffhaltiger Atmosphäre. Dadurch ist die jüngst gebildete Cellulose außenseitig lokalisiert und bereits gebildete Cellulose bleibt während der Synthese ortsfest. Der Sauerstoffeintrag erfolgt im Gegensatz zu
Durch diese unterschiedlichen Bildungsprozesse wird ein Produkt mit neuartiger Struktur erhalten.A product with a new structure is obtained through these different educational processes.
Insbesondere weist der Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die innere Oberfläche und die äußere Oberfläche eine identische oder ähnliche Bedeckung durch Fasern aus mikrobieller Cellulose pro Flächeneinheit aufweisen. Wie erwähnt, bilden BNC Fasern mehr oder weniger dichte bzw. mehr oder weniger poröse Netzwerke aus. Mit Methoden der Bildauswertung ist es möglich, Oberflächenbereiche, in denen sich Fasern befinden (in einer REM Aufnahme beispielsweise heller) von Oberflächenbereichen, in denen sich keine Fasern befinden (Lücken, in einer REM Aufnahme beispielsweise dunkler) abzugrenzen und die Bereiche ins Verhältnis zur betrachteten Gesamtfläche zu setzen. Die Bedeckung pro Flächeneinheit ist angegeben als
Die Bedeckung kann als Prozentzahl angegeben werden. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sich die Bedeckung auf der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) = (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.The coverage can be given as a percentage. The term “similar” in this context means that the coverage on the inner surface and the outer surface differ relative to one another by a maximum of 20%, preferably a maximum of 10%, most preferably a maximum of 5%. The percentage of the difference between the values is determined as follows: Difference (%) = (larger number - smaller number) / smaller number * 100.
Eine ähnliche Bedeckung wie oben definiert bedeutet eine ähnliche Porosität der inneren und äußeren Oberfläche, wobei die Porosität mit Bezug auf eine Oberfläche zweidimensional definiert ist als
Die nicht Fasern bedeckte Fläche kann als „offenporige Fläche“ oder „Porenfläche“ bezeichnet werden.The area not covered by fibers can be referred to as "open-pore area" or "pore area".
Für den Zusammenhang zwischen Bedeckung und zweidimensionaler Porosität gilt:
Bei der Bedeckung und Porosität können BNC Fasern mit berücksichtigt werden, die etwas außerhalb einer als zweidimensional angenommen inneren/äußeren Oberfläche liegen. Bei einer elektronenmikroskopischen Aufnahme erhält man eine zweidimensionale Darstellung der äußeren bzw. inneren Oberfläche der Wand des Hohlkörpers. Die abgebildeten BNC-Fasern liegen aber nicht immer in einer Ebene, da die Oberflächen eine gewisse Rauigkeit aufweisen können und/oder gegebenenfalls BNC Fasern mit abgebildet werden die aus Blickrichtung des Betrachters hinter der Oberfläche liegen. Es hat sich gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Hohlkörper die äußere Oberfläche der Wand rauer sein kann als die innere Oberfläche. Bei der Ermittlung der Bedeckung und Porosität werden vorzugsweise alle BNC Fasern mit berücksichtigt, die auf einer REM Aufnahme (10.000fache Vergrößerung) sichtbar sind und sie werden so behandelt als lägen sie in einer Ebene, da die Bedeckung/Porosität auf eine Flächeneinheit bezogen werden.In terms of coverage and porosity, BNC fibers can be taken into account that lie somewhat outside of an inner / outer surface assumed to be two-dimensional. An electron microscope image gives a two-dimensional representation of the outer or inner surface of the wall of the hollow body. However, the BNC fibers shown do not always lie in one plane, since the surfaces can have a certain roughness and / or BNC fibers may also be shown that are behind the surface when viewed from the observer. It has been shown that, in the case of the hollow body according to the invention, the outer surface of the wall can be rougher than the inner surface. When determining the coverage and porosity, all BNC fibers that are visible on an SEM image (10,000x magnification) are preferably taken into account and they are treated as if they were in one plane, since the coverage / porosity is based on a unit area.
Somit weist der Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die innere Oberfläche und die äußere Oberfläche eine ähnliche Porosität, wie oben definiert aufweisen. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet mit Bezug auf die Porosität, dass sich die zweidimensionale Porosität der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) = (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.Thus, the hollow body has a wall with an inner surface and an outer surface, wherein the inner surface and the outer surface have a similar porosity as defined above. With reference to the porosity, the term “similar” means that the two-dimensional porosity of the inner surface and the outer surface differ relative to one another by a maximum of 20%, preferably a maximum of 10%, most preferably a maximum of 5%. The percentage of the difference between the values is determined as follows: Difference (%) = (larger number - smaller number) / smaller number * 100.
Eine gleichartige Porosität von innerer und äußerer Oberfläche seiner Wand macht den Hohlkörper der vorliegenden Erfindung aufgrund des gleichmäßigen Faseraufbaus insbesondere geeignet zur Verwendung als Tunica media, insbesondere von herznahen Arterien. Die Erfindung stellt einen Hohlkörper bereit, der durch Schichten hoher und funktionsrelvanter Oberflächenqualität begrenzt ist. Die Oberflächen sind vorzugsweise frei von Störstellen und Inhomogenitäten.A similar porosity of the inner and outer surface of its wall makes the hollow body of the present invention particularly suitable for use as tunica media, in particular of arteries near the heart, due to the uniform fiber structure. The invention provides a hollow body that is limited by layers of high and functionally relevant surface quality. The surfaces are preferably free from imperfections and inhomogeneities.
Bei dem Verfahren nach
Insbesondere weist der erfindungsgemäße Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die Wand mehrere Schichten aus mikrobieller Cellulose umfasst, welche parallel zur der inneren und äußeren Oberfläche der Wand verlaufen. Diese Schichten werden nachfolgend auch als „Phasen“ bezeichnet. Die Schichten entsprechen den oben bereits genannten „Einzelschichten bzw.-Phasen“ der Wand des Hohlkörpers. Die Phasen der Wand des erfindungsgemäßen Hohlkörpers stellen sich im Gegensatz zu den in
Diese Phasen müssen nicht durch einen Verfahrenszyklus von Benetzung/Filmbildung und anschließender Cellulosebildung in oder auf dem Film erhalten sein. Eine Phase kann durch mehrere solche Verfahrenszyklen gebildet sein. Die Phasen sind mittels Rasterelektronenmikroskopie, beispielsweise bei 24facher Vergrößerung, optisch voneinander unterscheidbar. Die Phasen sind aus einem Netzwerk aus Fasern bakterieller Nanonocellulose aufgebaut, wobei die Faserstrukturen der Phasen beim Vergleich der Phasen gleich oder unterschiedlich sein können.These phases do not have to be obtained by a process cycle of wetting / film formation and subsequent cellulose formation in or on the film. A phase can be formed by several such process cycles. The phases are by means of scanning electron microscopy, for example at 24 times Magnification, visually distinguishable from each other. The phases are made up of a network of fibers from bacterial nanonocellulose, whereby the fiber structures of the phases can be the same or different when the phases are compared.
Vorzugsweise sind die Phasen in ihrer Dichte über die gesamte Phasendicke homogen. D.h. sie weisen keinen Dichtegradienten auf. Ferner sind die Phasen vorzugsweise auch frei von Störstellen (siehe auch
Die Erfindung betrifft auch einen Hohlkörper, dessen Wand aus Schichten, auch bezeichnet als Phasen aufgebaut ist wie oben beschrieben, wobei eine der Schichten die innere Oberfläche, d.h. die hohlraumseitige Oberfläche, der Wand aufweist und eine weitere Schicht die äußere Oberfläche der Wand aufweist und wobei diese beiden Schichten eine identische oder ähnliche Porosität aufweisen. Die Schicht/Phase, die die innere Oberfläche der Wand aufweist, wird auch als „Lumen-seitige Schicht/Phase“ oder „hohlraumseitige Schicht/Phase“ bezeichnet. Die Schicht/Phase, die die äußere Oberfläche der Wand aufweist, wird auch als „außenseitige Schicht/Phase“ bezeichnet.The invention also relates to a hollow body, the wall of which is made up of layers, also referred to as phases, as described above, one of the layers having the inner surface, ie the surface on the cavity side, of the wall and a further layer having the outer surface of the wall and where these two layers have an identical or similar porosity. The layer / phase comprising the inner surface of the wall is also referred to as the “lumen-side layer / phase” or “cavity-side layer / phase”. The layer / phase that has the outer surface of the wall is also referred to as the "outside layer / phase".
Mit Bezug auf die räumlich ausgebildeten Schichten/Phasen ist die Porosität räumlich definiert als:
Bei dem Gesamtvolumen kann das Volumen der gesamten Schicht/Phase herangezogen werden. Es ist aber auch möglich, nur einen Teil des Volumens der Schicht/Phase zu betrachten und diesen Volumenteil zum Zweck der Messung der Porosität als „Gesamtvolumen“ zu betrachten. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet mit Bezug auf die räumliche Porosität, dass sich die Porosität der Lumen-seitigen Phase und die Porosität der außenseitigen Phase" relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) = (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.For the total volume, the volume of the entire layer / phase can be used. However, it is also possible to consider only part of the volume of the layer / phase and to consider this part of the volume as the “total volume” for the purpose of measuring the porosity. With reference to the spatial porosity, the term “similar” means that the porosity of the lumen-side phase and the porosity of the outer-side phase differ relative to one another by a maximum of 20%, preferably a maximum of 10%, most preferably a maximum of 5% Percentage of the difference between the values is determined as follows: Difference (%) = (larger number - smaller number) / smaller number * 100.
Eine identische oder ähnliche dreidimensionale/räumliche Porosität wie oben definiert bedeutet, dass die Lumen-seitige Schicht/Phase und die außenseitige Schicht/Phase eine identische oder ähnliche Dichte aufweisen. Ferner bedeutet eine identische oder ähnliche dreidimensionale/räumliche Porosität wie oben definiert, dass die Lumen-seitige Schicht/Phase und die außenseitige Schicht/Phase eine identische oder ähnliche Faserdichte aufweisen. Die Dichte wird vorzugsweise angegeben als Masse/Volumen und die Faserdichte wird angegeben als Anzahl Fasern/Volumen. Bei dem Volumen kann das Volumen der gesamten Schicht/Phase herangezogen werden. Es ist aber auch möglich, und bevorzugt, zur Bestimmung der Dichte oder der Faserdichte nur einen Teil des Volumens der Schicht/Phase zu betrachten. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet mit Bezug auf die Dichte und Faserdichte, dass sich die Dichte/Faserdichte der Lumen-seitigen Phase und die Dichte/Faserdichte der außenseitigen Phase" relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt:
Vorzugsweise sind zwischen der Lumen-seitigen Phase und der außenseitigen Phase eine oder mehrere weitere Phasen angeordnet. Besonders bevorzugt weisen diese eine oder mehrere weiteren Phasen eine identische oder ähnliche Porosität, Dichte und Faserdichte auf wie die Lumen-seitige Phase und die außenseitige Phase.One or more further phases are preferably arranged between the phase on the lumen side and the phase on the outside. These one or more further phases particularly preferably have an identical or similar porosity, density and fiber density to the lumen-side phase and the outside phase.
Vorzugsweise sind die Phasen so fest miteinander verbunden, dass sie bei mechanischer Beanspruchung in einem Zugversuch nicht voneinander delaminieren. Dies bedeutet insbesondere, dass keine Delamination in Form verschiedener Peaks im Zug-Dehnungsdiagramm sichtbar sind, wenn ein Zugversuch mit der Methode durchgeführt wird, wie sie in Bodin A et al., Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434 auf Seite 427 unter der Überschrift „Tensile Measurement“ beschrieben sind. Hierbei wird ein Ring aus BNC mit 4 mm Innendurchmesser und 5 mm Breite geschnitten und radial mit einer Geschwindigkeit von 0,25 mm/s gestreckt.The phases are preferably connected to one another so firmly that they do not delaminate from one another in a tensile test when subjected to mechanical stress. This means in particular that no delamination in the form of various peaks is visible in the tensile strain diagram when a tensile test is carried out using the method as described in Bodin A et al., Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434 on page 427 under the heading "Tensile Measurement". A ring made of BNC with an inside diameter of 4 mm and a width of 5 mm is cut and stretched radially at a speed of 0.25 mm / s.
Insbesondere ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer Mittelachse, die mittig und längs der Zylinderausdehnung durch den Hohlraum verläuft. Insbesondere ist der Hohlkörper aus mindestens zwei, rotationssymmetrisch um die Hauptachse angeordneten, parallel zueinander verlaufenden, miteinander verbundenen, BNC-Phasen gekennzeichnet. Auf diese Weise kann ein biomimetischer Aufbau der Wand des Hohlkörpers erzeugt werden. Im Gegensatz zu
Überraschender Weise wurde gefunden, dass dieser Aufbau dem Hohlkörper über die gesamte Länge Formstabilität und gleichmäßig hohe mechanische Reiß- und Druckfestigkeit sowie ausreichende Elastizität unabhängig vom inneren Durchmesser des Hohlkörpers verleiht. Die Phasen sind vorzugsweise charakterisiert durch ein gleichmäßiges (isotropes), gut verzweigtes Fasernetzwerk. Anzahl und Stärke der Phasen sind kontrolliert einstellbar. Sie sind so angeordnet, dass sie der einem natürlichen Gefäß nahe kommenden Struktur insbesondere der Media entsprechen (biomimetische Struktur) und den Aufbau körpereigener Strukturen (Adventitia und Intima) sowie den Stoffaustausch vergleichbar mit dem natürlicher Austauschprozesse (bioaktives Material) anregen. Der Aufbau als geschichtete Phasenstruktur hat mutmaßlich, und ohne auf diese Erklärung festgelegt zu sein, eine mechanischen Stabilität, Biokompatibilität durch Endothelisierbarkeit der inneren Oberfläche, und eine Integration in die körpereigene Gewebestruktur zur Folge.Surprisingly, it has been found that this structure gives the hollow body dimensional stability and uniformly high mechanical tear and compressive strength as well as sufficient elasticity regardless of the inner diameter of the hollow body over the entire length. The phases are preferably characterized by a uniform (isotropic), well-branched fiber network. The number and strength of the phases can be adjusted in a controlled manner. They are arranged in such a way that they correspond to the structure that comes close to a natural vessel, especially the media (biomimetic structure) and stimulate the development of the body's own structures (adventitia and intima) as well as the exchange of substances comparable to natural exchange processes (bioactive material). The structure as a layered phase structure presumably results in mechanical stability, biocompatibility through endothelizability of the inner surface, and an integration into the body's own tissue structure, without being bound by this explanation.
Der Hohlkörper weist vorzugsweise eine oder mehrere Öffnungen auf, durch die der Hohlraum des Hohlkörpers zugänglich ist. Bei den Öffnungen kann es sich z.B. um die Zufluss und die Abflussöffnung eines Blutgefäßteils handeln.The hollow body preferably has one or more openings through which the cavity of the hollow body is accessible. The openings can be, for example, the inflow and outflow opening of a part of the blood vessel.
Geometrien des Hohlkörpers wurden bereits anhand des Herstellungsverfahrens weiter oben erläutert. In einer speziellen Ausführungsform ist der Hohlköper ausgewählt aus einer Röhre oder einem Hohlzylinder, der eine oder mehrere Verzweigungen aufweisen kann.Geometries of the hollow body have already been explained above using the manufacturing method. In a special embodiment, the hollow body is selected from a tube or a hollow cylinder, which can have one or more branches.
Die erfindungsgemäßen Hohlkörper sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften, gezielt einstellbare Mikrostrukturen (biomimetischer Aufbau) und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet. Weitere bevorzugte mechanische Eigenschaften, die beliebig mit den oben bereits beschriebenen mechanischen, strukturellen und geometrischen Eigenschaften kombinierbar sind, sind nachfolgend beschrieben.The hollow bodies according to the invention are characterized by improved mechanical properties, specifically adjustable microstructures (biomimetic structure) and bioactive surfaces. Further preferred mechanical properties, which can be combined as desired with the mechanical, structural and geometric properties already described above, are described below.
Die Erfindung betrifft auch einen Hohlkörper mit einer Nahtausreißfestigkeit im Bereich von 5 - 15 N, vorzugsweise 8-10 N, insbesondere einen Hohlzylinder oder eine Röhre mit einer solchen Nahtausreißfestigkeit. Die Nahtausreißfestigkeit wird nach der Methode bestimmt, die in den Beispielen angegeben ist.The invention also relates to a hollow body with a seam tear strength in the range of 5-15 N, preferably 8-10 N, in particular a hollow cylinder or a tube with such a seam tear strength. The seam pull-out strength is determined according to the method given in the examples.
Ferner wird auch ein Hohlkörper mit einem Berstdruck von mindestens 400 mm Hg angegeben, vorzugsweise mindestens 600 mm Hg und am meisten bevorzugt mindestens 800 mm Hg. Der Berstdruck wird nach der Methode bestimmt, die in den Beispielen angegeben ist.A hollow body with a bursting pressure of at least 400 mm Hg, preferably at least 600 mm Hg and most preferably at least 800 mm Hg, is also specified. The bursting pressure is determined by the method which is given in the examples.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung auch ein künstliches Gefäß, insbesondere zur Anwendung als Implantat im menschlichen oder tierischen Körper, aufweisend einen Hohlkörper wie zuvor beschrieben. Der Hohlkörper kann als Komposit mit weiteren Stoffen vorliegen, beispielsweise mit anderen Polymeren als BNC wie z.B. Cellulosederivate, Alginat oder Proteine, beispielsweise zum Zweck der Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Der Hohlkörper kann zusätzlich Wachstums- und/oder Rekrutierungsfaktoren und/oder andere biologisch wirksame Stoffe enthalten, beispielsweise zum Zweck der Verbesserung ihrer Bioaktivität durch Anlagerung und Einwanderung körpereigener Zellen.In one aspect, the invention also relates to an artificial vessel, in particular for use as an implant in the human or animal body, having a hollow body as described above. The hollow body can be present as a composite with other substances, for example with polymers other than BNC such as cellulose derivatives, alginate or proteins, for example for the purpose of improving the mechanical properties. The hollow body can additionally contain growth and / or recruitment factors and / or other biologically active substances, for example for the purpose of improving their bioactivity through the accumulation and immigration of the body's own cells.
Wenn der Hohlkörper als künstliches Blutgefäß eingesetzt werden soll, dann kann er direkt in den Körper eingesetzt werden. Der Hohlkörper kann auch einer Vorbehandlung unterzogen werden, beispielsweise kann eine Adhäsion von Endothelzellen an die Oberfläche des Hohlkörpers erfolgen.If the hollow body is to be used as an artificial blood vessel, then it can be inserted directly into the body. The hollow body can also be subjected to a pretreatment, for example endothelial cells can be adhered to the surface of the hollow body.
In noch einem Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Hohlkörpers oder eines künstlichen Gefäßes, wie vorangehend beschrieben, als medizinisches Implantat. Die Hohlkörper und künstlichen Gefäße können in medizinischen Anwendungen als innere Hohlstrukturen und -gefäße, wie Blutgefäße, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter, Lymphgefäße oder als Manschette (cuff) zur Umhüllung von körpereigenen Strukturen wie Hohlorganen oder Nervenfasern, oder als Interponat eingesetzt werden, wobei die Hohlkörper direkt oder nach Adaption an die Organspezifik eingesetzt werden können. Weitere Verwendungen sind die Verwendung als medizinisches Übungsmaterial, insbesondere für das realitätsnahe Training chirurgischer Techniken, in der cardiovaskulären Medizin und der Viszeralchirurgie, wozu die Hohlkörper auch mechanisch bearbeitet werden kann.In another aspect, the invention relates to the use of a hollow body or an artificial vessel, as described above, as a medical implant. The hollow bodies and artificial vessels can be used in medical applications as inner hollow structures and vessels, such as blood vessels, esophagus, digestive tract, trachea, urethra, bile duct, ureter, lymphatic vessels or as a cuff to enclose the body's own structures such as hollow organs or nerve fibers, or as Interponate can be used, whereby the hollow bodies can be used directly or after adaptation to the organ specifics. Further uses are the use as medical exercise material, in particular for the realistic training of surgical techniques, in cardiovascular medicine and visceral surgery, for which purpose the hollow body can also be processed mechanically.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen
-
1 eine erste Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dynamischer Anordnung des Templates und eine statische Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht -
2 eine alternative Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dynamischer Anordnung des Templates und dynamischer Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht -
3 rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahme eines erfindungsgemäßen BNC-Hohlzylinder-Querschnitts mit 3-Phasenaufbau -
4 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase a -
5 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase b -
6 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase c
-
1 a first device for performing the method according to the invention with a dynamic arrangement of the template and a static arrangement of the mixture, in a sectional view -
2 an alternative device for carrying out the method according to the invention with dynamic arrangement of the template and dynamic arrangement of the mixture, in a sectional view -
3 Scanning electron microscope (SEM) image of a BNC hollow cylinder cross-section according to the invention with a 3-phase structure -
4th SEM image of the BNC network of phase a -
5 SEM image of the BNC network of phase b -
6th SEM image of the BNC network of phase c
Beispiel 1: Vorrichtungen zur Durchführung des VerfahrensExample 1: Devices for carrying out the process
Die Vorrichtung
Eine weitere verschließbare Öffnung
Mehrere Templates
Die Templates
Die Kupplung
Durch eine schematisch dargestellte Bewegungseinrichtung
In der
Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen
Der Antrieb der Bewegungseinrichtung
Im dargestellten Zustand der Vorrichtung ist das erste Reservoir
Die Benetzungseinrichtung (
Die Vorrichtung der
Beispiel 2: Verfahren - Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose:Example 2: Process - production of a hollow body from microbial cellulose:
Allgemeines Vorgehen:General procedure:
Zur Herstellung der Produkte werden Templates
Es ist auch möglich, das Reservoir
Daraufhin wird der Motor
Sodann kann der Reaktor geöffnet, die Templates
Mit einer abgewandelten Vorrichtung ist es auch möglich die Sterilisation und Aufarbeitung der synthetisierten Hohlkörper im Reaktor derart vorzunehmen, dass beim Öffnen des Reaktors das fertige Produkt entnommen werden kann. Durch eine nicht gezeigte Einrichtung könnte durch eine weitere Öffnung das Kulturmedium
Methoden:Methods:
Nahtausreißfestigkeit:Seam tear strength:
Durch die Wandung eines rohrförmigen Cellulosehohlkörpers wie im Bespiel beschrieben werden mit chirurgischem Nahtmaterial (z.B. PROLENE 5/0 (1 metric)) Schlingen derart angebracht, dass von der Außenseite in Richtung Lumen durch die Wandung des Hohlkörpers gestochen, das Nahtmaterial hindurchgezogen und danach verknotet wird.
Dieses Vorgehen entspricht der Herstellung einer sog. Einzelknopfnaht. Dieser Vorgang wird einige Mal (z.B. sechs Mal) wiederholt, so dass auf dem Umfang des Hohlkörpers sechs Schlingen angebracht sind.
In einer Zugprüfmaschine wird das den Schlingen entgegengesetzte Ende des Hohlkörpers fixiert und eine der Schlingen mit einem Haken erfasst, welcher mit dem Kraftaufnehmer der Prüfmaschine verbunden ist. Die Prüfmaschine wird in Funktion gesetzt, so dass sich Kraftaufnehmer und Fixierungspunkt voneinander entfernen. Hierbei ergibt sich ein Zug an der eingehängten Schlinge, welche beim Überschreiten einer bestimmten Zugkraft aus dem Hohlkörper herausgerissen wird. Diese Kraft wird an der Prüfmaschine abgelesen und der Versuch zur statistischen Absicherung des Meßwertes mit allen weiteren Schlingen in der beschriebenen Weise wiederholt. Der Mittelwert der ermittelten Kräfte ist die Nahtausreißfestigkeit des Hohlkörpers.Surgical suture material (e.g. PROLENE 5/0 (1 metric)) is used to attach loops through the wall of a tubular cellulose hollow body, as described in the example, in such a way that it pierces from the outside in the direction of the lumen through the wall of the hollow body, the suture material is pulled through and then knotted .
This procedure corresponds to the production of a so-called single button seam. This process is repeated a few times (eg six times) so that six loops are attached to the circumference of the hollow body.
The end of the hollow body opposite the loops is fixed in a tensile testing machine and one of the loops is grasped with a hook that is connected to the load cell of the testing machine. The testing machine is activated so that the force transducer and the fixing point move away from each other. This results in a pull on the suspended loop, which is torn out of the hollow body when a certain tensile force is exceeded. This force is read off on the testing machine and the test for statistical validation of the measured value is repeated with all other loops in the manner described. The mean value of the forces determined is the seam pull-out strength of the hollow body.
BerstdruckBurst pressure
Ein rohrförmiger Cellulosehohkkörper wie im Bespiel beschrieben wird waagerecht auf zwei Schlaucholiven mit Kabelbindern derart fixiert, dass eine abrutschsichere und weitgehend flüssigkeitsdichte Verbindung gegeben ist. Der Abstand der Oliven beträgt 100 mm. Eine der Schlaucholiven ist mit mit einem Ventil verbunden, die andere mit einem Reservoir, welches Wasser enthält und durch Druckluft mit Druck beaufschlagt werden kann. Der Druck in diesem Reservoir wird auf 200 mbar (ü) erhöht, bis der Celluloshohlkörper vollständig mit Wasser gefüllt ist. Danach wird das Ventil geschlossen und der Druck im Reservoir in einer Geschwindigkeit von 0,1-0,2 bar/s erhöht, bis der Cellulosehohlkörper versagt, was an einem starken Austritt von Wasser an einer eng begrenzten Stelle erkennbar ist. Der zum Zeitpunkt des Versagens im System herrschende Druck wird an einem Manometer abgelesen.A tubular hollow cellulose body as described in the example is fixed horizontally on two hose nozzles with cable ties in such a way that a non-slip and largely liquid-tight connection is provided. The distance between the olives is 100 mm. One of the hose nozzles is connected to a valve, the other to a reservoir that contains water and can be pressurized by compressed air. The pressure in this reservoir is increased to 200 mbar (g) until the cellulose hollow body is completely filled with water. The valve is then closed and the pressure in the reservoir is increased at a rate of 0.1-0.2 bar / s until the cellulose hollow body fails, which can be seen from the strong leakage of water at a narrowly limited point. The pressure in the system at the time of failure is read on a manometer.
REMSEM
REM-Untersuchungen wurden durchgeführt, um den biomimetischen Aufbau der BNC-Hohlzylinder zu belegen, dafür wurde das Material für 24 Stunden einer Gefriertrocknung unterzogen und mit Gold besputtert.SEM examinations were carried out to prove the biomimetic structure of the BNC hollow cylinder. For this purpose, the material was subjected to freeze drying for 24 hours and sputtered with gold.
Beispiel 2.1Example 2.1
4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1,15 g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium) und bei 121°C für 20 min im Autoklaven dampfsterilisiert wurde, wurden mit 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter beimpft. Die sterilisierte Vorrichtung
Als Template
Nach Ablauf des Biosynthesezeitraums von 6 Tagen wurde der Bioreaktor
Die Synthese lieferte BNC-Hohlzylinder mit einem inneren Durchmesser von 5 mm, einer Wandstärke von 5 mm und einer Länge von 15 cm.The synthesis yielded BNC hollow cylinders with an inner diameter of 5 mm, a wall thickness of 5 mm and a length of 15 cm.
Die Struktur des erhaltenen BNC Hohlzylinders ist in den
Die Phase a weist die innere Oberfläche (hohlraumseitige Oberfläche) der Wand auf und wird auch als „Lumen-seitige Phase“ bezeichnet. Die Phase c weist die äußere Oberfläche der Wand auf und wird auch als „außenseitige Phase“ bezeichnet.Phase a has the inner surface (surface on the cavity side) of the wall and is also referred to as the “lumen-side phase”. Phase c has the outer surface of the wall and is also referred to as the "outside phase".
Bei der Lumen-seitigen Phase a ist sowohl die Querschnittsfläche als auch die dazu abgewinkelte Seitenfläche, die an die Phase b angrenzt, sichtbar. Der Schriftzug „Phase a“ ist auf die Querschnittsfläche gezeichnet. Die Seitenfläche der Phase a befindet sich rechts angrenzend dazu. Von den Phasen b und c sind nur Querschnittsflächen sichtbar, welche bei diesem Präparat gegenüber der Querschnittsfläche der Phase a nach hinten, in die Bildebene hinein, versetzt sind. Der Streifen rechts der Phase c ist ein Präparations-Artefakt und kein Teil der Wand oder einer Oberfläche davon. Der BNC-Hohlzylinder ist durch 2 Schichten/Grenzflächen hoher Oberflächenqualität begrenzt.In the case of phase a on the lumen side, both the cross-sectional area and the side area angled to it, which adjoins phase b, are visible. The lettering "Phase a" is drawn on the cross-sectional area. The side surface of phase a is adjacent to it on the right. Only cross-sectional areas of phases b and c are visible which, in this preparation, are offset towards the rear, into the image plane, compared to the cross-sectional area of phase a. The strip to the right of phase c is a preparation artifact and not part of the wall or any surface thereof. The BNC hollow cylinder is limited by 2 layers / interfaces of high surface quality.
Die lumenseitige Phase a weist die innere lumenseitige Oberfläche des Hohlkörpers auf, und die äußere Phase c weist die äußere Oberfläche des Hohlkörpers auf. Aufgrund des sehr gleichmäßigen Faseraufbaus und der ähnlichen Faserdichte der Phasen a und c weisen sehr wahrscheinlich die innere lumenseitige Oberfläche des Hohlzylinders und die äußere Oberfläche eine ähnliche Porosität und eine ähnliche Bedeckung mit Fasern auf, wobei bezüglich der Oberflächen die Porosität zweidimensional definiert ist wie in der Beschreibung angegeben.The lumen-side phase a has the inner lumen-side surface of the hollow body, and the outer phase c has the outer surface of the hollow body. Due to the very uniform fiber structure and the similar fiber density of phases a and c, the inner lumen-side surface of the hollow cylinder and the outer surface very likely have a similar porosity and a similar coverage with fibers, the porosity being defined two-dimensionally with regard to the surfaces as in FIG Description given.
Anwendungstests:Application tests:
Die beabsichtigte Verwendung ist die Verwendung als Gefäßprothese. Untersuchungen zur Berstfestigkeit der Gefäßprothese ergaben Berstdrücke im Bereich von 800mmHg und höher. Die Nahtausreißfestigkeit lag im Bereich von 8-10N.The intended use is as a vascular prosthesis. Investigations into the bursting strength of the vascular prosthesis showed bursting pressures in the range of 800mmHg and higher. The seam pull-out strength was in the range of 8-10N.
Die Blutverträglichkeit der Gefäßprothese aus Beispiel 2 wurde durch einen tierexperimentellen Test beurteilt, in dem Teile der Arteria carotis communis von Schafen mit dem hergestellten BNC-Implantat ersetzt wurden. Die BNC-Implantate überzeugten im chirurgischen Handling. Sie zeichneten sich durch vollständige Stabilität im Hochdrucktier aus (keine Risse oder Rupturen). Unmittelbar nach der Operation konnte ein ungehinderter Blutfluß beobachtet werden. Nach 3 Monaten wurde das künstliche Blutgefäß entnommen, das durch die Einbettung in Bindegewebe und die Ausbildung kleiner Blutgefäße innerhalb des Bindegewebes sehr gut in den tierischen Körper integriert war. Histologisch konnte eine „Biologisierung“ des Implantatmaterials nachgewiesen werden.The blood compatibility of the vascular prosthesis from Example 2 was assessed by means of an experimental animal test in which parts of the common carotid artery of sheep were replaced with the BNC implant produced. The BNC implants were convincing in terms of surgical handling. They were characterized by complete stability in the high pressure animal (no cracks or ruptures). Immediately after the operation, unhindered blood flow could be observed. After 3 months, the artificial blood vessel was removed, which was very well integrated into the animal body because it was embedded in connective tissue and the formation of small blood vessels within the connective tissue. A “biologization” of the implant material could be proven histologically.
Lichtmikroskopische Untersuchungen nach tierexperimenteller Testung zeigen einen 3-Schichten-Wandaufbau des entnommenen BNC-Implantat-Komplexes, wobei die BNC als Media erhalten blieb, sich eine innere Endothelschicht und eine äußere Bindegewebsschicht ausbildeten.Light microscopic examinations after animal experiments show a 3-layer wall structure of the removed BNC-implant complex, whereby the BNC was retained as media, an inner endothelial layer and an outer connective tissue layer formed.
Beispiel 2.2Example 2.2
4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1,15g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium) und bei 121°C für 20min im Autoklaven dampfsterilisiert wurde, wurden mit 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter beimpft. Die sterilisierte Vorrichtung
Als Templates (
Während des Kultivierungsprozesses wurden die in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates
Nach Ablauf des Biosynthesezeitraums von 10 Tagen wurde der Bioreaktor
Die Synthese lieferte Gefäßprothesen mit einem inneren Durchmesser von 5 mm, einer Wandstärke von 3 mm und einer Länge von 15 cm. Untersuchungen zur Berstfestigkeit der Gefäßprothese ergaben Berstdrücke größer 800mmHg.The synthesis yielded vascular prostheses with an inner diameter of 5 mm, a wall thickness of 3 mm and a length of 15 cm. Investigations into the bursting strength of the vascular prosthesis showed bursting pressures greater than 800mmHg.
BezugszeichenlisteList of reference symbols
- 11
- Vorrichtungcontraption
- 22
- Reservoir für Kulturlösung/GemischReservoir for culture solution / mixture
- 33
- TemplateTemplate
- 44th
- EinspannvorrichtungenJigs
- 55
- BewegungseinrichtungMovement device
- 66th
- Kupplungcoupling
- 77th
- Motorengine
- 88th
- Abdeckungcover
- 99
- Gefäßvessel
- 1010
- Gemisch, enthaltend Kulturlösung und MikroorganismusMixture containing culture solution and microorganism
- 1111
- DrehachsenAxes of rotation
- 1212
- UmhüllungWrapping
- 1313
- VerschlusseinrichtungLocking device
- 1414th
- Innenraum (mit sauerstoffhaltiger Atmosphäre)Interior (with an oxygen-containing atmosphere)
- 1515th
- Gehäusecasing
- 1616
- Dichtungpoetry
- 1717th
- Öffnungopening
- 1818th
- UmgebungSurroundings
- 1919th
- Öffnungopening
- 2020th
- VerschlussClasp
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R020 | Patent grant now final |