DE102012107166B4 - Transport of photosensitizing substances with the help of living immune cells for tumor treatment - Google Patents

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Abstract

Verwendung mindestens einer modifizierten mammalen Immunzelle zum gezielten Transport einer photosensibilisierenden Substanz zur Behandlung von Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, dass diese mit einer photosensibilisierenden Substanz beladen ist, bei welcher es sich um eine chemische Komponente oder einen Vorläufer einer chemischen Komponente handelt, wobei die photosensibilisierende Substanz in die Immunzelle aufgenommen wird und an eine Tumorzelle übertragen wird, und wobei die photosensibilisierende Substanz ein Photosensibilisator ist; oder die photosensibilisierende Substanz ein wasserlöslicher Photosensibilisator-Komplex, ein chemisch modifizierter Photosensibilisator, eine liposomale Photosensibilisator-Formulierung, eine nano- oder mikropartikuläre Photosensibilisator-Formulierung, eine dendrimerische Photosensibilisator-Formulierung, ein Photosensibilisator-Antikörper-Konjugat und/oder ein photosensibilisierender Nanopartikel ist.Use of at least one modified mammalian immune cell for the targeted transport of a photosensitizing substance for the treatment of tumor cells, characterized in that it is loaded with a photosensitizing substance which is a chemical component or a precursor of a chemical component, wherein the photosensitizing substance in the immune cell is taken up and transmitted to a tumor cell, and wherein the photosensitizing substance is a photosensitizer; or the photosensitizing substance is a water-soluble photosensitizer complex, a chemically modified photosensitizer, a liposomal photosensitizer formulation, a nano- or microparticulate photosensitizer formulation, a dendrimeric photosensitizer formulation, a photosensitizer-antibody conjugate, and / or a photosensitizing nanoparticle.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte mammale Immunzelle zur Tumorbehandlung. Zur Behandlung von Krebserkrankungen sind unterschiedliche Methoden bekannt. So ist u. a. neben der chirurgischen operativen Entfernung des entarteten Gewebes sowie einer Vor- und Nachbehandlung mit Chemo- und Strahlentherapie die Immuntherapie ein weiterer Ansatz in der Krebstherapie. Dabei werden Komponenten des Immunsystems, wie Antikörper, Zytokine oder Immunzellen, eingesetzt, um Tumorzellen zu bekämpfen.The present invention relates to a modified mammalian immune cell for tumor treatment. For the treatment of cancer different methods are known. So is u. a. In addition to the surgical removal of the degenerated tissue as well as a pre- and post-treatment with chemo- and radiotherapy, immunotherapy is another approach in cancer therapy. It uses components of the immune system, such as antibodies, cytokines or immune cells, to fight tumor cells.

Immunzellen haben eine natürliche Fähigkeit, Infektions- und Entzündungsherde oder auch Tumorzellen zu erkennen und sich gerichtet auf diese zuzubewegen. Diese Fähigkeit wird auch als „Homing”-Funktion bezeichnet. Tumorzellen weisen im Vergleich zu gesunden Zellen ein verändertes Proteom auf. Bestimmte veränderte Proteine und Peptide auf der Tumorzelloberfläche fungieren dabei als Tumorantigene, welche von bestimmten Immunzellen, z. B. T- und B-Lymphozyten, spezifisch erkannt werden können. Makrophagen, Neutrophile und NK-Zellen erkennen Krankheitserreger und Krebszellen hingegen tumorantigenunabhängig.Immune cells have a natural ability to recognize and target infection and inflammatory sites or even tumor cells. This ability is also referred to as a "homing" feature. Tumor cells have an altered proteome compared to healthy cells. Certain altered proteins and peptides on the tumor cell surface act as tumor antigens which are produced by certain immune cells, e.g. B. T and B lymphocytes, can be detected specifically. Macrophages, neutrophils and NK cells, however, detect pathogens and cancer cells independent of tumor antigen.

Ansatz der zellulären Immuntherapie ist es, Immunzellen einzusetzen, um körpereigene Tumorzellen abzutöten. Die eingesetzten Immunzellen sind dabei in der Lage, Tumorzellen von gesunden Zellen zu unterscheiden.The approach of cellular immunotherapy is to use immune cells to kill the body's own tumor cells. The immune cells used are able to distinguish tumor cells from healthy cells.

Bei den zellulären Immuntherapien spielen vor allem die Spenderlymphozyten-Infusion (Donor Lymphocyte Infusion, DLI), der „adoptive T-Zell-Transfer” (Adoptive Cell Transfer, ACT) und die therapeutische Vakzinierung mit dendritischen Zellen (DC-Vakzinierung) eine Rolle. Die DLI wird beispielsweise eingesetzt bei Patienten nach einer Transplantation allogener hämatopoetischer Stammzellen, um die Transplantat-gegen-Tumor-Reaktion zu verstärken. Unter ACT versteht man die Behandlung von Krebspatienten mit ihren eigenen (autologen), ex vivo aktivierten und expandierten T-Lymphozyten, wohingegen bei der DC-Vakzinierung ex vivo manipulierte dendritische Zellen verwendet werden, um im Patienten eine tumorspezifische Immunantwort hervorzurufen. Während die DLI bereits erfolgreich in der Klinik eingesetzt wird, werden verschiedene ACT- und DC-Vakzinierungsansätze derzeit klinisch erprobt.In cellular immunotherapies, donor lymphocyte infusion (DLI), adoptive cell transfer (ACT) and dendritic cell vaccination (DC vaccination) play a major role. The DLI is used, for example, in patients after transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells to enhance the graft-versus-tumor response. ACT is the treatment of cancer patients with their own (autologous), ex vivo activated and expanded T lymphocytes, whereas in DC vaccination ex vivo manipulated dendritic cells are used to induce a tumor specific immune response in the patient. While the DLI is already successfully used in the clinic, various ACT and DC vaccination approaches are currently being clinically tested.

Eine Methode, um bestimmte Substanzen, wie therapeutische oder diagnostische Substanzen, in vivo zu bestimmten Wirkorten zu transportieren, wird in der WO 20120/059253 A2 beschrieben. Dabei werden Nanopartikel, die mit der zu transportierenden Substanz versehen sind, an die Oberfläche von Carrier-Zellen gebunden. Die Zelle gelangt, abhängig vom Zelltyp und der damit verbunden „Homing”-Funktion, in vivo zu ihrem Ziel und damit zum Wirkort für die entsprechende Substanz.A method for transporting certain substances, such as therapeutic or diagnostic substances, in vivo to specific sites of action is described in US Pat WO 20120/059253 A2 described. Nanoparticles, which are provided with the substance to be transported, are bound to the surface of carrier cells. Depending on the cell type and the associated "homing" function, the cell arrives in vivo at its target and thus at the site of action for the corresponding substance.

Ein weiterer Ansatz in der Krebstherapie liegt in der photodynamischen Therapie (PDT). Bei der PDT werden Krebspatienten mit einer photosensibilisierenden Substanz behandelt, die sich bevorzugt in malignem Gewebe anreichert. Bestrahlung des Tumors mit Licht einer bestimmten Wellenlänge führt zur Aktivierung des lichtinduzierbaren Wirkstoffs, welcher daraufhin reaktive Sauerstoffspezies generiert. Durch deren Reaktion mit benachbarten Biomolekülen kommt es in der Folge zur Zerstörung des malignen Gewebes. Die photosensibilisierende Substanz kann systemisch oder lokal verabreicht werden. Selbst bei einer lokalen Applikation wird die lichtinduzierbare Substanz allerdings nicht nur von Tumorgewebe, sondern auch von anderen Organen, wie den Augen und der Haut, aufgenommen. Dadurch kommt es bei Lichtexposition der Patienten auch zu einer ungewollten Zerstörung gesunden Gewebes. Auf diese Weise behandelte Patienten können Nebenwirkungen dieser Art nur vermeiden, indem sie Tageslicht über einen längeren Zeitpunkt strikt meiden. Um diese Einschränkungen der Patienten zu verringern oder gar zu vermeiden, müssen die lichtinduzierbaren Substanzen zielgerichteter verabreicht werden können.Another approach to cancer therapy is photodynamic therapy (PDT). In PDT, cancer patients are treated with a photosensitizing substance that preferentially accumulates in malignant tissue. Irradiation of the tumor with light of a certain wavelength leads to the activation of the light-inducible active substance, which then generates reactive oxygen species. Their reaction with neighboring biomolecules results in the destruction of the malignant tissue. The photosensitizing substance may be administered systemically or locally. Even with a local application, however, the light-inducible substance is absorbed not only by tumor tissue but also by other organs such as the eyes and the skin. As a result, exposure of the patient to light also leads to unwanted destruction of healthy tissue. Patients treated in this way can only avoid side effects of this kind by strictly avoiding daylight for a long time. In order to reduce or even avoid these limitations of the patients, it is necessary to be able to administer the light-inducible substances in a more targeted manner.

Die US 2002/0197262 A1 offenbart zum spezifischeren Transport eines Photosensibilisators eine Methode, bei dem ein Photosensibilisator an einen Antikörper gebunden ist, welcher Tumorspezifität aufweist. Auf diese Weise gelangt der Photosensibilisator zur Tumorregion.The US 2002/0197262 A1 for more specific transport of a photosensitizer, discloses a method in which a photosensitizer is bound to an antibody having tumor specificity. In this way, the photosensitizer reaches the tumor region.

In Kawczyk-Krupka et al. (The role of photosensitized macrophages in photodynamic therapy; Oncology reports 26, S. 275–280, 2011) wird der Einfluss von PDT auf murine Macrophagen untersucht. Krosl, G. (The role of immune cells in photodynamic therapy; Univ. of British Columbia, Vancouver; BC, Can., September 1996) beschreibt die Aufnahme von Photofrin durch Maus Macrophagen in vitro und in vivo.In Kawczyk-Krupka et al. The role of photosensitized macrophages in photodynamic therapy (Oncology reports 26, pp. 275-280, 2011) investigates the influence of PDT on murine macrophages. Krosl, G. (1987) describes the uptake of photofrin by mouse macrophages in vitro and in vivo.

Kennedy et al. (T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo; Nanoscale Research Letters 6:283, S. 1–11, 2011) beschreiben, wie T-Zellen mit Gold-Nanopartikeln (AuNP) beladen werden und durch die natürliche Homing Funktion der T-Zellen zum Tumorherd gelangen, was vorteilhafter ist als die herkömmliche Injektion von AuNP. Durch Laserbestrahlung (photothermale Therapie) soll das Tumorwachstum verringert werden.Kennedy et al. Nanoscale Research Letters 6: 283, pp. 1-11, 2011) describe how T cells are loaded with gold nanoparticles (AuNPs) and are characterized by the natural homing function of T cells (T cells enhanced gold nanoparticle delivery to tumors in vivo; Cells to the tumor focus, which is more advantageous than the conventional injection of AuNP. Laser irradiation (photothermal therapy) is intended to reduce tumor growth.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Möglichkeit zu finden, die Spezifität und Wirksamkeit der photodynamischen Therapie zu steigern und dabei typische Nebenwirkungen zu reduzieren.The object of the present invention was to find a way to increase the specificity and effectiveness of photodynamic therapy increase and thereby reduce typical side effects.

Gelöst wird die Aufgabe durch die erfindungsgemäße modifizierte mammale Immunzelle nach Anspruch 1. Es ist vorgesehen, dass die modifizierte mammale Immunzelle mit einer photosensibilisierenden Substanz beladen ist, wobei die photosensibilisierende Substanz in die Immunzelle aufgenommen wird.The object is achieved by the modified mammalian immune cell according to the invention according to claim 1. It is provided that the modified mammalian immune cell is loaded with a photosensitizing substance, wherein the photosensitizing substance is taken up in the immune cell.

Beladung der Immunzelle bezeichnet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass die photosensibilisierende Substanz in die Zelle aufgenommen wird. Werden mit einer photosensibilisierenden Substanz versehene Partikel, wie nano- oder mikropartikuläre Partikel, verwendet, so werden diese ebenfalls von der Membran der Zelle umhüllt und auf diese Weise in die Zelle integriert. Die Aufnahme der photosensibilisierenden Substanz in die Zelle erfolgt über Endozytose und wird auch als Internalisierung bezeichnet.In the context of the present invention, loading of the immune cell means that the photosensitizing substance is taken up in the cell. If particles provided with a photosensitizing substance, such as nano- or microparticulate particles, are used, they too are enveloped by the membrane of the cell and in this way integrated into the cell. The uptake of the photosensitizing substance into the cell is via endocytosis and is also referred to as internalization.

Durch die Beladung einer Immunzelle mit einer photosensibilisierenden Substanz und damit Kombination von PDT und zellulärer Immuntherapie werden sowohl Selektivität als auch Effizienz der PDT erhöht. Die photosensibilisierende Substanz wird durch die Immunzelle direkt zur Tumorzelle gebracht und auf diese übertragen. Durch die unmittelbare Interaktion der Immunzelle mit der Zieltumorzelle können geringere Mengen der photosensibilisierenden Substanz selektiver eingesetzt werden, als wenn das Medikament dem Patienten intravenös/systemisch oder lokal verabreicht wird. Zielgerichteter Medikamenttransport und geringere Wirkstoffmengen tragen dazu bei, dass bei diesem Ansatz geringere Nebenwirkungen als bei der herkömmlichen PDT auftreten.By loading an immune cell with a photosensitizing substance and thus combination of PDT and cellular immunotherapy, both the selectivity and efficiency of PDT are increased. The photosensitizing substance is brought by the immune cell directly to the tumor cell and transferred to this. The immediate interaction of the immune cell with the target tumor cell allows smaller amounts of the photosensitizing substance to be used more selectively than if the drug is administered to the patient intravenously / systemically or locally. Targeted drug delivery and lower drug levels contribute to fewer side effects than traditional PDT in this approach.

Durch Verwendung der Immunzellen wird zudem die Effizienz der PDT erhöht. Die Zellen des menschlichen Abwehrsystems zeichnen sich dadurch aus, dass sie Krankheitsherde aufspüren und in maligne Gewebe aktiv eindringen können. Diese natürliche Homing-Funktion von Immunzellen soll ausgenutzt werden, um photosensibilisierende Substanzen gezielt zum Wirkort zu befördern. Darüber hinaus besitzen zahlreiche Immunzellen die Fähigkeit, krankhafte Zellen entweder durch zytotoxische Mechanismen oder durch Phagozytose abzutöten. Neben der Homing-Funktion der eingesetzten Immunzellen zum gezielten Transport der photosensibilisierenden Substanz soll auch die intrinsische zytotoxische Funktion bzw. Phagozytoseaktivität („Killing”-Funktion) und damit krebsabtötende Wirkung von Immunzellen genutzt werden, um Tumorzellen möglichst effizient zu bekämpfen. Immunzellen, die keine klassische intrinsische zytotoxische Aktivität haben, wie beispielsweise T-Helferzellen, wird durch die photosensibilisierende Substanz eine Art zytotoxische Funktion verliehen. Durch die Beladung der Immunzelle mit einer photosensibilisierenden Substanz wird dieser demnach eine zytotoxische Funktion verliehen oder die intrinsische „Killing”-Funktion der Immunzelle verstärkt.The use of immune cells also increases the efficiency of PDT. The cells of the human defense system are characterized by the fact that they can detect disease foci and actively penetrate into malignant tissue. This natural homing function of immune cells should be exploited to promote photosensitizing substances targeted to the site of action. In addition, many immune cells have the ability to kill diseased cells either by cytotoxic mechanisms or by phagocytosis. In addition to the homing function of the immune cells used for targeted transport of the photosensitizing substance and the intrinsic cytotoxic function or phagocytic activity ("killing" function) and thus cancer killing effect of immune cells should be used to combat tumor cells as efficiently as possible. Immune cells that do not have classical intrinsic cytotoxic activity, such as T helper cells, are given a type of cytotoxic function by the photosensitizing substance. By loading the immune cell with a photosensitizing substance, it is thus given a cytotoxic function or enhances the intrinsic "killing" function of the immune cell.

Unter Tumor oder Tumorzellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Krebszellen oder eine Vielzahl von Krebszellen in einem Verbund, wie maligne Gewebe, zu verstehen. Der Begriff Krebszelle umfasst Zellen, die onkogener Proliferation unterliegen.For the purposes of the present invention, tumor or tumor cells are cancer cells or a multiplicity of cancer cells in a composite, such as malignant tissue. The term cancer cell includes cells that undergo oncogenic proliferation.

Unter photosensibilisierender Substanz ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine chemische Komponente oder ein Vorläufer einer chemischen Komponente zu verstehen, die einen biologischen Effekt aufgrund von Photoaktivierung hervorruft.For the purposes of the present invention, photosensitizing substance is to be understood as meaning a chemical component or a precursor of a chemical component which causes a biological effect on the basis of photoactivation.

Dabei ist es bevorzugt, dass die photosensibilisierende Substanz ein Photosensibilisator ist, bevorzugt ein Hämatoporphyrin, Chlorin, Bacteriochlorin, Phthalocyanin, Benzoporphyrin-Derivat, 5-Aminolaevulinsäure (ALA) oder -ester, Hypericin, Purpurin, Porphycen, Indocyaningrün (ICG), sowie deren Derivate.In this case, it is preferable that the photosensitizing substance is a photosensitizer, preferably a hematoporphyrin, chlorin, bacteriochlorin, phthalocyanine, benzoporphyrin derivative, 5-aminolevulinic acid (ALA) or ester, hypericin, purpurin, porphycene, indocyanine green (ICG), and the like derivatives.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die photosensibilisierende Substanz ein wasserlöslicher Photosensibilisator-Komplex, beispielsweise PSS/mTHPP oder PSS/mTHPC, oder ein chemisch modifizierter Photosensibilisator.In a preferred embodiment, the photosensitizing substance is a water-soluble photosensitizer complex, for example PSS / mTHPP or PSS / mTHPC, or a chemically modified photosensitizer.

Weiterhin ist es bevorzugt, dass die photosensibilisierende Substanz eine dendrimerische Photosensibilisator-Formulierung, ein Photosensibilisator-Antikörper-Konjugat, ein photosensibilisierender Nanopartikel, eine liposomale Photosensibilisator-Formulierung oder eine nano- oder mikropartikuläre Photosensibilisator-Formulierung ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der nano- oder mikropartikulären Photosensibilisator-Formulierung um Photosensibilisator-Gold-Partikel, Photosensibilisator-PLGA-Partikel oder um mit einem Photosensibilisator beschichtete Partikel.Further, it is preferred that the photosensitizing substance is a dendrimeric photosensitizer formulation, a photosensitizer-antibody conjugate, a photosensitizing nanoparticle, a liposomal photosensitizer formulation, or a nano- or microparticulate photosensitizer formulation. Preferably, the nano- or microparticulate photosensitizer formulation is photosensitizer-gold particles, photosensitizer-PLGA particles, or particles coated with a photosensitizer.

Unter Mikropartikeln im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Teilchen mit Durchmessern von 400 Nanometern bis zu 10 Mikrometern zu verstehen, unter Nanopartikeln Teilchen mit Durchmessern von 1 bis 400 Nanometern.For the purposes of the present invention, microparticles are particles having diameters of from 400 nanometers to 10 micrometers, and nanoparticles are particles having diameters from 1 to 400 nanometers.

Es ist weiterhin bevorzugt, dass die Immunzelle ex vivo durch Inkubation mit der photosensibilisierenden Substanz beladen wird, wobei die Aufnahme in die Zelle durch Endozytose erfolgt.It is further preferred that the immune cell is loaded ex vivo by incubation with the photosensitizing substance, the uptake into the cell being by endocytosis.

Zur Gewinnung von mammalen Immunzellen müssen diese zunächst aus einer Gewebeprobe oder Blut isoliert werden. Anschließend wird die isolierte Immunzelle vorzugsweise ex vivo aktiviert und/oder ex vivo vermehrt und/oder ex vivo generiert. Unter ex vivo generiert ist dabei zu verstehen, dass diese Zelle zu einem abgeleiteten Immunzelltyp differenziert wird. Monozyten können z. B. ex vivo zu Makrophagen differenziert werden.To obtain mammalian immune cells, they must first be isolated from a tissue sample or blood. Subsequently, the isolated Immune cell preferably activated ex vivo and / or ex vivo increased and / or generated ex vivo. Generated by ex vivo is understood to mean that this cell is differentiated into a derived immune cell type. Monocytes can z. B. ex vivo to macrophages are differentiated.

Es ist weiterhin bevorzugt, dass die Immunzelle eine autologe Zelle oder eine allogene Zelle ist.It is further preferred that the immune cell is an autologous cell or an allogeneic cell.

Weiterhin ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass die Immunzelle ein T-Lymphozyt, insbesondere eine ex vivo aktivierte und expandierte polyklonale T-Zelle, eine ex vivo vermehrte tumorinfiltrierende T-Zelle, eine ex vivo expandierte monoklonale antigenspezifische T-Zelle, eine T-Zelle mit gentechnisch verändertem T-Zell-Rezeptor (TCR), oder eine gentechnisch veränderte CAR(chimeric antigen-receptor)-exprimierende T-Zelle ist. Alternativ ist die Immunzelle ein Monozyt, insbesondere ein autologer Monozyt, ein Makrophage, insbesondere ein autologer Makrophage, ein tumorassoziierter Makrophage (TAM) oder ein in vitro generierter Makrophage, ein neutrophiler Granulozyt, eine natürliche Killerzelle (NK-Zelle) und/oder eine Zelle einer NK-Zelllinie, insbesondere eine NK-92-Zelle und/oder eine CAR-exprimierende NK-92-Zelle ist.A further object of the present invention is that the immune cell comprises a T lymphocyte, in particular an ex vivo activated and expanded polyclonal T cell, an ex vivo propagated tumor infiltrating T cell, an ex vivo expanded monoclonal antigen-specific T cell, a T cell Cell with genetically engineered T cell receptor (TCR), or a genetically engineered CAR (chimeric antigen receptor) -expressing T cell. Alternatively, the immune cell is a monocyte, in particular an autologous monocyte, a macrophage, in particular an autologous macrophage, a tumor-associated macrophage (TAM) or an in vitro-generated macrophage, a neutrophilic granulocyte, a natural killer cell (NK cell) and / or a cell an NK cell line, in particular an NK-92 cell and / or a CAR-expressing NK-92 cell.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Immunzelle zusammen mit einer Retargeting-Substanz co-appliziert, wobei es sich bei der Retargeting-Substanz bevorzugt um einen bispezifischen Antikörper, Diabody, BiTE-Antikörper, trispezifischen Antikörper und/oder tetraspezifischen Antikörper, sowie Fragmente derer, handelt. Neben ex vivo aktivierten T-Lymphozyten können auch Monozyten, Makrophagen, NK-Zellen und neutrophile Granulozyten zusammen mit einer der oben genannten Retargeting-Substanzen co-appliziert werden. Bevorzugt wird die jeweilige Immunzelle unmittelbar vor der Applikation mit der entsprechenden Retargeting-Substanz vorinkubiert. Verabreicht wird dann eine mit der Retargeting-Substanz funktionalisierte Immunzelle.In a preferred embodiment, a modified immune cell is co-administered together with a retargeting substance, wherein the retargeting substance is preferably a bispecific antibody, diabody, BiTE antibody, trispecific antibody and / or tetraspecific antibody, and fragments thereof, is. In addition to ex vivo activated T lymphocytes, monocytes, macrophages, NK cells and neutrophilic granulocytes can also be co-administered together with one of the abovementioned retargeting substances. Preferably, the respective immune cell is pre-incubated with the corresponding retargeting substance immediately before administration. A immune cell functionalized with the retargeting substance is then administered.

T-Zellen besitzen Rezeptoren (T-Zell-Rezeptoren, TCR), die ein bestimmtes, an einen MHC-Komplex gebundenes Peptidantigen erkennen können. Wenn eine aktivierte T-Zelle auf eine Zielzelle, z. B. eine Krebszelle, trifft, die das entsprechende Peptidantigen MHC-abhängig auf ihrer Oberfläche präsentiert, bindet die T-Zelle mit ihren T-Zell-Rezeptoren an die Antigen-MHC-Komplexe der Zielzelle. Diese spezifische Erkennung der Zielzelle löst die Effektorfunktion der T-Zelle aus.T cells have receptors (T cell receptors, TCRs) that can recognize a particular peptide antigen bound to an MHC complex. When an activated T-cell targets a target cell, e.g. A cancer cell, which presents the corresponding peptide antigen MHC-dependent on its surface, binds the T cell with its T cell receptors to the antigen MHC complexes of the target cell. This specific recognition of the target cell triggers the effector function of the T cell.

So schütten beispielsweise CD8-positive zytotoxische T-Zellen Perforin und Granzyme aus, welche die Zielzelle in den programmierten Zelltod treiben (zytolytische Aktivität), während CD4-positive T-Zellen Zytokine sezernieren, wodurch andere Immunzellen angelockt werden (Helferfunktion). Ex vivo aktivierte polyklonale T-Zellen sind nicht spezifisch für ein bestimmtes Tumorantigen. Folglich können sie den Tumorherd zwar aufspüren, es ist ihnen allerdings nicht möglich, an Zielzellen zu binden und ihre natürlichen Effektorfunktionen auszuüben.For example, CD8-positive cytotoxic T cells release perforin and granzyme, which drive the target cell into programmed cell death (cytolytic activity), while CD4-positive T cells secrete cytokines, thereby attracting other immune cells (helper function). Ex vivo activated polyclonal T cells are not specific for a particular tumor antigen. Consequently, they can detect the tumor focus, but they are unable to bind to target cells and exercise their natural effector functions.

Ein bispezifischer Antikörper, der sowohl die TCR-Komponente CD3 erkennt als auch spezifisch für ein bestimmtes Tumorantigen (z. B. EpCAM) ist, vernetzt MHC-unabhängig unspezifisch aktivierte T-Zellen und Krebszellen und löst dabei die zytolytische Funktion von zytotoxischen T-Zellen aus. Auch andere T-Zell-Unterklassen, wie beispielsweise T-Helferzellen werden über den bispezifischen Antikörper MHC-unabhängig mit Zielzellen vernetzt, so dass sie ihre Effektorfunktionen ausüben können. Somit dient die Retargeting-Substanz sowohl der exakten Zielfindung als auch der Stimulierung der zytolytischen Aktivität und anderer Funktionen unspezifisch aktivierter, polyklonaler T-Zellen.A bispecific antibody that recognizes both the TCR component CD3 and specific for a particular tumor antigen (eg, EpCAM) cross-links MHC-independent nonspecifically activated T cells and cancer cells, thereby triggering the cytolytic function of cytotoxic T cells out. Other T cell subclasses, such as T helper cells, are MHC-independent crosslinked with target cells via the bispecific antibody so that they can exert their effector functions. Thus, the retargeting substance serves both the exact targeting and the stimulation of cytolytic activity and other functions of nonspecifically activated polyclonal T cells.

Die antigenspezifische Erkennung von Zielzellen gilt nur für B- und T-Zellen. Makrophagen und Neutrophile erkennen Krankheitserreger und Krebszellen antigenunabhängig. Werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Monozyten, Makrophagen, Neutrophile oder NK-Zellen eingesetzt, ist es vorteilhaft eine Retargeting-Substanz zu verwenden, die vor allem der Zielfindung der eingesetzten Immunzelle dient. So können bispezifische Antikörper eingesetzt werden, welche die auf Monozyten, Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und NK-Zellen exprimierten Fcγ-Rezeptoren CD64 bzw. CD16 erkennen und gleichzeitig eine Spezifität für ein Tumorantigen aufweisen.The antigen-specific recognition of target cells applies only to B and T cells. Macrophages and neutrophils recognize pathogens and cancer cells independent of antigen. If monocytes, macrophages, neutrophils or NK cells are used for the purposes of the present invention, it is advantageous to use a retargeting substance which primarily serves to target the immune cell used. Thus, bispecific antibodies can be used which recognize the Fcγ receptors CD64 or CD16 expressed on monocytes, macrophages, neutrophilic granulocytes and NK cells and at the same time have specificity for a tumor antigen.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Verwendung mindestens einer modifizierten Immunzelle zum gezielten Transport einer photosensibilisierenden Substanz zur Behandlung von Tumorzellen.Further advantages result from the use of at least one modified immune cell for the targeted transport of a photosensitizing substance for the treatment of tumor cells.

Vorzugsweise wird die mindestens eine modifizierte Immunzelle zur Krebstherapie an Tumoren an der Körperoberfläche und/oder an Tumoren, die minimalinvasiv erreicht werden können, wie Hauttumore, beispielsweise einem Basalzellkarzinom, malignen Melanom, Kopf-Hals-Karzinome, Bronchial- und Lungenkrebs, Blasenkrebs, Prostatakarzinome, Kolonkarzinome, Leberkarzinome, Nierenzellkarzinom, Tumore des weiblichen Genitalbereichs, Hirntumore oder maligne Aszites, eingesetzt.Preferably, the at least one modified immune cell is for cancer therapy on tumors on the body surface and / or tumors that can be achieved minimally invasive, such as skin tumors, such as a basal cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck carcinomas, bronchial and lung cancers, bladder cancer, prostate carcinomas Colon carcinomas, liver carcinomas, renal cell carcinoma, tumors of the female genital area, brain tumors or malignant ascites.

Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten mammalen Immunzelle Gegenstand der vorliegenden Erfindung.Furthermore, a method for producing a modified mammalian immune cell is the subject of the present invention.

Zur Gewinnung von mammale Immunzellen werden diese zunächst aus einer mammalen Gewebeprobe oder Blut isoliert. Anschließend wird die isolierte Immunzelle vorzugsweise ex vivo aktiviert und/oder ex vivo vermehrt und/oder ex vivo generiert. Unter ex vivo generiert ist zu verstehen, dass die isolierte Immunzelle zu einem abgeleiteten Immunzelltyp differenziert wird. Daraufhin erfolgt die Beladung der Immunzelle mit einer photosensibilisierenden Substanz, wobei die Beladung über Inkubation mit der photosensibilisierenden Substanz erfolgt. Vorzugsweise wird die Immunzelle anschließend noch mit einer Retargeting-Substanz, bevorzugt einem bispezifischen Antikörper, inkubiert.To obtain mammalian immune cells, these are first made from a mammalian Tissue sample or blood isolated. Subsequently, the isolated immune cell is preferably activated ex vivo and / or augmented ex vivo and / or generated ex vivo. Generated ex vivo is to understand that the isolated immune cell is differentiated into a derived immune cell type. Thereafter, the loading of the immune cell is carried out with a photosensitizing substance, wherein the loading is carried out by incubation with the photosensitizing substance. Preferably, the immune cell is subsequently incubated with a retargeting substance, preferably a bispecific antibody.

Weiterhin ist es bevorzugt, dass die photosensibilisierende Substanz ein Photosensibilisator ist, bevorzugt ein Hämatoporphyrin, Chlorin, Bacteriochlorin, Phthalocyanin, Benzoporphyrin-Derivat, 5-Aminolaevulinsäure (ALA) oder -ester, Hypericin, Purpurin, Porphycen, Indocyaningrün (ICG), sowie deren Derivate, oder ein wasserlöslicher Photosensibilisator-Komplex, ein chemisch modifizierter Photosensibilisator, eine liposomale Photosensibilisator-Formulierung, eine nano- oder mikropartikuläre Photosensibilisator-Formulierung, eine dendrimerische Photosensibilisator-Formulierung, ein Photosensibilisator-Antikörper-Konjugat und/oder ein photosensibilisierender Nanopartikel ist.Further, it is preferable that the photosensitizing substance is a photosensitizer, preferably a hematoporphyrin, chlorin, bacteriochlorin, phthalocyanine, benzoporphyrin derivative, 5-aminolevulinic acid (ALA) or ester, hypericin, purpurin, porphycene, indocyanine green (ICG), as well as theirs Derivatives, or a water-soluble photosensitizer complex, a chemically modified photosensitizer, a liposomal photosensitizer formulation, a nano- or microparticulate photosensitizer formulation, a dendrimeric photosensitizer formulation, a photosensitizer-antibody conjugate, and / or a photosensitizing nanoparticle.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine modifizierte Immunzelle zusammen mit einer Retargeting-Substanz co-appliziert, wobei es sich bei der Retargeting-Substanz bevorzugt um einen bispezifischen Antikörper, Diabody, BiTE-Antikörper, trispezifischen Antikörper und/oder tetraspezifischen Antikörper, sowie Fragmente derer, handelt. Da die photosensibilisierende Substanz mit Hilfe der Immunzellen gezielt zum Zielort, dem Tumorherd, transportiert wird, können geringere Substanzmengen als bei der herkömmlichen Photodynamischen Therapie eingesetzt werden. Dadurch sollen Nebenwirkungen der PDT deutlich reduziert werden. Durch die zusätzlich zum Tragen kommenden zellulären „Killing”-Mechanismen der Immunzellen kommt es zu einer signifikanten Effizienzsteigerung.In a preferred embodiment of the method according to the invention, a modified immune cell is co-administered together with a retargeting substance, wherein the retargeting substance is preferably a bispecific antibody, diabody, BiTE antibody, trispecific antibody and / or tetraspecific antibody, and Fragments of these, acts. Since the photosensitizing substance is transported to the target site, the tumor focus, with the aid of the immune cells, it is possible to use smaller amounts of substance than in conventional photodynamic therapy. This should significantly reduce the side effects of PDT. Due to the additional cellular "killing" mechanisms of the immune cells, there is a significant increase in efficiency.

Die vorliegende Erfindung wird anhand folgender Figuren näher erläutert. Es zeigen:The present invention will be explained in more detail with reference to the following figures. Show it:

1 einen fluoreszenzmikroskopischen Nachweis der Photosensibilisator-Aufnahme in ex vivo aktivierte humane T-Lymphozyten; 1 a fluorescence microscopic detection of photosensitizer uptake into ex vivo activated human T lymphocytes;

2 Ergebnisse der Bestimmung der Viabilität von PSS/mTHPP-beladenen T-Zellen; 2 Results of the determination of the viability of PSS / mTHPP-loaded T cells;

3 einen fluoreszenzmikroskopischen Nachweis der Photosensibilisator-Übertragung von PSS/mTHPP-beladenen T-Lymphozyten auf Krebszellen; und 3 a fluorescence microscopic detection of photosensitizer transfer of PSS / mTHPP-loaded T lymphocytes to cancer cells; and

4 Ergebnisse der Bestimmung des zytotoxischen Effekts von PSS/mTHPP-beladenen T-Zellen. 4 Results of the determination of the cytotoxic effect of PSS / mTHPP-loaded T cells.

1 zeigt ex vivo aktivierte humane T-Lymphozyten, welche den Photosensibilisator-Komplex PSS/mTHPP aufgenommen haben. Ex vivo stimulierte menschliche T-Zellen wurden am siebten Tag nach der Aktivierung 2 Stunden mit einer PSS/mTHPP-Menge inkubiert, die einer mTHPP-Konzentration von 10 μg/ml entspricht. Unmittelbar nach der Beladung wurde die subzelluläre Verteilung des Photosensibilisators mTHPP mit Hilfe eines inversen IX 71-Fluoreszenzmikroskops (Olympus) analysiert. Der Nachweis der Zellkerne erfolgte mit DAPI. Abbildung A zeigt dabei die einzelnen fluoreszierenden Zellkerne (N), Abbildung B die Fluoreszenz des Photosensibilisators (P) und Abbildung C die Kernfärbung und Photosensibilisatorfluoreszenz in einem Bild. 1 shows ex vivo activated human T lymphocytes which have taken up the photosensitizer complex PSS / mTHPP. Ex vivo stimulated human T cells were incubated on the seventh day after activation for 2 hours with a PSS / mTHPP amount corresponding to a mTHPP concentration of 10 μg / ml. Immediately after loading, the subcellular distribution of the photosensitizer mTHPP was analyzed by means of an IX 71 inverse fluorescence microscope (Olympus). The cell nuclei were detected by DAPI. Figure A shows the individual fluorescent nuclei (N), Figure B the fluorescence of the photosensitizer (P) and Figure C the nuclear staining and photosensitizer fluorescence in one image.

2 zeigt graphisch die Ergebnisse eines Viabilitätstests, wie dieser nach Ausführungsbeispiel 5 durchgeführt wurde. Am vierten (A) bzw. dritten (B) Tag nach der Aktivierung wurden T-Lymphozyten mit dem Photosensibilisator-Komplex PSS/mTHPP beladen, bzw. zur Kontrolle nur mit H2OMillipore versetzt (unbeladene T-Zellen). Ein Teil der Proben wurde nach der Beladung im Dunkeln aufbewahrt. Die restlichen Ansätze wurden hingegen entweder sofort (A) oder nach 72 Stunden (B) 2 min lang mit einer Kalthalogenlichtquelle bestrahlt (h × ν). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die T-Zell-Viabilität bestimmt. Triton X-100-behandelte T-Lymphozyten dienten jeweils als Positiv-Kontrolle. Es wurden jeweils Dreifachmessungen durchgeführt. (B) C1, C2, C3: Proben 1, 2, 3. 2 Graphically shows the results of a Viability test, as this was carried out according to Embodiment 5. On the fourth (A) and third (B) days after activation, T-lymphocytes were loaded with the photosensitizer complex PSS / mTHPP, or for control only with H 2 O Millipore loaded (unloaded T cells). Some of the samples were stored in the dark after loading. On the other hand, the remaining batches were irradiated either immediately (A) or after 72 hours (B) for 2 minutes with a calhalogen light source (h × ν). At the times indicated, T-cell viability was determined. Triton X-100-treated T lymphocytes each served as a positive control. In each case triple measurements were carried out. (B) C1, C2, C3: Samples 1, 2, 3.

Aus den Abbildungen A und B ist zu entnehmen, dass beladene und unbeladene, nicht bestrahlte Zellen die gleichen Viabilitätsraten aufweisen. Somit hat der Photosensibilisator bei Dunkelheit keinen Einfluss auf die Viabilität der beladenen T-Lymphozyten. Eine Bestrahlung der Zellen mit Licht, entweder unmittelbar (A) oder drei Tage (B) nach der Beladung, führt hingegen, zum Zelltod.From Figures A and B it can be seen that loaded and unloaded, unirradiated cells have the same viability rates. Thus, the photosensitizer has no influence on the viability of the loaded T-lymphocytes in the dark. By contrast, irradiation of the cells with light, either immediately (A) or three days (B) after loading, leads to cell death.

3 zeigt in Abbildung A eine Zellkernfärbung von Skov-3-Zellen (SN) (humane Ovarkarzinom-Zelllinie, ATCC, Manassas, USA) und beladenen T-Zellen (TN), wie in Beispiel 4 beschrieben. Zusätzlich ist in Abbildung B die Fluoreszenz des Photosensibilisators mTHPP in den Zellen sichtbar. Mittels dieser Fluoreszenzmikroskopie kann so die Verteilung des Photosensibilisators dokumentiert werden. In der Abbildung B ist zu erkennen, dass sich der Photosensibilisator auch in den Tumorzellen (P) befindet, und somit von den beladenen T-Lymphozyten (TNP) auf die kokultivierte Skov-3 Krebszellen übertragen wurde. 3 Figure A shows in Figure A a nuclear staining of Skov-3 cells (SN) (human ovarian carcinoma cell line, ATCC, Manassas, USA) and loaded T cells (TN) as described in Example 4. In addition, in Figure B, the fluorescence of the photosensitizer mTHPP is visible in the cells. By means of this fluorescence microscopy, the distribution of the photosensitizer can be documented. In Figure B it can be seen that the photosensitizer is also located in the tumor cells (P) and thus transferred from the loaded T lymphocytes (TNP) to the cocultured Skov-3 cancer cells.

4 zeigt graphisch den zytotoxischen Effekt von PS-beladenen T-Lymphozyten auf Skov-3-Zellen (humane Ovarkarzinom-Zelllinie). Nach Aktivierung des Photosensibilisators, durch insgesamt dreimalige (3, 2,5 und 2 Stunden) Bestrahlung aller Ansätze vor jeder Messung, wurde jeweils ein Viabilitätstest zu den angegebenen Zeitpunkten durchgeführt. Die experimentelle Durchführung ist in Beispiel 6 beschrieben. Dabei zeigt sich bei den Kontrollproben von unbeladenen T-Zellen sowie Skov-3-Zellen mit Medium allein ein Anstieg der Krebszellviabilität. Bei beladenen T-Zellen ohne bispezifischen Antikörper als Retargeting Substanz ist ein ähnlicher Abfall der Krebszellviabilität wie bei unbeladenen T-Zellen mit Retargeting Substanz zu erkennen. Dies zeigt, dass beladene T-Zellen ohne Retargeting Substanz einen ähnlichen zytotoxischen Effekt auf die Krebszellen haben wie unbeladene Zellen mit Retargeting Substanz. Den stärksten zytotoxischen Effekt auf die Skov-3-Zellen hat eine Kombination aus beladenen T-Zellen mit bispezifischem Antikörper als Retargeting Substanz. 4 graphically shows the cytotoxic effect of PS-loaded T lymphocytes on Skov-3 cells (human ovarian carcinoma cell line). After activation of the photosensitizer, by a total of three (3, 2.5 and 2 hours) irradiation of all approaches before each measurement, a viability test was carried out at the indicated times. The experimental procedure is described in Example 6. The control samples of uncharged T cells and of Skov-3 cells with medium alone show an increase in cancer cell viability. In the case of loaded T cells without bispecific antibodies as retargeting substance, a similar decrease in cancer cell viability as in unloaded T cells with retargeting substance can be recognized. This shows that loaded T cells without retargeting substance have a cytotoxic effect on the cancer cells similar to uncharged cells with retargeting substance. The most potent cytotoxic effect on the Skov-3 cells is a combination of loaded T cells with bispecific antibody as a retargeting substance.

Die Modifikation von menschlichen oder tierischen mammalen Immunzellen soll im Folgenden beispielhaft anhand der Modifikation von humanen T-Zellen näher erläutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.The modification of human or animal mammalian immune cells will be explained in more detail below by way of example with reference to the modification of human T cells, without restricting it thereto.

1. -Zell-Isolierung, -Aktivierung und -Vermehrung1. cell isolation, activation and propagation

Humane T-Lymphozyten werden mit Hilfe des RosetteSep® Human T Cell Enrichment Cocktails (StemCell Technologies, Grenoble, Frankreich) aus tagesfrischem Buffy coat-Blut nach den Angaben des Herstellers isoliert. Dazu werden jeweils 20 ml Blut mit 0,5 ml RosetteSep® Antikörper-Cocktail versetzt und unter leichtem Schütteln 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird der Ansatz mit 10 ml PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) vermischt, vorsichtig auf 15 ml PancoII human (PAN Biotech, Aidenbach, Deutschland) pipettiert und 20 min mit 1200 × g bei abgeschalteter Bremse zentrifugiert. Die daraufhin in der Grenzschicht zwischen PancoII und Serum angereicherten T-Zellen werden in PBS überführt und sedimentiert. Nach Entfernung restlicher Erythrozyten mit Hilfe des BD Pharm LyseTM Lysing-Puffers (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) werden die verbleibenden T-Zellen noch zweimal mit PBS gewaschen und schließlich in Kulturmedium (RPMI 1640, PAN Biotech + 10% (v/v) hitzeinaktiviertes FBS, PAN Biotech + 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) aufgenommen.Human T lymphocytes are using the RosetteSep® ® Human T Cell Enrichment cocktail (StemCell Technologies, Grenoble, France) isolated from daily fresh buffy coat blood following the manufacturer's instructions. For this purpose, 20 ml blood with 0.5 mL of RosetteSep ® antibody cocktail are added and incubated with gentle shaking for 20 min at room temperature. The mixture is then mixed with 10 ml of PBS (phosphate-buffered saline), carefully pipetted onto 15 ml of PancoII human (PAN Biotech, Aidenbach, Germany) and centrifuged for 20 minutes at 1200 × g with the brake off. The then enriched in the boundary layer between PancoII and serum T cells are transferred to PBS and sedimented. After removal of residual erythrocytes with the aid of the BD Pharm Lysis TM Lysing Buffer (BD Biosciences, Heidelberg, Germany), the remaining T cells are washed twice more with PBS and finally in culture medium (RPMI 1640, PAN Biotech + 10% (v / v ) heat-inactivated FBS, PAN Biotech + 1% (v / v) penicillin / streptomycin, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany).

Nach Bestimmung der Zellzahl mit Hilfe eines Casy® Cell Counter + Analyzer Systems (Model TT, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) werden die isolierten T-Lymphozyten unter Verwendung des T-Cell Activation/Expansion Kit human (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) gemäß den Herstellerangaben aktiviert. Hierzu wird zunächst die Zellkonzentration in Kulturmedium auf 2,5 × 106 T-Zellen/ml eingestellt. Anschließend werden die Zellen in einem Verhältnis von 2:1 mit anti-CD3, anti-CD28 und anti-CD2 gekoppelten Microbeads versetzt und 72 Stunden in einem wasserdampfgesättigten 5%igen CO2/Luftgemisch bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.After determining the number of cells using a Casy ® Cell Counter + Analyzer System (Model TT, Scharfe System GmbH, Reutlingen, Germany), the isolated T lymphocytes using the T-Cell Activation / Expansion Kit human (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) according to the manufacturer's instructions. For this purpose, first the cell concentration in culture medium is adjusted to 2.5 × 10 6 T cells / ml. Subsequently, the cells are in a ratio of 2: 1 with anti-CD3, anti-CD28 and anti-CD2 coupled microbeads and incubated for 72 hours in a water vapor saturated 5% CO 2 / air mixture at a temperature of 37 ° C.

Im Anschluss daran wird das Kulturmedium entfernt und die Zelldichte in frischem Medium nochmals auf 2,5 × 106 T-Zellen/ml eingestellt. Zur Expansion der aktivierten T-Lymphozyten werden die Kulturen mit 20 U/ml humanem Interleukin-2 (PAN Biotech) versetzt und einen Tag bei einer Temperatur von 37°C im CO2-Brutschrank kultiviert.Following this, the culture medium is removed and the cell density in fresh medium is adjusted again to 2.5 × 10 6 T cells / ml. To expand the activated T lymphocytes, the cultures are mixed with 20 U / ml of human interleukin-2 (PAN Biotech) and cultured for one day at a temperature of 37 ° C in the CO 2 incubator.

Um die „Aktivierungsbeads” und tote Zellen aus den Ansätzen zu entfernen, werden die T-Lymphozyten am vierten Tag nach der Aktivierung einer weiteren PancoII-Dichtegradienten-Zentrifugation unterzogen. Hierzu werden die in 20 ml Kulturmedium resuspendierten Zellen über 20 ml PancoII geschichtet und 20 min mit 1200 × g bei abgeschalteter Bremse zentrifugiert. Nach Überführung der in der Zwischenschicht angereicherten T-Zellen in PBS werden diese nochmals sedimentiert und in Kulturmedium aufgenommen. Im Anschluss an eine Zellzahlbestimmung werden die T-Lymphozyten entweder sofort für weiterführende Experimente verwendet oder bei einer Zelldichte von 2,5 × 106 Zellen/ml wiederum mit 20 U/ml Interleukin-2 versetzt und für weitere 1–3 Tage bei 37°C im CO2-Brutschrank kultiviert.To remove the "activation beads" and dead cells from the batches, the T lymphocytes are subjected to another Panco II density gradient centrifugation on the fourth day after activation. For this, the cells resuspended in 20 ml culture medium are layered over 20 ml Panco II and centrifuged for 20 min at 1200 × g with the brake off. After transfer of the enriched in the intermediate layer T cells in PBS they are sedimented again and taken up in culture medium. Following cell count determination, the T lymphocytes are either used immediately for further experiments or, at a cell density of 2.5 × 10 6 cells / ml, again mixed with 20 U / ml interleukin-2 and for a further 1-3 days at 37 ° C cultivated in the CO 2 incubator.

2. Beladung ex vivo stimulierter humaner T-Lymphozyten mit einem wasserlöslichen Photosensibilisator2. Loading ex vivo stimulated human T lymphocytes with a water-soluble photosensitizer

Beispielhaft wird in diesem Ausführungsbeispiel der wasserlösliche Photosensibilisator PSS/mTHPP verwendet. Der in lyophilisierter Form vorliegende wasserlösliche Photosensibilisator-Komplex PSS/mTHPP wird mit sterilem H2OMillipore in einer Konzentration von 5 mg/ml angesetzt. Die Stocklösung wird lichtgeschützt maximal zwei Wochen bei 4°C aufbewahrt.By way of example, the water-soluble photosensitizer PSS / mTHPP is used in this embodiment. The water-soluble photosensitizer complex PSS / mTHPP present in lyophilised form is prepared with sterile H 2 O millipore at a concentration of 5 mg / ml. The stock solution is kept protected from light for a maximum of two weeks at 4 ° C.

Zum Beladen ex vivo stimulierter menschlicher T-Zellen mit PSS/mTHPP wird 4–7 Tage nach der Aktivierung die Zelldichte in Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FBS und 1% Pen/Strep) auf 2,5 × 106 Zellen/ml eingestellt. Dann werden die Zellen mit einer Menge PSS/mTHPP-Stocklösung versetzt, die der jeweils angegebenen mTHPP-Konzentration entspricht, und 2 Stunden bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert. Zur Entfernung von nicht aufgenommenem Komplex werden die T-Lymphozyten anschließend dreimal mit eiskaltem Kulturmedium gewaschen. Danach werden die Zellen entweder sofort für den weiteren Gebrauch verwendet oder in IL-2-haltigem Kulturmedium aufgenommen und bis zu ihrer späteren Verwendung weiterkultiviert. Nur mit H2OMillipore inkubierte T-Zellen dienten jeweils als Kontrolle (unbeladene Zellen).For loading ex vivo stimulated human T cells with PSS / mTHPP, the cell density in culture medium (RPMI 1640 + 10% FBS and 1% Pen / Strep) is adjusted to 2.5 × 10 6 cells / ml 4-7 days after activation , Then the cells are mixed with an amount of PSS / mTHPP stock solution corresponding to the respective stated mTHPP concentration and incubated for 2 hours at 37 ° C. in the CO 2 incubator. To remove unaccumulated complex, the T lymphocytes are then washed three times with ice-cold culture medium. Thereafter, the cells are either immediately for the used further or taken up in IL-2-containing culture medium and further cultivated until its later use. Only T cells incubated with H 2 O Millipore each served as a control (uncharged cells).

Als Hintergrundlicht wird bei allen Arbeitsschritten eine Dukalux SL-Lampe (Kindermann GmbH, Ochsenfurt, Deutschland, Emission-λmax ≈ 611 nm) verwendet. Um eine vorzeitige Aktivierung des lichtinduzierbaren Medikaments zu vermeiden, erfolgen die Inkubationen im Dunkeln.The background light used in all work steps is a Dukalux SL lamp (Kindermann GmbH, Ochsenfurt, Germany, emission λ max ≈ 611 nm). To avoid premature activation of the light-inducible drug, the incubations are done in the dark.

Wird ein nicht-wasserlöslicher Photosensibilisator verwendet, wird dieser zunächst in Ethanol gelöst. Der in Ethanol gelöste Photosensibilisator wird dann zu der Zellsuspension gegeben und zusammen mit dieser inkubiert.If a non-water-soluble photosensitizer is used, it is first dissolved in ethanol. The photosensitizer dissolved in ethanol is then added to the cell suspension and incubated with it.

3. Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Photosensibilisator-Aufnahme in aktivierte T-Zellen3. Fluorescence microscopic analysis of photosensitizer uptake into activated T cells

Um die Aufnahme des Photosensibilisator-Komplexes in aktivierte humane T-Lymphozyten nachweisen zu können, werden am siebten Tag nach der Aktivierung T-Zellen mit einer in H2O gelösten PSS/mTHPP-Menge inkubiert, die einer mTHPP-Konzentration von 10 μg/ml entspricht. Unmittelbar nach der Beladung werden die Zellen einer fluoreszenzmikroskopischen Analyse unterzogen.To detect the uptake of the photosensitizer complex into activated human T-lymphocytes, on the seventh day after activation T cells are incubated with a PSS / mTHPP amount dissolved in H 2 O, which has a mTHPP concentration of 10 μg / ml. ml corresponds. Immediately after loading, the cells are subjected to fluorescence microscopic analysis.

Hierzu werden 3 × 106 beladene T-Lymphozyten zunächst 10 min in 4%iger (w/v) Paraformaldehyd(Sigma-Aldrich)-Lösung fixiert. Im Anschluss an zwei PBS-Waschschritte werden die Zellen in FluorSave-Mounting-Medium (Calbiochem) eingebettet, welches zum Nachweis der Zellkerne zuvor mit 1 μg/ml DAPI (Sigma-Aldrich) versetzt worden ist. Zum Aushärten werden die Proben über Nacht vor Licht geschützt bei Raumtemperatur gelagert. Anschließend werden die Präparate bis zur Mikroskopie abgedunkelt bei 4°C aufbewahrt.For this purpose, 3 × 10 6 loaded T lymphocytes are first fixed for 10 min in 4% (w / v) paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) solution. Following two PBS washes, the cells are embedded in FluorSave Mounting Medium (Calbiochem) which has been previously spiked with 1 μg / ml DAPI (Sigma-Aldrich) to detect cell nuclei. For curing, the samples are stored overnight protected from light at room temperature. Subsequently, the preparations are stored darkened at 4 ° C until microscopy.

Mit Hilfe eines inversen IX 71-Fluoreszenzmikroskops von Olympus, welches mit einer digitalen Kamera (F-View II, Olympus) und der Cell P-Software (Version 2.8, Olympus) ausgestattet ist, wird der internalisierte Photosensibilisator sichtbar gemacht. Zur Betrachtung der Zellen wird vorzugsweise ein 60x/1.42-Ölimmersions-Objektiv gewählt. Während ein NU-Filter (Anregungswellenlänge: 360–370 nm, Emission > 420 nm) zum Nachweis der DAPI-Signale bevorzugt verwendet wird, wird vorzugsweise die subzelluläre Verteilung des Photosensibilisators mit Hilfe eines WG-Filters (Anregung: 510–550 nm, Emission > 590 nm) untersucht. Die Belichtungszeiten variierten in Abhängigkeit von der Signalintensität.With the help of an inverse IX 71 fluorescence microscope from Olympus, equipped with a digital camera (F-View II, Olympus) and the Cell P software (version 2.8, Olympus), the internalized photosensitizer is visualized. For viewing the cells, a 60x / 1.42 oil immersion objective is preferably chosen. While a NU filter (excitation wavelength: 360-370 nm, emission> 420 nm) is preferred for detecting the DAPI signals, it is preferable to use the subcellular distribution of the photosensitizer with a WG filter (excitation: 510-550 nm, emission > 590 nm). The exposure times varied depending on the signal intensity.

4. Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Photosensibilisator-Übertragung von T-Lymphozyten auf Krebszellen4. Fluorescence microscopic analysis of photosensitizer transfer of T lymphocytes to cancer cells

Zur Überprüfung, ob der Photosensibilisator von den beladenen T-Lymphozyten in vitro auf kokultivierte Krebszellen übertragen wird, kann Live cell-Fluoreszenzmikroskopie angewandt werden. Am vierten Tag nach der Ex-vivo-Aktivierung werden dazu T-Lymphozyten drei Stunden lang mit einer in H2OMillipore gelösten Photosensibilisator-Komplex-Menge beladen, die einer mTHPP-Konzentration von 45 μg/ml entspricht. Gleichzeitig werden jeweils 40.000 Skov-3-Zellen (humane Ovarkarzinom-Zelllinie, ATCC, Manassas, USA) in einer μClear black 96-Well-Platte (Greiner Bio-one) ausgesät. Im Anschluss an zwei Medium-Waschschritte werden die beladenen T-Zellen in einem Verhältnis von 4:1 zu den Krebszellen gegeben. Die Ansätze werden daraufhin bei 37°C im CO2-Inkubator kultiviert. Nach einer Koinkubationszeit von 28 Stunden werden die Proben dreimal mit Medium gewaschen, wodurch ein Großteil der T-Zellen aus den Ansätzen entfernt wird. Danach werden die Zellen zur Sichtbarmachung der Zellkerne 20 min mit 5 μg/ml Hoechst-Farbstoff (Invitrogen) behandelt. Anschließend wird die Verteilung des Photosensibilisators mit Hilfe eines inversen Olympus IX 71-Fluoreszenzmikroskops analysiert. Der Photosensibilisator-Komplex mTHPP ist autofluoreszent. Die Durchführung erfolgt, wie unter 3. beschrieben.To test whether the photosensitizer is transferred from the loaded T lymphocytes to cocultivated cancer cells in vitro, live cell fluorescence microscopy can be used. On the fourth day after ex vivo activation of T-lymphocytes for three hours charged with a H 2 O dissolved in Millipore photosensitizer complex amount to corresponding to a mTHPP concentration of 45 ug / ml. At the same time, 40,000 Skov-3 cells (human ovarian carcinoma cell line, ATCC, Manassas, USA) are seeded in a μClear black 96-well plate (Greiner Bio-one). Following two medium washes, the loaded T cells are added to the cancer cells in a 4: 1 ratio. The batches are then cultured at 37 ° C in the CO 2 incubator. After a co-incubation time of 28 hours, the samples are washed three times with medium, removing most of the T cells from the batches. Thereafter, the cells are visualized for 20 min with 5 ug / ml Hoechst dye (Invitrogen) to visualize the cell nuclei. Subsequently, the distribution of the photosensitizer is analyzed by means of an inverse Olympus IX 71 fluorescence microscope. The photosensitizer complex mTHPP is autofluorescent. The procedure is carried out as described under 3..

5. Bestimmung der Viabilität von Photosensibilisator-beladenen T-Zellen5. Determination of viability of photosensitizer-loaded T cells

Um zu Kontrollzwecken die Viabilität von modifizierten Immunzellen zu bestimmen, wird vorzugsweise wie folgt verfahren. Am vierten bzw. dritten Tag nach der In-vitro-Stimulierung werden T-Zellen in Kulturmedium mit einer in H2OMillipore gelösten Komplex-Menge inkubiert, die einer mTHPP-Konzentration von 10 μg/ml entspricht, bzw. nur mit H2O versetzt (unbeladene T-Zellen). Nach Überführung der beladenen und unbeladenen T-Lymphozyten in 96-Well-Platten (2.5 × 105 T-Zellen/Well) wird die Hälfte der Proben im Dunkeln aufbewahrt. Die übrigen Ansätze werden entweder sofort oder nach einer 72-stündigen Inkubation im CO2-Brutschrank illuminiert. Für die jeweils 2-minütige Bestrahlung der Zellen wird eine Kalthalogenlichtquelle (KL 200, Schott, Mainz, Deutschland) verwendet. Mit 1% (w/v) Triton X-100 behandelte T-Zellen können als Positiv-Kontrollen dienen.In order to determine the viability of modified immune cells for control purposes, the procedure is preferably as follows. On the fourth and third day after the in vitro stimulation, T cells are incubated in culture medium with a complex amount dissolved in H 2 O Millipore corresponding to a mTHPP concentration of 10 μg / ml, or only with H 2 O offset (unloaded T cells). After transfer of the loaded and unloaded T lymphocytes to 96 well plates (2.5 x 10 5 T cells / well), half of the samples are stored in the dark. The remaining batches are illuminated either immediately or after a 72-hour incubation in the CO 2 incubator. For each 2-minute irradiation of the cells, a Kalthalogenlichtquelle (KL 200, Schott, Mainz, Germany) is used. T-cells treated with 1% (w / v) Triton X-100 can serve as positive controls.

Mit Hilfe des Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche Applied Science) wird zu unterschiedlichen Zeitpunkten (siehe 1) die Viabilität der T-Lymphozyten bestimmt. Der WST-1-Assay misst die mitochondriale Aktivität von Zellen, wodurch auf deren Viabilität rückgeschlossen werden kann. Der Test basiert auf der photometrischen Erfassung eines Formazanfarbstoffs, der bei der Reduktion eines Tetrazoliumsalzes durch lebende Zellen entsteht. Bei der Durchführung der Viabilitätstests wird nach den Angaben des Herstellers vorgegangen. Dabei werden jeweils 100 μl Zellsuspension mit 10 μl WST-1-Reagenz versetzt. Nach einer 1-stündigen Inkubation im CO2-Brutschrank (37°C) erfolgt die Absorptionsmessung in einem Microplate-Reader (Spectra ELISA Reader, Tecan, Crailsheim, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenzwellenlänge: 690 nm). Es werden jeweils Dreifachmessungen durchgeführt.With the help of the Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche Applied Science) is used at different times (see 1 ) determines the viability of T lymphocytes. The WST-1 assay measures the mitochondrial activity of cells, indicating their viability. The test is based on the photometric detection of a formazan dye resulting from the reduction of a tetrazolium salt by living cells. When carrying out the viability tests, proceed according to the manufacturer's instructions. In each case 100 .mu.l cell suspension are mixed with 10 ul WST-1 reagent. After a 1-hour incubation in the CO 2 incubator (37 ° C), the absorption measurement is carried out in a Microplate reader (Spectra ELISA Reader, Tecan, Crailsheim, Germany) at a wavelength of 450 nm (reference wavelength: 690 nm). Triple measurements are carried out in each case.

6. Bestimmung des zytotoxischen Effekts von Photosensibilisator-beladenen T-Lymphozyten in vitro6. Determination of the cytotoxic effect of photosensitizer-loaded T lymphocytes in vitro

Zur Bestimmung des zytotoxischen Effekts, des „Killing-Effekts”, von PS-beladenen T-Lymphozyten kann ebenfalls der WST-1-Assay herangezogen werden, wie unter 5. beschrieben. Zunächst werden am vierten Tag nach der Aktivierung T-Zellen mit einer in H2OMillipore gelösten PSS/mTHPP-Menge beladen, die einer mTHPP-Konzentration von 30 μg/ml entspricht, bzw. nur mit H2O inkubiert (unbeladene T-Zellen). Gleichzeitig werden jeweils 40.000 Skov-3-Zellen (humane Ovarkarzinom-Zelllinie) in 96-Well-Platten ausgesät. Nach zwei Medium-Waschschritten werden jeweils 80.000 T-Lymphozyten (beladen und unbeladen) in Triplikaten zu den Krebszellen gegeben. Die Hälfte der Ansätze wird zusätzlich mit einer Retargeting-Substanz, in diesem Fall 0,1 μg/ml bispezifischem Antikörper HEA125xOKT3 (Gerhard Moldenhauer, DKFZ Heidelberg, Deutschland), versetzt. Mit 1% (w/v) Triton X-100 behandelte Skov-3-Zellen sowie unbehandelte Krebszellen können als Positiv- bzw. Negativkontrolle dienen. Alle Ansätze werden im Dunkeln bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.To determine the cytotoxic effect, the "killing effect", of PS-loaded T lymphocytes, it is also possible to use the WST-1 assay, as described under 5. First, on the fourth day after activation, T cells are loaded with a PSS / mTHPP amount dissolved in H 2 O Millipore , which corresponds to a mTHPP concentration of 30 μg / ml, or only incubated with H 2 O (unloaded T cells). cells). At the same time, 40,000 Skov-3 cells (human ovarian carcinoma cell line) are seeded in 96-well plates. After two medium washes, 80,000 T lymphocytes (loaded and unloaded) are added in triplicate to the cancer cells. Half of the batches are additionally mixed with a retargeting substance, in this case 0.1 μg / ml bispecific antibody HEA125xOKT3 (Gerhard Moldenhauer, DKFZ Heidelberg, Germany). Skov-3 cells treated with 1% (w / v) Triton X-100 and untreated cancer cells can serve as positive or negative controls. All batches are incubated in the dark at 37 ° C and 5% CO 2 .

Um das Überleben der Tumorzellen in den verschiedenen Kulturen ermitteln zu können, werden zu den angegebenen Zeitpunkten WST-1-Assays (Roche Applied Science) durchgeführt. Der Photosensibilisator wird aktiviert, indem alle Ansätze insgesamt dreimal (3, 2,5 und 2 Stunden) vor jeder Messung unter standardisierten Bedingungen 2 Minuten lang mit einem Halogenlicht (Haloline Eco, 400 W, 9000 Im, OSRAM) bestrahlt werden. Die Viabilitätstests werden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt, wie unter 5. beschrieben. Um ausschließlich die mitochondriale Aktivität der Skov-3-Zellen erfassen zu können, wird jeweils die Absorption von 80.000 T-Lymphozyten von den entsprechenden Werten der Kokulturen subtrahiert.In order to determine the survival of the tumor cells in the different cultures, WST-1 assays (Roche Applied Science) are performed at the indicated times. The photosensitizer is activated by irradiating all the batches three times (3, 2.5, and 2 hours) under standard conditions with halogen light (Haloline Eco, 400 W, 9000 Im, OSRAM) for 2 minutes before each measurement. The viability tests are carried out according to the manufacturer's instructions, as described under 5.. In order to be able to detect exclusively the mitochondrial activity of the Skov-3 cells, in each case the absorption of 80,000 T-lymphocytes is subtracted from the corresponding values of the co-cultures.

7. Weitere Anwendung in vivo7. Further use in vivo

Nach erfolgter Gewinnung mammaler Immunzellen und anschließender Aktivierung und/oder Vermehrung sowie erfolgter Beladung der Immunzelle mit einer photosensibilisierenden Substanz wird die modifizierte Immunzelle vorzugsweise einem Patienten appliziert. Vorzugsweise wird die modifizierte Immunzelle dem Patienten dabei intravenös oder lokal verabreicht. Zusätzlich kann eine Retargeting-Substanz appliziert werden, um die Photosensibilisator-beladenen Immunzellen am Wirkort mit den Zielzellen zu vernetzen und dabei gegebenenfalls die intrinsische zytotoxische Aktivität der Carrier-Zellen auszulösen. Es ist bevorzugt, dass die modifizierten Immunzellen, wenn sie den Zielort erreicht haben, zunächst ihre natürliche „Killing”-Funktion ausüben, bevor zu einem definierten Zeitpunkt die photosensibilisierende Substanz durch Lichtbestrahlung aktiviert wird und so zusätzlich auf die Tumorzellen einwirkt. Die PDT von Tumoren kann dabei in einer einmaligen Bestrahlungssitzung erfolgen, jedoch besteht durchaus die Möglichkeit einer wiederholten Bestrahlung. Ebenso kann die Behandlung mit beladenen Immunzellen und Retargeting-Substanz ein- oder mehrmalig erfolgen.After recovery of mammalian immune cells and subsequent activation and / or propagation and loading of the immune cell with a photosensitizing substance, the modified immune cell is preferably applied to a patient. Preferably, the modified immune cell is administered to the patient intravenously or locally. In addition, a retargeting substance can be applied in order to crosslink the photosensitizer-loaded immune cells at the site of action with the target cells and, if appropriate, trigger the intrinsic cytotoxic activity of the carrier cells. It is preferred that the modified immune cells, once they have reached the target site, first perform their natural "killing" function before the photosensitizing substance is activated by light irradiation at a defined time, thereby additionally acting on the tumor cells. The PDT of tumors can take place in a single irradiation session, but there is the possibility of repeated irradiation. Similarly, the treatment with loaded immune cells and retargeting substance can be one or more times.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

  • NN
    Nukleusnucleus
    PP
    Photosensibilisatorphotosensitizer
    TNTN
    T-Zellen NukleusT-cell nucleus
    SNSN
    Zellkern Skov-3Nuclear Skov-3
    TNPTNP
    T-Zellen Nukleus + PhotosensibilisatorT cell nucleus + photosensitizer
    SNPSNP
    Zellkern Skov-3 + PhotosensibilisatorNuclear Skov-3 + photosensitizer

Claims (11)

Verwendung mindestens einer modifizierten mammalen Immunzelle zum gezielten Transport einer photosensibilisierenden Substanz zur Behandlung von Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, dass diese mit einer photosensibilisierenden Substanz beladen ist, bei welcher es sich um eine chemische Komponente oder einen Vorläufer einer chemischen Komponente handelt, wobei die photosensibilisierende Substanz in die Immunzelle aufgenommen wird und an eine Tumorzelle übertragen wird, und wobei die photosensibilisierende Substanz ein Photosensibilisator ist; oder die photosensibilisierende Substanz ein wasserlöslicher Photosensibilisator-Komplex, ein chemisch modifizierter Photosensibilisator, eine liposomale Photosensibilisator-Formulierung, eine nano- oder mikropartikuläre Photosensibilisator-Formulierung, eine dendrimerische Photosensibilisator-Formulierung, ein Photosensibilisator-Antikörper-Konjugat und/oder ein photosensibilisierender Nanopartikel ist.Use of at least one modified mammalian immune cell for the targeted transport of a photosensitizing substance for the treatment of tumor cells, characterized in that it is loaded with a photosensitizing substance which is a chemical component or a precursor of a chemical component, wherein the photosensitizing substance in the immune cell is taken up and transmitted to a tumor cell, and wherein the photosensitizing substance is a photosensitizer; or the photosensitizing substance is a water-soluble photosensitizer complex, a chemically modified photosensitizer, a liposomal photosensitizer formulation, a nano- or microparticulate photosensitizer formulation, a dendrimeric photosensitizer formulation, a photosensitizer-antibody conjugate, and / or a photosensitizing nanoparticle. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunzelle ex vivo durch Inkubation mit der photosensibilisierenden Substanz beladen wird.Use according to claim 1, characterized in that the immune cell ex vivo by Incubation is loaded with the photosensitizing substance. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunzelle ex vivo aktiviert und/oder ex vivo vermehrt und/oder ex vivo generiert wird.Use according to one of the preceding Claims 1 or 2, characterized in that the immune cell is activated ex vivo and / or multiplied ex vivo and / or generated ex vivo. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunzelle eine autologe Zelle oder eine allogene Zelle ist.Use according to one of the preceding claims 1 to 3, characterized in that the immune cell is an autologous cell or an allogeneic cell. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunzelle ein T-Lymphozyt, insbesondere eine ex vivo aktivierte und expandierte polyklonale T-Zelle, eine ex vivo vermehrte tumorinfiltrierende T-Zelle, eine ex vivo expandierte monoklonale antigenspezifische T-Zelle, eine T-Zelle mit gentechnisch verändertem T-Zell-Rezeptor (TCR), oder eine gentechnisch veränderte CAR(chimeric antigen-receptor)-exprimierende T-Zelle ist; oder ein Monozyt, insbesondere ein autologer Monozyt, ein Makrophage, insbesondere ein autologer Makrophage, ein tumorassoziierter Makrophage (TAM) und/oder ein in vitro generierter Makrophage, ein neutrophiler Granulozyt, eine natürliche Killerzelle (NK-Zelle) und/oder eine Zelle einer NK-Zelllinie, insbesondere eine NK-92-Zelle und/oder eine CAR-exprimierende NK-92-Zelle ist.Use according to one of the preceding claims 1 to 4, characterized in that the immune cell comprises a T lymphocyte, in particular an ex vivo activated and expanded polyclonal T cell, an ex vivo propagated tumor infiltrating T cell, an ex vivo expanded monoclonal antigen-specific T cell. Cell, a T cell with genetically engineered T cell receptor (TCR), or a genetically engineered CAR (chimeric antigen receptor) expressing T cell; or a monocyte, in particular an autologous monocyte, a macrophage, in particular an autologous macrophage, a tumor-associated macrophage (TAM) and / or an in vitro-generated macrophage, a neutrophilic granulocyte, a natural killer cell (NK cell) and / or a cell of one NK cell line, in particular an NK-92 cell and / or a CAR-expressing NK-92 cell. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunzelle zusammen mit einer Retargeting-Substanz co-appliziert wird, wobei es sich bei der Retargeting-Substanz bevorzugt um einen bispezifischen Antikörper, Diabody, BiTE-Antikörper, trispezifischen Antikörper und/oder tetraspezifischen Antikörper, sowie Fragmente derer, handelt.Use according to one of the preceding claims 1 to 5, characterized in that the immune cell is co-applied together with a retargeting substance, wherein the retargeting substance is preferably a bispecific antibody, diabody, BiTE antibodies, trispecific antibodies and or tetraspecific antibodies, as well as fragments thereof. Verwendung mindestens einer modifizierten Immunzelle nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur Krebstherapie vorzugsweise an Tumoren an der Körperoberfläche und/oder an Tumoren, die minimalinvasiv erreicht werden können, wie Hauttumore, Basalzellkarzinom, malignes Melanom, Kopf-Hals-Karzinome, Bronchial- und Lungenkrebs, Blasenkrebs, Prostatakarzinome, Kolonkarzinome, Leberkarzinome, Nierenzellkarzinom, Tumore des weiblichen Genitalbereichs, Hirntumore oder maligne Aszites, einsetzbar ist.Use of at least one modified immune cell according to one of the preceding claims, characterized in that it is preferably used for cancer therapy on tumors on the body surface and / or tumors that can be achieved minimally invasive, such as skin tumors, basal cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck carcinomas, Bronchial and lung cancer, bladder cancer, prostate cancer, colon carcinoma, liver carcinoma, renal cell carcinoma, tumors of the female genital area, brain tumors or malignant ascites, can be used. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Photosensibilisator bevorzugt ein Hämatoporphyrin, Chlorin, Bacteriochlorin, Phthalocyanin, Benzoporphyrin-Derivat, 5-Aminolaevulinsäure (ALA) oder -ester, Hypericin, Purpurin, Porphycen, Indocyaningrün (ICG), sowie deren Derivate ist.Use according to one of the preceding claims, characterized in that the photosensitizer preferably a hematoporphyrin, chlorin, bacteriochlorin, phthalocyanine, benzoporphyrin derivative, 5-aminolevulinic acid (ALA) or esters, hypericin, purpurin, porphycene, indocyanine green (ICG), and their Derivatives is. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten mammalen Immunzelle zur Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend mindestens folgende Schritte: – Isolierung einer mammalen Immunzelle aus einer mammalen Gewebeprobe oder Blut, – ex vivo Aktivierung und/oder ex vivo Vermehrung und/oder ex vivo Generierung der isolierten Immunzelle, – Beladung der Immunzelle mit einer photosensibilisierenden Substanz, bei welcher es sich um eine chemische Komponente oder einen Vorläufer einer chemischen Komponente handelt, wobei die Beladung über Inkubation mit der photosensibilisierenden Substanz erfolgt, – Übertragung der photosensibilisierenden Substanz an eine Tumorzelle, und wobei die photosensibilisierende Substanz ein Photosensibilisator ist, oder ein wasserlöslicher Photosensibilisator-Komplex, ein chemisch modifizierter Photosensibilisator, eine liposomale Photosensibilisator-Formulierung, eine nano- oder mikropartikuläre Photosensibilisator-Formulierung, eine dendrimerische Photosensibilisator-Formulierung, ein Photosensibilisator-Antikörper-Konjugat und/oder ein photosensibilisierender Nanopartikel ist.Method for producing a modified mammalian immune cell for use according to one of the preceding claims, comprising at least the following steps: Isolation of a mammalian immune cell from a mammalian tissue sample or blood, Ex vivo activation and / or ex vivo propagation and / or ex vivo generation of the isolated immune cell, Loading the immune cell with a photosensitizing substance which is a chemical component or a precursor of a chemical component, the loading being effected by incubation with the photosensitizing substance, Transfer of the photosensitizing substance to a tumor cell, and where the photosensitizing substance is a photosensitizer, or a water-soluble photosensitizer complex, a chemically modified photosensitizer, a liposomal photosensitizer formulation, a nano- or microparticulate photosensitizer formulation, a dendrimeric photosensitizer formulation, a photosensitizer-antibody conjugate and / or a photosensitizing nanoparticle. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten mammalen Immunzelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine modifizierte Immunzelle zusammen mit einer Retargeting-Substanz co-appliziert wird, wobei es sich bei der Retargeting-Substanz bevorzugt um einen bispezifischen Antikörper, Diabody, BiTE-Antikörper, trispezifischen Antikörper und/oder tetraspezifischen Antikörper, sowie Fragmente derer, handelt.A method for producing a modified mammalian immune cell according to claim 9, characterized in that a modified immune cell is co-administered together with a retargeting substance, wherein the retargeting substance is preferably a bispecific antibody, diabody, BiTE antibody, trispecific Antibodies and / or tetraspecific antibodies, as well as fragments thereof. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten mammalen Immunzelle einem der vorherigen Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Photosensibilisator bevorzugt ein Hämatoporphyrin, Chlorin, Bacteriochlorin, Phthalocyanin, Benzoporphyrin-Derivat, 5-Aminolaevulinsäure (ALA) oder -ester, Hypericin, Purpurin, Porphycen, Indocyaningrün (ICG), sowie deren Derivate ist.Method for producing a modified mammalian immune cell according to one of the preceding claims 9 or 10, characterized in that the photosensitizer preferably a hematoporphyrin, chlorin, bacteriochlorin, phthalocyanine, benzoporphyrin derivative, 5-aminolevulinic acid (ALA) or esters, hypericin, purpurin, porphycene , Indocyanine green (ICG), as well as their derivatives.
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