DE102012101344A1

DE102012101344A1 - Optical scanning microscope with two scanning units

Info

Publication number: DE102012101344A1
Application number: DE201210101344
Authority: DE
Inventors: Günter K. Auernhammer; Marcel Roth; Hans-Jürgen Butt
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2013-08-22
Also published as: WO2013124107A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein optisches Rastermikroskop sowie auf eine Verwendung dieses Optisches Rastermikroskops zum Abrastern einer zu untersuchenden Probe mit mindestens einer Lichtquelle zum Aussenden einer Lesestrahlung, einem einen Lesestrahlengang und einen Detektionsstrahlengang separierenden Strahlteiler, einer im Lesestrahlengang der Probe vorgeschaltet angeordneten Abbildungsscaneinheit und zumindest einem Abbildungsobjektiv zum Abrastern der Probe durch die Lesestrahlung, und einer dem Strahlteiler im Detektionsstrahlengang nachgeschaltet angeordneten Detektionsscaneinheit mit zumindest einer Detektionsoptik, um die Detektionsstrahlung auf einen Detektor zu fokussieren und zu rastern.The invention relates to an optical scanning microscope and to a use of this optical scanning microscope for scanning a sample to be examined with at least one light source for emitting a reading radiation, a read beam path and a detection beam path separating beam splitter, an upstream in the reading beam path of the sample arranged Bildscaneinheit and at least one An imaging objective for scanning the sample by the reading radiation, and a detection scanning unit arranged downstream of the beam splitter in the detection beam path, having at least one detection optical system for focusing and scanning the detection radiation onto a detector.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein optisches Rastermikroskop und eine Verwendung eines optischen Rastermikroskops zum dreidimensionalen Abrastern einer zu untersuchenden Probe gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1 sowie gemäß Anspruch 20. The present invention relates to a scanning optical microscope and a use of a scanning optical microscope for three-dimensional scanning of a sample to be examined according to the preamble of claim 1 and according to claim 20.

Die aus dem allgemeinen Stand der Technik bekannten optischen Rastermikroskope, welche insbesondere auch als konfokalen Mikroskope ausgebildet sein können, können sich folglich durch einen gleichnamigen konfokalen Aufbau aus Linsen und Lochblenden auszeichnen, d.h., dass die Lochblenden und das Abbildungsobjektiv derart angeordnet sind, dass diese zueinander konjugierte Brennpunkte besitzen. Die Probe selbst befindet sich in einem dem Abbildungsobjektiv nachgelagerten Brennpunkt, welche dort vorzugsweise in allen drei Raumrichtungen gerastert wird. Folglich ermöglicht ein derartiges konfokal ausgestaltetes Mikroskop eine Punktbeleuchtung und -detektion der Probe. Mittels eines geeignetes Rasterverfahren und einer entsprechend dazugehörigen elektronischen Auswertung kann die Probe in mehreren Raumdimensionen abgebildet werden. Demzufolge kann mit handelsüblichen konfokalen Mikroskopen eine Ortsauflösung bestenfalls von ca. 200nm lateral und beispielsweise 500nm longitudinal erreicht werden. The known from the general state of the art optical scanning microscopes, which may be formed in particular as confocal microscopes, can thus be characterized by a like confocal structure of lenses and pinholes, ie, that the pinhole and the imaging lens are arranged such that these to each other possess conjugate foci. The sample itself is located in a focal point downstream of the imaging objective, which is preferably scanned there in all three spatial directions. Consequently, such a confocal designed microscope allows spot illumination and detection of the sample. By means of a suitable screening method and a correspondingly associated electronic evaluation, the sample can be imaged in several spatial dimensions. Consequently, with local confocal microscopes, a spatial resolution of at best approximately 200 nm laterally and, for example, 500 nm longitudinally can be achieved.

Damit ermöglichen die aus dem allgemeinen Stand der Technik bekannten konfokalen Mikroskope die zerstörungsfreien dreidimensionalen Aufnahmen von Strukturen einer zu untersuchenden Probe, wobei diese Probe dabei beispielsweise mittels eines Laserstrahles punktweise abgerastert wird, um beispielsweise eine Fluoreszenz in der Probe anzuregen. Diese Fluoreszenz wird für jeden Punkt der Probe detektiert, so dass insbesondere die Zeitauflösung eines konfokalen Mikroskops über die Aufnahmezeit pro Bildpunkt an die Anzahl der Bildpunkte gekoppelt ist. Thus, the known from the general state of the art confocal microscopes allow the non-destructive three-dimensional images of structures of a sample to be examined, this sample is scanned pointwise, for example by means of a laser beam, for example, to stimulate fluorescence in the sample. This fluorescence is detected for each point of the sample, so that in particular the time resolution of a confocal microscope is coupled to the number of pixels over the recording time per pixel.

Demnach ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein optisches Rastermikroskop zur Verfügung zu stellen, mittels welchem gleichzeitig eine sehr hohe Ortsauflösung und eine sehr hohe Zeitauflösung ermöglicht werden kann. Accordingly, it is the object of the present invention to provide an optical scanning microscope, by means of which at the same time a very high spatial resolution and a very high time resolution can be made possible.

Folglich ist es denkbar, dass das erfindungsgemäße optische Rastermikroskop ein konfokales Mikroskop bzw. ein Konfokalmikroskop ist. Consequently, it is conceivable that the optical scanning microscope according to the invention is a confocal microscope or a confocal microscope.

D.h., dass es vornehmlich ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist insbesondere konfokale Bilder mit einer großen Anzahl an Bildpunkten je abgebildeter Ebene (z.B. 1000 × 1000), und/oder mit einer hohen Bildrate aufzeichnen zu können, ohne dabei durch die Aufnahmezeit pro Bildpunkt limitiert zu sein. That is, it is primarily an object of the present invention, in particular, to be able to record confocal images with a large number of pixels per mapped plane (eg 1000 × 1000) and / or with a high frame rate without being limited by the acquisition time per pixel be.

Diese Aufgabe löst die vorliegende Erfindung mittels eines optischen Rastermikroskops gemäß dem Anspruch 1 sowie mittels einer Verwendung des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops gemäß Anspruch 20. Vorteilhafte Ausführungsformen und Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche. This object is achieved by the present invention by means of an optical scanning microscope according to claim 1 and by means of a use of the optical scanning microscope according to the invention according to claim 20. Advantageous embodiments and further developments are the subject of the dependent claims.

Zwar sind auch weitestgehend konfokale Mikroskope bekannt, welche beispielsweise eine erhöhter Zeitauflösung realisieren könnten, jedoch weisen diese daneben erhebliche Nachteile auf, wie im Folgenden beschrieben wird:
Bei der Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit Nipkow-Scheibe (RSOM) wird beispielsweise durch die Löcher bzw. Mikrolinsen einer im konfokalen Mikroskop verwendeten Nipkow-Scheibe der einfallende Laserstrahl in viele parallele Strahlen zerlegt, welche durch die Rotation der Scheibe die Probe entlang von Kreissegmenten abrastern. Mit Hilfe eines wellenlängenabhängigen Spiegels wird dann das entstehende konfokale Bild direkt auf einen CCD-Chip (charge coupled device chip – ladungsgekoppelter Bauteilchip) geschrieben. Dadurch kann eine Zeitauflösung von ca. 50 bis 100 zweidimensionalen Bildern pro Sekunde bei maximal 1000 × 1000 Bildpunkten ermöglicht werden. Anstelle der benannten rotierenden Nipkow-Scheibe kann der Laserstrahl auch mittels eines Arrays aus Mikrolinsen aufgespalten werden, wobei zumindest etwas mehr als 100 Bilder pro Sekunde erreicht werden können. Jedoch können derartig konstruierte Zugänge bzw. Systeme sehr leicht zu Wechselwirkungen, dem sogenannten „Cross-Talk“ zwischen den verschiedenen Lesestrahlen bzw. Anregerstrahlen führen, so dass Fluoreszenzlicht aus dem Fokus eines Strahls in einen benachbarten Detektionspfad eintreten kann, wodurch insbesondere bei einem Abrastern von stark fluoreszierenden Proben die Auflösung erheblich eingeschränkt wird. Although confocal microscopes are known to a great extent as well, which could realize, for example, an increased time resolution, they also have considerable disadvantages, as will be described below:
When using a confocal microscope with Nipkow disk (RSOM), for example, through the holes or microlenses of a Nipkow disk used in the confocal microscope, the incident laser beam is split into many parallel beams, which scan the sample along circular segments by the rotation of the disk , With the aid of a wavelength-dependent mirror, the resulting confocal image is then written directly onto a CCD chip (charge coupled device chip). This allows a time resolution of about 50 to 100 two-dimensional images per second with a maximum of 1000 × 1000 pixels are possible. Instead of the named rotating Nipkow disc, the laser beam can also be split by means of an array of microlenses, whereby at least a little more than 100 images per second can be achieved. However, such designed accesses or systems can very easily lead to interactions, the so-called "cross-talk" between the various read beams or exciter beams, so that fluorescent light from the focus of a beam can enter an adjacent detection path, which in particular in a scanning of strongly fluorescent samples, the resolution is severely limited.

Zum Scannen eines einzigen Lesestrahls bzw. Anregerstrahls werden beispielsweise resonante Spiegel oder akusto-optische Deflektoren in den entsprechenden handelsüblichen konfokalen Mikroskopen eingesetzt, wobei die konfokale Information hierbei auf einen Punktdetektor geschrieben wird. Demzufolge ist die zeitliche Auflösung bereits durch die Geschwindigkeit des Punktdetektors limitiert, so dass die schnellsten konfokalen Mikroskope dieser Art lediglich ca. 50 zweidimensionale Bilder mit maximal ca. 1000 × 1000 Bildpunkten pro Sekunde ermöglichen. Bei dem Versuch eine höhere Zeitauflösung zu ermöglichen, müsste der Detektor nahe der Sättigung betrieben werden, was jedoch wiederum negative Auswirkungen auf die Bildqualität hat, so dass höchste Geschwindigkeiten lediglich mit einer geringen Bildauflösung einhergehen. For scanning a single read beam or exciter beam, for example, resonant mirrors or acousto-optic deflectors are used in the corresponding commercially available confocal microscopes, the confocal information in this case being written on a point detector. Consequently, the temporal resolution is already limited by the speed of the point detector, so that the fastest confocal microscopes of this type allow only about 50 two-dimensional images with a maximum of about 1000 × 1000 pixels per second. In an attempt to enable a higher time resolution, the detector would have to be operated near saturation, which in turn has negative effects on the image quality, so that highest speeds are associated with only a low image resolution.

Demnach ist es ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung eine maximale zeitliche und räumliche Auflösung ohne die oben genannten Nachteile zu ermöglichen. Accordingly, it is a further object of the present invention to provide maximum temporal and spatial resolution without the aforementioned disadvantages.

Zur Erreichung der benannten Ziele bzw. zur Erfüllung der benannten Aufgabe wird folglich ein optisches Rastermikroskop zum Abrastern einer zu untersuchenden Probe in vorzugsweise bis zu drei Raumrichtungen beansprucht, mit mindestens

– einer Lichtquelle zum Aussenden einer Lesestrahlung,
– einem einen Lesestrahlengang und einen Detektionsstrahlengang separierenden Strahlteiler,
– einer im Lesestrahlengang der Probe vorgeschaltet angeordneten Abbildungsscaneinheit und zumindest einem Abbildungsobjektiv zum Abrastern der Probe durch die Lesestrahlung, sowie
– einer dem Strahlteiler im Detektionsstrahlengang nachgeschaltet angeordneten Detektionsscaneinheit mit einer Detektionsoptik, um die Detektionsstrahlung auf einen Detektor zu fokussieren.

In order to achieve the stated objectives or to achieve the stated object, a scanning optical microscope for scanning a sample to be examined is claimed in preferably up to three spatial directions, with at least

A light source for emitting a reading radiation,
A beam splitter separating a read beam path and a detection beam path,
An image scanning unit arranged upstream in the reading beam path of the sample and at least one imaging objective for scanning the sample by the reading radiation, and
A detection scanning unit arranged downstream of the beam splitter in the detection beam path, with detection optics in order to focus the detection radiation on a detector.

Vorzugsweise weist das erfindungsgemäße optische Rastermikroskop, insbesondere in der Ausführungsform eines Konfokalmikroskopes eine im Detektionsstrahlengang und zu einem Fokus des Abbildungsobjektives optisch konjugiert angeordneten Detektionsstrahlen-Lochblende auf, welche insbesondere im Fall einer Reflexions- oder Ein-Photonen-Fluoreszenz-Messung die Auflösung vorteilhaft erhöht. The optical scanning microscope according to the invention, in particular in the embodiment of a confocal microscope, preferably has a detection beam aperture which is optically conjugate in the detection beam path and to a focus of the imaging objective, which advantageously increases the resolution, in particular in the case of a reflection or single-photon fluorescence measurement.

Vorzugsweise weist die Lichtquelle die Möglichkeit auf die Wellenlänge der Lesestrahlung bzw. des Lesestrahls im Wesentlichen schnell zu ändern. Preferably, the light source has the possibility to change the wavelength of the reading radiation or the reading beam substantially quickly.

Es ist des Weiteren denkbar, dass die Lichtquelle eine im Wesentlichen aus einem Punkt kommende Lesestrahlung, welche beispielsweise auch als punktförmige Lesestrahlung bezeichnet werden kann, aussendet, wobei es zudem auch möglich ist, dass die Lichtquelle parallele Lichtstrahlen aussendet. It is furthermore conceivable that the light source emits a reading radiation substantially coming from a point, which can for example also be referred to as punctiform reading radiation, it being also possible for the light source to emit parallel light beams.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine weitere im Lesestrahlengang der Lichtquelle nachgeschaltet angeordnete Lochblende, nämlich die Lesestrahlen-Lochblende zum Erzeugen einer im Wesentlichen punktförmigen Lesestrahlung angeordnet. Demnach wird die durch die Lichtquelle auf die Lesestrahlen-Lochblende aufgebrachte Lesestrahlung lediglich durch eine vornehmlich kreisförmig gestaltete Öffnung bzw. Durchgangsbohrung der Lesestrahlen-Lochblende geleitet, um eine definiert geformte Lesestrahlung zu erzeugen. Es ist jedoch auch denkbar, dass die Öffnung der Lesestrahlen-Lochblende eine andere Gestalt, wie beispielsweise eine schlitzförmige Gestalt, eine ovale Gestalt, eine eckige Gestalt usw. aufweist. In a preferred embodiment, a further arranged in the reading beam path of the light source arranged aperture, namely the reading beam aperture plate for generating a substantially punctiform reading radiation. Thus, the read radiation applied by the light source to the read beam aperture is directed only through a primarily circular aperture or throughbore of the read beam aperture to produce a defined shaped read radiation. However, it is also conceivable that the opening of the reading beam aperture has a different shape, such as a slit-like shape, an oval shape, an angular shape, etc.

Des Weiteren ist es denkbar, dass das erfindungsgemäße optische Rastermikroskop eine der Lesestrahlen-Lochblende nachgeschaltet angeordnete Strahlaufweitungseinrichtung zum Aufweiten der punktförmigen und/oder parallelen Lesestrahlung aufweist. Furthermore, it is conceivable that the optical scanning microscope according to the invention has a beam expander arranged downstream of the read beam aperture in order to expand the punctiform and / or parallel read radiation.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist es denkbar, dass der Strahlteiler auch wellenlängen-selektiv ausgeführt ist, insbesondere dann, wenn für die Detektion bzw. die Detektionsstrahlung eine andere Wellenlänge als für den Lesestrahl bzw. die Lesestrahlung bzw. die Anregerstrahlung gewählt wird. In a further preferred embodiment, it is conceivable that the beam splitter is also designed to be wavelength-selective, in particular when a different wavelength than for the read beam or the read radiation or the exciter radiation is selected for the detection or the detection radiation.

Die Abbildungsscaneinheit ist bevorzugt geeignet, um einen Fokus des Lesestrahls bzw. der Lesestrahlung in mindestens einer und vorzugsweise in zwei und besonders bevorzugt in drei Raumrichtung(en) durch die Probe zu bewegen. The image scanning unit is preferably suitable for moving a focus of the reading beam or reading radiation through the sample in at least one and preferably in two and particularly preferably in three spatial directions.

Vorzugsweise weist die erste dreidimensionale Scaneinheit bzw. die dreidimensionale Abbildungsscaneinheit eine erste Ablenkeinheit, nämlich die zweidimensionale Abbildungsablenkeinheit, deren Achsen mit verschiedenen Frequenzen betrieben werden, um eine durch eine schnelle und eine mittlere Achse aufgespannte Ebene abzurastern, eine nachgelagerte Optik, nämlich die Abbildungsoptik, und/oder eine zweite Ablenkeinheit, nämlich die eindimensionale Abbildungsablenkeinheit, welche eine zu der Ebene senkrecht ausgerichtete langsame Achse realisiert, auf. The first three-dimensional scanning unit or the three-dimensional image scanning unit preferably has a first deflection unit, namely the two-dimensional imaging deflection unit, whose axes are operated at different frequencies in order to scan a plane spanned by a fast and a central axis, downstream optics, namely the imaging optics, and or a second deflection unit, namely the one-dimensional image deflection unit, which realizes a slow axis oriented perpendicular to the plane.

Die der zweidimensionalen Abbildungsablenkeinheit nachgelagerte Abbildungsoptik, welche bevorzugt ein Bestandteil der zweidimensionalen Abbildungsscaneinheit ist, ist vorzugsweise auf die Geometrie des gesamten Aufbaus der Abbildungsscaneinheit, die Strahleigenschaften des Lese- und des Detektionsstrahls bzw. der Lese- und der Detektionsstrahlung, die Eigenschaften der Abbildungsablenkeinheit(en) und/oder die Eigenschaften des Abbildungsobjektivs abgestimmt. Bevorzugt wird die der zweidimensionalen Abbildungsablenkeinheit nachgeschaltet angeordnete Abbildungsoptik derart ausgelegt, dass die Probe in einer Ebene senkrecht zur Stahlrichtung (xy-Ebene) abgerastert wird, wobei diese Ebene beispielsweise durch die eindimensionale Abbildungsablenkeinheit auch in der Strahlrichung (z-Richtung) verschoben werden kann. The imaging optics downstream of the two-dimensional image deflection unit, which is preferably a component of the two-dimensional image scanning unit, is preferably based on the geometry of the entire structure of the image scanning unit, the beam properties of the reading and the detection beam and the reading and detection radiation, the properties of the image deflection unit (s ) and / or the properties of the imaging lens. Preferably, the imaging optics arranged downstream of the two-dimensional image deflection unit are designed such that the sample is scanned in a plane perpendicular to the steel direction (xy plane), whereby this plane can also be displaced in the beam direction (z direction) by the one-dimensional image deflection unit.

Die zweite Scaneinheit bzw. die Detektionsscaneinheit weist vorzugsweise eine dritte Ablenkeinheit, nämlich die Detektionsablenkeinheit und vorzugsweise eine dieser Detektionsablenkeinheit im Detektionsstrahlengang nachgeschaltet angeordneten Optik, nämlich die Detektionsoptik, um die Detektionsstrahlung auf einen der Detektionsscaneinheit im Detektionsstrahlengang nachgeschaltet angeordneter Detektor zu fokussieren, auf. The second scanning unit or the detection scanning unit preferably has a third deflection unit, namely the detection deflection unit and preferably one of these detection deflection unit downstream in the detection beam path arranged optics, namely, the detection optics to focus the detection radiation on one of the detection scan in the detection beam path arranged downstream detector on.

Der ein- oder zweidimensionale Detektor befindet sich bevorzugt in der Fokusebene der Detektionsoptik und besteht vorzugsweise aus mehreren Bildpunkten entlang jeder benutzbaren Raumrichtung (bevorzugt ca. 500 × 500, besser 1000 × 1000 Bildpunkte). The one- or two-dimensional detector is preferably located in the focal plane of the detection optics and preferably consists of several pixels along each usable spatial direction (preferably approximately 500 × 500, better 1000 × 1000 pixels).

Bevorzugt weisen die Detektionsablenkeinheit und der Detektor eine vergleichbare Anzahl an Dimensionen auf. D.h., dass beispielsweise eine eindimensionale Detektionsablenkeinheit mit einem eindimensionalen Detektor (Liniendetektor), bevorzugt aber eine zweidimensionale Detektionsablenkeinheit mit einem zweidimensionalen Detektor (Flächendetektor) benutzt werden kann. Preferably, the detection deflection unit and the detector have a comparable number of dimensions. That is, for example, a one-dimensional detection deflection unit having a one-dimensional detector (line detector), but preferably a two-dimensional detection deflection unit having a two-dimensional detector (area detector) can be used.

Die der Detektionsablenkeinheit nachgelagerte Detektionsoptik bzw. deren Ausgestaltung ist davon vorteilhaft im Wesentlichen unbeeinflusst, wobei diese jedoch bevorzugt beispielsweise auf die Geometrie des Aufbaus, die Strahleigenschaften des Detektionsstrahls und/oder die Eigenschaften der Detektionsablenkeinheit angepasst ist. Vorteilhaft ist diese Detektionsoptik derart ausgelegt, dass der Detektionsstrahl punktförmig auf den Detektor fokussiert wird, wobei es vornehmlich mittels der Detektionsablenkeinheit ermöglicht wird diesen Fokuspunkt über den Detektor zu rastern. Vorzugsweise liegt der Fokus der Detektionsoptik immer in der Ebene des Detektors. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der Durchmesser des Fokuspunktes der Detektionsstrahlung auf dem Detektor mit der Größe eines Bildpunktes des Detektors vergleichbar ist. The detection optical unit downstream of the detection deflection unit or its configuration is advantageously substantially unaffected, but this is preferably adapted, for example, to the geometry of the structure, the beam properties of the detection beam and / or the properties of the detection deflection unit. Advantageously, this detection optics is designed in such a way that the detection beam is focused in a punctiform manner on the detector, whereby it is primarily possible by means of the detection deflection unit to scan this focal point over the detector. Preferably, the focus of the detection optics is always in the plane of the detector. It is advantageous if the diameter of the focal point of the detection radiation on the detector is comparable to the size of a pixel of the detector.

Die Rasterbewegung des Fokuspunktes in der Probe ergibt vorteilhaft, dass die Achsen der zweidimensionalen Abbildungsablenkeinheit bevorzugt mit verschiedenen Frequenzen betrieben werden. Somit wird vorteilhaft eine schnelle Zeilenbewegung realisiert, welche auch als „schnelle“ Achse bezeichnet wird. Vorteilhaft wird diese Zeilenbewegung durch eine weiter Achse ergänzt, die den Fokus zu einer der schnellen Achse senkrecht orientierten Achse bewegt und so aus einzelnen gescannten Zeilen eine gescannte Ebene (xy-Ebene) erzeugt. Im Weiteren wird diese zweite Achse als „mittlere“ Achse bezeichnet. D.h., dass bevorzugt mittels der zweidimensionalen Abbildungsablenkeinheit eine bevorzugt durch die schnelle Achse und die mittlere Achse in xy-Richtung aufgespannte Ebene abgerastert wird. The raster movement of the focal point in the sample advantageously results in that the axes of the two-dimensional image deflection unit are preferably operated at different frequencies. Thus, advantageously, a fast line movement is realized, which is also referred to as a "fast" axis. Advantageously, this line movement is supplemented by a further axis, which moves the focus to an axis oriented perpendicular to the fast axis and thus generates a scanned plane (xy-plane) from individual scanned lines. In the following, this second axis is referred to as the "middle" axis. That is, it is preferable to scan, by means of the two-dimensional image deflection unit, a plane which is preferably spanned by the fast axis and the central axis in the xy direction.

Des Weiteren ist vorteilhaft, beispielsweise mittels der eindimensionalen Abbildungsscaneinheit, eine der schnellen und mittleren Achse zusätzliche dritte Achse hinzugefügt, welche auch als „langsame“ Achse bezeichnet wird, die den Fokus senkrecht zu der bzw. den gescannten Ebene(n) bewegt und somit vorteilhaft das Abrastern eines Probenvolumens ermöglicht. D.h., dass bevorzugt eine zu der durch die schnelle und mittlere Achse „erzeugte“ Ebene senkrecht stehende langsame Achse realisiert wird, welche sich folglich im Wesentlichen in z-Richtung bewegt bzw. erstreckt. Furthermore, it is advantageous, for example by means of the one-dimensional image scanning unit, to add one additional axis to the fast and central axis, which is also referred to as a "slow" axis, which moves the focus perpendicular to the scanned plane (s) and thus advantageously allows the scanning of a sample volume. That is, it is preferable to realize a slow axis orthogonal to the plane "generated" by the fast and middle axes, which thus substantially moves in the z-direction.

Analog zur Abbildungsscaneinheit weist vornehmlich auch die Detektionsscaneinheit, sofern diese zumindest zweidimensional ausgelegt ist, bevorzugt eine schnelle und eine langsame Achse auf. Analogously to the image scanning unit, the detection scanning unit, if it is designed at least two-dimensionally, preferably also has a fast and a slow axis.

Der Detektor weißt bevorzugt die Fähigkeit auf, die einfallenden Photonen in ein elektrisch messbares Signal umzuwandeln, dieses Signal pro Bildpunkt zu integrieren und bis zum Ausleseprozess zu speichern. Folglich wird diese Information vornehmlich in einem Ausleseprozess für alle Bildpunkte gesammelt an eine Steuerelektronik bzw. Steuerungseinrichtung weitergegeben. Beispiele für derartige Detektoren sind u.a. CCD-Sensoren (charge coupled device sensors – ladungsgekoppelter Bauteil-Sensoren) oder CMOS-Sensoren (complementary metal oxide semiconductor sensor – komplementärer Metalloxid-Halbleiter-Sensor). The detector preferably has the ability to convert the incident photons into an electrically measurable signal, integrate that signal per pixel, and store it until the readout process. Consequently, this information is mainly passed on in a read-out process for all pixels to a control electronics or control device. Examples of such detectors are i.a. CCD sensors (charge coupled device sensors) or CMOS sensors (complementary metal oxide semiconductor sensor).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das der Detektionsablenkeinheit nachgelagerte Objektiv bzw. die Detektionsoptik eine F-Theta-Optik, welche sich insbesondere dadurch auszeichnet, dass der Detektionsstrahlfokus im gesamten der Detektionsscaneinheit zugänglichen Winkelbereich (dem Scanfeld) in einer Ebene und bevorzugt der Ebene des Detektors gehalten wird, so dass diese Detektionsoptik beispielsweise auch Planfeldoptik genannt wird. Bevorzugt wird sowohl von der Abbildungsscaneinheit als auch von der Detektionsscaneinheit der zugehörige Fokus in einer Ebene bewegt. In a preferred embodiment, the objective downstream of the detection deflection unit or the detection optics is an F-theta optic, which is characterized in particular in that the detection beam focus is maintained in the entire angular range (the scan field) accessible to the detection scan unit in a plane and preferably the plane of the detector is, so that this detection optics, for example, also called plan field optics. Preferably, both the image scanning unit and the detection scanning unit move the associated focus in a plane.

Auch einsetzbar bei dem erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskop sind beispielsweise telezentrische F-Theta Objektive, durch welche der Laserstrahlfokus im gesamten Scanfeld nicht nur in einer Ebene gehalten wird, sondern zudem wird weiterhin der Laserstrahl senkrecht zum Scanfeld gehalten. For example, telecentric F-theta lenses can also be used in the optical scanning microscope according to the invention, by means of which the laser beam focus is not kept in the entire scan field in one plane, but furthermore the laser beam is kept perpendicular to the scan field.

Vorteilhaft wird eine hohe Zeitauflösung und insbesondere auch eine hohe Ortsauflösung ermöglicht, wenn beispielsweise das zu detektierende Licht, d.h., dass z.B. die von der Probe abgestrahlte Fluoreszenzstrahlung oder die von der Probe reflektierte Strahlung, welche hierbei auch als Detektionsstrahlung bezeichnet wird, mittels einer von der Abbildungsscaneinheit beabstandet angeordneten Detektionsscaneinheit und insbesondere einer Detektionsablenkeinheit und einer dazu optimierten Detektionsoptik, wie beispielsweise der oben aufgeführten F-Theta-Optik auf einen Linien- oder Flächendetektor fokussiert bzw. aufgebracht wird. Advantageously, a high time resolution and in particular also a high spatial resolution is made possible if, for example, the light to be detected, ie, for example, the fluorescence emitted by the sample or the radiation reflected by the sample, which is also referred to herein as detection radiation, by means of one of An imaging scan unit spaced detection scan unit and in particular a detection deflection unit and a detection optics optimized for this purpose, such as the above-mentioned F- Theta optics is focused or applied to a line or area detector.

Die Kombination von Abbildungsscaneinheit und Detektionsscaneinheit bewirkt hierbei vorteilhaft, dass jeder Bildpunkt des Linien- oder Flächendetektors einer Position in der Probenebene entspricht. D.h., sobald ein zweidimensionales Bild der Probe folglich auf den Flächendetektor aufgerastert bzw. geschrieben wurde, wird diese gespeicherte Information als gesamtes zweidimensionales Bild von einer entsprechenden Recheneinheit ausgelesen. Im Fall eines Liniendetektors wird das Bild der Probe zeilenweise auf den Liniendetektor aufgerastert bzw. geschrieben und dieser nach jeder Zeile ausgelesen. In this case, the combination of image scanning unit and detection scanning unit advantageously has the effect that each pixel of the line or area detector corresponds to a position in the sample plane. That is, once a two-dimensional image of the sample has been rasterized onto the area detector, this stored information is read out as a whole two-dimensional image from a corresponding arithmetic unit. In the case of a line detector, the image of the sample is rasterized line by line on the line detector and read out after each line.

Dadurch wird vorteilhaft die Taktrate zum Lesen der Daten durch die Anzahl der Bildpunkte auf dem Linien- bzw. Flächendetektor dividiert. Des Weiteren wird durch die Verwendung von vornehmlich hocheffizienten Linien- bzw. Flächendetektoren und/oder durch die Benutzung großer oder auch mehrerer Detektor-Bildpunkte pro Bildpunkt des übertragen bzw. gespeicherten Bilds (wenn insgesamt dreidimensional gerastert wird entspricht das einem Volumenelement-Voxel – der Probe) die Zählrate bzw. Empfindlichkeit erhöht. This advantageously divides the clock rate for reading the data by the number of pixels on the line or area detector. Furthermore, the use of primarily highly efficient line or area detectors and / or by the use of large or multiple detector pixels per pixel of the transmitted or stored image (if a total of three-dimensional rasterized corresponds to a voxel volume element - the sample ) increases the count rate or sensitivity.

Es ist anzumerken, dass der Liniendetektor bzw. der Flächendetektor selbst nicht zwingend auf einer CCD- oder CMOS-Technologie basieren muss, sondern dass vielmehr jede ein- oder zweidimensionale Matrix von Punktdetektoren mit hinreichender Sensitivität und räumlicher sowie zeitlicher Auflösung Verwendung finden kann. It should be noted that the line detector or the area detector itself need not necessarily be based on a CCD or CMOS technology, but rather that any one- or two-dimensional matrix of point detectors with sufficient sensitivity and spatial and temporal resolution can be used.

Indem beispielsweise der Liniendetektor oder der Flächendetektor zweigeteilt ausgeführt sind, ist es möglich Todzeiten, welche durch das Auslesen des Liniendetektors bzw. des Flächendetektors entstehen können und unvorteilhaft zu einer Erniedrigung bzw. Verringerung der Bildrate führen können, zu vermeiden. D.h., dass vorteilhaft der Liniendetektor bzw. der Flächendetektor zumindest zwei (Teil-)bereiche aufweist, welche getrennt voneinander ausgelesen werden können, so dass beispielsweise die zum Beschreiben des ersten Bereichs des Detektor erforderliche Zeitdauer verwendet werden kann, um den zweiten – bereits beschriebenen – Bereich des Detektors auszulesen. Ist der erste Bereich des Detektors beschreiben und der zweite Bereich des Detektors ausgelesen, erfolgt wiederum ein Beschreiben des zweiten Bereichs des Detektors und im Wesentlichen gleichzeitig ein Auslesen des ersten Bereichs des Detektors. By, for example, the line detector or the area detector are designed in two parts, it is possible to avoid dead times, which can arise due to the readout of the line detector or the area detector and can unfavorably lead to a reduction or reduction of the frame rate. That is, advantageously, the line detector or the area detector has at least two (sub-) areas which can be read out separately from one another, so that, for example, the time required to describe the first area of the detector can be used for the second - already described - Range of the detector. If the first area of the detector is described and the second area of the detector is read out, the second area of the detector is in turn written on and substantially the same time a readout of the first area of the detector takes place.

Zudem wäre es weiterhin denkbar anstatt eines Liniendetektors oder eines Flächendetektors mindestens zwei Photomultiplier zu verwenden, welche folglich abwechselnd zueinander belichtet und ausgelesen werden. D.h., während beispielsweise einer der Photomultiplier belichtet wird, wird der andere Photomultiplier ausgelesen, usw. In addition, it would also be conceivable to use at least two photomultipliers instead of a line detector or a surface detector, which are consequently exposed and read out alternately with respect to one another. That is, for example, while one of the photomultipliers is being exposed, the other photomultiplier is read out, and so on.

Wird die Detektionsstrahlung beispielsweise als Fluoreszenzlicht bzw. -strahlung umgesetzt (und nicht als Reflektionsstrahlung), ist der Strahlteiler vorzugsweise als wellenlängenselektiver dichroischer Strahlteiler bzw. als dichrioscher Spiegel realisiert. If the detection radiation is converted, for example, as fluorescent light or radiation (and not as reflection radiation), the beam splitter is preferably realized as a wavelength-selective dichroic beam splitter or as a dichroic mirror.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein im Detektionsstrahlengang der Detektionsscaneinheit vorgeschaltet angeordneter Sperrfilter, welcher die Wellenlänge der Lesestrahlung bzw. Anregerstrahlung herausfiltert, im erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskop angeordnet. In a further preferred embodiment, a blocking filter which is arranged upstream in the detection beam path of the detection scanning unit and filters out the wavelength of the reading radiation or exciting radiation is arranged in the optical scanning microscope according to the invention.

Bevorzugt umfasst die zur Abbildungsscaneinheit zugehörige Abbildungsoptik zumindest eine telezentrische Optik bzw. ein telezentrisches Objektiv, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Eintritts- und Austrittspupille im Unendlichen liegt. Des Weiteren ist der Abbildungsscaneinheit vorteilhaft zumindest ein Abbildungsobjektiv im Lesestrahlengang nachgeschaltet angeordnet. The imaging optics associated with the imaging scanning unit preferably comprise at least one telecentric lens or a telecentric lens, which is characterized in that the entrance and exit pupil lies at infinity. Furthermore, the imaging scanning unit is advantageously arranged downstream of at least one imaging objective in the read beam path.

In handelsüblichen konfokalen Mikroskopen wird bekannterweise zumeist die Fokusebene derart geändert, dass beispielsweise das Abbildungsobjektiv oder die Probe entlang der Strahlrichtung verschoben bzw. bewegt wird, so dass es jedoch bei einer hohen Bildrate zu mechanischen Störungen der Probe, ausgelöst durch Vibrationen entlang der Strahlrichtung, kommen kann. Um derartige Störungen zu vermeiden, ist es folglich vorteilhaft die Abbildungsscaneinheit derart zu gestalten, dass sich die im Lesestrahlengang direkt vor der Probe vorgeschaltet angeordnete Linse nicht bewegt, so dass bevorzug die Fokusebene (z-Komponente bzw. z-Position) in der Probe verändert wird, ohne die Probe und/oder das Abbildungsobjektiv zu bewegen. In conventional confocal microscopes, the focal plane is known to be changed in such a way that, for example, the imaging objective or the sample is moved or moved along the beam direction, so that at a high frame rate, mechanical disturbances of the sample caused by vibrations along the beam direction occur can. In order to avoid such interference, it is therefore advantageous to design the imaging scan unit such that the lens arranged in the read beam path directly in front of the sample does not move, so that the focal plane (z-component or z-position) in the sample changes without moving the sample and / or the imaging lens.

In dem erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskop ist die Veränderung der z-Komponente der Abbildungsscaneinheit beispielsweise mittels eines Zoomobjektivs realisierbar, welches bevorzugt zwischen der telezentrischen Optik bzw. der Abbildungsoptik und dem Abbildungsobjektiv angeordnet ist, um einen konvergenten bzw. divergenten Lesestrahl in das Abbildungsobjektiv zu leiten, um eine longitudinale Position (z-Position) einer Fokusebene der zu untersuchenden Probe zu verschieben. Das Zoomobjektiv ersetzt demnach vorzugsweise die eindimensionale Abbildungsablenkeinheit und die zugehörige Optik bzw. realisiert die eindimensionale Abbildungsablenkeinheit und die zugehörige Optik. In the confocal microscope according to the invention, the change of the z-component of the image scanning unit can be realized, for example, by means of a zoom lens, which is preferably arranged between the telecentric optical system and the imaging lens and the imaging objective, in order to guide a convergent or divergent reading beam into the imaging objective to shift a longitudinal position (z-position) of a focal plane of the sample to be examined. The zoom lens therefore preferably replaces the one-dimensional image deflection unit and the associated optics or realizes the one-dimensional image deflection unit and the associated optics.

Dabei ist es denkbar, dass die Linsen dieses Zoomobjektivs beispielsweise auf automatischen, wie beispielsweise piezomotorbetriebenen Positioniereinheiten montiert sind. D.h., dass die Linsen des Zoomobjektives beispielweise mittels beweglichen angeordneten Elementen bzw. Vorrichtungen, welche durch die Ansteuerung eines piezoelektrischen Motors bewegt werden, verschoben werden können. It is conceivable that the lenses of this zoom lens, for example, on automatic, such as piezomotor-driven Positioning units are mounted. That is, the lenses of the zoom lens can be displaced, for example, by means of movable elements moved by the driving of a piezoelectric motor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist für die Implementierung der z-Komponente der Abbildungsscaneinheit, d.h. für die Realisierung einer veränderbaren longitudinalen Position der Fokusebene eine elektrische Linse, welche mit oder auch ohne eine zugehörige Korrekturoptik ausgebildet ist, zwischen der Abbildungsoptik und dem Abbildungsobjektiv angeordnet, um einen konvergenten bzw. divergenten Lesestrahl in das Abbildungsobjektiv zu leiten, um eine longitudinale Position (z-Position) einer Fokusebene der zu untersuchenden Probe zu verschieben, so dass vorteilhaft eine Bewegung der letzten optischen Einheit vor der Probe, wie beispielsweise des Abbildungsobjektives vermieden werden kann. Die elektrische Linse ersetzt demnach vorzugsweise die eindimensionale Abbildungsablenkeinheit und die zugehörige Optik bzw. realisiert die eindimensionale Abbildungsablenkeinheit und die zugehörige Optik. In a further preferred embodiment, for the implementation of the z component of the image scan unit, i. for the realization of a variable longitudinal position of the focal plane, an electrical lens, which is formed with or without an associated correction optics, between the imaging optics and the imaging lens arranged to guide a convergent reading beam into the imaging lens to a longitudinal position ( z position) of a focal plane of the sample to be examined, so that advantageously a movement of the last optical unit in front of the sample, such as the imaging objective can be avoided. Accordingly, the electric lens preferably replaces the one-dimensional image deflection unit and the associated optics or realizes the one-dimensional image deflection unit and the associated optics.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Lichtquelle ein Laser, für beispielsweise eine kohärente Beleuchtung. Es ist jedoch auch denkbar, dass die Lichtquelle beispielsweise eine LED (Lichtemittierende Diode), eine Quecksilberdampflampe, eine Xenonlampe, eine Bogenlampe für eine inkohärente Beleuchtung oder ein anderes lichtstrahlenaussendendes Element ist. In a further preferred embodiment, the light source is a laser, for example, a coherent illumination. However, it is also conceivable that the light source is, for example, an LED (light-emitting diode), a mercury-vapor lamp, a xenon lamp, an arc lamp for incoherent illumination or another light-emitting element.

Dabei ist zu berücksichtigen, dass „Licht“ im Sinn des hier beschriebenen optischen Rastermikroskops nicht zwingend auf den sichtbaren Teil des elektromagnetischen Spektrums beschränkt ist. Vielmehr ist es auch möglich einen anderen, nicht sichtbaren Teil des elektromagnetischen Spektrums als Anreger- bzw. Lesestrahlung und folglich als Detektionsstrahlung zu verwenden. In einem solchen Fall ist es beispielsweis möglich verschiedene optische Komponenten, wie beispielsweise Linsen abweichend bzw. alternativ auszulegen. D.h., dass folglich in einer entsprechenden Ausführungsform das gesamte optische Rastermikroskop anstelle von Linsen z.B. gekrümmte Spiegel, wie z.B. Hohlspiegel, oder Fresnel-Zonen-Platten aufweist. It should be noted that "light" in the sense of optical scanning microscope described here is not necessarily limited to the visible part of the electromagnetic spectrum. Rather, it is also possible to use another, non-visible part of the electromagnetic spectrum as exciter or reading radiation and consequently as detection radiation. In such a case, for example, it is possible to design different optical components, such as lenses, for example. That is, in a corresponding embodiment, therefore, the entire scanning optical microscope instead of lenses e.g. curved mirrors, e.g. Concave mirror, or Fresnel zone plates.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das optische Rastermikroskop eine zwischen dem Strahlteiler und der Detektionsstrahlen-Lochblende im Detektionsstrahlengang angeordnete erste Linse zur Ermöglichung der Konfokalität der Detektionsstrahlen-Lochblende zu einer Fokusebene der Probe auf. In a further preferred embodiment, the optical scanning microscope has a first lens arranged between the beam splitter and the detection beam aperture in the detection beam path for enabling the confocality of the detection beam aperture to a focal plane of the specimen.

Des Weiteren weist das optisches Rastermikroskop vorzugsweise eine zweite im Detektionsstrahlengang zwischen der Detektionsstrahlen-Lochblende und einem Element, welches beispielsweise ein Sperrfilter oder auch ein wellenlängen-dispersives Ablenkelement sein kann, angeordnete Linse, welche vornehmlich die Detektionsstrahlung parallelisiert, zum Weiterleiten der Detektionsstrahlung in die Detektionsscaneinheit auf. Furthermore, the optical scanning microscope preferably has a second lens arranged in the detection beam path between the detection beam aperture and an element, which may be, for example, a blocking filter or a wavelength-dispersive deflection element, which primarily parallelizes the detection radiation, for passing the detection radiation into the detection scanning unit on.

Vorzugsweise sind die Detektionsscaneinheit bzw. der Detektor derart mit der Abbildungsscaneinheit gekoppelt, dass die Bewegung(en) der Detektionsstrahlung bzw. des Detektionsstrahls entlang der Achse oder der Achsen, d.h. der schnellen und/oder langsamen Achse der Detektionsscaneinheit zumindest in Frequenz und Phase an die entsprechenden Bewegung der Lesestrahlung bzw. des Lesestrahls entlang der Achsen, d.h. der schnellen und/oder mittleren und/oder langsamen Achse der Abbildungsscaneinheit im Wesentlichen starr gekoppelt sind. Aus der Rasterbewegung des Lesestrahls durch die Probe ergibt sich, dass eine Achse mit der höchsten Frequenz schwingt. Diese schnelle Achse ist vorteilhaft immer die oder eine der in Frequenz und Phase gekoppelten Achse oder Achsen. Preferably, the detection scanning unit or the detector are coupled to the image scanning unit such that the movement (s) of the detection radiation and the detection beam along the axis or the axes, i. the fast and / or slow axis of the detection scan unit at least in frequency and phase to the corresponding movement of the read radiation and the read beam along the axes, i. the fast and / or middle and / or slow axis of the imaging scan unit are substantially rigidly coupled. The raster motion of the reading beam through the sample causes an axis to oscillate at the highest frequency. This fast axis is always advantageous or one of the coupled in frequency and phase axis or axes.

Die Kopplung der Bewegung der einen oder auch der mehreren Achsen der Abbildungsscaneinheit und der Detektionsscaneinheit in Frequenz und Phase schließt insbesondere ein, dass die Frequenzen in beiden Scaneinheiten im Wesentlichen verschieden bzw. unterschiedlich zueinander sein können, wobei jedoch vorteilhaft zumindest eine im Wesentlichen feste Frequenz- und Phasenbeziehung zwischen einer Achse oder mehreren Achsen der Abbildungsscaneinheit und der Detektionsscaneinheit besteht. Bevorzugt ist es denkbar das Frequenzverhältnis insbesondere der korrespondierenden Achsen ganzzahlig zu wählen, so dass es möglich ist beispielsweise zwei Zeilenbewegungen der Abbildungsscaneinheit auf eine Zeilenbewegung der Detektionsscaneinheit umzulegen. The coupling of the movement of the one or more axes of the image scanning unit and the detection scanning unit in frequency and phase includes, in particular, that the frequencies in both scanning units may be substantially different, but advantageously at least one substantially fixed frequency. and phase relationship between one or more axes of the image scanning unit and the detection scanning unit. It is preferably conceivable to select the frequency ratio in particular of the corresponding axes as an integer, so that it is possible, for example, to convert two line movements of the image scanning unit to one line movement of the detection scanning unit.

Unter Berücksichtigung, dass die Detektionsscaneinheit, welche das Bild vorzugsweise auf einen nicht-punkt-förmigen Detektor und insbesondere einen Linien- oder Flächendetektor aufbringt bzw. „schreibt“ und dessen Achse oder Achsen sich im Wesentlichen synchron zur Abbildungsscaneinheit bewegen soll(en), ist bevorzugt die schnellen Achse der Detektionsscaneinheit bzw. des Linien- oder Flächendetektors mit der schnellen Achse der Abbildungsscaneinheit synchronisiert. Eine derartige Synchronisation findet insbesondere in dem Fall statt, wenn als Detektor ein eindimensionales Array oder Liniendetektor verwendet wird und auch die Abbildungs- und/oder die Detektionsscaneinheit eindimensional ausgebildet ist. Considering that the detection scan unit, which preferably applies the image to a non-point-shaped detector and in particular a line or area detector, and whose axis or axes are to move substantially synchronously with the image scanning unit, is preferably synchronizes the fast axis of the detection scan unit or of the line or area detector with the fast axis of the image scan unit. Such a synchronization takes place in particular in the case when a one-dimensional array or line detector is used as the detector and also the imaging and / or the detection scan unit is formed one-dimensionally.

Anderenfalls, d.h., sofern als Detektionseinheit bzw. als Flächendetektor ein zweidimensionales Array verwendet wird und auch die Abbildungs- und/oder die Detektionsscaneinheit mindestens zweidimensional ausgebildet sind, ist vorzugsweise die schnelle Achse der Detektionsscaneinheit bzw. des Flächendetektors entsprechend mit der schnellen Achse der Abbildungsscaneinheit synchronisiert, und die langsame Achse der Detektionsscaneinheit bzw. des Flächendetektors entsprechend mit der langsamen Achse oder auch der mittleren Achse der Abbildungsscaneinheit synchronisiert. Otherwise, that is, if a two-dimensional array is used as the detection unit or area detector and the imaging and / or the detection scan unit are at least two-dimensional, preferably the fast axis of the detection scan unit or the area detector is synchronized with the fast axis of the image scan unit , and synchronizes the slow axis of the detection scan unit and the area detector, respectively, with the slow axis or even the center axis of the image scan unit.

D.h., dass vorzugsweise die schnelle Achse der Abbildungsscaneinheit mit der schnellen Achse der Detektionsscaneinheit synchronisiert ist, und dass die mittlere Achse der Abbildungsscaneinheit mit der langsamen Achse der Detektionsscaneinheit synchronisiert ist. That is, preferably, the fast axis of the image scan unit is synchronized with the fast axis of the detection scan unit, and the center axis of the image scan unit is synchronized with the slow axis of the detection scan unit.

Je nach Anwendungsgebiet und Dynamik, und insbesondere der maximal zugänglichen Frequenz der Scanbewegung der einzelnen Achsen der Abbildungs- und/oder Detektionsscaneinheit, ist es vorteilhaft möglich die Zuordnung der schnellen, und ggf. auch der langsamen Achse der Detektionsscaneinheit zu den Achsen der Abbildungsscaneinheit frei zu wählen. Beispielsweise kann im Fall einer zweidimensionalen Detektionseinheit bzw. eines zweidimensionalen Detektors die schnelle Achse beider Scaneinheiten (Detektionsscaneinheit und Abbildungsscaneinheit) eine zum Lesestrahl senkrechte Achse auf eine Achse des Detektors schreiben, die zweite Achse der Detektionsscaneinheit kann dagegen jedoch vornehmlich einer Achse senkrecht oder parallel zur optischen Achse in der Probe zugeordnet werden. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform besteht folglich die Möglichkeit Bilder der xy- oder der xz-Ebene der Probe auf den zweidimensionalen Detektor zu schreiben. Des Weiteren ist es vorteilhaft möglich den Achsen der Detektionsscaneinheit eine Kombination der Achsen der Abbildungsscaneinheit zuzuordnen, welche auf dem Detektor bzw. der Detektoreinheit abgebildet sind und im Wesentlichen nicht einer der Koordinatenebenen der Abbildungsscaneinheit entsprechen müssen. Derartige Umsetzungen bzw. Zuordnungen sind mittels der aus dem allgemeinen Stand der Technik bekannten konfokale Mikroskope, welche z.B. eine Vielzahl von Lesestrahlen aufweisen, wie dies beispielsweise das konfokale Mikroskop mit der Nipkow-Scheibe ermöglicht, nicht realisierbar. Depending on the field of application and dynamics, and in particular the maximum accessible frequency of the scanning movement of the individual axes of the imaging and / or detection scan unit, it is advantageously possible to freely assign the fast, and possibly also the slow, axis of the detection scan unit to the axes of the image scan unit choose. For example, in the case of a two-dimensional detection unit or a two-dimensional detector, the fast axis of both scan units (detection scan unit and imaging scan unit) can write an axis perpendicular to the read beam to an axis of the detector, while the second axis of the detection scan unit can be primarily perpendicular to or parallel to the optical axis Axis can be assigned in the sample. In a further advantageous embodiment, it is therefore possible to write images of the xy or the xz plane of the sample on the two-dimensional detector. Furthermore, it is advantageously possible to associate the axes of the detection scanning unit with a combination of the axes of the image scanning unit, which are imaged on the detector or the detector unit and do not essentially have to correspond to one of the coordinate planes of the image scanning unit. Such transpositions are by means of confocal microscopes known from the general state of the art, which e.g. have a variety of reading beams, as for example, the confocal microscope allows with the Nipkow disc, not feasible.

Vorzugsweise weisen die Abbildungsscaneinheit und/oder die Detektionsscaneinheit jeweils eine Ablenkeinheit zur Strahlablenkung und -justierung auf, um die aus der Abbildungsscaneinheit und/oder die aus der Detektionsscaneinheit austretende Strahlung in einem definierten und im Wesentlichen frei – zumindest innerhalb eines definierten Bereiches – wählbaren Winkel gegenüber der in die Scaneinheit eintretende Strahlung abzulenken. Der Winkelbereich des aus der jeweiligen Ablenkeinheit, wie der Abbildungsablenkeinheit und/oder der Detektionsablenkeinheit, austretenden Strahls kann um eine definierte und im Wesentlichen bevorzugt vorbestimmbare Einfallsrichtung herum zentriert oder auch gegen diese verdreht sein. Dabei sollte die Ablenkeinheit des Lichtstrahles bevorzugt nicht von der Wellenlänge des Lichts abhängen, da ansonsten eine Detektionsstrahlung mit einer anderer Wellenlänge als die des Lesestrahls, wie z.B. im Fall von Fluoreszenzlicht, unter einem anderen Winkel abgelenkt wird, als die Lesestrahlung selbst, also beispielsweise das Anregelicht. Ein derartiger Unterschied in der Ablenkung von Lesestrahl und Detektionsstrahl würde zu einer Reduktion der Auflösung führen, was sich wiederum negativ auf die Verwendung der entsprechenden Scaneinheit auswirkt. Preferably, the image scanning unit and / or the detection scanning unit each have a deflection unit for beam deflection and adjustment in order to select the radiation emerging from the image scanning unit and / or the detection scanning unit in a defined and essentially free angle, at least within a defined range to divert the radiation entering the scanning unit. The angular range of the beam emerging from the respective deflection unit, such as the imaging deflection unit and / or the detection deflection unit, can be centered around or also rotated about a defined and substantially preferably predeterminable direction of incidence. In this case, the deflection unit of the light beam should preferably not depend on the wavelength of the light, since otherwise a detection radiation with a different wavelength than that of the reading beam, such. in the case of fluorescent light, is deflected at a different angle than the reading radiation itself, so for example the Anleichicht. Such a difference in the deflection of reading beam and detection beam would lead to a reduction of the resolution, which in turn has a negative effect on the use of the corresponding scanning unit.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die Abbildungsscaneinheit und/oder die Detektionsscaneinheit, welche beispielsweise auf der Beugung des Lichtstrahls basieren einen akusto-optischen oder auch elektro-optischen Deflektor auf. In a further preferred embodiment, the image scanning unit and / or the detection scanning unit, which are based, for example, on the diffraction of the light beam, have an acousto-optical or also an electro-optical deflector.

Des Weiteren besitzt die Abbildungsscaneinheit und/oder die Detektionsscaneinheit vorzugsweise eine geringe Massenträgheit, um dadurch vorteilhaft eine hohe Zeilenrate bzw. Bildrate durch im Wesentlichen schnell ausführbare Bewegungen zu ermöglichen. Furthermore, the image scanning unit and / or the detection scanning unit preferably has a low mass inertia, thereby advantageously allowing a high line rate or frame rate by movements that can be executed substantially quickly.

Vorzugsweise weisen die Abbildungsscaneinheit und/oder die Detektionsscaneinheit einen resonanten Spiegel mit einer möglichst hohen Resonanzfrequenz auf, so dass insbesondere auf die Verwendung von akustisch-optischen Deflektoren (AOD) verzichtet werden könnte. Je höher die Frequenz der schnellen Achse der Abbildungsscaneinheit und/oder der Detektionsscaneinheit gewählt wird, desto mehr Zeilen können pro Sekunde gescannt und desto mehr Bilder pro Sekunde aufgenommen werden. The imaging scanning unit and / or the detection scanning unit preferably have a resonant mirror with the highest possible resonance frequency, so that in particular the use of acoustic-optical deflectors (AOD) could be dispensed with. The higher the frequency of the fast axis of the imaging scan unit and / or the detection scan unit is selected, the more lines can be scanned per second and the more frames captured per second.

Des Weiteren ist die Deflektion der Abbildungsscaneinheit entlang der langsamen oder mittleren Achse vorzugsweise ersetzbar durch eine dynamische Wellenlängenvariation der Anregungsstrahlung bzw. der Lesestrahlung. Hierzu wird vorteilhaft eine polychromatische Lichtquelle und ein der Lichtquelle im Lesestrahlgang nachgeschaltet angeordnetes und dem Strahlteiler vorgeschaltet angeordnetes wellenlängen-dispersives Element benötigt. Ein solches dispersives Element kann beispielsweise als ein akusto-optischer Deflektor oder ein rotierendes Gitter umgesetzt werden Furthermore, the deflection of the imaging scan unit along the slow or central axis is preferably replaceable by a dynamic wavelength variation of the excitation radiation or the read radiation. For this purpose, a polychromatic light source and a wavelength-dispersive element arranged downstream of the light source in the reading beam and arranged upstream of the beam splitter are advantageously required. Such a dispersive element can be implemented, for example, as an acousto-optic deflector or a rotating grating

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops wird ein in dem Detektionsstrahlengang der Detektionsscaneinheit vorgeschaltet angeordnetes wellenlängen-dispersives Ablenkelement dazu verwendet die Detektionsstrahlung spektral aufzuspalten, so dass vorteilhaft dadurch eine dynamische Variation der detektierten Strahlung erfolgen kann. Beispielsweise wird dann in diesem Fall die langsame Achse der Detektionsscaneinheit vornehmlich nicht zur Abbildung einer räumlichen Dimension verwendet, sondern bevorzugt zur Abbildung verschiedener Wellenlängen auf dem Detektor bzw. der Detektoreinheit. Die langsame Achse der Detektionsscaneinheit ist dabei vorzugsweise in Frequenz und Phase mit dem eingeführten dispersiven Element im Wesentlichen starr verbunden und synchronisiert. Dieses wellenlängen-dispersives Ablenkelement ersetzt in dieser Ausführungsform den ansonsten z.B. für die Detektion von Fluoreszenz bzw. Fluoreszenzstrahlung bevorzugt angeordneten Sperrfilter. Eine entsprechende Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn beispielsweise die Detektionsstrahlung nicht lediglich aus in der Probe reflektierter Strahlung besteht. In a further preferred embodiment of the optical scanning microscope according to the invention, a in the detection beam path The wavelength-dispersive deflection element arranged upstream of the detection scanning unit is used to spectrally split the detection radiation, so that advantageously a dynamic variation of the detected radiation can take place. For example, in this case, the slow axis of the detection scan unit is not primarily used for imaging a spatial dimension, but preferably for imaging different wavelengths on the detector or the detector unit. The slow axis of the detection scan unit is preferably substantially rigidly connected and synchronized in frequency and phase with the introduced dispersive element. In this embodiment, this wavelength-dispersive deflection element replaces the blocking filter which is otherwise preferably arranged, for example, for the detection of fluorescence or fluorescence radiation. A corresponding embodiment of the optical scanning microscope according to the invention is particularly advantageous if, for example, the detection radiation does not consist solely of radiation reflected in the sample.

Des Weiteren wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops, wie zuvor beschrieben, zum dreidimensionalen Abrastern einer zu untersuchenden Probe beansprucht, wobei die Verwendung eines derartigen optischen Rastermikroskops nicht nur auf die Mikroskopie selbst beschränkt ist, sondern in allen Bereichen der Bildererzeugung bzw. -darstellung Anwendung finden kann. D.h., dass die Auflösung sowie die Größe des Sichtfeldes durch das Abbildungsobjektiv und die entsprechend zugehörige Optik bestimmt wird und im Wesentlichen somit von den Abbildungseigenschaften dieser Elemente bzw. Einrichtungen abhängen, wobei im Wesentlichen all diejenigen Optiken Verwendung finden können, deren hintere Fokalebene im Unendlichen liegen. Furthermore, the use of a scanning optical microscope according to the invention, as described above, claimed for the three-dimensional scanning of a sample to be examined, the use of such a scanning optical microscope is not limited to the microscopy itself, but in all areas of image production or representation application Can be found. That is, the resolution and the size of the field of view is determined by the imaging lens and the corresponding associated optics and thus essentially depend on the imaging properties of these elements or devices, wherein substantially all those optics can be used, the rear focal plane lie at infinity ,

Weitere Vorteile, Ziele und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden anhand nachfolgender Beschreibung anliegender Zeichnung erläutert, in welcher beispielhaft ein Aufbau einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops dargestellt wird. Further advantages, objects and characteristics of the present invention will be explained with reference to the following description of the appended drawing, in which an example of a construction of an embodiment of the optical scanning microscope according to the invention is shown.

1 zeigt eine schematische Darstellung des Strahlengangs der Lesestrahlung und der Detektionsstrahlung durch einzelne Einheiten einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops. 1 shows a schematic representation of the beam path of the reading radiation and the detection radiation through individual units of an embodiment of the optical scanning microscope according to the invention.

1 zeigt eine schematische Darstellung des Strahlengangs der Lesestrahlung 2 (durchgezogene Linie) und der Detektionsstrahlung 3 (gestrichelte Linie) durch einzelne Einheiten 5 bis 21 einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops 1. 1 shows a schematic representation of the beam path of the reading radiation 2 (solid line) and the detection radiation 3 (dashed line) through individual units 5 to 21 an embodiment of the optical scanning microscope according to the invention 1 ,

Zur Ermöglichung der Konfokalität ist es u.a. vorteilhaft zwei Lochblenden 6 und 16 anzuordnen, wobei die erste Lochblende, nämlich die Lesestrahlen-Lochblende 6 vorzugsweise im Lesestrahlengang 2 und dabei bevorzugt zwischen der Lichtquelle 4 und einer Strahlaufweitungsvorrichtung 7 angeordnet ist, während die zweite Lochblende, nämlich die Detektionsstrahlen-Lochblende 16 bevorzugt im Detektionsstrahlengang 3 zwischen einer ersten Linsen 15 und einer zweiten Linse 17 angeordnet ist. Die von der Lichtquelle 4 erzeugte Lesestrahlung 2 wird auf die Lesestrahlen-Lochblende 6 geworfen, so dass nur ein einziger durch ein definiertes Loch bzw. durch eine definiert ausgeformte Öffnung (hier nicht gezeigt) der Lesestrahlen-Lochblende 6 dringender Lesestrahl 2 auf eine Strahlaufweitungsvorrichtung 7 projiziert werden kann. To enable confocality, it is advantageous, inter alia, two pinhole 6 and 16 to arrange, wherein the first pinhole, namely the reading beam aperture 6 preferably in the reading track 2 and preferably between the light source 4 and a beam expanding device 7 is disposed while the second pinhole, namely the detection beam aperture 16 preferably in the detection beam path 3 between a first lens 15 and a second lens 17 is arranged. The of the light source 4 generated reading radiation 2 gets on the reading rays aperture 6 thrown so that only a single through a defined hole or by a defined shaped opening (not shown here) of the reading beam aperture 6 urgent reading beam 2 to a beam broadening device 7 can be projected.

Gemäß dem Bezugszeichen 5 ist ein wellenlängendispersives Element 5 dargestellt, welches im Lesestrahlgang 2 zwischen der Lichtquelle 4 und der Lesestrahlen-Lochblende 6 angeordnet ist und, wie oben bereits aufgezeigt, beispielsweise ein akusto-optischer Deflektor oder ein rotierendes Gitter oder auch ein Prisma sein kann. Dieses wellenlängendispersive Element 5 dient vorteilhaft dazu die Deflektion der Abbildungsscaneinheit entlang der langsamen oder mittleren Achse vorzugsweise durch eine dynamische Wellenlängenvariation der Anregungsstrahlung bzw. der Lesestrahlung zu ersetzen. According to the reference numeral 5 is a wavelength dispersive element 5 shown, which in the reading beam 2 between the light source 4 and the reading beam aperture 6 is arranged and, as already shown above, for example, an acousto-optic deflector or a rotating grid or a prism can be. This wavelength dispersive element 5 advantageously serves to replace the deflection of the image scanning unit along the slow or central axis preferably by a dynamic wavelength variation of the excitation radiation or the read radiation.

Für die Lochblenden 6 und 16 gilt allgemein, dass eine groß dimensionierte Lochblende einerseits mehr Intensität, jedoch andererseits eine geringere Genauigkeit ermöglicht, wobei eine kleiner dimensionierte Lochblende dementsprechend eine geringe Intensität, jedoch eine höhere Genauigkeit liefert, wobei jedoch auch die detektierte Intensität abnimmt, was wiederum zu einer Erhöhung des Messrausches führen kann. For the pinholes 6 and 16 It is generally true that a large-sized pinhole allows, on the one hand, more intensity but, on the other hand, lower accuracy, with a smaller sized pinhole correspondingly providing low intensity but higher accuracy but also decreasing the detected intensity, which in turn increases measurement noise can lead.

Durch die bevorzugte Verwendung des nur einen Lese- bzw. Anregestrahles 2 bzw. der nur einen Lese- bzw. Anregerstrahlung 2 wird vorteilhaft die Bildqualität nicht durch Wechselwirkungen zwischen einzelnen Lese- bzw. Anregestrahlen 2 bzw. einzelnen Lese- bzw. Anregerstrahlungen 2 negativ beeinträchtig, wobei die von handelsüblichen konfokalen Mikroskopen bekannte Abbildungsqualität vornehmlich durch die Verwendung des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops mit lediglich einem Lese- bzw. Anregestrahl 2 bzw. einer Lese- bzw. Anregerstrahlung 2 zumindest erhalten und vorteilhaft sogar noch deutlich verbessert wird. By the preferred use of only a read or stimulating beam 2 or the only one reading or Anregerstrahlung 2 Advantageously, the image quality is not due to interactions between individual reading or exciting beams 2 or individual read or Anregerstrahlungen 2 adversely affected, the known from commercial confocal microscopes imaging quality mainly by the use of the optical scanning microscope according to the invention with only a read or excitation beam 2 or a reading or exciting radiation 2 at least preserved and advantageous even improved significantly.

Bekannterweise wird die Lesestrahlung in die zu untersuchende Probe hineinfokussiert bzw. auf die zu untersuchende Probe auffokussiert und die von der Probe reflektierte bzw. fluoreszent emittierte Detektionsstrahlung aus diesem Fokus durch das gleiche Objektiv auf eine zweite Lochblende abgebildet, von da aus die Detektionsstrahlung auf einen Strahlungsdetektor (beispielsweise ein Photomultiplier oder eine Avalanche-Photodiode) gelangt. Dabei liegen der Anregungsfokus und der Detektionsfokus konfokal zueinander, d.h., dass der Anregungsfokus und der Detektionsfokus folglich optisch konjugiert zueinander sind. As is known, the reading radiation is focussed into the sample to be examined or focused on the sample to be examined, and the detection radiation reflected or fluorescently emitted by the sample from this focus through the sample imaged the same lens on a second pinhole, from there the detection radiation to a radiation detector (for example, a photomultiplier or an avalanche photodiode) passes. In this case, the excitation focus and the detection focus are confocal to one another, ie the excitation focus and the detection focus are consequently optically conjugate to one another.

Demzufolge wird auch gemäß der 1 die von der Strahlaufweitungseinrichtung 7 bzw. Strahlaufweitungsvorrichtung 7 aufgeweitete Lesestrahlung 2 einer Abbildungsscaneinheit 9 zugeführt, welche u.a. eine erste zweidimensionale Abbildungsablenkeinheit 10 und eine im Wesentlichen zu dieser ersten zweidimensionale Abbildungsablenkeinheit 10 zuzuordnenden Abbildungsoptik 11, welche beispielsweise eine telezentrische Optik sein kann, aufweist, und ein Abrastern bzw. Abscannen der in der Probeneben bzw. Fokusebene liegende Probe 14 bzw. liegenden Probenbereich 14 durchführt. Zwischen Abbildungsscaneinheit 9 und der Probe 14 bzw. der Probeneben ist zudem ein Abbildungsobjektiv 13 angeordnet. Dabei ist es möglich, jedoch nicht zwingend erforderlich, dass die in die Abbildungsscaneinheit 9 eintretende Lesestrahlung 2 über die erste zweidimensionale Abbildungsablenkeinheit 10 nicht nur in einem gewissen Winkelbereich gescannt, sondern auch im Mittel – beispielsweise in einem Winkel von ca. 90° – abgelenkt aus der zweidimensionalen Abbildungsablenkeinheit 10 heraustritt. Accordingly, also according to the 1 that of the beam expander 7 or beam expanding device 7 expanded reading radiation 2 an image scanning unit 9 which, inter alia, a first two-dimensional image deflection unit 10 and a substantially to this first two-dimensional image deflection unit 10 to be assigned imaging optics 11 , which may be, for example, a telecentric optics, and a scanning or scanning the lying in the sample plane or focal plane sample 14 or lying sample area 14 performs. Between picture scanning unit 9 and the sample 14 or the sample plane is also an imaging lens 13 arranged. It is possible, but not mandatory, that the in the image scanning unit 9 incoming reading radiation 2 over the first two-dimensional image deflection unit 10 not only scanned in a certain angular range, but also on average - for example, at an angle of about 90 ° - deflected from the two-dimensional imaging deflection unit 10 emerges.

Um ein Verschieben der abgerasterten Fokusebene entlang der Strahlrichtung zu ermöglichen ist es möglich die zweidimensionale Abbildungsablenkeinheit 10 und die dazugehörige Abbildungsoptik 11 um eine eindimensionale Abbildungsscaneinheit 12 zu ergänzen, wobei die eindimensionale Abbildungsscaneinheit 12 vornehmlich dazu dient die Fokusebene entlang der Strahlrichtung (z-Richtung) zu verschieben. In order to enable shifting of the scanned focus plane along the beam direction, it is possible to use the two-dimensional image deflection unit 10 and the associated imaging optics 11 by a one-dimensional image scanning unit 12 to supplement, wherein the one-dimensional imaging scan unit 12 primarily serves to move the focal plane along the beam direction (z-direction).

Die von der in der Probenebene liegende Probe 14 reflektierte oder fluoreszent emittierte Strahlung bzw. Detektionsstrahlung 3 wird dann wieder durch die Abbildungsscaneinheit 9 in Richtung des Strahlteilers 8, welcher auch als dichroischer Spiegel ausgebildet sein kann, geleitet, welcher bereits die von der Strahlaufweitungseinrichtung 7 übertragene Lesestrahlung 2 an die Abbildungsscaneinheit 9 weitergeleitet hat. The sample lying in the sample plane 14 reflected or fluorescently emitted radiation or detection radiation 3 then goes through the image scan unit again 9 in the direction of the beam splitter 8th , which may also be designed as a dichroic mirror, which already passes the beam expander 7 transmitted reading radiation 2 to the image scanning unit 9 has forwarded.

Der die Lese- und Detektionsstrahlung voneinander trennende Strahlteiler 8 zeichnet sich durch ein definiertes und im Wesentlichen bestimmbares Verhältnis von transmittierter und reflektierter Strahlung aus. D.h., wenn die optischen Komponenten im erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskop 1 derart angeordnet sind, dass die Lesestrahlung 2 in Richtung der Abbildungsscaneinheit 9 transmittiert wird, ist der Anteil der transmittierten Strahlung vorzugsweise kleiner zu wählen als der Anteil der zur Detektionsscaneinheit 19 reflektierten Detektionsstrahlung 3. In einer alternativen Ausführungsform kann es beispielsweise vorteilhaft sein das Verhältnis von Transmission und Reflektion entsprechend anzupassen. Insbesondere bei Verwendung von Laserlicht als Lesestrahlung 2 ist der Strahlteiler 8 vorzugsweise als polarisationsunabhängiges Element ausgeführt. The reading and detection radiation from each other separating beam splitter 8th is characterized by a defined and essentially determinable ratio of transmitted and reflected radiation. That is, when the optical components in the scanning optical microscope of the present invention 1 are arranged such that the reading radiation 2 in the direction of the image scanning unit 9 is to be selected, the proportion of the transmitted radiation is preferably smaller than the proportion of the detection scan unit 19 reflected detection radiation 3 , For example, in an alternative embodiment, it may be advantageous to adjust the ratio of transmission and reflection accordingly. Especially when using laser light as reading radiation 2 is the beam splitter 8th preferably designed as a polarization-independent element.

Wird dagegen beispielsweise Fluoreszenzlicht als Detektionsstrahlung verwendet, wird der Strahlteiler 8 vorzugsweise durch einen dichroischen Spiegel realisiert. Dichroische Spiegel sind insbesondere dafür bekannt, dass diese beispielsweise aus speziell bedampftem Glas bestehenden Spiegel selektiv bestimmte Wellenlängen reflektieren und andere transmittieren. Demnach wird die Anregerstrahlung 2 (hier Anregerstrahlung, da diese einzelne Moleküle der zu untersuchenden Probe zum Fluoreszieren anregen soll) von dem dichroischen Spiegel 7 vorzugsweise vollständig transmittiert und die Detektionsstrahlung 3 vorzugsweise vollständig reflektiert. Je nach Ausgestaltung bzw. Auslegung des dichroischen Spiegels kann der Lesestrahl bzw. Anregerstrahl auch daran reflektiert werden und der Detektionsstrahl transmittiert, wobei in einem derartigen Fall die Komponenten der Lichterzeugung und der Detektion entsprechend positioniert werden müssen. If, for example, fluorescent light is used as detection radiation, the beam splitter becomes 8th preferably realized by a dichroic mirror. Dichroic mirrors are known, in particular, for the fact that these mirrors, for example made of specially vaporized glass, selectively reflect certain wavelengths and transmit others. Accordingly, the excitation radiation 2 (here excitation radiation, since this single molecules of the sample to be examined to stimulate fluorescence) of the dichroic mirror 7 preferably completely transmitted and the detection radiation 3 preferably completely reflected. Depending on the configuration or design of the dichroic mirror, the reading beam or exciter beam can also be reflected thereon and the detection beam transmitted, in which case the components of the light generation and the detection must be correspondingly positioned.

Die von dem Strahlteiler 8 bzw. dichroischen Spiegel 8 kommende Detektionsstrahlung 3 wird über eine erste Linse 15, welche die ankommende Detektionsstrahlung 3 vorzugsweise weitestgehend bündelt, auf eine Detektionsstrahlen-Lochblende 16 gestrahlt, wobei lediglich die durch das Loch bzw. die Ausnehmung der Detektionsstrahlen-Lochblende 16 dringende Detektionsstrahlung 3 an eine weitere, zweite Linse 17 übertragen wird, welche zum Einen die transmittierte Detektionsstrahlung derart parallelisiert bzw. kollimiert, dass möglichst wenig Streustrahlung entsteht, und zum Anderen (falls Fluoreszenz detektiert werden soll) diese parallelisierte bzw. kollimierte Detektionsstrahlung 3 an einen Sperrfilter 18 weitergibt. Der Sperrfilter 18, welcher vornehmlich in optischen Fluoreszenz-Rastermikroskopen eingesetzt wird, dient dabei vorzugsweise zum Herausfiltern bzw. Absorbieren der noch verbliebenen Anregerstrahlung 2 bzw. der entstandenen und unerwünschte Streustrahlung, welche für eine Bilderzeugung der Probe im Wesentlichen nachteilig wäre, da dadurch beispielsweise die Bildqualität zunehmend verschlechtert werden würde. Bei einem optischen Reflektions-Rastermikroskop, bei welchem keine Fluoreszenzstrahlung, sondern eine Reflektionsstrahlung als Detektionsstrahlung auftritt, findet der Sperrfilter 18 vornehmlich keine Verwendung. The of the beam splitter 8th or dichroic mirror 8th upcoming detection radiation 3 is about a first lens 15 which the incoming detection radiation 3 preferably largely bundles, on a detection beam aperture 16 blasted, with only the through the hole or the recess of the detection beam aperture 16 urgent detection radiation 3 to another, second lens 17 which, on the one hand, parallelises or collimates the transmitted detection radiation such that as little stray radiation as possible is generated, and on the other hand (if fluorescence is to be detected) this parallelized or collimated detection radiation 3 to a blocking filter 18 passes. The blocking filter 18 , which is used primarily in optical fluorescence scanning microscopes, preferably serves to filter out or absorb the remaining excitation radiation 2 or the resulting and unwanted scattered radiation, which would be substantially detrimental to image formation of the sample, as, for example, image quality would be progressively worsened. In a reflection optical scanning microscope, in which no fluorescence radiation, but a reflection radiation as detection radiation occurs, finds the notch filter 18 mainly no use.

Anders als bei den aus dem allgemeinen Stand der Technik bekannten optischen Rastermikroskopen bzw. konfokal ausgebildeten Mikroskopen, bei welchen die durch den Sperrfilter tretende Detektionsstrahlung beispielsweise auf einen Photonenzähler fokussiert wird, der wiederum die Intensität der Detektionsstrahlung versucht pro Bildpunkt aufzuzeichnen, wird entsprechend der in 1 aufgezeigten Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops die beispielsweise vom Sperrfilter 18 transmittierte Detektionsstrahlung 2 an eine Detektionsscaneinheit 19 geführt, welche folglich im Detektionsstrahlengang 3 der Detektionsstrahlen-Lochblende 16 nachgeschaltet angeordnet ist und vorzugsweise in Frequenz und Phase für alle Achsen, d.h. beispielsweise im Fall der zweidimensionalen Detektionsscaneinheit 19 für die schnelle Achse und die langsame Achse im Wesentlichen starr mit der jeweiligen Achse der Abbildungsscaneinheit 9 gekoppelt ist. Eine derartige Kopplung der unterschiedlichen Achsen der beiden Scaneinheiten 9 und 19 untereinander ist beispielsweise durch die Verwendung von nicht-resonanten Systemen realisierbar, so dass beispielsweise akusto-optische Deflektoren (AODs) oder elektro-optische Deflektoren (EODs), welche eine entsprechend erforderliche Dynamik und Präzession, jedoch zeitgleich höhere Verluste aufweisen vorzugsweise für die schnelle Achse verwendet werden, während beispielsweise ein galvanischer Spiegel für die langsame bzw. mittlere Achse Verwendung findet. Aufgrund der oben bereits aufgeführten Wellenlängenabhängigkeit des Ablenkwinkels von akusto-optische Deflektoren bzw. elektro-optische Deflektoren ist des vorteilhaft auch für die schnellen Achsen Spiegel zu verwenden. In contrast to the known from the general state of the art optical scanning microscopes or confocal microscopes in which the passing through the notch filter detection is focused, for example, on a photon counter, which in turn tries to record the intensity of the detection radiation per pixel, is in accordance with the 1 pointed embodiment of the optical scanning microscope according to the invention, for example, the blocking filter 18 transmitted detection radiation 2 to a detection scan unit 19 guided, which consequently in the detection beam path 3 the detection beam aperture 16 arranged downstream and preferably in frequency and phase for all axes, that is, for example, in the case of the two-dimensional detection scan unit 19 for the fast axis and the slow axis substantially rigid with the respective axis of the imaging scan unit 9 is coupled. Such a coupling of the different axes of the two scanning units 9 and 19 with each other, for example, by the use of non-resonant systems feasible, so that for example acousto-optical deflectors (AODs) or electro-optical deflectors (EODs), which have a correspondingly required dynamics and precession, but at the same time higher losses, preferably for the fast axis while, for example, a galvanic mirror is used for the slow or middle axis. Due to the wavelength dependence of the deflection angle of acousto-optical deflectors or electro-optical deflectors already mentioned above, it is also advantageous to use mirrors for the fast axes.

Dabei ist es denkbar diese Spiegel mit einer zugehörigen Steuerelektronik entsprechend den Anforderungen des erfindungsgemäßen optischen Rastermikroskops in Frequenz und Phase im Wesentlichen starr aneinander zu koppeln. It is conceivable that these mirrors with an associated control electronics according to the requirements of the optical scanning microscope according to the invention in frequency and phase substantially rigidly coupled to each other.

Gemäß der 1 weist die Detektionsscaneinheit 19 insbesondere eine Detektionsablenkeinheit 20, für welche die oben beschriebenen Kopplungen oder zumindest eine der oben beschriebenen Kopplung in Frequenz und Phase zu den entsprechenden Achsen oder zu der jeweiligen entsprechenden Achse der Abbildungsablenkeinheit bestehen bzw. besteht, sowie eine Detektionsoptik 21 auf. According to the 1 has the detection scan unit 19 in particular a detection deflection unit 20 for which the above-described couplings or at least one of the above-described coupling exists in frequency and phase to the respective axes or to the respective corresponding axis of the imaging deflection unit, as well as detection optics 21 on.

Die Verwendung der Detektionsscaneinheit 19, welche beispielsweise eine F-Theta-Optik aufweist, ermöglicht ein Aufscannen eines ein- oder zweidimensionalen Abbildes der zu untersuchenden Probe gemäß der Fokusebene Bildpunkt für Bildpunkt auf einem Detektor 22 und insbesondere auf einem Linien- oder Flächendetektor 22. The use of the detection scan unit 19 which has, for example, an F-theta optical system, makes it possible to scan a one- or two-dimensional image of the sample to be examined according to the focal plane pixel by pixel on a detector 22 and in particular on a line or area detector 22 ,

Um eine optimierte Strahlführung zu ermöglichen kann es dabei vorteilhaft sein, wenn an unterschiedlichen Bereichen des Rastermikroskopaufbaus weitere optische Elemente, wie beispielsweise justierbare Spiegel (hier nicht gezeigt) angeordnet werden. In order to enable an optimized beam guidance, it may be advantageous if further optical elements, such as adjustable mirrors (not shown here) are arranged at different areas of the scanning microscope construction.

Je nach benutzten Wellenlängenbereich des elektromagnetischen Spektrums sind die optischen Elemente als Linse, durch welche das Licht transmittiert und dabei durch Brechungseffekte gebündelt oder aufgeweitet wird, oder als Spiegel, welche beispielsweise bei einer nicht-ebenen Ausführung, wie z. B. bei Hohlspiegeln den reflektieren Strahl ebenfalls bündeln oder aufweiten können, oder als ein anderes strahlformendes Element, wie beispielsweise Fresnel-Zonen-Platten ausgeführt. Depending on the wavelength range of the electromagnetic spectrum used are the optical elements as a lens through which the light is transmitted and thereby bundled or expanded by refraction effects, or as a mirror which, for example, in a non-planar design, such as. B. in concave mirrors the reflected beam can also focus or expand, or as another beam-forming element, such as Fresnel zone plates executed.

Die Anmelderin behält sich vor sämtliche in den Anmeldungsunterlagen offenbarten Merkmale als erfindungswesentlich zu beanspruchen, sofern sie einzeln oder in Kombination gegenüber dem Stand der Technik neu sind. The Applicant reserves the right to claim all features disclosed in the application documents as essential to the invention, provided that they are novel individually or in combination with respect to the prior art.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1 1: optisches Rastermikroskop optical scanning microscope
2 2: Lesestrahlung/Lesestrahlengang Reading radiation / write optical path
3 3: Detektionsstrahlung/Detektionsstrahlengang Detection radiation / detection beam path
4 4: Lichtquelle light source
5 5: wellenlängen-dispersives Element wavelength-dispersive element
6 6: Lesestrahlen-Lochblende Reading beams pinhole
7 7: Strahlaufweitungseinrichtung Beam expander
8 8th: Strahlteiler beamsplitter
9 9: Abbildungsscaneinheit Figure scanning unit
10 10: zweidimensionale Abbildungsablenkeinheit two-dimensional image deflection unit
11 11: Abbildungsoptik imaging optics
12 12: eindimensionale Abbildungsablenkeinheit und zugehörige Optik one-dimensional image deflection unit and associated optics
13 13: Abbildungsobjektiv imaging lens
14 14: Probe sample
15 15: erste Linse first lens
16 16: Detektionsstrahlen-Lochblende Detection beam pinhole
17 17: zweite Linse second lens
18 18: Sperrfilter/wellenlängen-dispersives Ablenkelement Barrier filter / wavelength-dispersive deflection element
19 19: Detektionsscaneinheit Detection scanning unit
20 20: Detektionsablenkeinheit Detection deflector
21 21: Detektionsoptik detection optics
22 22: Detektor detector

Claims

Scanning optical microscope for scanning a sample to be examined ( 14 ) with at least one light source ( 4 ) for emitting a reading radiation ( 2 ), - a read beam path ( 2 ) and a detection beam path ( 3 ) separating beam splitters ( 8th ), - one in the reading track ( 2 ) of the sample ( 14 ) arranged upstream imaging scan unit ( 9 ) and at least one imaging lens ( 13 ) for scanning the sample by the reading radiation ( 2 ), and - a beam splitter ( 8th ) in the detection beam path ( 3 ) arranged downstream detection scan unit ( 19 ) with at least one detection optics ( 21 ) to the detection radiation ( 3 ) to a detector ( 22 ) to focus and to rasterize.

Optical scanning microscope according to claim 1, characterized by a in the detection beam path ( 3 ) and to a focus of the imaging lens ( 13 ) optically conjugated detection beam aperture ( 16 ).

Scanning optical microscope according to one of claims 1 or 2, characterized by a read beam path ( 2 ) of the light source ( 4 ) arranged downstream read beam aperture ( 6 ) for generating a punctiform reading radiation ( 2 ).

Scanning optical microscope according to claim 3, characterized by one of the reading beam aperture plates ( 6 ) arranged downstream beam expander ( 7 ) for expanding the punctiform and / or parallel reading radiation ( 2 ).

Scanning optical microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the beam splitter ( 8th ) is wavelength selective.

Scanning optical microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the image scanning unit ( 9 ) at least one two-dimensional image deflection unit ( 10 ) whose axes are operated at different frequencies in order to scan a plane spanned by a fast and a central axis, an imaging optics (FIG. 11 ) and / or a one-dimensional image deflection unit ( 12 ) which realizes a slow axis oriented perpendicular to the plane.

Scanning optical microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the detection scanning unit ( 19 ) further comprises a detection deflection unit ( 20 ) and the detection deflection unit ( 20 ) and the detector ( 22 ) have a comparable number of dimensions.

Scanning optical microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the detection optics ( 21 ) is an F-theta optic.

Optical scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that a zoom lens between the imaging optics ( 11 ) and the imaging lens ( 13 ) is arranged to produce a convergent or divergent read beam ( 2 ) into the imaging lens ( 13 ) to a longitudinal position of a focal plane of the sample to be examined ( 14 ) to move.

Optical scanning microscope according to one of claims 1 to 8, characterized in that an electric lens with or without associated correction optics between the imaging optics ( 11 ) and the imaging lens ( 13 ) is arranged to produce a convergent or divergent read beam ( 2 ) into the imaging lens ( 13 ) to a longitudinal position of a focal plane of the sample to be examined ( 14 ) to move

Optical scanning microscope according to one of claims 2 to 10, characterized by a first intermediate beam splitter ( 8th ) and the detection beam aperture ( 16 ) in the detection beam path ( 3 ) arranged lens ( 15 ) to enable the confocality of the detection beam aperture ( 16 ) to a focal plane of the sample ( 14 ).

Optical scanning microscope according to one of claims 2 to 11, characterized by a second between the detection beam aperture ( 16 ) and an element ( 18 ) in the detection beam path ( 3 ) arranged lens ( 17 ) for forwarding the detection radiation ( 3 ) into the detection scan unit ( 19 ).

Scanning optical microscope according to one of claims 6 to 12, characterized in that the detection scan unit ( 19 ) and the detector ( 22 ) in such a way with the image scanning unit ( 9 ), that the movement (s) of the detection radiation ( 3 ) along the axis or along the axes of the detection scan unit ( 19 ) at least in frequency and phase to corresponding movements of the reading radiation ( 2 ) along the axis or along the axes of the image scanning unit ( 9 ) are rigidly coupled.

Scanning optical microscope according to claim 13, characterized in that the fast axis of the detection scan unit ( 19 ) with the fast axis of the imaging scan unit ( 9 ) is synchronized, provided that the image scanning unit ( 9 ) and / or the detection scan unit ( 19 ) are formed one-dimensionally.

Scanning optical microscope according to claim 13, characterized in that the fast axis of the detection scan unit ( 19 ) corresponding to the fast axis of the imaging scan unit ( 9 ) and the slow axis of the detection scan unit ( 19 ) corresponding to the slow or middle axis of the imaging scan unit ( 9 ) is synchronized, provided that the image scanning unit ( 9 ) and / or the detection scan unit ( 19 ) are formed at least two-dimensional.

Scanning optical microscope according to one of the preceding claims, characterized in that the image scanning unit ( 9 ) and / or the detection scan unit ( 19 ) has an acousto-optic or electro-optical deflector.

Scanning optical microscope according to one of claims 1 to 15, characterized in that the image scanning unit ( 9 ) and / or the detection scan unit ( 19 ) has a resonant mirror with a high resonant frequency.

Optical scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that a read beam path ( 2 ) of the light source ( 4 ) arranged downstream wavelength-dispersive element ( 5 ) is arranged to provide a dynamic wavelength variation of the reading radiation ( 2 ).

Optical scanning microscope according to one of the preceding claims, characterized in that a in the detection beam path ( 3 ) of the detection scan unit ( 19 ) arranged upstream wavelength-dispersive deflection element ( 18 ) is arranged to spectrally split the detection radiation.

Use of a scanning optical microscope according to one of the preceding claims for the three-dimensional scanning of a sample to be examined.